Yöntem makalesi

Sağlam ve Yenileyici Aksolotl Ekstremitelerde Kıkırdak Atomik Kuvvet Mikroskobu Ölçümleri

DOI:

10.3791/66946

⸱

11 Ekim 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine III, Center for Healthy Aging, University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden (TUD), 2Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), Center for Molecular and Cellular Bioengineering (CMCB), Technische Universität Dresden (TUD), 3Biotechnology Center, Center for Molecular and Cellular Bioengineering (CMCB), Technische Universität Dresden (TUD), 4Paul Langerhans Institute Dresden, Helmholtz Centre Munich, University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden (TUD)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, aksolotl dokusunun atomik kuvvet mikroskobu (AFM) için nasıl hazırlanacağını ve sağlam ve yenileyici ekstremite kıkırdağında girinti ölçümlerinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekanik kuvvetler, gelişmekte olan dokularda normal hücre fonksiyonu ve patern oluşumu için önemli sinyaller sağlar ve rolleri embriyogenez ve patogenez sırasında geniş çapta incelenmiştir. Nispeten, hayvan rejenerasyonu sırasında bu sinyaller hakkında çok az şey bilinmektedir.

Aksolotl, eksik kıkırdak ve kemik de dahil olmak üzere yaralanmadan sonra birçok organ ve dokuyu tamamen eski haline getirme yeteneği göz önüne alındığında, rejenerasyon çalışması için önemli bir model organizmadır. Omurgalı vücudundaki ana destek dokusu olarak çok önemli rolü nedeniyle, rejenerasyon sırasında iskelet fonksiyonunun yeniden kazanılması, hem eksik yapıların restorasyonunu hem de mekanik özelliklerini gerektirir. Bu protokol, hücre ve doku mekanik özelliklerini yüksek uzamsal çözünürlükte araştırmak için altın standart olan atomik kuvvet mikroskobu (AFM) için aksolotl uzuv örneklerinin işlenmesi için bir yöntemi açıklar.

Aksolotlun rejeneratif yeteneklerinden yararlanan bu çalışma, homeostaz sırasında ekstremite kıkırdağının sertliğini ve ekstremite rejenerasyonunun iki aşamasını ölçtü: doku histolizi ve kıkırdak yoğunlaşması. AFM'nin dinamik doku yeniden yapılandırması ve rejenerasyon sırasında meydana gelen mekanik değişiklikler hakkında bilgi edinmek için değerli bir araç olduğunu gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İskelet, özellikle kıkırdak ve kemikler, omurgalılarda vücudun yumuşak dokuları için ana mekanik desteği sağlar. Bu nedenle, iskelet sistemindeki herhangi bir hasarın, işlevselliği ve hatta hayatta kalmayı büyük ölçüde tehlikeye atması muhtemeldir. İnsanlarda, kemik kırıkları en yaygın travmatik yaralanmalardan biridir1, çoğu birkaç hafta içinde onarılır, ancak bunların %5-10'u iyileşmede gecikmeler yaşar veya hiçbir zaman tam olarak iyileşmez 2,3. Ayrıca, insanlar geniş kemik veya kıkırdak kaybından kurtulamazlar 4,5. Bununla birlikte, bazı semenderler, tam uzuvlar 6 da dahil olmak üzere çeşitli vücut yapılarını yenileyebilirve bu da onları iskelet rejenerasyonu çalışmaları için ideal bir model haline getirir.

Aksolotl (Ambystoma mexicanum), uzuv rejenerasyonunun kapsamlı bir şekilde incelendiği bir semender türüdür. Bu süreç dört ana ardışık ancak örtüşen aşamada gerçekleşir: 1) yara iyileşmesi, 2) iltihaplanma / histoliz, 3) blastema oluşumu ve 4) blastema büyümesi / farklılaşması (7,8'de gözden geçirilmiştir). Amputasyonu takiben, yaralanma bölgesini sınırlayan keratinositler hızla göç ederek yarayı kapatır ve yara epitelini (WE) oluşturur. Takip eden iltihaplanma ve histoliz sırasında, patojenler elimine edilir, döküntüler ve hasarlı hücreler temizlenir ve amputasyon yüzeyinin altındaki hücre dışı matris (ECM) yeniden şekillendirilir9. Doku histolizi, ekstremite rejenerasyonunungerçekleşmesi için gereklidir 10, burada proteolitik enzimlerin salgılanması sadece genel ECM yeniden şekillenmesi için değil, aynı zamanda blastema neden olan hücrelerin serbest bırakılması ve ECM'nin kendisinde tutulan biyoaktif moleküllerin serbest bırakılması için de çok önemlidir8. Aslında, birçok rejeneratif bağlam ve model organizma üzerinde yapılan çalışmalar, histoliz sırasında ECM'nin benzersiz malzeme özelliklerinin, farklılaşma süreçlerini indükleyebildiğini veya hücrelerin yaralanma bölgesine doğru göçünü yönlendirebildiğini göstermiştir (11'de gözden geçirilmiştir). Ayrıca, histolizin geç aşamalarında kalsifiye dokunun rezorpsiyonunun, yeni oluşan ekstremite iskelet elemanlarının uygun entegrasyonu için anahtar olduğu gösterilmiştir12. Histoliz aşamasını takiben, blastema, farklılaşmamış olgun doku hücrelerinden veya yerleşik kök hücrelerden kaynaklanan farklılaşmamış, çok soylu progenitörlerin bir birikimi olarak yara epiteli (WE) altında oluşur. Blastema hücreleri çoğalır ve tüm eksik hücre tiplerine farklılaşır. Son olarak, iskelet dokusunun periskeletal hücrelerden türetilen kondroprogenitörlerin ve transdiferansiye dermal fibroblastlarınyoğunlaşması yoluyla rejenere edildiği ekstremite morfogenezi gerçekleşir 13,14,15.

Hücre kimliği ve ECM bileşimindeki değişiklikleri düzenleyen biyokimyasal ipuçlarının çoğu tanımlanmış olmasına rağmen 10,13,14,16,17,18, uzuv rejenerasyonunun farklı aşamaları sırasında doku mekanik özellikleri ve bunların rejenerasyondaki etkileri büyük ölçüde keşfedilmemiş kalmıştır. Birçok çalışma, hücrelerin kaderlerini ve davranışlarını çeşitli bağlamlarda düzenleyen mekanik ipuçlarını algıladığını ve bütünleştirdiğini göstermiştir (19,20'de gözden geçirilmiştir). Bu nedenle, uzuv rejenerasyonu hakkındaki hücresel ve moleküler bilgimizi doku mekanik ölçümleriyle tamamlamak, bu süreçleri anlamamızı büyük ölçüde geliştirecektir.

Biyolojik numunelerin mekanik karakterizasyonuna ve kuvvet manipülasyonuna izin veren farklı teknikler geliştirilmiştir21. Bu teknikler arasında, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), biyolojik numunelerin viskoelastik özelliklerinin, ultra hassas bir kuvvet sensörü olan AFM konsol22 ile girinti yapılarak yüksek uzamsal çözünürlükte incelendiği mekanobiyolojide altın standart haline gelmiştir. Bu teknik, numune ile doğrudan temas gerektirdiğinden, tipik olarak, bazı durumlarda zor olabilen doku dilimleri oluşturulur. Bu nedenle, fizyolojik koşullara mümkün olduğunca yakın kalabilmesi ve minimum artefaktların oluşabilmesi için hazırlama koşullarının her bir numune için uyarlanması ve optimize edilmesi gerekir23. Bu protokol, AFM kullanılarak, sağlam koşullarda kıkırdaklı dokulara odaklanarak, histoliz sırasında ve kıkırdak yoğunlaşma aşamalarında aksolotl ekstremitelerde doku sertliğinin nasıl ölçüleceğini açıklar (Şekil 1 ve Şekil 2). Bu yöntem diğer doku tiplerinin ölçümü için de genişletilebilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aksolotllar (Ambystoma mexicanum), Dresden Teknoloji Üniversitesi'ne (TUD) bağlı Dresden Rejeneratif Tedaviler Merkezi'nin (CRTD) Axolotl tesisinde yetiştirildi. Hayvancılık koşullarının tam bir açıklaması24'te bulunabilir. Kısaca, odalar 12/12 saat gündüz/gece döngüsü ile 20-22 °C'de tutuldu. Tüm taşıma ve cerrahi prosedürler yerel etik kurul yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Almanya'daki Landesdirektion Sachsen tarafından onaylandı.

Bu çalışmada, tüm deneyler için beyaz (d/d) aksolotllar, vücut pigmentasyonu olmayan (melanoforlar ve ksantoforlar çok az veya hiç olmayan), iridoforlar sadece gözlerin irisinde bulunan, doğal olarak oluşan bir mutant suş kullanılmıştır. Bu çalışmada, cinsiyete özgü önyargı olmaksızın burundan kuyruğa (5-7 aylık) 8-15 cm ölçülerinde aksolotllar kullanılmıştır.

1. Hazırlık

  1. Aksolotlların anestezisi ve ötenazisi için kullanılacak 'luk (a/h) bir benzokain stok solüsyonu hazırlayın (aşağıya bakınız). Bunun için hacimsel bir şişede 50 g benzokain ile 0 etanol ile 500 mL sınırına ulaşılana kadar karıştırın.
  2. % 0.03 (a / h) benzokain stok çözeltisi hazırlayın.
    1. 1 L için, 50 mL 10x Tris tamponlu salin (TBS) ile 30 mL (a/h) benzokain ve 5 mL @00 (a/h) Holtfreter solüsyonlarını 915 mL damıtılmış su ile karıştırın ve gece boyunca manyetik bir karıştırma çubuğu ile karıştırın.
    2. 1 L 10x TBS çözeltisi için 24.2 g Trizma bazı ve 90 g NaCl'yi 990 mL deiyonize su ile karıştırın. Manyetik bir karıştırma çubuğu ile iyice karıştırın. Daha sonra, yaklaşık 10 mL konsantre HCl (12 M veya% 37) ekleyin ve pH 8'e ayarlayın.
    3. 1 L @00 (a/h) Holtfreter çözeltisi için 158.4 g NaCl, 11.13 g MgSO4·7H2O, 5.36 g CaCl2·2H2Ove 2.88 g KCl'yi deiyonize su ile 1 L'ye kadar karıştırın.
  3. % 0.03 (a / h) stok çözeltisini 1: 3 seyrelterek anestezi için tutma tankı suyunda% 0.01 (a / h) çalışan bir benzokain seyreltmesi hazırlayın.
    1. 1 L çözelti için 333 mL benzokain stok çözeltisi artı 666 mL tutma tankı suyu kullanın.
  4. Analjezi için 5 mg / mL'lik bir butorphanol tartrat stok çözeltisi hazırlayın. Bunun için 100 mg butorphanol (+)-tartrat tuzunu 20 mL ultra saf su ile karıştırın. Alikotları 4 °C'de saklayın.
  5. Amputasyonların yapıldığı gün, cerrahi işlemleri takiben hayvan ağrısını azaltmak için 0.5 mg/L butorphanol tartrat çalışma solüsyonunu bekletme tankı suyunda 1:10.000 oranında seyrelterek taze olarak hazırlayınız.
    1. 8 cm'den daha küçük hayvanlar için, 20 μL stok çözeltisini 200 mL tutma tankı suyuna karıştırın.
    2. Daha büyük hayvanlar için, 60 μL stok çözeltisini 600 mL tutma tankı suyuna karıştırın.
  6. % 80 (h / h) PBS çözeltisi olan steril amfibi fosfat tamponlu salin (APBS) hazırlayın ve 800 mL DPBS'yi 200 mL deiyonize su ile karıştırarak oda sıcaklığında (RT) tutun.
  7. 1 mg / mL insülin stok çözeltisi hazırlayın. Bunun için 250 mg insülin tozunu 25 mL HCl 0.1 M ile karıştırın ve eriyene kadar yavaşça çalkalayın. Çalkalarken, çözelti berraklaşana kadar 225 mL APBS ekleyin. Steril filtre ve 4 mL alikotları -20 ° C'de saklayın.
  8. Steril kültür ortamı hazırlayın (tümü % (h/h): b,5 L15 orta, ısıyla inaktive edilmiş FBS, %1 Penisilin / Streptomisin, %1 İnsülin, %1 L-Glutamin) ve kullanım gününe kadar 4 ° C'de tutun. Deney gününde, kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
    1. 400 mL kültür ortamı için 250 mL L15 ortamı, 40 mL ısıyla inaktive edilmiş FBS, 4 mL Penisilin / Streptomisin, 4 mL İnsülin çözeltisi (Adım 1.7'den itibaren), 4 mL L-Glutamin ve 98 mL deiyonize steril su kullanın. Tüm bileşenleri karıştırdıktan sonra steril koşullar altında ve steril bir filtre altında hazırlayın. 15 mL alikot hazırlayın.
  9. APBS çözeltisinde %2,5 ve %3 (a/h) düşük erime noktalı (lmp)-agaroz hazırlayın ve agarozu tamamen çözmek için 70 ° C'de ısıtın. Alikotları 1,5 mL'lik tüplerde hazırlayın ve kullanım gününe kadar 4 ° C'de saklayın.
    1. 20 mL% 2.5 (a / h) lmp-agaroz için, 50 mL'lik bir tüpte 0.5 g lmp-agarozu 20 mL APBS ile karıştırın ve agaroz tamamen eriyene kadar 70 ° C'de bir su banyosunda ısıtın. Çözümün açık ve şeffaf hale gelmesi gerekiyor. Hala sıcakken alikotlar hazırlayın.
    2. 20 mL% 3 (a/h) lmp-agaroz için, 0.6 g lmp-agarozu 20 mL APBS ile karıştırın ve yukarıdaki gibi devam edin.
    3. (İsteğe bağlı): 20 mL %1 (a/h) lmp-agaroz için 0.2 g lmp-agarozu 20 mL APBS ile karıştırın ve yukarıdaki gibi devam edin.
      NOT: Erime süresi lmp-agarozun konsantrasyonuna bağlıdır ve yaklaşık 15-40 dakika arasında değişebilir.
  10. Amputasyon ve doku montajı için parlak alanlı bir stereoskop kullanın.
  11. Amputasyonlar ve doku toplama için 100 mm çapında plastik Petri kapları, forseps, neşter ve cerrahi makasları birleştirin.
  12. İndentasyon ölçümleri için 35 mm çapında plastik Petri kapları hazırlayın.
  13. ~1 cm uzunluğunda ~1 cm çapında silindirler hazırlayın. Bunun için bir karton kesiciyi Bunsen brülör alevi altında ısıtın ve ısıtılmış bıçakla 15 mL'lik bir tüp kesin.
  14. 1 cm'lik küçük2 kare parafilm kesin ve saklayın.
  15. Dondurucuda en az 1 saat bekleterek -20 °C'de metalik veya soğuk bir blok hazırlayın.
  16. Plastik Pasteur pipetleri hazırlayın.
  17. (İsteğe bağlı): Fiksatif MEMFa çözeltisi hazırlayın (3- (N-morfolino) propansülfonik asit [MOPS] 0.1 M pH 7.4, Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N', N', tetraasetik asit [EGTA] 2 mM, MgSO4·7H2O 1 mM,% 3.7 formaldehit). Bunun için 10.465 g MOPS, 0.123 g MgSO4·7H2O, 2 mL 0.5 M EDTA pH 8.0 ekleyin ve 45 mL'ye kadar su ekleyin. Toplam 50 mL hacme 5 mL formaldehit% 37 (a / h) ekleyin.

2. Reaktifler

  1. Bu iş için kullanılan reaktifler için Malzeme Tablosuna bakın, ancak diğer ticari sağlayıcılar da kullanılabilir.

3. Axolotl amputasyonu ve uzuv rejenerasyonu

  1. Tüm deneysel prosedürlerden önce, hayvanı 20 dakika boyunca tank suyunda (adım 1.3) seyreltilmiş %0.01 (a/h) benzokain içinde uyuşturun, böylece hayvanların derinlemesine anestezi altında olduğundan ve dokunsal uyaranlara yanıt vermediğinden emin olun.
  2. Aksolotl'u anesteziden çıkarın ve anestezi içeren su ile nemlendirilmiş bir kağıt mendil içeren 100 mm'lik bir Petri kabının üzerine koyun. Uzvu vücut eksenine dik olarak yönlendirin ve daha iyi görselleştirme için plakayı stereoskopun altına yerleştirin.
    NOT: Burada kompakt kaz boynu lambalı bir stereoskop kullanılmıştır.
  3. Zeugopodial bölgenin (radius/ulna) kalsifiye bölgesinin hemen distalinde keskin bir steril neşter ile uzuv ampute edin (Şekil 1A).
    NOT: 3R hayvan refahı ilkesine bağlı kalarak, başlangıçta amputasyon ile çıkarılan uzuvların sağlam kontroller olarak kullanılması önerilir.
  4. Hayvanı tabağın üzerinde bırakın ve kanın pıhtılaşmasını ve yaranın kapanmasını sağlamak için 15 dakika boyunca benzokain içeren suyla ıslatılmış nemlendirilmiş bir kağıt mendil ile örtün.
  5. Hayvanları analjezikli taze tutma suyu içeren bir tanka geri koyun (butorphanol tartarat, 0.5 mg / L, adım 1.5'ten itibaren).
  6. Ameliyat sonrası analjezik tedaviden 24 saat sonra hayvanları taze tutma suyu içeren orijinal tanklarına taşıyın.
  7. İstenilen ilgi aşamasına kadar hayvanların yenilenmesine izin verin.
    NOT: Analiz edilen uzuvlar, 5 aylık hayvanlarda sağlam faz için amputasyon gününde ve histoliz fazı için amputasyondan 5 gün sonra (dpa) toplandı. Kıkırdak yoğunlaşma aşaması 7 aylık hayvanlarda 21 dpa'da ölçüldü.

4. Ölçümler için doku montajı ve işlenmesi

  1. %2,5 veya %3 (a/h) lmp-agaroz (adım 1.9'dan itibaren) içeren 1,5 mL'lik tüpleri, agaroz tamamen eriyene kadar 70 °C'de bir termoblok üzerinde ısıtın. Tüpleri 37 °C'de farklı bir termoblokla değiştirin ve kullanmadan önce sıcaklığın dengelenmesini bekleyin.
    NOT: Burada, yenilenen dokuları ölçmek için %2.5 lmp-agaroz ve sağlam dokular için %3 kullanılmıştır.
  2. 1 cm uzunluğundaki silindirlerin bir tarafını (adım 1.13'ten itibaren) parafilm parçalarından biriyle (adım 1.14) örtün, böylece altları tamamen sızdırmaz hale gelir.
  3. 15 mL kültür ortamının alikotunu RT'ye dengeleyin (adım 1.8'den itibaren)
  4. Hayvanları en az 20 dakika boyunca anestezik içeren suya (tutma tankı suyunda seyreltilmiş %0.01 (a/h) benzokain) batırarak uyuşturun.
  5. Kantitatif ölçümlere izin veren bir yazılımla uzuvları bir stereoskop altında görüntüleyin. İlgilenilen yapının uzunluğunu ölçün ve ilgilenilen bölüme ulaşılana kadar uzuvun distal ucundan ne kadar doku çıkarılması gerektiğini hesaplayın.
  6. Uzuvları yenilemek için, dirsek hizasında bir neşter ve/veya cerrahi makasla keserek ve uzuvdaki fazla dokuyu inceleyerek toplayın. Bir sonraki adımı hazırlarken dokuyu APBS solüsyonunda bırakın. Düz bir yüzey oluşturmak için kesimin alt kol eksenine çapraz (90°) olduğundan emin olun. Sağlam uzuvlar için, karpal bölgeyi keserek elinizi çıkarın.
  7. Hayvanları en az 20 dakika boyunca öldürücü dozda anesteziye (% 0.1 benzokain) maruz bırakarak ötenazi yapın. Bunun için, %0,1 (a/h) konsantrasyona ulaşmak için gerekli hacimde (a/h) benzokain çözeltisi ekleyin.
    1. Hayvanlar 100 mL% 0.01 (a / h) benzokain çözeltisi içinde anestezi altına alındıysa,% 10 (a / h) benzokain çözeltisinden 900 μL ekleyin.
  8. Uzuvları APBS çözeltisine batırarak durulayın.
  9. Pasteur pipetlerinin ve termoblokun (agaroz alikotları ile 37 °C'de stabilize edilmiş) çalışma istasyonuna yakın olduğundan emin olun. Soğuk bloğu -20 °C dondurucudan çıkarın ve silindiri parafilm kaplı ucu aşağı bakacak şekilde üzerine yerleştirin.
  10. Kesilen uzuvu tutun ve fazla sıvıyı kağıt mendille nazikçe çıkarın. Uzuvu temiz bir tabağa yerleştirin, erimiş lmp-agarozu üstüne ekleyin ve kalan APBS'yi cilt yüzeyinden uzaklaştırmak için uzvu agaroz içinde kısa bir süre hareket ettirin.
  11. Hızlı bir şekilde çalışarak, uzvu silindirin içine yerleştirin ve ilgi alanı yukarı bakacak şekilde dikey olarak yönlendirildiğinden emin olun.
  12. Uzuvu forseps ile nazikçe tutarken, doku tamamen kaplanana kadar silindirin içine lmp-agaroz ekleyin. Agaroz katılaşmadan önce forsepsleri yavaşça çıkarın.
  13. Silindiri soğuk bloktan çıkarın ve agarozun RT'de yaklaşık 30 saniye boyunca tamamen katılaşmasına izin verin.
  14. Doku içeren agaroz bloğunu, RT'de steril kültür ortamı alikotları ve APBS ile birlikte hemen vibratom odasına götürün.
  15. Parafilmi silindirin altından çıkarın ve dokuyu içeren agarozu siyanoakrilat yapıştırıcı ile vibratom aşamasına tutturun. Hem agarozun hem de numunenin sahneye yapıştırıldığından emin olun.
  16. Bölümlere ayırmak için sahneyi APBS'ye daldırın.
    NOT: Sağlam dokular daha sert kemik/kıkırdak içerirken, yenilenen dokular daha yumuşaktır. Bu nedenle, vibratom parametrelerinin buna göre ayarlanması gerekir. Bu çalışmada aşağıdaki parametreler kullanılmıştır: İntakt dokular (amplitüd 1.2 mm ve hız 0.1 mm/s) ve rejenerasyon dokuları (amplitüd 0.9 mm ve hız 0.4 mm/s).
  17. Doku ucuna ulaşılana kadar agarozu kısa adımlarla (ör. 100 μm'lik adımlarla) bölümlere ayırmaya başlayın. Ardından, dokunun distal kısmı (adım 4.5'te hesaplanan) çıkarılana kadar doku bloğunu bölümlere ayırın. Bu şekilde, ilgi alanının enine bir kesitine kolayca erişilebilir olacaktır.
    NOT: Çıkarılan doku bölümü, AFM ile problanan yüzeye hemen bitişik yüzeyi içerecektir ve doku yapısı için bir referans görevi görebilir. Bu nedenle, doğrudan tamamlayıcı analiz için kullanılabilir veya sonraki boyama için sabitlenebilir (bkz. bölüm 6).
  18. Doku içeren bloğu bir tıraş bıçağıyla vibratom aşamasından dikkatlice çıkarın ve tüm tutkal izlerini temizleyin. Bloğu hemen 35 mm'lik plastik bir Petri kabına cerrahi doku yapıştırıcı yapıştırıcı ile yapıştırın ve dokunun tamamen kaplandığından emin olmak için RT'de yaklaşık 2 mL kültür ortamı ekleyin.
    NOT: Agaroz bloğundaki açıkta kalan doku yüzeyi, incelenecek yüzeydir.

5. AFM ile ölçümler

  1. Ölçümlerden en az 1 gün önce konsolu ölçümler için hazırlayın.
    NOT: Bu çalışma için, uçsuz silikon konsollar polistiren boncuklarla (çap 20 μm) işlevselleştirildi ve boncuk-konsol bağı, girinti ölçümleri için kullanılmadan önce en az 1 gün güçlenmeye bırakıldı.
    1. İşlem süresi 5 dakika olan epoksi yapıştırıcı kullanarak boncukları konsollara tutturun.
    2. Konsolu, sonunda küçük bir tutkal damlası oluşacak şekilde tutkal kaplı bir cam sürgün üzerine minimum temasla hızlı bir şekilde indirin ve hemen ardından uygun bir boncukla temas ettirin.
    3. Konsol boncuk temasını bağlı bir boncukla yüzeyden kaldırmadan önce ~ 10 dakika tutun.
  2. Ölçümlerden önce konsolu kalibre edin.
    NOT: Modifiye edilmiş konsol, AFM yazılımının yerleşik prosedürleri kullanılarak termal gürültü yöntemiyle her deney setinden önce kalibre edilmiştir.
  3. Petri kabını doku bloğu (adım 4.18'den itibaren) ve kültür ortamı ile birlikte AFM'nin petri kabı tutucusuna yerleştirin ve parlak alan mikroskobunda bir genel bakış görüntüsü elde edin (Şekil 1B).
    NOT: Girinti testleri için, dik bir ışık mikroskobunun üzerinde bir motor kademesi ile donatılmış bir kurulum kullanılır. AFM başlığını monte edin ve konsolu dokunun üzerine yerleştirin ve konsolu yüzeye yaklaştırın.
  4. Belirli bir ilgi alanını seçin ve bir dizi kuvvet-mesafe eğrisi kaydedin (Şekil 2A).
    NOT: Farklı sertlikteki dokular için ~1-4 μm'lik karşılaştırılabilir girinti derinliklerine ulaşmak için 2-25 nN'lik bağıl kuvvet ayar noktaları, 7.5 μm/s yaklaşma ve geri çekme hızı, 50 μm z uzunluğu, ızgara boyutu 70 μm x 70 μm ve 3 x 3 nokta.
  5. Problanan her bölge için, elde edilen değerleri uzuv bölümündeki her bir belirli bölgeyle ilişkilendirmek için bir parlak alan mikroskobu görüntüsü elde edin.
  6. Tüm numuneler için, doku tipi başına en az 3 farklı bölgeyi araştırın.
    NOT: Tüm olgularda, bu çalışmada kıkırdak merkezinde 4 bölge ve kıkırdak bölgesinin çevresinde 3 bölge ölçüldü ve doku mikroskop altında en fazla 1 saat tutuldu.
  7. Girinti ölçümleri bittiğinde, daha fazla analiz için dokuyu atın veya sabitleyin.
    NOT: Numuneler, ölçümler tamamlandıktan sonra MEMFa çözeltisi içeren 2 mL'lik tüplere yerleştirilerek sabitlendi ve gece boyunca 4 °C'de sabitlendi. MEMFa (aşama 1.17) kullanıldı, ancak PBS'deki formaldehit% 4 (a / h) çözeltisi de kullanılabilir.

6. (İsteğe bağlı) Bitişik doku bölümlerinin işlenmesi

  1. Bitişik doku bölümleri sonraki boyama için kullanılıyorsa, bunları kesitlerden hemen sonra fiksatif içeren 2 mL'lik küçük bir tüpe yerleştirin ve gece boyunca 4 ° C'de sabitleyin.
    1. Aktin hücre iskeleti ve çekirdeklerinin etiketlenmesi yoluyla doku mimarisini ortaya çıkarmak için, fiksatifi çıkarmak için her biri 5 dakika boyunca PBS ile 3 kez yıkayın ve Alexa Fluor 488 konjuge Phalloidin (1:250) ve Hoechst 33258 (1:10000) içeren bir çözelti ile boyayın.
    2. Daha sonra, 37 ° C'de stabilize edilmiş APBS'de (adım 1.9'dan itibaren) %1 (a/h) lmp-agaroz kullanarak lekeli numuneleri cam tabanlı tabakların üzerinde hareketsiz hale getirin. İlgilenilen yüzeyin cama baktığından emin olun. Agaroz katılaştıktan sonra, dehidrasyonu önlemek için numuneleri PBS ile örtün.
      NOT: Sağlam ve histoliz örnekleri, ters konfokal mikroskop (10x büyütme ve 8 μm optik kesitler) ile görüntülenir. Şekil 1C'deki görüntüler, 8 optik bölümün maksimum projeksiyonlarıdır.
  2. Bitişik doku bölümü, taze doku gerektiren (RNA ekstraksiyonu, canlı boyalarla inkübasyon vb.) hemen aşağı akış analizi için kullanılıyorsa, mümkün olan en yüksek doku bütünlüğünü sağlamak için hızlı bir şekilde çalıştığınızdan ve bir hücre kültürü ortamı (adım 1.8'den itibaren) kullandığınızdan emin olun.

7. Veri analizi ve görüntüleme

  1. Görünür Young modülünü hesaplamak için, JPK/Bruker veri işleme yazılımını kullanarak küresel bir girinti için Hertz/Sneddon modelini (Eşitlik 1) kullanarak, Poisson oranının 0,5 olduğunu varsayarak kuvvet-mesafe eğrilerini analiz edin.
    figure-protocol-1(Eşitlik 1)
    Burada R: girinti yarıçapı, E: elastik modül, ν: Poisson oranı, a: girinti ve numune arasındaki dairesel temas alanının yarıçapı, δ: girinti derinliği.
  2. Viskoelastik analiz için, "Hertz modeli Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM) kullanılarak viskoelastisite için düzeltildi" (Paul Müller, https://github.com/AFM-analysis/PyJibe) tarafından yazılmıştır) uzantısıyla PyJibe 0.15.0'daki kuvvet-girinti eğrilerinin yaklaşım kısımlarını analiz edin.25. Uyum fonksiyonu, Abuhattum ve ark.26 tarafından tanımlanan ve Kelvin-Voigt-Maxwell model elemanlarını entegre eden bir modele dayanmaktadır.
    1. Yaklaşma kısmı için bir çizgi (taban çizgisi) ile parça parça uyum ve bir polinom uyum fonksiyonu kullanarak temas noktasını tahmin etmek için kuvvet girinti eğrilerini önceden işleyin.
    2. Kuvvet-girinti eğrilerini "Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM) modeli kullanılarak viskoelastisite için düzeltilmiş Hertz modeli"ne uydurun. Uyumdan, gevşememiş Young modülünü, görünür Young modülünü ve görünür viskoziteyi elde edin. Model ayrıca Maxwell'e gevşeme ve girinti süreleri verir.
      NOT: Analiz edilen birkaç kuvvet girinti eğrisinde (özellikle sağlam doku), Maxwell gevşeme süreleri, girinti süresinden önemli ölçüde daha büyük veya daha küçüktü, bu da sırasıyla oldukça elastik davranışı veya Kelvin-Voigt mekanik davranışını gösterir.
  3. Tüm ölçümleri bir elektronik tabloya aktarın ve doku tipi ve numune başına medyan görünür Young modülünü hesaplayın.
  4. Verileri uygun yazılımla çizin ve istatistiksel olarak analiz edin.
    NOT: Burada GraphPad Prizması kullanılmıştır ve sonuçları açıklarken, çalışma, numune başına medyan görünen Young modülünün ortalama ± SD'sine atıfta bulunur (Şekil 2D-F'de gösterilmiştir).
  5. Fiji maksimum projeksiyon işleviyle yansıtarak konfokal görüntülerden optik kesitler görüntüleyin. Floresan boyamaların en iyi şekilde görselleştirilmesi için her bir kanalın parlaklığını ve kontrastını ayarlayın.
  6. Uygun yazılımla bir şekil paneli oluşturun.
    NOT: Panelleri oluşturmak için Affinity Designer kullanılır ve Şekil 1A'daki model Affinity Designer kullanılarak çizilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda tarif edilen protokolü kullanarak, homeostatik ("Sağlam") koşullarda, erken kıkırdak histolizi ve daha sonraki kıkırdak yoğunlaşma aşamaları sırasında kıkırdaklı aksolotl ekstremite dokularının görünür Young modülünü ölçtük (Şekil 1A). Ayrıca, konsol pozisyonunu gösteren görüntülerde gösterildiği gibi, iskelet elemanlarının merkezi ve çevresi de dahil olmak üzere farklı bölgelerdeki mekanik özelliklerini de araştırdık (Şekil 1B). Doku mimarisini görüntülemek ve sertlik ölçümleri ile ilişkilendirmek için, enine doku kesitleri veya ölçümlerin yapıldığı doku bloğu, sırasıyla Alexa Fluor 488 konjuge Phalloidin ve Hoechst ile aktin filamentleri ve çekirdekleri için sabitlendi ve boyandı (Şekil 1C). Sağlam uzuvlarda, yarıçap ulnadan açıkça daha büyüktür, ancak her iki kıkırdaklı iskelet elemanı da benzer bir morfolojiye sahiptir, merkezde eşit olarak dağılmış yuvarlak çekirdekler bulunur ve perikondriyum24'e karşılık gelen düzleştirilmiş bir çekirdek halkası ile çevrilidir. Histoliz fazı sırasında, iskelet elemanlarının içinde düzensiz ve daha az yoğun paketlenmiş çekirdekler ile doku mimarisinde dramatik değişiklikler tespit edildi. Daha sonraki kıkırdak yoğunlaşma aşamasında, çekirdekler yeni oluşan kıkırdak ve çevresindeki yenilenen dokular arasında net bir sınırlama ile tekrar organize hale gelir. Bununla birlikte, bu aşamada, çoğu çekirdek düzleşir ve merkez ile çevre arasında net bir morfolojik fark yoktur.

Zeugopodial bölgede (radius ve ulna) bulunan her iki iskelet elemanının enine kesitleri ölçüldüğünde, anatomik benzerlikleriyle uyumlu olan medyan değerler sırasıyla 10.95 ± 11.69 kPa ve 15.71 ± 6.49 kPa olan medyan değerler ile sağlam uzuvlarda ayırt edilemeyen belirgin Young modülü tespit edildi (Şekil 2D, solda) (Şekil 1C). İlginç bir şekilde, kıkırdak merkezi ve perifer analizi, sağlam koşullarda, merkezdeki belirgin Young modüllerinin periferden daha yüksek olduğunu ve medyan değerlerin sırasıyla 16.48 ± 6.86 kPa'ya karşı 7.53 ± 4.63 kPa olduğunu gösterdi (Şekil 2E, sol). Amputasyondan sonraki 5. günde, histoliz fazına karşılık gelen, radius ve ulnadaki belirgin Young modülü önemli ölçüde azaldı (sırasıyla 0.03 ± 0.02 kPa ve 0.13 ± 0.09 kPa, Şekil 2D, sağ), ancak aynı zamanda merkez ve çevre arasındaki farklar da ortadan kalktı, medyan Young modülü sırasıyla 0.11 ± 0.07 kPa ve 0.27 ± 0.34 kPa idi (Şekil 2E, sağ). Daha sonraki bir rejenerasyon aşamasında kıkırdak özellikleri analiz edilirken, kıkırdak yoğunlaşmaya başladığında, belirgin Young modülünde önemli bir artış tespit edildi ve sağlam ve histolitik fazlar arasında ara değerlere ulaştı (0.77 ± 0.29 kPa, Şekil 2F).

Verilen örnek eğrilerde (Şekil 2B) görülebileceği gibi, çoğu yaklaşma ve geri çekme eğrisi çifti arasında histerezis meydana geldi ve bu da kuvvet altındaki dokunun viskoelastik bir tepkisini gösterir. Ayrıca, farklı dokuların viskoelastik özelliklerini daha ayrıntılı olarak analiz etmek için yola çıktık. Birden fazla frekansta salınım ölçümleri zaman alıcı ve doku bütünlüğünün korunması açısından biraz kritik olduğundan, özellikle birden fazla doku bölgesini haritalandırırken, Abuhattum ve arkadaşları tarafından daha önce yayınlanmış bir yöntem kullandık. konsol26'nın hemen geri çekilmesinden önce kuvvet-mesafe eğrilerinin yaklaşma kısmının takılmasına izin verir. Model, Kelvin-Voigt Maxwell model elemanlarına dayanmaktadır ve daha önce hücrelerin ve hidrojellerin(26) yanı sıra pankreas dokusunun(27) viskoelastik özelliklerinin analizi için uygulanmıştır. Rejenerasyonun farklı aşamalarındaki dokular için elde edilen medyan gevşememiş modül (Sağlam: 23.05 kPa, Histoliz: 0.20 kPa ve Kondenzan kıkırdak: 1.60 kPa) ve belirgin Young modülü (Sağlam: 17.54 kPa, Histoliz: 0.07 kPa ve Kondenzan kıkırdak: 1.54 kPa) önemli farklılıklar göstermiştir (Şekil 2G-H). Genel olarak, gevşememiş ve görünür elastik modüllerin büyük benzerliği ile yansıtıldığı gibi, seçilen deformasyon oranında dokuların deformasyona baskın olarak elastik bir tepkisi gözlenmiştir (Şekil 2G,H). Histolitik faz (0.72 Pa·s) için sağlam (2.06 Pa·s) ve kondensatör kıkırdak fazlarına (2.32 Pa·s) kıyasla önemli ölçüde daha düşük medyan görünür viskozite değerleri elde edildi (Şekil 2I). Beklendiği gibi, PyJjibe analizinin görünen Young modülü (Şekil 2H), JPK veri işleme yazılımı tarafından elde edilen değerlerle (Şekil 2F) yüksek uyum içindeydi.

Sonuç olarak, mekanik karakterizasyon, rejenerasyon süreci sırasında dinamik doku yeniden yapılanmasını yansıtır. Bu ölçümler, doku mimarisinde gözlenen değişikliklerle birlikte doku sertliğinin azaldığı ve rejenerasyon sırasında yavaş yavaş geri kazanıldığı anatomik gözlemlerle uyumludur (Şekil 1C).

figure-results-1
Şekil 1: Rejenerasyon sırasında aksolotl ekstremite kıkırdağının girinti ölçümleri. (A) Rejenerasyon aşamalarının şematik gösterimi. Kesikli çizgi, ölçümlerin gerçekleştirildiği vibratom tarafından oluşturulan enine kesitin yaklaşık yerini gösterir. (B) Ekstremite kıkırdağında merkez (üst) ve çevre (alt) ölçümlerinin temsili görüntüleri. Siyah uç konsoldur. Ölçek çubuğu: 100 μm. (C) Sağlam uzuvlarda doku mimarisi (solda), histoliz geçiren doku (ortada) ve yoğunlaşan kıkırdak (sağda). Yeşil: çekirdekler (Hoechst), macenta: aktin filamentleri (Phalloidin). Ölçek çubuğu: 500 μm. C' Panelde özetlenen büyütülmüş bölge. Ölçek çubuğu: 100 μm. 70 μm x 70 μm girinti ızgaraları beyaz (orta) ve sarı (çevre) noktalı karelerle gösterilir. B ve C panellerinde, R ve U harfleri sırasıyla Yarıçap ve Ulna'yı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: AFM ile aksolotl ekstremite rejenerasyonu sırasında kıkırdak sertliğinin ölçümü. (A) AFM girinti deneyinin şemaları, zamanın bir fonksiyonu olarak kuvvet (yukarıda) ve girinti ile numune arasındaki mesafenin bir fonksiyonu olarak kuvvet (aşağıda) olarak gösterilmiştir. Yaklaşma ve geri çekme eğrileri sırasıyla mavi ve kırmızı olarak görüntülenir. Temas noktası siyah dikey kesikli bir çizgi ile görüntülenir. Kuvvet-girinti eğrileri, Hertz / Sneddon modeli (JPK veri işleme yazılımı ve Pyjibe) veya Pyjibe'deki viskoelastik KVM model uzantısı kullanılarak eğrinin yaklaşma kısmına sığdırıldı. (B) Histoliz ve yoğunlaşan kıkırdak aşamaları sırasında sağlam ve yenilenen uzuvlarda AFM ölçümlerinden temsili kuvvet-mesafe eğrileri. Analiz edilebilir eğrilerin yüzdesi (yani, artefaktlar olmadan) her eğrinin sağ üst köşesinde gösterilir. (C) Kuvvet-girinti eğrilerindeki tipik artefakt örnekleri, örneğin, girintinin yüzeyle uygun olmayan teması nedeniyle. Gösterilen örnekler sağlam uzuvlara karşılık gelir, ancak her koşulda eşdeğer türde artefaktlar gözlenmiştir. B-C için: Temsili kuvvet-mesafe eğrileri Pyjibe kullanılarak yerleştirildi ve görüntülendi. Açık mavi eğri, eğrinin yaklaşma kısmını gösterir ve açık kırmızı eğri, geri çekme kısmıdır. Daha koyu mavi çizgi, küresel bir girinti için uygulanan Hertz/Sneddon uyumudur. Uyumdan ilgili kalıntılar, alt kuvvet-mesafe eğrileri için aşağıda gösterilmiştir. Çizilen kalıntılar, uygun ve gerçek kuvvet değerleri arasındaki farkı temsil eder. (D) Sağlam uzuvlarda ölçülen ve histoliz geçiren belirgin Young yarıçap ve ulna merkezleri moduli. (E) Sağlam uzuvlarda ve histoliz sırasında Görünür Young'ın kıkırdak merkezinin perifere (Peri) karşı moduli. (F) Analiz edilen rejenerasyon aşamalarında kıkırdak merkezi için ölçülen görünür Young moduli. DF için: Her nokta, başarıyla analiz edilen bir kuvvet-mesafe eğrisinden türetilir ve daha büyük noktalar, numune başına medyan değerlere karşılık gelir. Görünür Young'ın modülleri, JPK Bruker yazılımının Hertz/Sneddon model uyumu kullanılarak elde edildi. (G-I) Gevşememiş modül (G), görünür Young modülü (H) ve görünür viskozite (I), rejenerasyonun analiz edilen aşamalarında kıkırdak merkezi ölçümlerinden PyJibe (KVM uzantısı) kullanılarak hesaplanmıştır. Her nokta, başarılı bir şekilde analiz edilen bir kuvvet-mesafe eğrisinden türetilir. Çizgiler, koşul başına tüm ölçümlerin medyan değerlerine karşılık gelir. D-I için: Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi ile Kruskal-Wallis. Farklı harfler istatistiksel olarak birbirinden farklı koşulları temsil eder (p < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, AFM ile aksolotl ekstremitelerde kıkırdak sertliğinin ölçümü için bir teknik gösteriyoruz. Bununla birlikte, bu yöntem diğer doku tiplerini de araştırmak için genişletilebilir. Başarılı AFM ölçümleri için önemli bir adım, aksolotl numunelerinde özellikle zor olduğu kanıtlanan numune hazırlamadır. Hala agaroz bloğuna gömülü olan doku yüzeyini incelemenin, doku bütünlüğünü korumanın en iyi yolu olduğunu bulduk. Bunun nedeni, aksolotl derisinin epidermisin yüzeyine yüksek düzeyde mukus salgılamasıdır, bu da dilimlenmiş doku bölümünün agaroza stabil bir şekilde gömülmesini önler.

Bazı numuneler, yüksek yapışkanlık gibi ek zorluklar getirebilir. Bu sorunu, özellikle histoliz aşamasındaki, nispeten uyumlu ve yapışkan olan numunelerde yaşadık. Bu numuneler üzerinde, girinti parçasının "pürüzlü" bir görünüme sahip olduğu çoklu kuvvet-mesafe eğrileri de gözlemledik, bu da boncuğun numune yüzeyini sürekli olmayan bir şekilde deforme ettiğini gösteriyor (Şekil 2C), örneğin, yüzeyin gerilme altında vermesi nedeniyle. Bu tür kuvvet-mesafe eğrileri, Hertz-Sneddon modeline uydurulamadıkları için atılmak zorunda kaldı. Yapışmayı azaltmak için, girintinin pasivasyonuyardımcı olabilir 28, yani girinti boncuğunu polietilenglikol (PEG) veya sığır serum albümini gibi yapışkanlığını azaltan maddelerle kaplayarak. Ayrıca, kuvvet-mesafe eğrilerini uydurmak için alternatif modeller kullanılabilir, örneğin JKR (Johnson-Kendall-Roberts) model29. Burada analiz edilen dokular, bitişik doku bölgeleri ve test edilen farklı koşullar için birden fazla büyüklük sırasına sahip elastik modüllerde nispeten büyük farklılıklar gösterdiğinden, bu, tek bir ideal konsol/girinti (yay sabiti/girinti boyutu) seçimini zorlaştırdı. Doku sertliğindeki oldukça büyük varyasyonlar, girinti derinliğini karşılaştırılabilir ve uygun bir aralıkta (girinti çapının yaklaşık %5-25'i) tutmak için uygulanan temas kuvvetinin uyarlanmasını da gerektirdi.

Dokunun mekanik özelliklerini mümkün olduğunca fizyolojik olarak korumak için bir diğer kritik parametre de maksimum doku bütünlüğünün korunmasıdır. Bu, toplandıktan hemen sonra işlenen ve pH stabilize edilmiş bir hücre kültürü ortamı altında uygun bir sıcaklıkta tutulan taze numunelerin ölçülmesiyle sağlandı.

Son zamanlarda, diğer gruplar, alternatif numune işleme yöntemleri30 kullanarak aksolotl iskelet elemanlarında mikro girinti ölçümleri gerçekleştirmiştir. Bununla birlikte, bu deneylerde, doku önceden donduruldu ve yenilenen iskelet parçaları, yerinde ölçmek için çevre dokularından manuel olarak diseke edildi. Ampirik olarak kanıtlanana kadar, bu manipülasyonların kıkırdak dokusu bütünlüğü ve mekanik özellikleri üzerinde bir etkisi olup olmadığı belirsizdir. Semender kasları ve blastemlerin analizleri de bildirilmiştir31,32. Bununla birlikte, bu durumlarda, deri çıkarıldı ve numuneler kesit alınmadı; Böylece, sadece çıkarılan epitelin hemen altındaki yüzeyden bilgi elde edildi. Bu tür bir niceleme doğru olsa da, daha çok kas yan yüzeyi hakkında bilgi sağlar, böylece iç kas katmanlarından gelen mekanik bilgileri göz ardı eder. 20 μm'lik bir girinti kullandık, bu da ölçümlerin bildirilen mikro girinti ölçümleri30,31,32 gibi toplu olarak değil, daha çok hücresel ve hücre dışı ölçekte olduğu anlamına geliyordu. Bu nedenle, hücrelerin gerçekte maruz kaldığı mekanik ipuçlarını yansıtan ve aynı zamanda doku heterojenliğini ortaya çıkaran bir çözünürlük elde ediyoruz (Şekil 2D-I).

Ölçümlerde, sağlam iskelet elemanlarının çevresinde daha düşük belirgin Young modül değerleri tespit edildi, bu da aksolotl perikondriumun kıkırdaktan daha uyumlu olduğunu ima etti. Bununla birlikte, iskelet elemanlarına bitişik dokuların da 70 μm x 70 μm ızgara ayarı nedeniyle sondalandığını göz ardı edemeyiz. Histolitik faz sırasında, bu tür farklılıklar gözlenmedi, bu da aksolotl rejenere uzuvlardaki histolizin kıkırdak, çevresindeki perikondriyum ve komşu dokularda eşdeğer şekilde ilerleyebileceğini düşündürdü. Yarıçap ve ulna benzer bir yapıyı paylaşır, ancak yarıçapın daha büyük bir çapa sahip olması ve ulnanındaha uzun olması gibi önemli anatomik farklılıklara sahiptir 24. Bununla birlikte, tıbbi amaçlı mekanik yüklemeye verdikleri tepkiler dışında, sertliklerinin karşılaştırmalı bir analizi şu ana kadar rapor edilmemiştir33. Burada, sağlam ve yenileyici uzuvlarda bu iki iskelet elemanının enine kesitlerindeki girinti ölçümlerini açıklıyoruz. Aksolotl uzuvlarda radius ve ulnas arasında sertlik açısından önemli bir fark olmadığını gösteriyoruz, bu da insan muadillerinde tespit edilen eşdeğer kemik mineral yoğunlukları ile uyumludur34. Bununla birlikte, özellikle histoliz sırasında, yarıçapta daha düşük Görünür Young modülü eğilimi gözlenmiştir. Bu gözlemin biyolojik olarak önemli olup olmadığını belirlemek için daha fazla sayıda örnek tercih edilir. Bu çalışmada elde edilen verilere dayanarak, koşul başına en az 5 örnek öneriyoruz. Histoliz fazı sırasında, her iki iskelet elemanı da daha uyumlu hale gelir, bu da bu aşamada meydana geldiği açıklanan ECM yeniden şekillenmesi ile uyumludur9. Son olarak, bu çalışmada elde edilen ölçümler, daha sonraki kıkırdak yoğunlaşma fazı sırasında kıkırdak sertliğinin kademeli olarak arttığını göstermektedir. Bu gözlemler, sağlam kemiklerde ve yoğunlaşan kıkırdakta29 yakın zamanda bildirilen girinti ölçümlerinin yanı sıra Brillouin konfokal mikroskobu35 ile kıkırdak mekanik özelliklerinin in vivo değerlendirmesi ile uyumludur.

Toplamda, bu çalışma, aksolotl uzuvlarının mekanik özelliklerini incelemek için değerli bir araç olarak AFM'nin potansiyelini genişletiyor. Bu teknikle, doku mekaniğinin rejeneratif süreci nasıl şekillendirdiğini ve etkilediğini daha iyi anlamak için gen ekspresyonu ve hücre transdiferansiyasyon yörüngeleri16,13 hakkındaki bilgimizi tamamlamayı amaçlıyoruz.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sandoval-Guzmán laboratuvarının tüm üyelerine, bu çalışmanın geliştirilmesi sırasında sürekli destek ve arkadaşlık için teşekkür ederiz. Ayrıca Anja Wagner, Beate Gruhl ve Judith Konantz'a aksolotl bakımına olan bağlılıkları için minnettarız. AFM veri analizi için kodlar sağladığı için Paul Müller'e de teşekkür ederiz. Bu çalışma, TU Dresden'deki CMCB Teknoloji Platformu'nun Işık Mikroskobu Tesisi tarafından desteklenmiştir. AT, Alman Kanser Yardımı (Deutsche Krebshilfe) tarafından finanse edilen Mildred Scheel Erken Kariyer Merkezi Dresden P2'nin bir üyesidir. RA, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) – AI 214/1-1'den bir Geçici PI pozisyonu (Eigene Stelle) tarafından finanse edilmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AffinityTasarımcısı Affinity  Sürüm 1.10.4Figür montajı için
Agarose Low MeltRoth6351.1Numune hazırlama için
Alexa Fluor 488 PhalloidinInvitrogenA12379Dokuyu boyamak için
AxiozoomZeissaltında örnek görüntü almak için
Hayvanları uyuşturmak için
Butorphanol (+)-tartrat tuzSigma-Aldrich  B9156Analjezik olarak
KonsolNanoWorldArrow TL1AFM girinti ölçümleri için
Cellhesion 200 kurulumu bir motorstageJPK/BrukerAFM girinti ölçümleri için
Stereoskop Olympus UC90CellSense Girişi
s Fosfat Tamponlu Salin (DPBS, 1x)Gibco14190-144Vibratom altındaki numuneleri ve kesiti temizlemek için
FIJI (ImageJ2)https://imagej.net/software/fijisürüm 2.9.0/1.53tGörüntü işleme için
GraphPad PrismGraphPad Yazılımı(sürüm 8.4.3)Verileri grafiklendirmek ve istatistiksel olarak analiz etmek
etkisiz hale getirilmiş FBSGibco10270-106 kültür ortamı
Histoakril yapıştırıcı (2-Butil-Siyanoakrilat)BraunNumuneyi petri kaplarına yapıştırmak için
Hoechst 33258Abcamab228550Dokuyu boyamak için
İnsülinSigma-AldrichI5500Hücre kültürü ortamı için
Ters konfokal mikroskopZeiss780 LSMDoku kesitlerini görüntülemek için
Ters konfokal mikroskopZeiss980 LSMDoku kesitlerini görüntülemek için
JPK/Bruker veri işleme yazılımıJPK/BrukerSPM 6.4Kuvvet-mesafe eğrilerini analiz etmek için
L15 ortamı (Leibovitz)SigmaL1518Hücre kültürü ortamı için
L-GlutaminGibco25030-024Hücre kültürü ortamı için
Penisilin/StreptomisinGibco15140-122Hücre için Kültür ortamı
polistiren boncuklar ( 20 & mikro; m çapı); )AFM girinti ölçümleri içinmikroPartiküller
Pyjibe, Paul Mü tarafından yazılmıştır; ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe0.15.0Viskoelastik analiz için
Stereoskop Olympus SX10OlympusSX10Uzuv amputasyonları ve doku montajı için
Stereoskop Olympus UC90OlympusUC90Görüntüleme için
Vibratom LeicaLeica VT 1200SDoku kesiti için
AFM Benzokain Sigma-Aldrich E1501 ile donatılmıştır Dulbecco'da görüntüleme içiniçin Hücre için Isı ile

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mills, L. A., Aitken, S. A., Simpson, A. H. R. W. The risk of non-union per fracture: current myths and revised figures from a population of over 4 million adults. Acta Orthop. 88 (4), 434-439 (2017).
  2. Calori, G. M., et al. Non-unions. Clin Cases Miner Bone Metab. 14 (2), 186-188 (2017).
  3. Nandra, R., Grover, L., Porter, K. Fracture non-union epidemiology and treatment. Trauma. 18 (1), 3-11 (2016).
  4. Nauth, A., Schemitsch, E., Norris, B., Nollin, Z., Watson, J. T. Critical-size bone defects: Is there a consensus for diagnosis and treatment. J Orthop Trauma. 32 (3 Suppl), S7-S11 (2018).
  5. Schemitsch, E. H. Size matters: Defining critical in bone defect size. J Orthop Trauma. 31 (10), S20-S22 (2017).
  6. Joven, A., Elewa, A., Simon, A. Model systems for regeneration: Salamanders. Development (Cambridge). 146 (14), 0-2 (2019).
  7. Aires, R., Keeley, S. D., Sandoval-Guzmán, T. Basics of Self-Regeneration. Cell Engineering and Regeneration. , Springer. Cham. (2020).
  8. Stocum, D. L. Mechanisms of urodele limb regeneration. Regeneration. 4 (4), 159-200 (2017).
  9. Bassat, E., Tanaka, E. M. The cellular and signaling dynamics of salamander limb regeneration. Curr Opin Cell Biol. 73, 117-123 (2021).
  10. Vinarsky, V., Atkinson, D. L., Stevenson, T. J., Keating, M. T., Odelberg, S. J. Normal newt limb regeneration requires matrix metalloproteinase function. Dev Biol. 279 (1), 86-98 (2005).
  11. Godwin, J., Kuraitis, D., Rosenthal, N. Extracellular matrix considerations for scar-free repair and regeneration: Insights from regenerative diversity among vertebrates. International J Biochem Cell Biol. 56, 47-55 (2014).
  12. Riquelme-Guzmán, C., et al. Osteoclast-mediated resorption primes the skeleton for successful integration during axolotl limb regeneration. ELife. 11, e79966(2022).
  13. Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), aaq0681(2018).
  14. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  15. Currie, J. D., et al. Live Imaging of Axolotl Digit Regeneration Reveals Spatiotemporal Choreography of Diverse Connective Tissue Progenitor Pools. Dev Cell. 39 (4), 411-423 (2016).
  16. Qin, T., et al. Single-cell RNA-seq reveals novel mitochondria-related musculoskeletal cell populations during adult axolotl limb regeneration process. Cell Death Differ. 28 (3), 1110-1125 (2021).
  17. Sandoval-Guzman, T., et al. Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species. Cell Stem Cell. 14, 174-187 (2014).
  18. Currie, J. D., et al. The Prrx1limb enhancer marks an adult subpopulation of injury-responsive dermal fibroblasts. Biol Open. 8, bio043711(2019).
  19. Wagh, K., Ishikawa, M., Garcia, D. A., Stavreva, D. A., Upadhyaya, A., Hager, G. L. Mechanical regulation of transcription: Recent advances. Trends Cell Biol. 31 (6), 457-472 (2021).
  20. d'Angelo, M., et al. The role of stiffness in cell reprogramming: A potential role for biomaterials in inducing tissue regeneration. Cells. 8 (9), 1036(2019).
  21. Akhtar, R., Sherratt, M. J., Cruickshank, J. K., Derby, B. Characterizing the elastic properties of tissues. Mater Today (Kidlington). 14 (3), 96-105 (2011).
  22. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1 (1), 41-57 (2019).
  23. El Kirat, K., Burton, I., Dupres, V., Dufrene, Y. F. Sample preparation procedures for biological atomic force microscopy. J Microsc. 218 (3), 199-207 (2005).
  24. Riquelme-Guzmán, C., et al. Postembryonic development and aging of the appendicular skeleton in Ambystoma mexicanum. Dev Dyn. 251 (6), 1015-1034 (2021).
  25. López-Alonso, J., Eroles, M., Janel, S., et al. PyFMLab: Open-source software for atomic force microscopy microrheology data analysis [version 2; peer review: 2 approved]. Open Res Europe 2024. 3 (187), (2024).
  26. Abuhattum, S., Mokbel, D., Müller, P., Soteriou, D., Guck, J., Aland, S. An explicit model to extract viscoelastic properties of cells from AFM force-indentation curves. iScience. 25 (4), 104016(2022).
  27. Glorieux, L., et al. In-depth analysis of the pancreatic extracellular matrix during development for next-generation tissue engineering. Int J Mol Sci. 24 (12), 10268(2023).
  28. Hiratsuka, S., et al. Power-law stress and creep relaxations of single cells measured by colloidal probe atomic force microscopy. Jpn J Appl Phys. 48 (8 PART 3), 08JB17(2009).
  29. Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. Surface energy and the contact of elastic solids. Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).
  30. Kondiboyina, V., Duerr, T. J., Monaghan, J. R., Shefelbine, S. J. Material properties in regenerating axolotl limbs using inverse finite element analysis. J Mech Behav Biomed Mater. 150, 106341(2024).
  31. Calve, S., Simon, H. Biochemical and mechanical environment cooperatively regulate skeletal muscle regeneration. FASEB J. 26 (6), 2538-2545 (2012).
  32. Calve, S., Simon, H. G. Extracellular control of limb regeneration. IUTAM Symposium on Cellular, Molecular and Tissue Mechanics. IUTAM Bookseries. 16, Springer. Dordrecht. 257-266 (2010).
  33. Kaufmann, R. A., Kozin, S. H., Barnes, A., Kalluri, P. Changes in strain distribution along the radius and ulna with loading and interosseous membrane section. J Hand Surg Am. 27 (1), 93-97 (2002).
  34. Martin, A. R., et al. Measurement of distal forearm bone mineral density: Can different forearm segments be used interchangeably. J Clin Densitom. 2 (4), 381-387 (1999).
  35. Riquelme-Guzmán, C., et al. In vivo assessment of mechanical properties during axolotl development and regeneration using confocal Brillouin microscopy. Open Biol. 12 (6), 220078(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

K k rdak RejenerasyonuAksolotl UzvuMekanik zelliklerDoku Sertli iUzuv RejenerasyonuDoku M hendisli iMekanik SinyallerK k rdak KondansasyonuDoku Histolizi

İlgili makaleler