Yöntem makalesi

α-Sinüklein Agregatlarının İntranazal Uygulama Tekniği

1.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66943

⸱

8 Kasım 2024

 , 
1Department of Neurology, Graduate School of Medicine, Kyoto University

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, α-sinüklein agregatlarının intranazal uygulaması için bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yöntem, Parkinson hastalığında koku alma mukozasından koku soğancığına α-sinüklein yayılımı hakkında bilgi sağlar.

Özet

Parkinson hastalığı (PH), α-sinükleinin (α-Syn) agregatları olan Lewy cisimciklerinin varlığı ile karakterize nörodejeneratif bir hastalıktır. Son zamanlarda, hastalığın, vagus sinirinin koku soğanciği (OB) veya dorsal çekirdeğinden α-Syn agregatlarının prion benzeri yayılması yoluyla geliştiği ve ilerlediği öne sürülmüştür. OB'deki α-Syn agregatlarının kökeni belirsizliğini korusa da, koku alma mukozasından yayılmaları son zamanlarda önerilmiştir. Daha önce, bir fare modelinde α-Syn agregatlarının intranazal uygulamasının, farelerin OB'sinde α-Syn patolojisini indüklediğini göstermiştik. Bu çalışmada, farelerin OB'sinde α-Syn patolojisini indükleyen α-Syn agregatlarının intranazal uygulama yöntemini sunuyoruz. α-Syn agregatlarının intranazal uygulaması çok basit ve anlaşılır bir yöntemdir ve OB'deki α-Syn patolojisinin kökenini ve koku alma sistemi yoluyla α-Syn yayılımının yolunu aydınlatmak için araştırmalarda yararlı bir araç olacağına inanıyoruz.

Giriş

Bradikinezi, istirahat titremesi ve kas sertliği gibi motor semptomlarla karakterize Parkinson hastalığı (PH), en sık görülen ikinci nörodejeneratif bozukluktur1. PH ayrıca koku alma disfonksiyonu, kognitif bozukluk, depresyon, halüsinasyonlar, kabızlık ve ortostatik hipotansiyon gibi motor olmayan semptomlar da gösterir. Patolojik özellikleri, substantia nigra'daki dopaminerjik hücre ölümü ve Lewy cisimcikleri 2 olarak adlandırılan α-sinüklein (α-Syn) agregatlarının varlığıdır.

α-Syn, normal koşullar altında çözünür bir monomer (veya tetramer) şeklinde bulunan 140 amino asitlik bir proteindir. Bununla birlikte, anormal koşullar altında, çözünür monomer, oligomerler ve fibriller dahil olmak üzere çözünmeyen yüksek moleküler ağırlıklı agregalara dönüştürülür. α-Syn'in oligomerlere ve fibrillere geçişinin hücresel toksisite3'te rol oynadığı bildirilmektedir.

Son çalışmalar, nöronlar arasında α-Syn agregatlarının prion benzeri yayılımını önermiştir. Çok sayıda postmortem incelemeye dayanarak, Braak ve ark. 2003 yılında Lewy cisimciği patolojisinin beyinde biraz stereotipik bir şekilde ilerleyici olarak yayıldığı hipotezini öne sürdüler (Braak'ın hipotezi)4,5. 2008 yılında, fetal orta beyin nakli yapılan PH'li hastaların postmortem muayenesinde, fetal dokulardan türetilen dopaminerjik nöronlarda Lewy cisimcikleri ortaya çıktı 6,7. Bu çalışmalar, α-Syn agregatlarının hastalıklı beyinden greftlere yayılabileceğini ve Braak'ın hipotezini desteklediğini öne sürdü.

Bu gözlemleri takiben, farelerde birincil nöronal kültürleri ve α-Syn agregatlarının intraserebral enjeksiyonunu içeren deneyler, Lewy cisimciği benzeri agregatların yayılmasını yeniden üretmiş ve prion benzeri bir şekilde α-Syn yayılımı için daha fazla kanıt sağlamıştır 8,9.

Braak ve ark. PD'deki Lewy cisimciği patolojisinin koku soğancığı (OB) ve/veya vagus sinirinin dorsal çekirdeğinde (dmX) başladığını göstermiştir4. Braak'ın hipotezine dayanarak, birkaç çalışma, α-Syn agregatlarının veya Lewy cisimciği ekstraktlarının PD beyinlerinden deney hayvanlarının OB ve gastrointestinal sistemine uygulandığını bildirmiştir 10,11,12. 2018'de yapılan bir araştırma, α-Syn agregatlarının vahşi tip farelerin OB'sine uygulanmasının, koku alma yolu boyunca α-Syn patolojisinin yayılmasını indüklediğini ve koku alma disfonksiyonuna neden olduğunu gösterdi13. Daha önce α-Syn agregatlarını α-Syn transgenik farelerin OB'sine aşıladık ve bunun hipokampal atrofi ve hafıza bozukluğuna yol açtığını bulduk14.

2022'de, α-Syn agregalarını, insan olmayan küçük bir primat olan marmosetlerin OB'sine aşıladık; bu, α-Syn patolojisinin koku alma yolu, OB atrofisi ve yaygın serebral glukoz hipometabolizması boyunca yayılmasına neden oldu10.

Bununla birlikte, α-Syn agregalarının yayılması OB'den meydana gelirse, kritik bir soru ortaya çıkar: α-Syn agregaları başlangıçta hangi mekanizmayla ortaya çıkar? Saito ve ark. daha önce nazal mukozada Lewy cisimciklerinin varlığını bildirmişlerdir15. Gerçek zamanlı sarsıntı kaynaklı konversiyon (RT-QUIC) analizi16 kullanılarak PD ve çoklu sistem atrofisi (MSA) olan hastaların burun mukozasında α-Syn agregatlarının varlığı tespit edildi. Özellikle, PD'nin prodromal bir aşaması olarak kabul edilen hızlı göz hareketi uyku davranış bozukluğu (RBD) olan hastalardan alınan burun mukozası örneklerinin analizi, α-Syn seviyelerinde bir artış olduğunu ortaya koymuştur17. Bu çalışma, α-Syn patolojisinin PH'nin prodromal fazından itibaren bile nazal mukozada bulunabileceğini düşündürmektedir.

Bu bulgular nazal mukozadan OB'ye potansiyel bir yol önerse de, bu senaryoyu destekleyen sınırlı deneysel kanıt vardır. Bu boşluğu gidermek için, farelerin burun boşluğuna α-Syn agregatları uyguladık ve α-Syn patolojisinin burun mukozasından OB'ye yayılmasını araştırdık. Deneysel yaklaşımımız, vahşi tip farelerde α-Syn agregatlarının tek doz intranazal uygulamasının OB'de α-Syn patolojisini indüklediğini ve nazal mukozadan OB'ye yayılma yolu için deneysel kanıt sağladığını göstermiştir.

Protokol

Bu çalışma için 2 aylık C57BL/6J erkek fareler kullanıldı. Tüm deneysel prosedürler ulusal yönergelere göre gerçekleştirilmiştir. Kyoto Üniversitesi Hayvan Araştırma Komitesi bu çalışma için etik onay ve izin vermiştir (MedKyo 23,544).

1. α-Syn önceden oluşturulmuş fibrillerin intranazal uygulaması

  1. Daha önce bildirilen yöntemlere göre PBS'de (4 mg / mL) fare α-Syn fibrilleri çözeltisini hazırlayın11. Kontaminasyonu önlemek için tüpü şeffaf bir filmle sarın.
  2. Su banyosu tipi bir sonikatör (Malzeme Tablosu) kullanarak α-Syn önceden oluşturulmuş fibriller (PFF'ler) oluşturmak için 200 μL α-Syn fibril solüsyonunu sonikleştirin. Ultrasonik banyoyu suyla doldurun ve sonikasyon için 4 ° C'ye kadar soğuması için buz küpleri ekleyin. Fibrilleri toplam 5 dakika boyunca sonikleştirin, her döngü 30 s sonikasyondan oluşur ve ardından 30 s'lik bir aralık (toplam beş döngü) gelir.
    NOT: α-Syn'e maruz kalmayı önlemek için tek kullanımlık eldiven, maske ve koruyucu gözlük gibi kişisel koruyucu ekipman kullanın.
  3. 10 μL pipet ucu ile bir P10 pipeti (Malzeme Tablosu) hazırlayın. İntraperitoneal (ip) enjeksiyon ile medetomidin hidroklorür, midazolam ve butorphanol (MMB) kombinasyonu kullanarak her fareyi uyuşturun. MMB kombinasyon anestezik ajan midazolam (0.3 mg / kg), medetomidin (4 mg / kg) ve butorphanol tartrat (5 mg / kg) içeriyordu. Midazolam (1 mg / mL) 0.3 mL, medetomidin (5 mg / mL) 0.8 mL, butorphanol tartrat (5 mg / mL) 1 mL ve salin 2.9 mL'yi karıştırırken enjeksiyon ile 0.005 mL / g kullanın.
  4. Farelerin tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için 10 dakika bekleyin. Fare yanal yaslanma durumundaysa ve kendini düzeltemiyorsa, uygun anestezik doğrulama doğrulanabilir. Anestezi uygulandıktan sonra, gözlerin kurumasını önlemek için steril bir pamuk aplikatörü kullanarak oftalmik merhem sürün.
    NOT: Anestezi olmadan, nazal dozları uygularken, fareleri sırtüstü tutmak ve fareler hapşırırken α-Syn solüsyonunu düzgün bir şekilde uygulamak zordur. Bu nedenlerden dolayı sedasyon gerekliydi.
  5. Anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Vücudun altına bir kağıt havlu veya benzeri bir malzeme yerleştirin ve başın hafifçe aşağı doğru eğilmesini sağlayın (Şekil 1A,B). Bu konumlandırma, uygulanan α-Syn solüsyonunun hızlı bir şekilde akciğerlere veya yemek borusuna akmasını önleyerek burun boşluğunda tutulmasını kolaylaştırır. Burun delikleri Şekil 1C'de görülmektedir.
  6. 1 μL α-Syn solüsyonunu (4 mg/mL) bir P10 pipetine çekin ve pipet ucunu farenin burnuna yakın bir yere yerleştirin. Yavaşça yuvarlak bir damla oluşturun ve pipet ucunun ucunda tutun (Şekil 1D, kırmızı ok). Tek taraflı burun deliği için intranazal uygulama yapılır, karşı tarafı kontrol tarafı olarak kullanın.
  7. Damlayı fare burun deliklerinin bir tarafına yaklaştırın ve farenin doğal olarak nefes almasına izin verin. Solumayı izleyin ve 30 saniye ila 1 dakika bekleyin (Şekil 1E).
  8. 1.6.-1.7 adımlarını tekrarlayın. toplam hacim 20 μL α-Syn çözeltisi uygulanana kadar. Tüm işlemlerden sonra, eldivenleri atın ve yüzey α-Syn ile kirlenmişse bir tezgahı ticari deterjanlarla silin.
    NOT: Prosedürü gerçekleştiren personel tarafından α-Syn fibrillerinin solunmasını önlemek için tüm prosedür bir güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Önceki bir rapor, 25 μL'lik hacmin burundan beyne ilaç uygulaması için en verimli olduğunu göstermiştir18. Bu çalışmada benzer bir hacim olan 20 μL'yi kullanıyoruz. Ayrıca, 400 μM (5.6 mg / mL) PFF'ye(19) yakın olan önceki raporda10 OB'ye enjeksiyon için kullanılanla aynı PFF konsantrasyonunu kullanıyoruz.
  9. Atipamezol uygulayın (3 mg / kg; Malzeme Tablosu) i.p. medetomidini tersine çevirmek ve iyileşmeyi kolaylaştırmak için enjeksiyon. Atipamezol (5 mg / mL) 0.6 mL ve salin 4.4 mL'yi karıştırırken i.p. enjeksiyonu ile 0.005 mL / g kullanın.
    NOT: Analjezi sağlayın çünkü α-Syn'in intranazal uygulamasının ne kadar stresli olacağı tam olarak anlaşılmamıştır.
  10. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileştikten sonra, fareyi kafese geri koyun.

2. Numune hazırlama

  1. Tedavi edilen fareleri, α-Syn önceden oluşturulmuş fibrillerin intranazal uygulamasından 1, 3, 6 ve 12 ay sonra sakit edin.
    1. Fareleri indüksiyon kutusuna koyun, sevofluran (% >6.5) uygulayın ve > 60 saniye boyunca solunum durması meydana gelene kadar devam edin. Fareleri çıkarın ve ötenaziyi sağlamak için sağ atriyal insizyon ile hızlı kan kaybı yapın.
  2. Kalbin tepesine 25G'lik bir iğne (Malzeme Tablosu) yerleştirin. Fareyi 15 mL PBS ile 4 mL / dk'da perfüze edin ve ardından PBS'de 15 mL% 4 PFA.
  3. Kafayı makasla kesin ve neşter ile kafa derisinde 2 cm'lik bir kesi yapın. Kafatası kemiğini makasla lateral taraftan alttan buruna doğru kesin (Şekil 2A,B). OB'leri elde etmek için, OB'lerdeki kafatası kemiğini tamamen çıkarın (Şekil 2B, sarı daire).
  4. Başınızı ters çevirin, beyin sinirlerini kesin ve ardından beyni forseps ile dikkatlice çıkarın (Şekil 2C, D). Sağlam OB'lerle beyni elde edin (Şekil 2E). Sağlam OB'leri elde etmek için, OB'ler kafatası kemiğine yapışırken koku alma sinirlerini forseps ile dikkatlice kesin (Şekil 2D, sarı daire).
  5. Beyin örneklerini gece boyunca 4 ° C'de PBS'deki% 4 PFA'ya yerleştirin. Beyin örneklerini 24 saatten fazla bırakmayın.
    NOT: Aşırı fiksasyon immünohistokimyasal boyamayı azaltacaktır. Uzun süreli depolama gerekiyorsa, steriliteyi korumak için beyin örneklerini %70 etanol veya %0.1 sodyum azid içeren PBS'de saklayın.

3. OB'nin immünohistokimyasal boyanması

  1. Numuneleri aşağıda açıklandığı gibi otomatik bir doku işlemcisi (Malzeme Tablosu) kullanarak parafinlendirin.
    1. 120 dakika boyunca %70 etanole daldırın, ardından 60 dakika boyunca 8x %100 etanole daldırın. Ardından, 120 dakika boyunca 3x için% 100 ksilene daldırın.
    2. 60 ° C'de 120 dakika parafine daldırın, ardından 60 ° C'de 240 dakika parafine daldırın.
  2. Örnekleri aşağıda açıklandığı gibi parafine gömün.
    1. Numuneleri modüler bir doku gömme merkezi (Malzeme Tablosu) ile 60 ° C'de parafine gömün. Onları buz üzerinde soğutun.
  3. Numuneleri bir mikrotom ile 8 μm kalınlığında bölümler halinde kesin (Malzeme Tablosu)18.
  4. Aşağıda açıklandığı gibi deparafinizasyon gerçekleştirin.
    1. 5 dakika boyunca 2x için% 100 ksilene daldırın, ardından 3 dakika boyunca 2 kez% 100 etanole daldırın.
    2. 3 dakika boyunca% 70 etanole daldırın. PBS'de 3 dakika yıkayın.
  5. Aşağıda açıklandığı gibi antijen alımını gerçekleştirin.
    1. 15 dakika boyunca %100 formik aside daldırın. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 2 dakika durulayın.
    2. 120 °C'de 10 dakika otoklavlayın. Doğal olarak soğumasına izin verin.
  6. 10 dakika boyunca% 1 hidrojen peroksiti metanole daldırın. PBS'de 5 dakika yıkayın.
  7. Slaytların üzerine PBS'ye 500 μL %5 yağsız süt ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  8. 500 μL anti-fosforile α-Syn antikorunu (p-α-Syn, 1/10000) PBS'ye slaytların üzerine koyun ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Her biri 5 dakika boyunca PBS ile 2 kez yıkayın.
  9. Üniversal immüno-peroksidaz polimeri, anti-Tavşan (Malzeme Tablosu) ile 25 ° C'de 1 saat inkübe edin. Her biri 5 dakika boyunca PBS ile 2 kez yıkayın.
  10. Üreticinin talimatlarına göre 3,3'-diaminobenzidin (DAB) boyama kitini (Malzeme Tablosu) 5 dakika kullanarak geliştirin.
  11. 1 dakika hematoksilen çözeltisine daldırın (Malzeme Tablosu). Akan suda 10 dakika renkten arındırın.
  12. Montajı aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
    1. 5 dakika boyunca% 70 etanole daldırın. 5 dakika boyunca 2x boyunca% 100 etanole daldırın.
    2. 5 dakika boyunca 2 kez %100 ksilene daldırın. Bir gömme ortamı (Malzeme Tablosu) kullanarak monte edin. Slaytlara 100 μL'lik bir gömme ortamı uygulayın ve bir cam lamel ile örtün.
  13. 20x ve 40x büyütmede Hepsi Bir Arada mikroskop kullanarak görüntüler elde edin (Malzeme Tablosu).

Sonuçlar

Şekil 3, OB'deki α-Syn agregalarının birkaç örneğini göstermektedir. Bu çalışmada tek taraflı burun deliğine α-Syn agregatları uygulandı. İki burun boşluğu nazal septum ile ayrılır ve her OB, koku alma duyu nöronlarını her bir burun boşluğuna ayrı ayrı yansıtır. Bu nedenle, karşı taraftaki OB bir kontrol olarak kullanılabilir.

1 ve 3 ay sonra tedavi edilen taraftaki OB'de P-α-Syn patolojisi gözlenmedi (Şekil 3A, B). Tedavi edilen taraftaki glomerüllerde 6 ve 12 ay sonra Lewy nörit benzeri p-α-Syn agregatları gözlendi. (Şekil 3C,D,F,G). Bu agregalar, kontrol tarafındaki OB'de gözlenmedi (Şekil 3E).

α-Syn patolojisini, α-Syn agregatlarını sayarak veya ImageJ (Table of Materials) kullanarak boyutu vb. inceleyerek tahmin edebiliriz. Örneğin, daha önce bu model20'deki α-Syn toplamlarının sayısını saydık ve raporladık. Tedavi edilen taraftaki OB'de, OB'deki Lewy nörit benzeri agregalar 12 ay boyunca önemli ölçüde artmıştır (tek yönlü ANOVA, ardından Dunnett testi, p < 0.01; Şekil 3H). Kontrol tarafındaki OB'de birkaç α-Syn agregası vardır.

Önceki bir çalışma, fare beynine enjekte edilen PFF'lerin bir hafta içinde bozulduğunu ve endojen fare α-Syn'nin α-Syn agregatlarınadönüştürüldüğünü gösterdi 19. Bu çalışmada, zaman içinde α-Syn patolojisindeki artış, endojen fare α-Syn'in PFF'lerin tek doz intranazal uygulaması ile α-Syn agregatlarına dönüştürüldüğünü göstermektedir. Bu sonuçlar, α-Syn patolojisinin koku alma mukozasından OB'ye yayılabileceğini gösterdi.

figure-results-1
Şekil 1: Fare burun boşluğu uygulama yöntemi. (A) Fare, başı hafifçe aşağı doğru eğik olacak şekilde sırtüstü pozisyonda konumlandırılmıştır. (B) Farenin burun delikleri sarı ok uçlarıyla gösterilir. (C, D) α-Syn fibril çözeltisi farenin burun deliğine (C, kırmızı ok) damlatılır ve hızlı bir şekilde solunur (D, kırmızı oklar). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Bozulmamış koku ampullerini elde etmek için adımların ana hatları. (A) Makas kullanarak kafatası kemiğini sagittal ve lateral olarak kesin (sarı çizgi çizgisi). (B) Koku soğancıkları (OB'ler) üzerindeki kafatası kemiğini tamamen çıkarın. (C) Başınızı ters çevirin ve beyni dikkatlice çıkarın. Beyin sinirlerini kesin. (D) Kafatası kemiğine bağlı koku alma sinirlerini kesin. (E) Sağlam OB'leri olan tüm beyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Koku soğancığının glomerüllerindeki P-α-Syn agregatları. (AG) P -α-Syn (EP1536Y) OB'nin immünohistokimyası (AD) tedavi edilen tarafta intranazal uygulamadan 1, 3, 6 ve 12 ay sonra (sırasıyla 1 m, 3 m, 6 m ve 12 m) ve (E) intranazal uygulamadan 12 ay sonra kontrol tarafında. (C, D) Glomerüllerin etrafında Lewy nörit benzeri iplik benzeri α-Syn agregaları görülür. (F, G) Büyütülmüş görüntüler, Lewy nörit benzeri p-α-Syn'in intranazal uygulamadan 6 ve 12 ay sonra yüksek büyütmeli görüntüleridir. (H) Tedavi edilen ve kontrol taraflarında OB'de Lewy nörit benzeri p-α-Syn birikiminin miktarı (n = 4-5). Grafikler ortalama ± SEM'i göstermektedir. Tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett'in testi; **<0.01. Bu rakam önceki bir rapora göre değiştirilmiştir20. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Daha önceki bir çalışmada, α-Syn agregatlarının makakların burun boşluğuna uygulanması, α-Syn agregatları gözlenmese de, dopaminerjik hücrelerin ölümüne ve substantia nigra'da demir birikimine neden olmuştur21. Prion promotörü α-Syn transgenik farelerin (M83 fareleri) burun boşluğuna 28 gün boyunca A53T insan α-Syn agregatlarının günlük olarak uygulanmasının, beyinlerde α-Syn patolojisine ve farelerde motor semptomlara neden olduğu bildirilmiştir19,22. Bu çalışmada, vahşi tip farelerin burun boşluğuna tek dozda α-Syn agregatlarının uygulanmasının OB'de α-Syn patolojisini indüklediğini gösterdik. Bu basit yöntem, nazal mukozadan OB'ye α-Syn yayılımını araştırmak için değerli kabul edilebilir.

Bu yöntemde α-Syn fibrillerinin yeterli sonikasyonu çok önemlidir, çünkü önceki raporlar parçalanmış α-Syn agregatlarının küçük boyutunun α-Syn patolojisini tetiklemek için en verimli olduğunu göstermiştir23,24. α-Syn fibrillerinin yetersiz sonikasyonu, OB'ye çok az yayılmaya neden olacaktır. Farklı sonikatörler değişen sonikasyon gücüne sahip olduğundan, bu işlemin optimizasyonu gereklidir. α-Syn solüsyonu farenin burun deliklerine uygulandığında farenin sırtüstü duruşu da çok önemlidir. Farenin kafası yükseltilirse, α-Syn çözeltisi akciğerlere ve yemek borusuna akacaktır. Uygun olmayan duruş beklenmedik ölüme veya yetersiz α-Syn yayılımına neden olabilir.

Bu çalışmada i.p. anestezi için MMB kombinasyonlu anestezik ajan kullanmıştır. MMB kombinasyon anestezisinin iyi sedasyon ve analjezi sağladığı ve etkisinin atipamezol23 ile hızla tersine çevrilebileceği bildirilmiştir. İnhalasyon anestezisi, anesteziyi sürdürmek için burun deliklerinin bir maske ile kapatılmasını gerektirdiğinden, α-Syn solüsyonunun intranazal olarak uygulanması daha zordur. Ek olarak, rotenon modeli geniş çapta incelenmiştir ve çok kullanışlı bir modeldir25. Bununla birlikte, ilaca bağlı bir modeldir ve idiyopatik Parkinson hastalığından (iPD) farklı patomekanizmalara sahip olabilir25. Bu model α-Syn yayılımını indüklediğinden, iPD'ye daha yakın olduğuna inanıyoruz.

Çalışmamız ayrıca ekzojen α-Syn agregatlarının burun mukozasından geçebileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, araştırmacılar α-Syn agregalarını kullanarak deneyler yaparken, α-Syn agregalarının solunmasını önlemek için önlemler alınmalıdır. Örneğin, sonikasyon adımı sırasında α-Syn aerosolleri üretilebilir. Bir güvenlik kabini içinde kapalı tip bir sonikatör veya sonikasyon kullanılmasını öneririz. Ek olarak, fareler hapşırabilir ve potansiyel olarak α-Syn aerosolleri üretebilir. Bu riski azaltmak için, tüm işlemler bir güvenlik kabini içinde gerçekleştirilmelidir. Ayrıca araştırmacılar, α-Syn'ye maruz kalmayı önlemek için tek kullanımlık eldivenler, maskeler ve koruyucu gözlükler gibi kişisel koruyucu ekipman kullanmalıdır. Tüm prosedürlerden sonra, yüzey α-Syn ile kirlenmişse, araştırmacıların bir tezgahı ticari deterjanlarla silmeleri gerekir. Önceki raporlar, hem ticari deterjanların hem de SDS'nin agregaları kontamine yüzeylerden ayırdığını göstermiştir26,27.

Bu çalışmada, OB'deki α-Syn patolojisini değerlendirmek için parafin kesitleri kullanıldı, çünkü OB'nin küçük yapısı parafin kesitlerinde donmuş kesitlere göre daha iyi korunmuştur. Bu çalışma, OB'de α-Syn patolojisinin indüklendiğini gösterdi; bununla birlikte, gözlenen α-Syn patolojisi hafif ve sınırlıydı ve çoğunlukla glomerüllerde Lewy nöritleri olarak bilinen iplik benzeri agregatlarla temsil edildi.

Bu çalışmada deney farelerinde belirgin davranış değişikliklerinin gözlenmediğine dikkat edilmelidir. Bu yöntemle indüklenen α-Syn patolojisi, davranış fenotipinde değişiklikleri indüklemek için yetersiz olabilir. Ciddi patoloji ve davranış değişikliklerine yol açan spesifik durumları aydınlatmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Gelecekte, burun mukozasından OB'ye yayılma için daha verimli bir yol oluşturabilirsek, bu basit yöntem, α-Syn yayılımını cerrahi teknik olmadan değerlendirmek için alternatif bir yol sağlar.

Ek olarak, tedavi edilen farelerde kontralateral tarafta OB'yi kontrol olarak kullandık. Bununla birlikte, daha uzun süreli bir takipte anterior koku alma çekirdeğinden veya piriform korteksten kontralateral OB'ye retrograd yayılım meydana gelebilir. Bu durumda, tedavi edilmeyen fareler kontrol olarak kullanıldı.

Bu basit yöntem, nazal mukozadan OB'ye α-Syn yayılımı hakkında değerli bilgiler sağlarken, PH'nin altında yatan mekanizmaları kapsamlı bir şekilde anlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Tüm deneyler Rie Hikawa tarafından desteklendi. Evrak işleri için Yasuko Matsuzawa'ya teşekkürlerimizi sunarız. Bu çalışma JSPS KAKENHI (M.S., No. JP19K23779, JP20K16493 ve JP20H00663).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hepsi Bir Arada Floresan Mikroskobu BZ-X710KEYENCEN/AHepsi Bir Arada mikroskop
Ampisilin Sodyum TuzuNacalai tesque02739-32
Bioruptor IISonicbioBR2006ASu banyosu tipi sonikatör.
Butorphanol tartrateMeiji Seika PharmaWAK-52850
Selüloz tüpMISUMIUC20-32-100
DeepWellMaximizerTAITECMBR-022UPÇalkalayıcı
DynaYetkin Hücreler Zip BL21 (DE3)BioDynamics Laboratory Inc.DS255Yetkili hücre
EntellanSigma-Aldrich107961Mikroskopi için hızlı montaj ortamı
Graefe Ekstra İnce Forseps Kavisli TırtıklıFST11152-10 Forseps
Sertleştirilmiş İnce MakasFST14090-09makas
Histofine Basit leke faresi MAX-PO (R)Nichirei Bioscience414341Evrensel İmmüno-peroksidaz Polimeri, anti-Tavşan
ImageJ ver 1.52pNANAhttps://imagej.net/
innova4200New Brunswick bilimsel9105085İnkübatör çalkalayıcı
İzopropil-β- D-thiogalactopyranosideNacalai tesque19742-94
LB et suyu, LennoxNacalai tesque20066-24
Leica EG 1150 HLeica14 0388 86 108Modüler Doku Gömme Merkezi
Leica TP 1020Leica14 0422 85108Otomatik Doku İşlemcisi 
MedetomidinFuji Film135-17473
Mikrom HM325 Döner MikrotomTermo Bilimsel902100
MidazolamMaruishi Seiyaku4987-211-76210-0
Yeni hematoksilen Tip GMuto65-9197-38Hematoksilen çözeltisi
Damar D tipi için normal kanatlı iğne, 25GTERUMONN2332R25G iğne
Optima TLX UltrasantrifüjBeckman Couler8043-30-1197Ultrasantrifüj
P10 pipetGilsonFA10002P
ParafinLeica39601095
paraformaldehitNacalai tesque30525-89-4
Peroksidaz Leke DAB KitiNacalai tesque25985-50
Pirece BCA Protein Test KitleriThermo Scientific23225BCA testi
pRK172Addgene# 134504Plazmid
Q-Sefaroz Hızlı Akış.cytiva17051001İyon değiştirici reçine

Kaynaklar

  1. Tysnes, O. B., Storstein, A. Epidemiology of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 124 (8), 901-905 (2017).
  2. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nature Rev Neurosci. 2, 492-501 (2001).
  3. Conway, K. A., et al. Acceleration of oligomerization, not fibrillization, is a shared property of both alpha-synuclein mutations linked to early-onset Parkinson's disease: implications for pathogenesis and therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (2), 571-576 (2000).
  4. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
  5. Braak, H., Rüb, U., Gai, W. P., Del Tredici, K. Idiopathic Parkinson's disease: possible routes by which vulnerable neuronal types may be subject to neuroinvasion by an unknown pathogen. J Neural Transm (Vienna). 110 (5), 517-536 (2003).
  6. Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
  7. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  8. Luk, K. C., et al. Pathological α-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  9. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  10. Sawamura, M., et al. Lewy body disease primate model with α-Synuclein propagation from the olfactory bulb. Mov Disord. 37 (10), 2033-2044 (2022).
  11. Uemura, N., et al. Inoculation of α-synuclein preformed fibrils into the mouse gastrointestinal tract induces Lewy body-like aggregates in the brainstem via the vagus nerve. Mol Neurodegener. 13 (1), 21(2018).
  12. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  13. Rey, N. L., et al. Spread of aggregates after olfactory bulb injection of α-synuclein fibrils is associated with early neuronal loss and is reduced long term. Acta Neuropathol. 135 (1), 65-83 (2018).
  14. Uemura, N., et al. α-Synuclein spread from olfactory bulb causes hyposmia, anxiety, and memory loss in BAC-SNCA mice. Mov Disord. 36 (9), 2036-2047 (2021).
  15. Saito, Y., et al. Lewy body pathology involves the olfactory cells in Parkinson's disease and related disorders. Mov Disord. 31 (1), 135-138 (2016).
  16. De Luca, C. M. G., et al. Efficient RT-QuIC seeding activity for α-synuclein in olfactory mucosa samples of patients with Parkinson's disease and multiple system atrophy. Transl Neurodegener. 8, 24(2019).
  17. Stefani, A., et al. Alpha-synuclein seeds in olfactory mucosa of patients with isolated REM sleep behaviour disorder. Brain. 144 (4), 1118-1126 (2021).
  18. Ucciferri, C. C., et al. Scoring central nervous system inflammation, demyelination, and axon injury in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (204), e65738(2024).
  19. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological α-synuclein in brain. Brain. 136 (Pt 4), 1128-1138 (2013).
  20. Sawamura, M., et al. Single-dose intranasal administration of α-syn PFFs induce lewy neurite-like pathology in olfactory bulbs. Parkinsonism Relat Disord. 112, 105440(2023).
  21. Guo, J. J., et al. Intranasal administration of α-synuclein preformed fibrils triggers microglial iron deposition in the substantia nigra of Macaca fascicularis. Cell Death Dis. 12 (1), 81(2021).
  22. Macdonald, J. A., et al. Assembly of α-synuclein and neurodegeneration in the central nervous system of heterozygous M83 mice following the peripheral administration of α-synuclein seeds. Acta Neuropathol Commun. 9 (1), 189(2021).
  23. Abdelmotilib, H., et al. α-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiol Dis. 105, 84-98 (2017).
  24. Tarutani, A., et al. The effect of fragmented pathogenic α-Synuclein seeds on prion-like propagation. J Biol Chem. 291 (36), 18675-18688 (2016).
  25. Taguchi, T., Ikuno, M., Yamakado, H., Takahashi, R. Animal model for prodromal Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 21 (6), 1961(2020).
  26. Bousset, L., Brundin, P., Böckmann, A., Meier, B., Melki, R. An efficient procedure for removal and inactivation of alpha-Synuclein assemblies from laboratory materials. J Parkinsons Dis. 6 (1), 143-151 (2016).
  27. Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Sci Rep. 8, 10788(2018).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Alfa Sin klein AgregatlarOlfakt r BulbusParkinson HastalPrion Benzeri Yay l mFare ModeliOlfakt r Mukozanceden Olu turulmu FibrillerLewy CisimcikleriN rodejeneratif Bozukluk
α-Sinüklein Agregatlarının İntranazal Uygulama Tekniği
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.