Yöntem makalesi

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

1.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66966

⸱

15 Kasım 2024

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Th17 farklılaşmasının incelenmesinde gen düzenleme için etkili bir alternatif sağlayan, Cas9 transgenik farelerden alınan birincil T hücrelerine kılavuz RNA'nın retroviral transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Th17 hücreleri olarak bilinen IL-17A üreten T yardımcı hücreleri, bağışıklık savunmasında kritik bir rol oynar ve otoimmün bozukluklarda rol oynar. CD4 T hücreleri, in vivo Th17 hücre farklılaşmasını taklit etmek için in vitro olarak antijenler ve iyi tanımlanmış sitokin kokteylleri ile uyarılabilir. İn vitro Th17 polarizasyon testi kullanılarak Th17 farklılaşma düzenleme mekanizmaları üzerine kapsamlı araştırmalar yapılmıştır.

Geleneksel Th17 polarizasyon yöntemleri tipik olarak, spesifik genlerin Th17 farklılaşması ve işlevi üzerindeki etkilerini incelemek için genetik olarak değiştirilmiş farelerden saf CD4 T hücrelerinin elde edilmesini içerir. Bu yöntemler zaman alıcı ve maliyetli olabilir ve nakavt hayvanlardan kaynaklanan hücre dışı faktörlerden etkilenebilir. Bu nedenle, CRISPR/Cas9 knockin primer fare T hücrelerinde gen nakavtını tanıtmak için kılavuz RNA'nın retroviral transdüksiyonunu kullanan bir protokol, çok yararlı bir alternatif yaklaşım olarak hizmet eder. Bu makale, retroviral aracılı gen hedeflemesini takiben naif primer T hücrelerini Th17 hücrelerine ayırmak için bir protokol ve ayrıca enfeksiyon ve farklılaşma verimliliğini test etmek için sonraki akış sitometrisi analiz yöntemlerini sunmaktadır.

Giriş

CD4 + T yardımcı hücrelerinin benzersiz bir alt kümesi olan Th17 hücreleri, hücre dışı bakteri ve mantarların yok edilmesi için hayati öneme sahiptir ve çeşitli otoimmün hastalıklarda önemli bir rol oynar 1,2,3. Ortaya çıkan kanıtlar, Th17 hücrelerinin çevresel ve genetik faktörlerden etkilenen hem patojenik hem de patojenik olmayan koşullarda işlev gören heterojenlik sergilediğini göstermektedir. Th17 hücrelerinin farklılaşmasını, plastisitesini ve heterojenliğini kontrol eden düzenleyici süreçlerin aydınlatılması, daha etkili immünoterapötik stratejilerin geliştirilmesi için çok önemlidir.

Genetiği değiştirilmiş hayvanlar, Th17 hücre farklılaşması ve işlevlerinin temel düzenleyicilerini ortaya çıkarmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Genetiği değiştirilmiş hayvanların kullanılması, in vivo olarak tam manipülasyonu içerir ve fizyolojik koşullardaki veya hastalık modellerindeki rolünün özgünlüğünü ve sistematik çalışmasını sağlar. Bununla birlikte, bu yaklaşımla yüksek verimli tarama büyük ölçüde pratik değildir. İn vitro polarizasyon deneyleri, Th17 hücre farklılaşmasını incelemek için bir alternatif sunar. İnterlökin 6'nın (IL-6), dönüştürücü büyüme faktörü β1 (TGFβ1) ile kombinasyon halinde, patojenik olmayan Th17 hücrelerinin gelişimini teşvik ettiği gösterilirken, IL-6, IL-1β ve IL-23'ün patojenik Th17 hücrelerinin farklılaşmasında rol oynadığı gösterilmiştir (pTh17)4,5.

CRISPR / Cas9 teknolojisinin ortaya çıkışı, belirli bazlarda hassas genom düzenlemesini kolaylaştırmıştır. Retroviral transdüksiyon ile birleştirildiğinde, bu yaklaşım Th17 hücrelerinde potansiyel düzenleyicilerin taranması ve işlevsel olarak incelenmesi için güçlü, verimli ve ekonomik bir genetik yöntem sağlar 6,7. Bu çalışmada, Th17 polarizasyon sistemi içinde retroviral transdüksiyon prosedürünü geliştirdik. Retroviral bir sistem kullanarak, farelerden önceden kurulmuş Cas9 eksprese eden aktive edilmiş naif T hücrelerini enfekte ettik. Hücreler, hedef genin nakavtını kolaylaştırmak için EF1a promotörün kontrolü altında floresan raportör proteinleri kodlayan genlerle birlikte U6 promotörü tarafından yönlendirilen kılavuz RNA (gRNA) yapıları ile dönüştürüldü. Daha sonra, transdüksiyon yapılan T hücreleri, Th17 hücrelerine farklılaşmayı indüklemek için spesifik sitokin koşulları altında kültürlendi. Özellikle, RoRγt'un devre dışı bırakılması, kontrol grubuna kıyasla IL-17A üretimini önemli ölçüde azalttı. Bu sistemin etkinliği, aktive edilmiş primer T hücreleri için optimize edilmiş retrovirüs üretimi ve transdüksiyon koşullarına bağlıdır ve Th17 farklılaşması ve işlevindeki spesifik genleri incelemek için hızlı ve pratik bir yaklaşım sağlar.

Protokol

Tüm prosedürler Deney Hayvanları Refahı Etik Kurulu, Renji Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından onaylanmıştır ve kurumsal yönergelere uygundur.

1. Retroviral üretim

  1. Retroviral yapının hazırlanması
    1. RORγt nakavt 8 için sgRNA'yı tasarlamak için CRISPick aracını (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) kullanın. Referans genomunu Fare GRCm38 olarak belirtin ve PAM dizisini CRISPRko kılavuz sistemine dayalı olarak NGG (SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA için) olarak seçin. Hedef genin adını veya diğer hedef gen formatlarını doğrulayın ve sgRNA adaylarını elde etmek için geçerli girdiyi gönderin. Diğer parametreleri varsayılan değerlere ayarlayarak, Th17'nin farklılaşmasını bozmak için sgRNA hedefini RORγt (Rorc, Gen Kimliği: 19885) olarak ayarlayın ve fare GeCKO v2 kitaplıklarından hedeflemeyen sgRNA'yı (kısaltma sgNT, dizi: GCGAGGTATTCGGCTCCGCG) seçin.
      NOT: Bu araç, kılavuz RNA'ları tasarlamak için bir dizi tıklanabilir seçenek sunarak, belirli gereksinimleri karşılamak için uygun özelleştirmeye olanak tanır.
      1. Hızlı Gen Arama sütununun altındaki arama kutusuna hedef gen adını girin. Sistem, doğru seçimi sağlamak için gen kimliğini ve hedef genin tam adını gösterecektir.
        NOT: Farklı hedef gen formatlarını doğrulamak için ek seçenekler mevcuttur.
    2. Hedef dışı eşleşmelerden kaçınmak ve hedef üzerindeki etkinliği artırmak için yüksek birleşik sıralama ve seçim sırasına göre Rorc (kısaltması sgRorc) dizisinde hedeflenen bir sgRNA seçin (sgRorc dizisi: GTCATCTGGGATCCACTACG). sgRorc ve sgNT için iki oligonükleotid sentezleyin: ileri oligo için, her kılavuz dizisinin 5' ucuna "gttttagagctagaaatagcaagttaaaat" dizisini ekleyin; Ters oligo için, her kılavuz dizisinin 3' ucuna "tttcgtcctttccacaagatatataaagc" dizisini ekleyin.
      NOT: Tipik olarak, sgRNA dizileri için birden fazla seçenek vardır. Nakavt verimliliklerini değerlendirmek için aynı genotipi hedefleyen 2 veya 3 sgRNA dizisinin seçilmesi önemlidir. Ön deneylerimizde, karşılaştırma için Rorc'u hedefleyen iki gRNA seçildi (sgRNA dizisi1: GTCATCTGGGATCCACTACG; sgRNA dizisi2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). Deneysel sonuçlar, mevcut yöntemde (sgRNA dizisi1) sunulan gRNA'nın, ikisi arasında daha yüksek nakavt verimliliği sergilediğini gösterdi.
    3. Yukarıdaki primerlerle PCR'de DNA polimeraz kullanarak sgRorc ve sgNT kodlama dizilerini amplifiye edin ve bunları sırasıyla mCherry floresan proteini ile çerçeve içinde pMX-U6-MCS vektörüne (U6 promotörü ve gRNA iskelesi bölgeleri arasında) klonlayın9. Reaksiyon sistemini (50 μL) Tablo 1'deki gibi ayarlayın. Bu primerler, sgRNA'yı vektöre yerleştirebilen sgRNA dizisinden (3') ve tam uzunlukta vektör parçasını çoğaltabilen bir vektör dizisi segmentinden (5') oluşur. Ek olarak, sgRNA bölgesi içinde yaklaşık 18 bp'lik bir örtüşme ile (ancak tamamen örtüşmeyen) ileri ve geri primerleri tasarlayın, bu da ligasyon işlemi sırasında doğrusallaştırılmış klonlama vektörünün montajını kolaylaştırır.
      NOT: Yaklaşık 5.551 kd'lik PCR ile primerli sgRNA dizisi bölgesinde doğrusallaştırılmış bir vektör parçası elde edilmelidir.
    4. Bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak yapıyı saflaştırın ve bir klonlama kiti kullanarak dairesel hale getirin. Dönüşüm tahlilleri için rekombinasyon ürünlerini kullanın.
    5. Plakalardan tek klonları seçin ve U6 promotör astarı (dizi: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA) kullanarak birinci nesil dizileme yoluyla sgRorc veya sgNT kodlama dizilerini doğrulayın.
    6. LB suyunda amplifikasyon için istenen tek klonu seçin. Endotoksin içermeyen bir plazmit kiti kullanarak bakteri hücrelerinden yüksek kaliteli plazmit DNA'sı çıkarın.
      NOT: Plazmit çözeltisinin yüksek kalitede olduğundan emin olun. Plazmit çözeltisi konsantrasyonunun en az 1 μg/μL olmasını öneririz.
  2. Paketleme hücrelerinin hazırlanması
    1. Aşağıdaki prosedürü kullanarak Platin-E (Plat-E) hücrelerini hazırlayın: Plat-E hücrelerini% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 birim / mL penisilin ve 0.1 mg / mL streptomisin içeren Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM ortamı) ile kültürleyin 10 cm'lik bir kültür kabında. Aşağıda hücre kültürü ortamı olarak anılacaktır.
      NOT: Uygun transfeksiyon verimliliğini elde etmek için, logaritmik büyüme fazında 15'ten az geçiş numarasına sahip hücrelerin kullanılmasını öneririz.
    2. 10 cm'lik Plat-E hücrelerinden (~ 2.6 × 107 hücreli) dolu bir plakayı, transfeksiyondan 1 gün önce uygun bir oranda 10 cm'lik yeni bir tabağa bölün ve ertesi gün yaklaşık% 80'lik bir hücre birleşmesi elde edin, bu transfeksiyon için en uygun koşuldur. 10 cm'lik yeni bir tabak için 1:3 oranında hücre geçişi gerçekleştirin (transfeksiyondan bir gün önce yeni 10 cm'lik bir tabakta tohum ~8 ×10 6 hücre).
      NOT: Bölünme oranı, hücrelerin büyüme durumuna bağlıdır ve sağlam büyüme sergileyen hücrelerde daha yüksek transfeksiyon verimliliği elde edilebilir. 10 cm'lik bir çanak için 1:3 oranında hücre geçişi gerçekleştiriyoruz. 6 cm'lik bir tabak gibi farklı hücre kültürü kapları için, transfeksiyondan bir gün önce 1.5 × 106 Plat-E hücresinin tohumlanmasını öneririz.
  3. Transfeksiyon
    1. Transfeksiyondan bir saat önce, hücre kültürü ortamını,% 5 FBS ile fenol kırmızısı içermeyen, ancak penisilin-streptomisin içermeyen 8 mL indirgenmiş serum ortamı ile değiştirin, çünkü transfeksiyon reaktifine müdahale edebilir. Kullanmadan önce azaltılmış serum ortamını 37 °C'ye ısıtın.
    2. Karışım 1 ve karışım 2'yi içeren transfeksiyon karışımını hazırlayın: karışım 1, 18 μg plazmit DNA (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry / pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) ve 6 μg pCL-Ekotropik Retroviral Vektör (pCL-Eco) 1.000 μL indirgenmiş serum ortamında. Karışım 2, 1.000 μL indirgenmiş serum ortamında 48 μL transfeksiyon reaktifi içerir. Karışım 1'e 2 damla damla karıştırın ve hafifçe ve iyice karıştırın. Kompleksi 20-25 ° C'de 15-20 dakika inkübe edin.
    3. Karışımı dikkatlice Plat-E hücrelerine damlatın ve eşit dağılımı sağlamak için plakayı hafifçe döndürün. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 altında 6-12 saat inkübe edin.
    4. Ortamı 10 mL taze hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2 48 saat boyunca inkübe etmeye devam edin.
    5. Floresan mikroskobu veya akış sitometrisi yoluyla vekil görevi gören retroviral vektör etiketini tespit ederek Plat-E hücrelerindeki transfeksiyon verimliliğini değerlendirin.
      NOT: pMX-U6-MCS vektörü ile transfekte edilen Plat-E hücrelerinin önemli bir kısmında güçlü bir mCherry floresan (floresan pozitif% 80'i aşıyor) sinyali tespit edildi ve bu da başarılı transfeksiyonu gösterdi.
    6. Virüs içeren kültür süpernatanı hasat edin ve hücre parçalarını çıkarmak için 10 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüjleyin. Virüs süpernatanı flakon başına 1 mL alikot edin ve -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Filtreleme, hücre kalıntılarını gidermek için alternatif bir yöntemdir. Viral partiküllerin filtre membranı üzerinde tutulmasını en aza indirmek için 0,45 μm gözenek boyutuna sahip bir şırınga filtresi ve bir polietersülfon (PES) membranı kullanmanızı öneririz.

2. Aktive edilmiş CD4 + T hücrelerinin retroviral enfeksiyonu ve Th17 farklılaşması

  1. Birincil naif CD4 + T hücrelerini hazırlayın ve etkinleştirin
    1. 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının her bir kuyusunu steril 500 μL PBS'de 2 μg / mL anti-CD3e ve 4 μg / mL anti-CD28 ile kaplayın, buharlaşmayı ve kontaminasyonu önlemek için plakayı parafilm içine sarın ve daha sonra plakayı gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (veya CD4 + T hücrelerini kaplamadan önce 1-2 saat boyunca 37 ° C'de) saf CD4 + T hücrelerini izole etmeden önceki gün.
      NOT: Bu adım, viral transdüksiyon gerçekleştirmeden önce fare T hücreleri için plakaya bağlı stimülasyon gerçekleştirmek için gereklidir.
    2. Ertesi gün, 6-8 haftalık Cas9 eksprese eden fareleri (R26-CAG-Cas9 fareleri) CO2 asfiksisyonu ile ötenazi yapın ve% 70 etanol ile sterilize edin.
    3. Fare dalağını kesin ve %2 FBS ve 100 μM EDTA (FACS tamponu) içeren PBS'ye yerleştirin.
    4. Dalağı FACS tamponunda sterilize edilmiş buzlu cam (mat taraf) ile öğütün, dokuyu tek hücreli bir süspansiyona homojenize edin ve hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir tüpe süzün.
      NOT: Dokuyu nemli tutmak için dokuyu nazikçe ve tutarlı bir şekilde öğüttüğünüzden emin olun. Dokuyu şiddetli bir şekilde öğütmek, hücre sağkalımını önemli ölçüde etkileyebilir.
    5. Dalak hücreli süspansiyonu 800 × g'da 5 dakika döndürün. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 2 mL kırmızı hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 5 dakika bekletin, ardından toplam 15 mL hacme ulaşmak için FACS tamponu ekleyin. Splenositleri 800 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    6. Splenositleri yeniden süspanse edin ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. CD4 + T hücre izolasyonu için son hacmi 1 mL'ye ayarlayın.
    7. Kılavuzdaki talimatları izleyerek ticari reaktif kitleri kullanarak CD4+ T hücrelerini izole edin.
    8. CD4 + T hücrelerini floresan antikor karışımı (CD4, CD25, CD44 ve CD62L) ile 4 ° C'de 30 dakika boyunca etiketleyin, hücreleri FACS tamponu ile yıkayın ve saf CD4 + T hücrelerini bir akış hücresi sıralayıcı kullanarak izole edin. Bu, CD4 + CD25-CD62LyüksekCD44düşük naif T hücrelerinin elde edilmesiyle sonuçlanacaktır.
    9. Plakaya bağlı stimülasyon süpernatantını 24 oyuklu hücre kültürü plakasından (adım 2.1.1'de hazırlanan) çıkarın ve her bir kuyucuğu 500 μL PBS ile iki kez durulayın. Plaka: 1 x 10,6 saf CD4 + T hücreleri, 24 oyuklu hücre kültürü plakasının bir oyuğunda 1 mL lenfosit kültürü ortamında. Hücreleri hücre inkübatörde inkübe edin.
      NOT: Lenfosit kültür ortamı, RPMI 1640 ortamında %10 FBS, 100 ünite/mL penisilin ve 0.1 mg/mL streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM HEPES ve 50 μM β-ME içerir.
  2. Retroviral enfeksiyon
    1. 18-24 saat sonra, aktive edilmiş hücrelerin her bir kuyusunu 1.5 mL'lik tüpe toplayın. 800 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    2. Hücre peletini 1 mL enfeksiyon karışımında (10 μg / mL heksadimetrin bromür, virüs süpernatanında 10 mM HEPE) yeniden süspanse edin ve karışımın 1 mL'sini 48 oyuklu bir hücre kültürü plakasının yeni bir kuyucuğuna ekleyin. Bu arada, negatif (dönüştürülmemiş) kontrol olarak yeterli sayıda hücreyi kaydedin.
      NOT: Oyuk başına 1 x 106'dan az aktive edilmiş naif CD4 + T hücresine sahip olmak mümkündür, ancak oyuk başına 0,5 x 106'dan az hücre kullanılması önerilmez. Ek olarak, 48 oyuklu kültür plakasının periferik oyuklarına hiçbir hücre tohumlanmamalıdır.
    3. Plakayı parafilm ile sarın ve 32 ° C'de 90 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Hızlanmayı ve yavaşlamayı 3 olarak ayarlayın. Santrifüjlemeden sonra, parafilmi çıkarın, hücreleri inkübatörde 4 saat inkübe edin ve farklılaşma adımlarına devam edin.
  3. Enfekte hücrelerin Th17 hücrelerine farklılaşması
    1. Retroviral enfeksiyon sırasında antijen sunan hücreleri (APC) hazırlayın. İlk olarak, 2.1.2'den 2.1.4'e kadar olan adımları izleyerek vahşi tip farelerden splenositler elde edin. Splenositleri 15 mL'lik bir tüpte 50 μg / mL mitomisin ile 1 mL lenfosit kültür ortamı ile yeniden süspanse edin. Splenositleri 37 ° C'de% 5 CO2 altında 1 saat inkübe edin.
    2. Bir saat sonra, splenositleri yıkamak için 15 mL işaretine kadar PBS ekleyin, 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın, splenositleri 1 mL lenfosit kültür ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücre sayısını sayın. APC hücreleri başarıyla hazırlanmıştır.
    3. 4 saatlik hücre inkübasyonundan sonra (adım 2.2.3'te olduğu gibi), transdüksiyona uğramış CD4 + T hücrelerini 1.5 mL'lik tüplerde toplayın ve 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve enfekte olmuş hücreleri yıkamak için 600 μL PBS'de yeniden süspanse edin. 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    4. 0.5 × 106 dönüştürülmüş CD4 + T hücrelerini, 1.5 x 106 APC hücresi ile 1 mL lenfosit kültür ortamına 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının bir kuyusuna yerleştirin. 2 μg/mL anti-CD3e, 2 μg/mL anti-CD28 ve 10 μg/mL anti-IFNγ, 10 μg/mL anti-IL-12/IL23 p40, 10 μg/mL anti-IL4, 2.5-3 ng/mL hTGF-β ve 20-30 ng/mL IL-6 içeren Th17 hücre farklılaşma kokteyli ile takviye edin. 2 gün boyunca kültür hücreleri.
    5. Her bir hücre kuyusunu 1.5 mL'lik tüplere toplayın, 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Sadece 3 ng / mL TGF-β ve 30 ng / mL IL-6 ile yeni 1 mL lenfosit kültür ortamını yenileyin. Hücreleri, uzun bir kültür periyodu için 24 oyuklu hücre kültürü plakasından oluşan yeni bir kuyuya yerleştirin. Ortam değişiminden 2 gün sonra hücreleri analiz edin.

3. Transdüksiyon verimliliğinin ve farklılaşma sonuçlarının değerlendirilmesi

  1. İki günlük orta değişimden sonra, hücreleri toplayın ve 5 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Farklılaşmış hücreleri 50 ng / mL forbol 12-miristat 13-asetat (PMA), 500 ng / mL iyonomisin ve 5 μg / mL brefeldin A ile 500 μL lenfosit kültür ortamında 37 ° C inkübatörde 24 oyuklu hücre kültürü plakasının yeni bir kuyusunda 4 saat boyunca tedavi edin. Akış sitometrisi analizi için hücrelerin yarısını toplayın ve hücrelerin diğer yarısını qPCR analizi için RNA ekstraksiyon tamponu ile parçalayın.
  2. Akış sitometrisi analizi için
    1. Hücreleri 1,5 mL'lik tüplere toplayın. Tüplere 1 mL FACS tamponu ekleyin ve hücreleri yıkamak için 800 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    2. Hücre peletini floresan antikor karışımı (100 μL PBS'de CD4 ve Sabitlenebilir Canlılık Boyası) ile yeniden süspanse edin ve hücreleri 30 dakika boyunca 4 ° C'de boyayın.
    3. Hücreleri 300 μL PBS ile yıkayın ve 300 μL %2 fosfat tamponlu formaldehit (FA) ile 4 °C'de en az 60 dakika sabitleyin.
    4. Bir saat sonra, hücreleri PBS ile yıkayın, 600 μL 1x geçirgenlik tamponu ile tekrar süspanse edin ve 5 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin.
    5. Süpernatanı atın ve oda sıcaklığında 60 dakika veya gece boyunca 1 μL 1x geçirgenlik tamponunda 17 μL 4x geçirgenleştirme tamponunda anti-IL-4A ile boyayın.
    6. Ertesi gün, hücreleri 1x geçirgenlik tamponu ile yıkayın ve 200 μL PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri akış sitometrisi10 ile analiz edin. Temsilci Sonuçları bölümüne bakın.
  3. qPCR analizi için, RNA ekstraksiyon kitinin talimatlarını izleyerek RNA'yı çıkarın. Depolama veya sonraki qPCR analizi için RNA'yı cDNA'ya ters transkribe edin. Bu primerlerin tasarımı, genel qPCR primer tasarım ilkelerine bağlı kalmalı ve aynı zamanda gRNA aracılı bölünmenin meydana geldiği beklenen indel bölgesini kapsayan bölgeyi özel olarak hedeflemelidir. Bu bölgedeki amplifikasyon verimliliğindeki herhangi bir azalma veya sinyal kaybı, başarılı nakavtın bir göstergesi olarak hizmet edebilir. qPCR primerleri aşağıdaki gibidir:
    Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

Sonuçlar

Çalışmada, sgRNA hedefini Rorc'a ve sgRNA-hedeflemesiz kodlama dizilerini mCherry floresan proteini ile pMX-U6-MCS vektörüne klonladık (Şekil 1A,B). Retrovirüs üretimi, Şekil 2'de belirtilen protokole göre gerçekleştirildi. Transfeksiyon 0. günde başlatıldı ve retroviral hasat 2. günde gerçekleşti. Transfeksiyon verimliliği, mCherry floresan yoğunluğu ile test edilebilir (Şekil 1C). Virüs hasat edilmeden önce, saf CD4 + T hücreleri sıralandı ve aktive edildi. Bu aktive edilmiş CD4 + T hücreleri daha sonra spin enfeksiyonu kullanılarak enfekte edildi, ardından tarif edildiği gibi farklılaşma adımlarının devamı geldi. Son olarak, transdüksiyonun etkinliği ve farklılaşma sonuçları akış sitometri analizi ve qPCR analizi kullanılarak değerlendirildi.

Şekil 3, saf CD4+ T hücrelerini sıralamak için uygulanan geçit stratejisini göstermektedir. Ana hücre popülasyonu ve singlet hücreler seçildikten sonra (Şekil 3'ün ilk iki kapısında gösterildiği gibi), FVD-CD4+ hücreleri, Th17 hücrelerine polarize CD4 T hücrelerini APC'lerdekilerden ayırt etmek için kapılandı. Son olarak, CD4 T hücreleri tarafından üretilen IL-17A, nakavt verimliliğini gösteren Th17 farklılaşma verimliliğini temsil eder. mCherry pozitif hücrelerin yüzdesi, retroviral enfeksiyonun etkinliğini yansıtırken, nakavt etkinliği, IL-17A pozitif hücrelerin yüzdesi ile gösterilir. Hücre canlılığını artırmak ve sıralama süresini en aza indirmek için, splenositler bir fare CD4 +

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

Tartışma

Retroviral iletim yoluyla CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi, yardımcı T hücrelerinin rollerini keşfetmek için sağlam bir yöntemdir. Bu protokol, Th17 farklılaşması ve işlevinde yer alan spesifik genleri incelemek için hızlı ve etkili bir yaklaşım sunar. En iyi sonuçları elde etmek için birkaç kritik adım dikkatlice izlenmelidir. İlk olarak, gelişmiş gen nakavt verimliliği için gRNA'lar dikkatlice seçilmelidir. CRISPR/Cas9 gen düzenlemesinde hedef dışı etki riski göz önüne alındığında, daha sonraki deneyler için protokol bölümü 1.1.1'de tanımlandığı gibi yüksek puanlara sahip 2-3 gRNA'nın seçilmesi ihtiyatlıdır11,12. İkincisi, başarılı bir enfeksiyon için yüksek bir viral titre gereklidir. Plat-E paketleme hücresi hattının uygun şekilde bakımı çok önemlidir. Hem yetersiz hem de aşırı hücre sayıları virüs titrelerini tehlikeye atacağından, hücreler transfeksiyon gününde yaklaşık% 80 birleşmeye ulaşmalıdır. Plat-E hücreleri mevcut değilse, İnsan Embriyonik Böbrek 293T hücrelerinin pCL-Eco vektörü ile birlikte transfekte edilmesi de yüksek viral titrelerüretebilir 13,14. En az 1 μg/μL'lik yüksek bir plazmit konsantrasyonunun korunması, yüksek bir virüs titresi elde etmek için önemlidir. Virüs pH değişikliğine karşı hassasiyet gösterdiğinden, virüs süspansiyonunun limon sarısına dönmeden önce hasat edilmesi önemlidir. Bu nedenle, kültür ortamının pH'ı uygun bir aralıkta dikkatli bir şekilde düzenlenmelidir. Virüs, bütünlüğünü korumak ve tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden korunmak için -80 ºC'de saklanmalıdır15.

Üçüncüsü, yüksek enfeksiyon verimliliği elde etmek için, birincil hücrelerin yeterince aktive edilmesi gerekir. Yetersiz hücresel aktivasyon, viral enfeksiyon etkinliğini önemli ölçüde tehlikeye atar16. Viral enfeksiyondan önce, aktive edilmiş hücreler inaktive edilmiş hücrelerden belirgin şekilde daha büyük bir boyut sergilediğinden, T hücrelerinin aktivasyon durumu mikroskobik olarak doğrulanmalıdır. Th17 farklılaşma protokolümüzün C57BL/6 fareler için özel olarak optimize edildiğini belirtmekte fayda var, bu nedenle diğer fare türleri için ayarlamalar gerekli olabilir. Dördüncüsü, istenen Th17 farklılaşma sonuçlarını elde etmek için, optimal hücresel koşulların korunması çok önemlidir. Spin enfeksiyonu sırasında, hücre canlılığının korunmasına yardımcı olmak için hücreleri merkeze yakın kuyucuklara yerleştirmek önemlidir. Spin enfeksiyonunu takiben, hücrelerin 4 saat boyunca inkübe edilmesi (protokol adımı 2.2.4) iyileşmeleri için çok önemlidir. Ek olarak, hücreleri aktarırken, hücre canlılığını korumak için nazik pipetleme önemlidir. Farklı stimülasyon koşulları Th17 farklılaşmasını etkileyebilir. Bu deneyde, antijen sunan hücrelerin farklılaşma sistemine dahil edilmesi, anti-CD3e ve anti-CD28 plakaya bağlı stimülasyona kıyasla farklılaşma verimliliğini önemli ölçüde artırdı. Son olarak, kullanılan tüm sitokinlerin taşıma ve depolama sırasında işlevsel kalmasını sağlamak çok önemlidir. Sitokinler, tekrarlanan donma-çözülme döngülerinde veya uygun olmayan sulandırma solüsyonlarında stabiliteyi hızla kaybedebilir. Sitokinlerin prosedürler boyunca fonksiyonlarını sürdürmesi için soğuk tedavi ve eşit alikotlar gereklidir.

Spesifik gen nakavt Th17 hücreleri oluşturmak için bu protokolün çeşitli sınırlamaları vardır. İlk olarak, birincil fare T hücrelerinde tam transdüksiyon verimliliği elde etmek zordur. Bazı hücreler, Th17 farklılaşması sırasında amaçlanan gen nakavtına maruz kalmayabilir. İkincisi, birincil T hücreleri in vitro olarak sınırlı bir ömre sahiptir. Yaklaşık bir hafta sonra, bu hücreler ölme eğilimindedir ve sonraki deneyler için zorluklar ortaya çıkar. Üçüncüsü, protokolümüz Cas9 transgenik farelere dayanır ve Cas9 dizisini çekirdek plazmidine dahil etmeye çalıştığımızda, bu viral titrelerde önemli bir azalma ile sonuçlandı. Son olarak, bu protokolün, naif CD4+ T hücresi aktivasyonunun erken aşamalarında yer alan genlerin fonksiyonlarını analiz etmek için uygun olmadığını fark ettik, çünkü bu hücrelerin retroviral transdüksiyondan önce aktive edilmesi gerekiyor.

Sınırlamalarına rağmen, bu protokol çeşitli çalışmalarda başarıyla uygulanmış ve Th17 farklılaşmasında rol oynayan anahtar genetik düzenleyicilerin araştırılmasını kolaylaştırmıştır. Aktive edilmiş T hücrelerinde hedef genlerin devre dışı bırakılmasını takiben Th17 farklılaşma verimliliğindeki değişikliklerin değerlendirilmesini sağlar. Ek olarak, bu protokol, hücre proliferasyonu, sağkalım, transkripsiyon faktörü stabilitesi, sitokin sekresyonu ve bağışıklık tepkileri dahil olmak üzere Th17 hücre fonksiyonunun diğer yönlerini değerlendirmek için uygundur. Ayrıca, laboratuvarımız, indüklenmiş düzenleyici T hücrelerinin (iTreg'ler) retroviral transdüksiyonu ve farklılaşmasında etkinliğini göstermiştir. Tüm T hücresi tipleri test edilmemiş olsa da, bu protokol Th1, Th2 ve CD8 + T hücreleri gibi diğer alt kümelerde de uygulanabilir. Genel olarak, bu teknik, bağışıklık hücrelerinde gen nakavtlarını gerçekleştirmek için değerli bir araç olarak hizmet eder ve bağışıklık fonksiyonlarını düzenleyen kritik genetik sinyalleri ortaya çıkarmak için önemli bir potansiyel sunar.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Şanghay Bağışıklık Tedavisi Enstitüsü'nün çekirdek tesisinden Dou Liu, Dongliang Xu ve Pinpin Hou'ya enstrümanların kullanımındaki destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Hibeleri 31930038, U21A20199, 32100718 ve 32350007 (Linrong Lu'ya); 32100718 (Xuexiao Jin'e); Şanghay'daki üst düzey yerel üniversitelerin yenilikçi araştırma ekibi SHSMU-ZLCX 20211600 (Linrong Lu'ya); Dahili Kuluçka Programı RJTJ24-QN-076 (Zejin Cui'ye). Şekil 2 Figdraw ile hazırlanmıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5 M EDTA (pH 8.0)SolarbioE1170
100 mm Hücre ve Doku Kültür KabıBIOFILTCD010100
1 M Hepes (Serbest Asit, steril)SolarbioH1090
24 oyuklu hücre ve doku kültürü plakasıNEST702002
48 oyuklu hücre ve doku kültürü plakasıNEST748002
Brefeldin Bir Çözüm (1,000x)BioLegend420601
Brilliant Violet 650 anti-fare CD4 Antikoru (RM4-5)BioLegend100546
CD3e Monoklonal Antikor (145-2C11), Fonksiyonel Sınıf, eBioscienceInvitrogen16-0031-82
CD44 Monoklonal Antikor (IM7), PE, eBioscienceInvitrogen12-0441-83
CD62L (L-Selectin) Monoklonal Antikor (MEL-14), APC, eBioscienceInvitrogen17-0621-82 
Hücre sayacıNexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
Hücre Süzgeci (40 μ m)biosharpBS-40-CS
Hücre Süzgeci (70 & mu; m)biosharpBS-70-CS
Santrifüj eppendorf5425  R
Santrifüj eppendorf5810 R
ChamQ SYBR Renk qPCR Master MixVazymeQ411-02
ClonExpress II Tek Adımlı KlonlamaKiti VazymeC112
DH5 & alpha; Yetkili HücrelerSangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM OrtaBasalMediaL110KJ
EasySep Fare CD4+ T Hücre İzolasyon KitiSTEMCELL19852
eBioscience Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor 660Invitrogen65-0864-18
EndoFree Mini Plazmid Kiti IITIANGENDP118-02
ExFect Transfeksiyon ReaktifiVazymeT101-01
Fetal Sığır Serumu, Premium PlusGibcoA5669701
FITC anti-fare IL-17A Antikoru (TC11-18H10.1)BioLegend506907
Formaldehit çözeltisiMacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix qPCR?+gDNA sileceği için?VazymeR423-01
İyonomisinBeyotimeS1672
Mitomisin CMaokang Biyoteknoloji7/7/1950
Fare GRCm38NCBIRefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Azaltılmış Serum OrtamıGibco31985070azaltılmış serum ortamı
Pasifik Mavisi anti-fare CD4 Antikoru (RM4-5)BioLegend
PE / Siyanin7 anti-fare CD25 Antikoru (PC61)BioLegend102015
PE / Cyanine7 anti-fare CD4 Antikoru (GK1.5)BioLegend100422
Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)Gibco15140122
PMA / TPA ve nbsp;BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 fareler Şangay Model Organizmalar Merkezi Cat. NO. NM-KI-00120
Rekombinant İnsan TGF-beta 1 (CHO-Eksprese Edilmiş) Protein, CFR& D Systems11409-BH
Rekombinant Murin IL-6PeproTech216-16
Araştırma Hücresi AnalizBD BiosciencesBD LSRFortessa
Araştırma Hücresi SıralayıcısıSONYMA900
RPMI 1640 OrtaBasalMediaL210KJ
SimpliAmp Termal Döngüleyici PCR SistemiUygulamalı BiyosistemlerA24811
Sodyum piruvat çözeltisi (100 mM)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF Saflaştırılmış anti-fare CD28 Antikoru (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF Saflaştırılmış anti-fare IFN-&gama; Antikor (XMG1.2)BioLegend505847
Ultra-LEAF Saflaştırılmış anti-fare IL-4 Antikoru (11B11)BioLegend504135
Ultra-LEAF Saflaştırılmış anti-fare IL-12/IL-23 p40 Antikoru (C17.8)BioLegend505309
β-Merkaptoetanol (50 mM)SolarbioM8211
100531 Cihazı

Kaynaklar

  1. Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).
  2. Dong, C. Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
  3. Patel, D. D., Kuchroo, V. K. Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions. Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).
  4. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling. Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).
  5. Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells. Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).
  6. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  7. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  8. Doench, J. G., et al. Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  9. Holst, J., et al. Generation of t-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).
  10. Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells. J Vis Exp. (172), (2021).
  11. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  12. Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  13. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function. J Vis Exp. (117), e54698(2016).
  14. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  15. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters. BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).
  16. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J Vis Exp. (44), 2307(2010).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Retroviral Transd ksiyonCD4 T H creleriAk SitometrisiIn Vitro PolarizasyonROR Gamma TTek K lavuz RNAmm n D zenleme
İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.