Yöntem makalesi

mRNA ve Protein Analizi için Farelerde Gözyaşı Toplamanın Optimize Edilmesi

2.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66955

⸱

19 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, CINVESTAV Sede Sur

Bu makalede

Özet

Fare modellerinde gözyaşlarından RNA ve protein biyobelirteçlerinin tanımlanması, çeşitli hastalıklarda erken teşhis için büyük umut vaat etmektedir. Bu makale, mRNA'nın etkinliğini ve verimliliğini ve fare gözyaşlarından protein izolasyonunu optimize etmek için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.

Özet

Gözyaşı filmi, sadece oküler yüzeyde değil, aynı zamanda diğer doku ve organlarda da patoloji ile ilişkili moleküler değişiklikleri yansıtabilen oldukça dinamik bir biyosıvıdır. Bu biyosıvının moleküler analizi, hastalıkları teşhis etmek veya izlemek, tıbbi tedavi etkinliğini değerlendirmek ve olası biyobelirteçleri belirlemek için invaziv olmayan bir yol sunar. Sınırlı numune hacmi nedeniyle, gözyaşı numunelerinin toplanması, yüksek kalite ve maksimum verimlilik sağlamak için özel beceriler ve uygun araçlar gerektirir. İnsan çalışmalarında çeşitli gözyaşı örnekleme metodolojileri tanımlanmıştır. Bu makalede, deneysel hayvan modellerinden, özellikle farelerden yırtılma ile ilgili protein bilgilerinin çıkarılması için özel olarak uyarlanmış, optimize edilmiş bir protokolün kapsamlı bir açıklaması sunulmaktadır. Bu yöntem, 2 aylık farelerde gözyaşı üretiminin farmakolojik olarak stimülasyonunu, ardından Schirmer şeritleri kullanılarak numune toplanmasını ve standart prosedürler, SDS-PAGE, qPCR ve dijital PCR (dPCR) yoluyla protokolün etkinliğinin ve verimliliğinin değerlendirilmesini içerir. Bu protokol, çeşitli deneysel paradigmalarda gözyaşı proteini imzasının araştırılması için kolayca uyarlanabilir. Amaç, hayvan modelleri için uygun maliyetli, standartlaştırılmış ve optimize edilmiş bir gözyaşı örnekleme protokolü oluşturarak, insan ve hayvan araştırmaları arasındaki boşluğu doldurmak, translasyonel çalışmaları kolaylaştırmak ve oküler ve sistemik hastalık araştırmaları alanındaki ilerlemeleri hızlandırmaktı.

Giriş

Gözyaşları bir plazma ultrafiltratı olarak kabul edilir ve ayrıca paylaştıkları biyomoleküllerdeki önemli bir örtüşme nedeniyle plazma serumu ile beyin omurilik sıvısı arasında bir ara sıvı olarak tanımlanmıştır1. İnsan gözyaşlarının proteinler, gözyaşı lipitleri, metabolitler ve elektrolitler içerdiği bildirilmiştir2. Son zamanlarda, mRNA'lar, miRNA'lar ve hücre dışı veziküller gibi diğer biyomoleküller de tanımlanmıştır 3,4,5,6,7.

İnsanlarda bazal yırtıklar, üç katmandan oluşan gözyaşı filminde bulunur: gözyaşı yüzeyini pürüzsüz tutan, içini görmemizi ve gözyaşı buharlaşmasını önlememizi sağlayan dış lipit tabakası; gözü nemli tutan, bakterileri uzaklaştıran, korneayı koruyan ve gözyaşı filminin %90'ını oluşturan orta sulu tabaka; ve son olarak, kornea ile temas halinde olan ve gözyaşının göze yapışmasını sağlayan yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerden oluşan bir aile olan müsin tabakası8. Oküler yüzey boyunca yırtık dağılımı, lakrimal bezden salgı ile başlar. Bu sıvı daha sonra göz yüzeyinden geçmek ve drenaj kanallarına akmak için gözyaşı kanallarından geçirilir. Her göz kırpma, gözyaşının tüm göze eşit şekilde dağılmasını sağlayarak gözü nemli tutar9.

Gözyaşı filmi, sadece oküler yüzeyde değil, diğer doku ve organlarda da meydana gelen moleküler değişiklikleri yansıtabilen oldukça dinamik bir biyoakışkandır. Bu biyoakışkandaki diferansiyel ekspresyonun analizi, insan hastalıklarında biyobelirteçlerin keşfi için umut verici bir yaklaşımı temsil etmektedir10,11. Gözyaşı filminin çeşitli patolojilerde erken tanı için bir biyobelirteç kaynağı olarak kullanılması, non-invaziv toplama yöntemlerinin varlığı ile büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. İnsan ve veteriner kliniklerinde gözyaşı toplamak için en yaygın yöntem, kılcal hareket prensibine göre çalışan ve gözyaşlarındaki suyun deneğin alt konjonktival kesesine yerleştirilen bir kağıt test şeridi veya kılcal tüplerin uzunluğu boyunca hareket etmesine izin veren membran bazlı desteği (Schirmer şeridi) içerir 12,13,14. Bu yöntemle küçük bir numune hacmi elde etmenin doğal sınırlamasına rağmen, çeşitli hassas teknikler kullanılarak gözyaşı bileşiminin biyokimyasal analizi, potansiyel biyobelirteç moleküllerinintanımlanmasını kolaylaştırmıştır 11,15. İnsan hastalarda Schirmer şeritlerinden ve kılcal damarlardan gözyaşı proteinlerinin elüsyonunu optimize etmek ve değerlendirmek için protokoller iyi belgelenmiştir16,17. Bununla birlikte, deneysel hayvan modellerinden gözyaşlarıyla ilgili moleküler bilgileri çıkarmak için özel olarak tasarlanmış optimize edilmiş protokollerin tam açıklamaları mevcuttur, ancak azdır. Lakrimal bezin18 doğrudan uyarılması yoluyla gözyaşı indüksiyonu gibi mevcut yöntemler, daha büyük hacimlerin toplanmasına izin verirken, invazivdir ve hayvanlarda rahatsızlığa neden olabilir. Oküler yüzeyden gözyaşı toplamak gibi invaziv olmayan yöntemler, DNA ve miRNA'ları izole etmenin bir yolu olarak tanımlanmıştır19,21.

Bu protokol, farelerde gözyaşlarının toplanması ve işlenmesi için uygun maliyetli ve optimize edilmiş bir yöntem oluşturmayı amaçlamaktadır. Yöntem, SDS-PAGE, qPCR ve dPCR gibi tekniklerle moleküler analiz için uygun yeterli gözyaşı hacimleri elde ederken non-invazivliğe öncelik verir. Ekstrakte edilen protein ve mRNA içeriği bilgisi daha sonra mevcut deneysel hastalık modellerindeki potansiyel biyobelirteçleri tanımlamak için kullanılabilir.

Protokol

Burada açıklanan tüm prosedürler Cinvestav Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (CICUAL, # 0354/23). Laboratuvar hayvanları, derginin hayvan kullanım yönergelerine ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Bildirimi'ne göre sıkı bir şekilde tedavi edildi ve ele alındı. İşlem öncesi ve sonrası oküler sağlık, oküler akıntılar, şişmiş göz kapakları, oküler anormallikler ve davranış değişiklikleri değerlendirilerek değerlendirildi.

1. Hayvanlar ve reaktif hazırlama

  1. Prosedür için replike başına ~ 25 g başlangıç ağırlığına sahip üç adet 2 aylık C57BL / 6 erkek fare kullanın (Şekil 1). Her fareyi ayrı ayrı işleyin ve sıcaklığı korumak için bir ısıtma yastığına yerleştirin.
  2. Gözyaşı sekresyonunu indüklemek için, steril su kullanarak 20 mg / mL'de bir pilokarpin stok çözeltisi hazırlayın.
  3. Schirmer'in test şeritlerini 5 mm uzunluğunda kesin ve her bir şeridi çentikte 90° açıyla bükün.
  4. Bir proteaz inhibitörü ile 250 μL steril su hazırlayın (üretici talimatlarına göre 50 mL için 1 tablet).

2. Gözyaşı üretimi stimülasyonu ve toplanması

  1. Uygun tedavi dozunu hesaplamak için her fareyi ayrı ayrı tartın.
  2. Gözyaşı üretimini uyarmak için, 6 mm'lik bir insülin şırıngası ile intraperitoneal olarak 30 mg / kg pilokarpin uygulayın (Şekil 1B). Etkilerinin ortaya çıkması için ilaç enjeksiyonundan 2 dakika sonra bekleyin.
    NOT: Gözyaşı sıvısının sınırlı mevcudiyeti nedeniyle uyarılmamış hayvanlardan veri elde edilememiştir.
  3. Her bir Schirmer şerit parçasının ucunu bir cımbızla alt göz kapağının ortasına yerleştirerek gözyaşlarını toplayın ve yırtık şerit sınırına ulaşana kadar yerinde tutun (Şekil 1C). Ardından şeridi değiştirin. Toplama için şeritler arasında 2 dakikalık bir aralık olacak şekilde her göze sırayla 2 Schirmer şeridi yerleştirin. Gözyaşı toplama işlemi, fare başına 10 dakikadan fazla yaklaşık dört şerit parçası gerektirir.
  4. Bileşenlerin bozulmasını önlemek için Schirmer şerit parçalarını buz üzerindeki steril tüplere yerleştirin. Toplama işlemi biter bitmez gözyaşı işlemine başlayın.

3. Protein izolasyonu

  1. Şerit parçalarını, bir proteaz inhibitörü ile 20 μL steril su içeren 600 μL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve daha önce gösterildiği gibi 4 ° C'de 600 x g'de 1 saat santrifüjleyin17 (Şekil 1D).
  2. Numuneyi içeren 7.5 μL'lik tüpün ucunda 600 cm'lik paslanmaz çelik enjektör iğnesi kullanarak bir delme işlemi yapın (Şekil 1E). Daha sonra, bu delinmiş tüpü yeni bir sterilize edilmiş 1.5 mL tüpe aktarın ve seyreltilmiş gözyaşı hacmini geri kazanmak için numuneleri daha önce bildirildiği gibi 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin 17. Gözyaşı filmi hacmi (süpernatant) tüpün altında olacaktır.
  3. Tüm örneklerden elde edilen süpernatanı birleştirerek bir protein havuzu oluşturun. Bu deneyde yaklaşık 200 μL'lik bir toplam hacim elde edilmiştir.
    NOT: Gözyaşı üretimi 1 saatten fazla sürebilir. Bu süre zarfında, gözyaşları hala toplanabilir.
  4. Bradford standart yöntemini22 kullanarak gözyaşı havuzunun toplam protein içeriğini ölçün.

4. SDS-PAGE analizi

  1. Proteinleri denatüre etmek için protein örneklerini 99 °C'de 4 dakika ısıtın. Bileşenleri karıştırmak için numuneleri kısaca vorteksleyin.
  2. Her numuneden 30 μg kantitatif protein içeriğini %10'luk bir SDS-PAGE jele (Tablo 1) yükleyin ve numuneleri standart bir yöntem23 kullanarak 2 saat boyunca 90 V'ta çalıştırın.
  3. Elektroforezden sonra, jeli boyama solüsyonu ile örtün (Tablo 1) ve proteinleri boyamak için 30 dakika inkübe edin.
  4. Arka plan netleşene ve protein bantları görünene kadar jeli leke giderici solüsyonla birkaç kez durulayın.
  5. Bir jel dokümantasyon sistemi ile görüntüler elde edin.

5. qPCR ve dijital PCR için mRNA izolasyonu

  1. Şeritleri 20 μL steril su içeren 600 μL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Numuneyi içeren tüpün ucunda bir delik açın, yeni bir sterilize edilmiş 1.5 mL'lik tüpe koyun ve daha önce insan gözyaşlarında3'te bildirildiği gibi santrifüjleyin, 4 ° C'de 2.000 x g'da 20 dakika boyunca (Şekil 1E-H).
  2. Tüm örneklerden bir havuz oluşturun. Bu deneyin geri kazanılan hacmi, her fare için yaklaşık 22 μL süpernatant, yani 66 μL toplam hacimdi. Biyomolekül bozulmasını önlemek için tüpleri kuru buzun üzerine yerleştirin.
  3. 200 μL monofazik fenol ve guanidinyum izotiyosiyanat çözeltisi (ticari olarak elde edilir) ekleyin ve pipetleme ile homojenize edin. Oda sıcaklığında 5 dakika bekletin. Bu adımda, numuneler -20 °C'de birkaç hafta veya -70 °C'de birkaç ay saklanabilir.
  4. 40 μL kloroform ekleyin ve 15 saniye boyunca bir girdapta karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika bekletin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
  5. Sulu fazı (interfazı almadan) dikkatlice yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
  6. 100 μL izopropanole 0,5 μL glikojen (0,05 μg/μL) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Glikojen, RNA ile birlikte çökeltilir ve sonraki adımlara müdahale etmez.
  7. -20 °C'de 10 dakika bekletin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı hızla boşaltın.
  8. 200 μL soğuk %75 etanol ekleyin ve RNA peletini girdaplama ile yeniden süspanse edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 8.000 x g'da santrifüjleyin.
  9. Etanolü boşaltın. Tüpü ters çevirmeden 20-30 dakika kurumaya bırakın. 20 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve tekrar süspanse edin.
  10. RNA'nın saflığını değerlendirmek için mikrohacim spektrofotometresindeki optik yoğunluğu 260 nm ve 280 nm'de okumaya devam edin. Numuneler buz üzerinde olmalıdır.
    NOT: Ribozomal bantlar 28S ve 18S, numunenin doğası gereği bir agaroz jel kullanılarak gözlemlenemez. MiRNA'lar veya mRNA'lar gibi diğer RNA'ların varlığı, daha önce gösterildiği gibi bir biyoanalizör kullanılarak analiz edilebilir18.
  11. Üreticinin protokolüne göre ticari bir kit kullanarak gözyaşı RNA'sından cDNA'yı sentezleyin.
    1. 10 ng-5000 ng aralığında bir giriş RNA'sı ile başlayın; kullanılan kite göre 1 μL Oligo (dT) ve 12 μL'ye kadar RNaz içermeyen su ile karıştırın. 30 saniye boyunca 500 x g'da döndürün ve 65 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
    2. Karıştırma tüpüne 4 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL RNaz inhibitörü, 2 μL dNTP karışımı ve 1 μL ters transkriptaz ekleyin.
    3. Karışımı aşağı çekmek için tüpü 30 saniye boyunca 500 x g'da döndürün. Daha sonra tüpü 42 °C'de 60 dakika inkübe edin. Tüpü 70 °C'de 10 dakika inkübe ederek reaksiyonu bitirin.
  12. Gözyaşlarındaki düşük mRNA konsantrasyonu nedeniyle, qPCR24 için seyreltilmemiş cDNA kullanılması önerilir. Bu deney için 150 ng cDNA kullanıldı. DNMT3a primerlerini kullanarak qPCR gerçekleştirin:
    İleri: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, Geri: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA ve GAPDH primerleri:
    İleri: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCTTA, Geri: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC üreticilerin ve ekipman prosedürlerinin talimatlarını izleyerek.
    1. qPCR döngüsü için aşağıdaki programı kullanın: İlk denatürasyon: 10 dakika boyunca 95 °C, ardından 45 döngü C 95 ° C - 15 s, 60 ° C - 30 s ve 72 ° C - 30 s, 72 ° C'de 5 dakika boyunca son bir uzatma ile sona erer.
    2. Reaksiyonda primer dimerlerin veya spesifik olmayan amplikonların varlığını değerlendirmek için bir erime eğrisi analizi yapın. Sıcaklık rampası 50 °C'den son 99 °C'ye kadar başladı, ilk adım için 90 sn ve her adım arasında 5 sn bekletme ile.
    3. dPCR25 için, ilgilenilen mRNA'yı tespit etmek için gereken cDNA miktarını optimize etmek için seri seyreltmeler gerçekleştirin. Bu deneyde, nükleaz içermeyen suda aşağıdaki cDNA dilüsyonlarını kullanın: 150 ng, 75 ng, 37.5 ng ve 18.75 ng cDNA. Daha önce bahsedilen DNMT3a için astarlar kullanıldı. dPCR döngüsü için aşağıdaki programı kullanın: ilk denatürasyon: 2 dakika boyunca 95 °C, ardından 95 °C - 15 s ve 60 °C - 30 s'lik 40 döngü.

Sonuçlar

Bu yazıda açıklanan protokol, çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında yaygın olarak bulunan teknikleri kullanarak gözyaşı sıvısından moleküler bilgi elde etmek için kolay ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar. Ayrıca, enzimatik aktivite tespiti için ELISA gibi son derece hassas teknikler kullanılarak protokol ölçeklendirilebilir.

Bu işlemlerden sonra toplam protein verimi yaklaşık 3-4 μg/μL idi. Toplam protein ekstraktlarının Coomassie ile boyanmış SDS sayfası analizi, toplam retina ve gözyaşlarında protein ekspresyon paternlerini ortaya koymaktadır (Şekil 2A).

İzole edilmiş RNA, 1.9 ile 2.0 arasında 260/280 UV absorpsiyon oranına sahipti. Ortalama verim 134.8 ng/μL idi. qPCR, bir temizlik geni (gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz, GAPDH)3 ve varsayılan bir biyobelirteç geni (DNA-metil transferaz 3a, DNMT3a)26 için primer setleri kullanılarak gerçekleştirildi. Seyreltilmemiş bir cDNA örneği 1: 1 (150 ng) kullanıldı.

Erime eğrisi analizi yapıldı ve qPCR yazılımında Ct oranları hesaplandı. Tüm deneyler iki kez yapıldı. Analiz, numunedeki hedef mRNA'nın başlangıç miktarı için uygun bir aralık olan 20 ile 24 arasında Ct değerlerini ortaya çıkardı (Şekil 2B). Bununla birlikte, Şekil 2C'deki erime eğrisi analizi, hedef mRNA'nın düşük varlığını göstermektedir. Bununla birlikte, %2'lik agaroz jeli, beklenen boyutta amplikonların varlığını doğruladı (Şekil 2D).

dPCR, DNMT3a için aynı primer seti çifti kullanılarak gerçekleştirildi. Kullanılan cDNA örneklerinin seyreltilmesi 1: 1 (150 ng), 1: 2 (75 ng), 1: 4 (37.5 ng), 1: 8 (18.75 ng) idi. Tüm deneyler iki kez yapıldı. dPCR, seyreltilmemiş numunede 1.33 kopya/μL'den, 8 kat seyreltilmiş numunede 0.45 kopya/μL'ye kadar tespit edebildi (Şekil 3A,3B). Bu nedenle, dPCR, qPCR'ye kıyasla gözyaşlarında bulunan hedef mRNA'ya karşı artan bir duyarlılık gösterdi.

figure-results-1
Şekil 1: Farelerden gözyaşı ekstraksiyon protokolünün şeması. (a) Gözyaşı toplama. Üç adet 2 aylık C57BL / 6J faresi kullanıldı. (B) Gözyaşı üretimi, pilokarpinin intraperitoneal uygulamasıyla farmakolojik olarak indüklenmiştir. Schirmer şeridinin yerleşimini gösteren fotoğraf. (c) Yırtılma İşleme. Gözyaşları daha sonra 10 dakika boyunca Schirmer şeritleri kullanılarak toplandı ve mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı. (D) Schirmer şeritlerinde toplanan gözyaşları, steril su ve proteaz inhibitörleri veya sadece steril su ile santrifüj edildi. (E, F) Bu tüpler altta delinmiş ve daha sonra sıvı elusiyonunu kolaylaştırmak için yeni bir sterilize edilmiş 1.5 mL tüpe aktarılmıştır. (G, H) Gözyaşları 1.5 mL'lik tüpte toplanır. (I) Gözyaşı toplama prosedürünün temsili fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Moleküler uygulamalar için gözyaşı filminin aşağı akış analizi. (A) Fare gözyaşlarının SDS-PAGE'i ve bir retinal protein ekstraktı. MW: Moleküler ağırlık belirteci.; şerit 1: Retinanın protein profilleri (30 μg); Şerit 2: Gözyaşının protein profilleri (30 μg). (B) Fare gözyaşlarında GAPDH ve DNMT3a için qPCR. Ortalama BT ve ΔCT Tablo 2'de gösterilmiştir. (C) DNMT3a ve GAPDH PCR ürünleri için erime eğrisi analizi. Y ekseni, amplifikasyon reaksiyonundaki (dF/dT) floresan değişim hızını temsil eder ve x ekseni, °C cinsinden sıcaklığı temsil eder (D) 0.5 μg/mL etidyum bromür içeren %2 agaroz jel elektroforezinde PCR amplikonunun analizi. Şerit M: 1 kb Artı DNA Merdiveni. Şerit 1,2: Sırasıyla GAPDH ve DNMT3a PCR amplicon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Fare gözyaşlarında DNMT3a ekspresyonu için dijital PCR (dPCR). (A) dPCR sonuçları, DNMT3a transkript kopyalarının mavi noktalarla gösterildiği bir 1D dağılım grafiği olarak görüntülenir. Siyah noktalar, DNMT3a transkript kopyaları bulunmayan bölümlerdir. (B) DNMT3a transkript kopyalarını ölçmek için optimal konsantrasyonu belirlemek için bir seyreltme cDNA serisi oluşturuldu. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Malzemenin AdıAçıklama
SDS JelBir ayırma jeli için: 3.8 mL damıtılmış H2O; 2.6 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 3.4 mL akrilamid; 100 μL SDS; 100 μL APS; 4 μL TEMED.
Bir toplama jeli için: 2.72 mL damıtılmış H2O, 0.52 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.68 mL akrilamid, 40 μL SDS, 40 μL APS 4 μL TEMED.
Elektroforez Tamponu250 mM Tris baz, 2 M Glisin, %1 SDS
Boyama ÇözeltisiAşağıdaki reaktifleri 43 mL su içinde çözün (oda sıcaklığında amber bir şişede saklayın): Coomassie 0.25 g; asetik asit 7 mL; metanol 50 mL
Leke çıkarma çözümüAşağıdaki reaktifleri 63 mL suda çözün (oda sıcaklığında saklayın): asetik asit 7 mL; etanol 30 mL

Tablo 1. SDS-Page için ayarlayın.

Gen adıCT1 (Radyo Frekansı)CT2 (Radyo Frekansı)SD ile ortalamaΔCT
GAPDH20.1420.7320.44±0.17
DNMT3a24.5924.9724.78±0.074.35

Tablo 2. Farelerin gözyaşlarında DNMT3a ve GAPDH'nin Ct değerleri.

Tartışma

Gözyaşı sıvısına kolayca erişilebilir ve gözyaşlarındaki biyobelirteçlerin belirlenmesi, çeşitli insan hastalıklarının erken teşhisi için başarılı bir tamamlayıcı teknik olarak kullanılabilir27. Deneysel hayvan modellerinde gözyaşı bileşiminin biyokimyasal analizi bu yaklaşımı tamamlar ve hastalıkların moleküler temelini anlamada önemli ilerlemeler vaat ederken, mevcut veri ve protokollerin kıtlığı vardır ve bu da bizi bir tane geliştirmeye yöneltmiştir. Bu raporda açıklanan yöntemin gerçekleştirilmesi teknik olarak basittir ve hastalıkla ilişkili farklı aday moleküllerin diferansiyel ekspresyonunun ön tanımlamasına izin verir.

Yırtık toplama, kılcal borular ve Schirmer şeritleri16,17, swablar 28 ve süngerler29 gibi çeşitli yöntemlerlesağlanabilir. Schirmer şerit yöntemi, erişim kolaylığı, kantitatif yetenekleri, numune toplama sırasında uyarlanabilirliği, maliyeti ve laboratuvar işlemleri için gözyaşı bileşenlerinin çıkarılmasındaki basitliği nedeniyle tercih edilmiştir. Ek olarak, bu yöntem uygun maliyetlidir, minimal invazivdir ve kağıt filtre şeridinin16,17 bileşimi sayesinde korneada yaralanma veya hasar riski oluşturmaz. Bu protokolün kritik adımları, pilokarpin kullanılarak gözyaşı üretiminin farmakolojik olarak uyarılması ihtiyacını ve uygun bir elüsyon tamponunun seçimini içerir.

Pilokarpin, M3 muskarinik reseptörlerine bağlanan ve ekzokrin bezlerinin farmakolojik stimülasyonuna, gözyaşı üretimini, tükürük salgısını ve idrara çıkmayı artırabilen kolinerjik bir agonisttir. İnsanlarda yapılan çalışmalar, gözyaşı stimülasyonunun toplanan sıvınınozmolaritesini değiştirmediğini gösterse de 30, protein profillerini31 açıkça etkiler. Pilokarpinin ekzokrin bezlerin kolinerjik farmakolojik uyarıcısı ve gözyaşı sekresyonu arttırıcı olarak kullanımı tavşanlarda ve farelerde başarılı bir şekilde bildirilmiştir 19,32,33, ancak stimülasyonun protein içeriği üzerindeki etkisi değerlendirilmemiştir. Bu sınırlamayı önlemek ve deneysel koşullar arasında yırtılma profillerinin doğru bir şekilde karşılaştırılmasına izin vermek için, özel toplama ayarlarını dikkate almak çok önemlidir. Benzer şekilde, gözyaşı toplamadan önce bir durulama adımının uygulanması, göz yüzeyinin önceden kirlenmesini önlemek için faydalı olabilir. Bu protokolde 30 mg / kg pilokarpin konsantrasyonu kullanılmıştır13. Bu ilacın enjeksiyonundan sonra fareler hareketsiz ve sakin kaldığından, gözyaşları herhangi bir anestezi olmadan toplandı ve örnek toplamayı kolaylaştırdı.

Uygun bir elüsyon tamponunun seçimi, bir gözyaşı numunesinin biyokimyasal bileşimini ve şeritten biyolojik materyalin geri kazanım oranını analiz etmek için seçilen yöntemle yakından ilgilidir. Örneğin, hastalarda Schirmer şeritlerinden protein tutulmasına odaklanan karşılaştırmalı bir çalışmada, %0.25 Nonidet P40 (NP40) ile birlikte 100 mM amonyum bikarbonat içeren bir tamponun proteomik veya multipleks ELISA analiz uygulamaları için üstün sonuçlar verdiği tespit edilmiştir17. Elimizde, steril su kullanımının, SDS-PAGE'deki toplam protein ekstraktlarını görselleştirmek ve PCR ile ilgilenilen genlerin mRNA'sını tespit etmek için yeterli olduğu kanıtlanmıştır.

Fare gözyaşlarında DNMT3a ve GAPDH mRNA'nın varlığını değerlendirmek için qPCR ve dPCR'nin performansını karşılaştırdık. qPCR erime eğrisinde gözlenen primer dimerlerin varlığı, DNMT3a transkriptinin düşük bolluğuna bağlanmaktadır. Gösterildiği gibi, dPCR, seyreltilmemiş ve seyreltilmiş numunelerde bu numunelerde hedef mRNA'yı tespit etmede önemli ölçüde daha fazla duyarlılığa ve etkinliğe sahiptir. Bu hassas tespit yeteneği, dPCR'yi farelerde yırtılma analizi için tercih edilen yöntem haline getirerek araştırmacılara ve klinisyenlere gelecekteki çalışmalar ve potansiyel klinik uygulamalar için güvenilir bir araç sunar.

Hayvan modellerinde gözyaşı örneği toplanması için standartlaştırılmış bir protokolün geliştirilmesi, araştırmada önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Bu protokol sadece gözyaşı örneklerinin sistematik ve hassas bir şekilde toplanmasını kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda çeşitli çalışma alanlarında uygulamaları için çok çeşitli olanaklar sunar. Hayvan modellerinden gözyaşı örnekleri elde etme yeteneği, geniş bir hastalık ve durum yelpazesinin araştırılmasının yanı sıra yeni biyobelirteçlerin ve potansiyel tedavilerin araştırılmasına olanak tanır. Ayrıca, standartlaştırılmış bir protokol oluşturularak, sonuçların farklı çalışmalar ve laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği teşvik edilmekte ve böylece araştırmanın geçerliliğine ve güvenilirliğine katkıda bulunulmaktadır. Sonuç olarak, hayvan modellerinde gözyaşı örneği toplama metodolojisindeki bu ilerleme, önemli keşifleri teşvik etme ve çeşitli hastalıkların patofizyolojisinin anlaşılmasını geliştirme, teşhis, tedavi ve önleme için yeni yollar açma potansiyeline sahiptir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, VELUX STIFTUNG [proje 1852] tarafından M.L.'ye ve CONAHCYT'den M.B.'ye (836810), E.J.M.C. (802436) ve AMF'ye (CVU 1317418) lisansüstü burs hibeleri ile desteklenmiştir. Laboratuvarın tüm üyelerine, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento'ya ve Departamento de Farmacobiología'ya (Cinvestav) teşvik edici tartışmalara katkılarından dolayı içten teşekkürlerimizi sunarım.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-merkaptoetanolGibco1985023
2x Laemmli tamponuBiyo-Rad16-0737
Asetik asitQuimica Meyer64-19-7
AkrilamidSigma-AldrichA4058 Serisi
Bradford ReaktifiSigma-AldrichB6916 (İngilizce)
KloroformSigma-Aldrich1003045143
Coomassie Mavi R 250ABD Biyolojik6104-59-2
EtanolQuimica Rique64-17-5
GeneRuler 1kb artı DNA MerdiveniThermofisher bilimselSM1331 Serisi
GliserolABD BiyolojikG8145 Serisi
GlisinNOEL BABA CRUZSC- 29096
GlikojenRoche10901393001
HclQuimica Rique7647-01-0
İzopropil alkolQuimica Rique67-63-0
MetanolQuimica Meyer67-56-1
Mikro tüpler 1,5 mlAxygenMCT-150-C
Mikro tüpler 600 &mikro; lAxygenMCT-060-C
NaClSigma-AldrichS3014 Serisi
PCR tüpleri ve ŞeritNovasbio HakkındaPCR 0104
PilokarpinSigma-AldrichP6503-10g
Proteaz inhibitörüRoche11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kiti (5 mL)Qiagen250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-oyuklu (10)Qiagen250001
Gerçek qPlus 2x Master Mix YeşilAmpliqonA323402
RevertAid İlk Strad cDNA Sentez KitiThermofisher bilimselK1622 Serisi
Schirmer'in test şeritleriSantgar LaboratuvarıSANT1553
SDSSigma-AldrichL3771 Serisi
TEMEDSigma aldrich102560430
TRI reaktifiSigma-AldrichT9424-200MLmonofazik fenol ve guanidinyum izotiyosiyanat çözeltisi
TrisABD BiyolojikT8650 Serisi
Tris tabanıKimya CruzSC-3715A

Kaynaklar

  1. Ravishankar, P., Daily, A. Tears as the next diagnostic biofluid: A comparative study between ocular fluid and blood. Appl Sci. 12 (6), 2884(2022).
  2. Masoudi, S. Biochemistry of human tear film: A review. Exp Eye Res. 220, 109101(2022).
  3. Dara, M., et al. Novel RNA extraction method from human tears. Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).
  4. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  5. Arslan, M. A., et al. Expanded biochemical analyses of human tear fluid: Polyvalent faces of the Schirmer strip. Exp Eye Res. 237, 109679(2023).
  6. Liu, R., et al. Analysis of th17-associated cytokines and clinical correlations in patients with dry eye disease. PloS one. 12 (4), e0173301(2017).
  7. Cross, T., et al. Rna profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390(2023).
  8. Paranjpe, V., Phung, L., Galor, A. The tear film: Anatomy and physiology. Ocular Fluid Dyn: Anat, Physiol, Imaging Tech, and Math Model. , 329-345 (2019).
  9. Jung, J. H., et al. Proteomic analysis of human lacrimal and tear fluid in dry eye disease. Sci Rep. 7 (1), 13363(2017).
  10. Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers. J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).
  11. Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).
  12. Pieczynski, J., Szulc, U., Harazna, J., Szulc, A., Kiewisz, J. Tear fluid collection methods: Review of current techniques. Eur J Ophthalmol. 31 (5), 2245-2251 (2021).
  13. Shiraki, T., Shigeta, M., Tahara, N., Furukawa, H., Ohtsuka, H. A tear production assessment by using Schirmer tear test strips in mice, rats and dogs. Animal Eye Res. 24 (1-2), 1-5 (2005).
  14. Zhao, J., Nagasaki, T. Lacrimal gland as the major source of mouse tear factors that are cytotoxic to corneal keratocytes. Exp Eye Res. 77 (3), 297-304 (2003).
  15. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  16. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  17. Koduri, M. A., et al. Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer's strips in dry eye disease. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).
  18. Kakan, S. S., et al. Tear miRNAs identified in a murine model of sjogren's syndrome as potential diagnostic biomarkers and indicators of disease mechanism. Front Immunol. 13, 833254(2022).
  19. Moore, M., Ma, T., Yang, B., Verkman, A. Tear secretion by lacrimal glands in transgenic mice lacking water channels aqp1, aqp3, aqp4 and aqp5. Exp Eye Res. 70 (5), 557-562 (2000).
  20. Balafas, E., et al. A noninvasive ocular (tear) sampling method for genetic ascertainment of transgenic mice and research ethics innovation. OMICS. 23 (6), 312-317 (2019).
  21. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals mir-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  23. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  24. RealQPlus2x Master Mix Green without ROX. Ampliqon. , Available from: https://ampliqon.com/en/pcr-enzymes/pcr-enzymes/real-time-pcr/realq-plus-2x-master-mix-green (2023).
  25. Qiagen. Quick-Start Protocol QIAcuity EG PCR Kit. Qiagen. , (2023).
  26. Anier, K., Malinovskaja, K., Aonurm-Helm, A., Zharkovsky, A., Kalda, A. DNA methylation regulates cocaine-induced behavioral sensitization in mice. Neuropsychopharmacology. 35 (12), 2450-2461 (2010).
  27. Hagan, S., Martin, E., Enriquez-De-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: Potential use for predictive, preventive, and personalized medicine. EPMA J. 7 (1), 15(2016).
  28. Gasparini, M. S., et al. Identification of sars-cov-2 on the ocular surface in a cohort of covid-19 patients from Brazil. Exp Biol Med. 246 (23), Maywood. 2495-2501 (2021).
  29. Sebbag, L., Harrington, D. M., Mochel, J. P. Tear fluid collection in dogs and cats using ophthalmic sponges. Vet Ophthalmol. 21, 249-254 (2018).
  30. Abusharha, A. A., et al. Analysis of basal and reflex human tear osmolarity in normal subjects: assessment of tear osmolarity. Ther Adv Ophthal. 10, 2515841418794886(2018).
  31. Fullard, R. J., Snyder, C. Protein levels in nonstimulated and stimulated tears of normal human subjects. Inves Opht Vis Sci. 31 (6), 1119-1126 (1990).
  32. Longwell, A., Birss, S., Keller, N., Moore, D. Effect of topically applied pilocarpine on tear film pH. J Pharm Sci. 65 (11), 1654-1657 (1976).
  33. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Prog Ret Eye Res. 28 (3), 155-177 (2009).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare G zya rneklemesiG zya Proteini AnalizimRNA AnaliziSchirmer eritleriFarmakolojik Stim lasyonSDS PAGEDijital PCRG zya Biyobelirte leriOk ler Hastal k Modelleri

İlgili makaleler