Mantar patojenlerine karşı antagonizma gösteren mikrobiyal doğal ürünleri tanımlamak için ince tabaka kromatografisi, doğrudan biyootografi testi ve sıvı kromatografisi-kütle spektrometresinin kullanımını, model sistem olarak patojen Sclerotinia sclerotiorum ve biyopestisit Bacillus izolatlarını kullanarak açıklıyoruz.
Yöntem makalesi
İnce Tabaka Kromatografisi-Doğrudan Biyootoografi ile Biyokontrol için Doğal Ürünlerin Biyotahlil Kılavuzluğunda Tanımlanması
Bu makalede
Özet
Özet
İnce tabaka kromatografisi-doğrudan biyootografi (TLC-DB), bir hedef patojene karşı antagonistik olan doğal ürünleri (NP'ler) ayırmak ve tanımlamak için kullanılan iyi bilinen bir biyotahlildir. Biyoaktiviteyi incelemek için bir hedef patojenin doğrudan uygulanmasıyla birlikte TLC ile ayrılmaya bağlı olan NP'lerin biyotahlil kılavuzluğunda izolasyonu ve tanımlanması için hızlı, ucuz ve basit bir seçenektir. Tipik olarak biyoaktif bitki özlerinin analizi, bakteri, mantar ve enzimlere karşı inhibitör aktiviteyi tespit etmek için kullanılır. Bununla birlikte, özellikle bakteriyel NP'leri ilgili tarımsal patojenlere karşı değerlendirmek için bakteriyel NP keşfinde büyük bir potansiyele sahiptir ve bu, tarım endüstrisi için yeni biyopestisitlerin keşfedilmesi ve geliştirilmesi için değerlidir. Ayrıca, biyoaktif bileşiklerin keşfi ve tanımlanması ile ilgili araştırma programlarında diğer hedef patojenlere veya NP kaynaklarına uygulanabilen ayarlanabilir bir protokoldür. Burada, Bacillus spp. ve tarımsal patojen Sclerotinia sclerotiorum ile TLC-DB kullanarak biyopestisit NP'leri keşfetmek ve tanımlamak için bir model sistemi açıklıyoruz.
Giriş
Mantar tarımsal patojenleri, dünya çapında mahsul kalitesinde ve veriminde önemli kayıplara neden olarak, istikrarlı bir küresel gıda üretim sisteminin ekonomik ve tedarik zorluklarına katkıda bulunur 1,2. Patojen hasarı, enfeksiyona dirençli çeşitlerin ıslahı ve patojençoğalmasını bastırmak için ürün rotasyonları ve arazi yönetimi uygulamaları dahil olmak üzere entegre ürün yönetim sistemleri kullanılarak önlenebilir. Bu yöntemler ekinlere verilen zararı azaltsa da, kimyasal pestisitler genellikle tarladaki mantar üreme yapılarını aktif olarak öldürmek ve hasarı ve verim düşüşlerini daha da önlemek için birlikte kullanılır. Etkili olmasına rağmen, kimyasal pestisit kullanımı, çevredeki ekosistemlere zarar verme, toprak verimliliğinde düşüş, ilişkili insan sağlığı riskleri ve patojen direncinin gelişmesi gibi birçok dezavantaja sahiptir, ikincisi her yıl daha yüksek dozlarda pestisitlere ihtiyaç duyulmasına neden olur 5,6,7.
Mikrobiyal bazlı haşere ve patojen yönetimi ürünleri uzun zamandır sentetik pestisitlere potansiyel alternatifler veya tamamlayıcı olarak kabul edilmektedir. 1900'lerin başından beri, Bacillus thuringiensis , tarımsal zararlıları ve patojenleri kontrol etmek için tohum muamelesi, yaprak spreyi ve doğrudan toprak işlemede yaygın olarak kullanılmaktadır8. Bu tür ürünler biyopestisitler olarak adlandırılmıştır ve hedef bir haşere veya patojeni öldürebilen, bastırabilen veya canlılığını azaltabilen doğal olarak oluşan mikroorganizmalar veya biyokimyasallar olarak karakterize edilir. Biyopestisitler, bir patojenin büyümesini çeşitli mekanizmalar yoluyla kontrol edebilir, ancak en yaygın olarak bunu ikincil metabolitlerin salgılanması yoluyla yapar9. Genellikle doğal ürünler olarak adlandırılan ikincil metabolitler, birincil metabolizmada yer almazlar, ancak diğer mikroorganizmaları geride bırakmak için evrimsel bir avantaj olarak üretilirler10.
Biyopestisitler, sentetik muadillerine göre birçok avantaj sunar. Sentetik haşere yönetimi ürünlerine kıyasla çevre, fauna ve insanlar için düşük toksisite riski oluştururlar 9,10. Biyopestisitlerin çoğu binlerce yıldır çevrede doğal olarak var olduğundan, çevrede mikrobiyal metabolitler için biyolojik bozunma yolları mevcuttur, bu da toprak veya ekosistem kontaminasyonu olasılığını sınırlar ve sentetik pestisitlerin çevreye bu kadar zararlı olmasına katkıda bulunan kalma sürelerini azaltır11. Ek olarak, patojen enfeksiyonunu hafifletmek için kullanılan birçok biyopestisit, besin biyoyararlanımını artırabilen ve bitki sistemik direncini indükleyebilen bitki büyümesini teşvik edici özellikler de sergiler12.
En yaygın olarak, biyopestisitler mikrobiyal inokulum şeklinde uygulanır ve NP'ler canlı mikroorganizmalar tarafından yerinde salgılanır 12,13. Böyle bir durumda, bir biyopestisitin aktivitesinin kaynağını belirlemek çok değerlidir. Bunu yapmak, biyopestisitin etki mekanizması hakkında bilgi sağlar, bir mikroorganizmanın patentli olarak korunması için bir dava oluşturulmasına yardımcı olur ve yapıları yeniyse önemli bir bilimsel etkiye sahip olabilir. Bununla birlikte, en önemlisi, biyoaktif kaynağın tanımlanması, bir sonraki biyopestisit ürünü için formülasyon olasılıkları hakkında bilgi verir. NP'nin kendisi aktifse, mikroorganizma büyük ölçekli biyopestisit üretimi için bir biyomolekül fabrikası olarak kullanılabilir. Ek olarak, biyokontrol için araştırılan birçok NP'nin insan tıbbında da potansiyel uygulamaları vardır ve bu da onları ekonomik olarak daha da değerli kılmaktadır8.
İnce tabaka kromatografisi-doğrudan biyootografi (TLC-DB) testleri, biyopestisit metabolitlerin biyoaktivite kılavuzluğunda izolasyonu ve tanımlanması için ucuz ve basit bir yöntemdir. Teknik, fitokimyasalların biyoaktivite testini ham bitki ekstraktlarından ayırmak için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, mikrobiyal ekstraktların analizi için de büyük bir potansiyele sahiptir14. TLC, ham bir mikrobiyal ekstraktta NP'lerin hızlı ve ucuz bir şekilde ayrılmasını sağlar ve bir ortam patojeni süspansiyonu ile kaplandıktan sonra, aktif metabolitler içeren bölgeler kolayca görselleştirilir. Bu bölgeler plakadan kazınabilir ve bilinen metabolitleri tanımlamak için kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile kimyasal analiz için ekstrakte edilebilir. Daha önce bildirilen bileşiklerle eşleşmeyen metabolitler, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ve X-ışını kristalografisi15 gibi teknikler kullanılarak yapı aydınlatma çalışmalarına tabi tutulmak üzere sıvı kromatografisi yoluyla daha büyük miktarlarda izole edilebilir.
Bu makale, Bacillus spp. ve tarımsal patojen Sclerotinia sclerotiorum ile TLC-DB kullanarak biyopestisit NP'leri keşfetmek ve tanımlamak için bir model sistemi açıklamaktadır. Şekil 1 , TLC-DB prosedürüne şematik bir genel bakış sağlar.
Şekil 1: TLC-DB prosedürünün 4-7 adımlarına şematik genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protokol
Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Mikrobiyal biyokontrol adaylarının seçilmesi
- Rekabet plakası tahlillerini kullanarak, ilgilenilen patojene karşı antagonizma gösteren mikrobiyal izolatları seçin.
NOT: Bu protokolü göstermek için Bacillus atrophaeus, mojavensis ve subtilis türleri de dahil olmak üzere S. sclerotiorum'a karşı antagonizma sergileyen dokuz Bacillus izolatı seçilmiştir.
2. Medya hazırlığı
- Litre suya 39 g orta maddeyi çözerek patates dekstroz agar (PDA) hazırlayın.
- Bir litre suya 45 g ortam ekleyerek Pseudomonas F agar'ı hazırlayın.
- Litre suya 24 g orta ve 0.24 g agar ekleyerek% 1 agar ile patates dekstroz suyu (PDB) hazırlayın.
- Maya-glikoz-manganez (YGM) suyu hazırlayın. 100 mL su içinde 2.5 g KH2PO4 ve 2.5 g K2HPO4 ve 0.58 g MnS04 içeren bir tuz çözeltisinden oluşan bir tampon çözelti oluşturun. 100 mL su içinde H20, 0.5 g NaCl ve 0.05 g FeSO 4.7H20.
- Daha sonra, metal tuzlarının çözelti içinde çökelmemesini sağlamak için 1 g maya özütü, 1.25 g dekstroz, 400 mL su, 5 mL tampon çözeltisi, 5 mL tuz çözeltisi ve 90 mL su ekleyin.
- Ortamı otoklavla sterilize edin, agarı 100 x 15 mm Petri plakalarına dökün ve kullanmadan önce oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
3. Patojen hazırlama
- Beş tabak Sclerotinia sclerotiorum'u PDA (adım 2.1'de hazırlanan) üzerinde kültürleyin ve 3 gün boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
4. Doğal ürün özü hazırlama
- Her bakteri izolatını Pseudomonas F Agar (adım 2.2'de hazırlanmıştır) üzerinde kültürleyin ve tek tek koloniler gözlenene kadar büyütün.
- Tek bakteri kolonilerini santrifüj veya kültür tüplerinde 25 mL YGM ortamına subkültür yapın ve 3 gün çalkalayarak inkübe edin.
- Her ekstraktın 5 mL alikotunu 1 L YGM'ye aktarın ve aynı koşullarda 3 gün daha inkübe edin.
- Hücreleri peletlemek için her kültürü 3000 x g'da 25 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
- Kültür ortamından metabolitleri çıkarmak için süpernatanı üç kez boşaltın ve etil asetat ile yıkayın.
- Döner buharlaştırma kullanarak her birinin etil asetat tabakasını birleştirin ve kurutun.
- Ekstraktı minimum metanol içinde yeniden çözün, küçük bir sintilasyon şişesine aktarın ve döner buharlaştırma ile tekrar kurutun.
NOT: Ekstrakt yağlı veya reçineli bir malzemeye kurursa, doğru bir şekilde tartılabilen kuru bir toz elde etmek için malzemeyi liyofilize edin.
5. TLC plaka hazırlama
- 20 cm x 20 cm TLC plakayı, plakanın altından 2 cm ve üstünden 2 cm bir çizgi çizerek hazırlayın. Alt satıra, 2 cm aralıklarla dokuz nokta yerleştirin. Üst çizginin üzerine 4 cm aralıklarla dört nokta yerleştirin.
- Her ekstraktın 5 mg'ını 15 μL metanol içinde çözün ve bir pipet kullanarak alt satırda işaretlenmiş dokuz noktaya her ekstrakttan 5 μL uygulayın. Her bir ekstrakt noktasını TLC plakasında kurumaya bırakın ve aynı noktaya 5 μL daha alikot uygulayın. Tüm malzeme TLC plakasına yüklenene kadar tekrarlayın.
- TLC plakasını, çözücü plakanın üstünden 2 cm uzakta işaretlenen çizgiye ulaşana kadar (yaklaşık 45 dakika) 1: 2 diklorometan ve metanol çözeltisi kullanarak gelişmekte olan bir tankta geliştirin.
- Geliştirildikten sonra, TLC plakasını çıkarın ve çözücü çizgisinin üzerinde işaretlenmiş dört nokta üzerinde bir dizi pozitif kontrol uygulayın. Aynı kontrolün dört konsantrasyonu kullanılır. S. scl. için 0.5 μg/mL, 5 μg/mL, 50 μg/mL ve 500 μg/mL Higromisin B pozitif kontrollerdir.
- Tüm çözücü plakadan buharlaşmadan önce, etanol ile sterilize edilmiş bir TLC plaka kutusuna yerleştirin.
6. Doğrudan biyootografi testi
- Tahlilde kullanılacak malzemeleri (kromatografi püskürtücünün cam bileşenleri, metal spatula, dört yaprak kağıt havlu, selüloz veya filtre kağıdı, su ve ortam) teneke ile kaplı büyük bir beherde otoklavlayın.
NOT: Kağıt malzemeler (kağıt havlu, selüloz kağıt) otoklavda ıslanmamak için kalay folyoya sarılmalıdır. - Etanol ile sterilize edilmiş PTFE boru kullanarak bir hava kaynağı, basınç göstergesi ve kromatografi püskürtücü bağlayın. Kromatografi püskürtücü ile manometre arasına bir HEPA filtresi bağlayın.
- Steril metal spatula kullanarak beş patojen plakasının misel matını steril bir spatula kullanarak 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın.
NOT: Gerekirse miselin yerinden çıkmasına yardımcı olmak için az miktarda sıvı et suyu kullanın ve steril bir pipetle aktarın. - 50 mL santrifüj tüpüne agar ve steril cam boncuklarla modifiye edilmiş 25 mL PDB ekleyin ve misel matını parçalamak için 5 dakika vorteksleyin.
- Büyük misel parçalarının kromatografi püskürtücüyü tıkamamasını sağlamak için iğne ucu olan steril bir şırınga kullanarak misel süspansiyonunu bir kromatografi püskürtücüsüne aktarın.
- Ortam süspansiyonunu uygularken plaka ile el temasını azaltmak için önceden geliştirilmiş TLC plakalarını laminer akışlı bir başlıkta steril kağıt havluların üzerine yerleştirin.
- Hava basıncını yaklaşık 4 bar'a yükseltin ve TLC plakasına üç kat süspansiyon uygulayın, böylece plakanın uygulamalar arasında tamamen kurumasını sağlayın.
NOT: Üç katmanın en uygun miktar olduğu bulunmuştur. Bundan daha azı ve patojenin büyümesi için yeterli ortamı yoktur. Bundan daha fazlası, ortam çok kalındır ve bu da aktif metabolitlerle patojen temasına izin vermeyebilir. - Sterilize edilmiş bir plastik tabak kutusuna 500 mL steril su ekleyin ve nemi tutmak için her iki tarafa sterilize edilmiş katlanmış selüloz levhalar veya filtre kağıdı yerleştirin.
- Doldurulmuş tahlil plakasını kutudaki dört boş Petri kabına yerleştirin.
- Testi 3 gün ila 1 hafta boyunca veya pozitif kontroller ve inhibisyon bölgesi (ZOI'ler) dışında TLC plakası boyunca eşit bir misel tabakası eşit şekilde büyüyene kadar inkübe edin.
7. Sıvı kromatografisi kütle spektrometresi analizi
- Tamamlanan tahlili fotoğraf kullanarak görüntüleyin.
- Alt satırdan ZOI'ye olan mesafeyi, alt satırdan üst satıra olan mesafeye bölerek her bir inhibisyon bölgesi için tutma faktörünü hesaplayın.
- Silikayı inhibisyon bölgelerinden kazıyın ve mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.
- Her tüpe 500 μL metanol ekleyin ve metabolitleri silikadan çıkarmak için girdap yapın.
- 10 dakika boyunca 20 ° C'de 8.500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı küçük bir şişeye aktarın.
- Döner buharlaştırma veya bir nitrojen akışı altında kuruyana kadar buharlaştırın.
- Ekstraktı bir LC şişesinde 50 μL metanol içinde yeniden süspanse edin.
- LC-MS ile inhibisyon bölgesindeki metabolitleri analiz edin ve ham ekstrakttaki hangi metabolitlerin patojenin16 inhibisyonundan sorumlu olduğunu belirlemek için bunları ham ekstrakttaki metabolitlerle karşılaştırın.
- Kaynak mikroorganizmanın cinsini ve türünü ve ZOI'de tanımlanan kitleleri kullanarak, metabolitleri tanımlamak için literatürü ve Antibase ve Doğal Ürünler Sözlüğü gibi ilgili veritabanlarını araştırın.
Sonuçlar
Mikrobiyal ekstraktların TLC ile ayrılması üzerine, metabolitler TLC plakası boyunca dikey olarak dağıtılmalıdır. Görünür ışık altında, görünür ışık aralığında emilmeyen metabolitleri görmek zor olabilir. Bu nedenle, UV ışığı altında görüntüleme, Şekil 2A, B'de görüldüğü gibi metabolitlerin ayrılmasını görmeye yardımcı olabilir. İnkübasyon süresinden sonra, patojen, Şekil 2C'de gösterildiği gibi, pozitif kontroller ve aktif metabolitlerin bulunduğu inhibisyon bölgeleri dışında tüm plaka boyunca eşit şekilde büyüyor gibi görünmelidir.
Şekil 2: Mikrobiyal ekstraktların TLC ile ayrılması. (A) Mantar aşısı uygulamasından önce görünür ışık altında ve (B) 320 nm UV ışığı altında görüntülenen dokuz Bacillus özütü içeren geliştirilmiş TLC plakası. (C) Pozitif kontroller etrafında büyümenin inhibe edildiği durumlar ve her bir ekstraktın ZOI'si dışında, plaka boyunca gözlenen patojen büyümesi ile tamamlanmış biyootografi testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
İnhibisyon bölgelerinden ekstrakte edilen metabolitler, LC-MS ile analiz edilir ve patojene karşı antagonizmadan sorumlu NP'leri belirlemek için ham ekstrakt ile karşılaştırılır. Eşleşen metabolitler, bir eşleşme olarak kabul edilmek için aynı tutma süresine ve moleküler iyon türlerine sahip olmalıdır. Aktif metabolitler tanımlandıktan sonra, bakteri kültürü, yapısal kimya veya biyolojik çalışma için ilgilenilen aktif metabolitleri izole etmek için toplu olarak büyütülebilir.
Tartışma
TLC-DB, değerli ve köklü bir NP araştırma aracıdır ve mikroplaka biyotahlil kılavuzlu izolasyon yöntemlerine basit ve ucuz bir alternatiftir17. Sıvı kromatografi teknikleri kullanılarak metabolit ayrımı gerektiren mikroplaka tahlillerine kıyasla minimum zaman ve malzeme kaynağı gerektirir. 18,19,20,21,22,23 enzim inhibitörlerine ek olarak antibakteriyel, antifungal, anti-parazitik ve antioksidan NP'leri tespit etmek için kullanılabilen çok yönlü bir testtir. En yaygın olarak biyoaktif fitokimyasalları tespit etmek ve tanımlamak için kullanılsa da, bu protokolde18 keşfedildiği gibi aynı yöntem bakteriyel NP'ler için de uygulanabilir. Ek olarak, protokol, yeni biyoaktif NP'lerin keşfedilmesine ve değerlendirilmesine yardımcı olmak için çeşitli NP kaynakları ve hedef patojenlerle kullanım için optimize edilebilir.
Bakteri üremesi için kullanılan ortam ve ekstraksiyon için kullanılan çözücü, doğal ürün keşif sonuçlarını büyük ölçüde etkileyebilir. Bu protokolde kullanılan besiyeri, Pseudomonas ve Bacillus spp. dahil olmak üzere siklik lipopeptitler üreten bakteriler için optimize edilmiştir. Ancak diğer cinsler araştırılıyorsa diğer ortam ve besin kaynakları da göz önünde bulundurulmalıdır. Bir izolattan metabolit çeşitliliğinin tam genişliğini değerlendirmek için bir dizi ortamda yetiştirilen aynı mikroorganizmayı kullanarak TLC-DB'yi tamamlamayı seçebilir veya daha geniş bir izolat aralığı için aynı büyüme koşullarını kullanabilir. Ekstraksiyon çözücüsü seçimi, tespit edilen doğal ürünleri de etkiler. Genel olarak, çoğu biyoaktif NP'nin düşük ila orta derecede polariteye sahip olduğu anlaşılır, bu da etil asetatı düşük kaynama noktası nedeniyle uygun bir seçim haline getirir ve bu da çıkarılmasını kolaylaştırır. Bununla birlikte, polar ve polar olmayan fraksiyonlar da incelenmek istenirse, diğer çözücülerle çoklu ekstraksiyonlar gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, hücresiz ekstrakt liyofilize edilebilir ve ortama salınan tüm metabolitleri görmek için tahlilde kullanılabilir. Bununla birlikte, liyofilize malzemedeki kurutulmuş ortam bileşenlerini hesaba katmak için TLC plakasına genellikle daha fazla malzeme yüklenmesi gerekecektir. Benzer şekilde, bu yöntem inokulum gibi farklı bir patojen ile kullanılıyorsa, TLC-DB testi için kullanılan 5 agar miselyum plakasını elde etmek için kullanılan ortam ve inkübasyon koşulları optimize edilmelidir.
TLC-DB, en ince agar ve inokulum tabakasını kullandığından, metabolitlerin agar tabakasına difüzyonuna olan bağımlılığı en aza indirdiği için temas ve daldırma biyootografisine kıyasla avantajlıdır, bu da daha az miktarda doğal ürünün patojen inhibisyonunu indüklemesine izin verebilir17. TLC biyootografik yöntemleri kullanılarak daha önce yayınlanan bulgular, testi tamamlamak için patojenin bir spor süspansiyonunu kullanmıştır17. Bu, süspansiyon konsantrasyonu üzerinde hassas kontrole izin verse de, belirli mantarların24 sporlanmasını indüklemek son derece zor ve zaman alıcı olabilir. Bu modifikasyon, testi büyük ölçüde basitleştirir ve sporlanması zor olan ve bu yöntem için daha önce kaçınılmış olabilecek mantar patojenleri kullanılarak testin tamamlanmasına izin verir.
Testte kullanılan bakteri özütü kütlesi sonuçları etkileyebilir. TLC plakasına çok az ekstrakt uygulanırsa, aktif bir bileşiğin minimum inhibitör konsantrasyonunun aşılamaması ve biyoaktivitenin tespit edilmemesi mümkündür. Sonuç olarak, bazı durumlarda ve Şekil 1 ve Şekil 2'de görüldüğü gibi, aktiviteyi kolayca tespit etme yeteneği için ayırmayı tehlikeye atarak TLC plakasını aşırı yüklemeye değer. Benzer şekilde, plakaya püskürtülen patojen yükü çok düşük olmamalıdır, çünkü patojen büyümesini desteklemek için yeterli ortam uygulanmayacaktır. Bu yöntem, çeşitli bakteri ekstraktlarını ve patojenleri barındıracak şekilde kolayca ayarlanabilir ve protokolde belirtilen mikrobiyal ekstrakt ve inokulum miktarları, çoklu patojenler ve mikrobiyal ekstraktlar için biyoaktivitenin tespit edilebilmesini sağlamıştır. Testin tamamlanmasından sonra herhangi bir inhibisyon bölgesi gözlenmezse, aşağıdakilerden birini gösterebilir. İlk olarak, bakteri üremesi için uyumsuz ortamın kullanılması veya bakteri aktivitesinin NP üretiminin bir sonucu olmaması nedeniyle uygulanan ekstraktta aktif metabolitler bulunmayabilir. Ekstrakt ile bir disk difüzyon testi, ekstrakttaki aktif NP'lerin varlığını doğrulamak veya reddetmek için tamamlanabilir. Disk difüzyon testi patojen baskılanması göstermiyorsa, diğer koşulların biyoaktif NP'ler üretip üretmediğini belirlemek için diğer ortamlar test edilebilir. Disk difüzyon testi, ekstraktın patojeni baskıladığını gösteriyorsa, TLC plakasına daha büyük bir bakteri ekstraktı kütlesinin uygulanması gerekebilir, bu durumda başka bir test denenebilir.
ZOI'deki metabolitleri ham ekstrakt ile karşılaştırmak, aktif NP'leri tanımlamak için çok önemlidir. Tahlilde, ham ekstrakttan gelen metabolitler, LC-MS yoluyla gözlemlenebilen patojen tarafından metabolize edilebilir veya modifiye edilebilir. Bu nedenle, yalnızca hem ham ekstraktta hem de ZOI'de meydana gelen metabolitler, incelenen bakteriler tarafından üretilen NP'ler olarak kabul edilebilir. ZOI'den ekstrakte edilen metabolitler ham ekstrakttaki metabolitlerle ilişkilendirilemezse, adım 5'te tarif edildiği gibi bir TLC plakası hazırlanabilir. Biyootografi testini tamamlamadan, tamamlanan tahlilde gözlenen aynı tutma süresinde metabolitleri TLC plakasından çıkarın. Bu, ZOI'lerdeki metabolitler ile ham ekstrakt arasında daha kolay bir korelasyona izin vermeli ve patojen baskılanmasına neden olmalıdır.
TLC-DB'nin bir dezavantajı, TLC'nin çözünürlüğünün, ayırma için sıvı kromatografisi gerektiren geleneksel mikro kuyu tarama teknikleri kullanıldığında elde edilenden önemli ölçüde daha düşük olmasıdır. Bu nedenle, bazı metabolitlerin biyoaktiviteye katkıda bulunmayabileceği inhibisyon bölgesinde çoklu metabolitlerin bulunması yaygındır. Bu sorun, biyoaktiviteyi daha net gözlemlemek için TLC plakasının aşırı yüklenmesi uygulamasından da kaynaklanabilir. Son çalışmalar, çözünürlüğü büyük ölçüde artıran ve geleneksel TLC14,21,22,23 kullanıldığında imkansız olan TLC geliştirmenin otomasyonuna izin verebilen yüksek performanslı TLC (HP-TLC) kullanılarak yayınlanmıştır. Ayrıca, benzer tutma sürelerine sahip metabolitleri daha da ayırmak için ikinci bir boyutta (2D-TLC) plakalar geliştirilebilir. Bununla birlikte, artan zaman ve malzeme maliyetinin, HP ve 2D-TLC25'ten elde edilen artan çözünürlük için değerli bir uzlaşma olup olmadığı değerlendirilmelidir.
Açıklamalar
Dr. Susan Boyetchko, bu çalışmanın sunulmasından önce vefat etti (8 Şubat 2023). Diğer tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.
Teşekkürler
Bu araştırmanın mümkün kılındığı finansman için Tarım ve Tarım-Gıda Kanada'ya minnetle teşekkür ederiz (J-001843 ve J-002021 projeleri). Brett van Heyningen'e bu protokol için video içeriğini çektiği için teşekkür ederiz. Ayrıca, eski lisansüstü öğrencilerine (Jennifer Vacon ve Mark Nabuurs) bu makalede açıklanan yöntemlere ilişkin görüşleri için teşekkür ederiz.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0,5-5 mL tek kanallı Pipet | VWR | CA11020-004 | |
| 10 mL İnce Tabaka Kromatografisi Püskürtücü | VWR | KT422530-0010 | |
| 100 x 15 mm Petri plakaları | VWR | 89038-970 | |
| 100-1000 & mikro; L pipet uçları | VWR | 76322-164 | |
| 100-1000 ve mikro; L tek kanallı pipet | VWR | 76169-240 | |
| 15 mL steril santrifüj tüpleri | VWR | CA21008-918 | |
| 1 L cam şişe | Millipore Sigma | CLS13951L | Otoklav güvenli olmalıdır |
| İğneli 1 mL steril şırınga | Thomas Scientific | 8935L75 | Çıkarılabilir iğne önerilir |
| 2 mL Mikrosantrifüj tüpü | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL steril santrifüj tüpleri | VWR | CA21008-940 | |
| 5 mL pipet uçları | VWR | CA11020-008 | |
| 7 mL scintilasyon şişeleri | VWR | 76538-962 | |
| %95 etanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
| Otoklav | Cole-Parmer | UZ-01850-34 | 8 L, 115 VAC |
| Bakteriyolojik agar | VWR | 97064-336 | |
| bin | Thomas Scientific | 1216H91 | |
| D-Glikoz | VWR | BDH9230-500G | |
| Diklorometan ve ge; % 99,8 ACS | VWR | BDH1113-4LG | |
| Etil Asetat & ge; % 99,8 ACS | VWR | BDH1123-4LG | |
| Filtre kağıdı | VWR | CA28297-846 | |
| Öğütme Boncukları | VWR | 12621-148 | |
| Higromisin B | VWR | CA80501-074 | |
| Demir Sülfat Heptahidrat | VWR | 97061-542 | |
| Laminer akış başlığı | CleanTech | 1000-6-A | |
| LC-MS | Sular | LITR10064178 | UPLC / MS / MS TQD sistemi |
| Liyofilizatör | Labconco | 700201000 | Sıcaklık kolektörü ve -50 ° C; C |
| Manganez Sülfat Hidrat | VWR | CAAA10807-14 | |
| Metanol & ge; % 99,8 ACS | VWR | BDH2018-5GLP | |
| Kağıt havlu | VWR | 89402-824 | |
| Patates Dekstroz Agar | VWR | CA90000-758 | |
| Patates Dekstroz Suyu | VWR | CA90003-494 | |
| Potsasyum Fosfat Dibazik | VWR | 470302-246 | |
| Potsasium Fosfat Monobazik | VWR | 470302-252 | |
| Basınç Göstergesi 6mm Rakor Düz 0-10 bar (0-145 psi) | Tameson | F25U6 | |
| Pseudomonas F Agar | VWR | 90003-352 | Flo Agar |
| PTFE Boru | Sigma Aldrich | 58697-U | 1/16 inç iç çap |
| Sodyum Klorür | VWR | BDH9286-500G | |
| Spatula | VWR | 82027-490 | |
| İğneli Steril Aşılama halkaları | VWR | 76534-512 | |
| Folyo Thomas | Scientific | 1086F24 | Süpermarketten satın alınabilir |
| TLC Silika Jel 60 RP-18 F254S 25 Cam Tabak 20 X 20 cm | Thomas Scientific | 1205Q12 | |
| Vakum Pompası | Labconco | 1472100 | 98 L/dak |
| Vorteks | VWR | 76549-928 | 15 mL ve 50 mL santrifüj tüplerini eklemelidir |
| Whatman sıralı HEPA-VENT | Millipore Sigma | WHA67235000 | 10 filtre, 1/4 ila 3/8 inç giriş/çıkış |
| VWR | 97063-370 |
Kaynaklar
- Fisher, M. C., et al. Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health. Nature. 484 (7393), 186-194 (2012).
- Savary, S., et al. The global burden of pathogens and pests on major food crops. Nat Ecol Evol. 3 (3), 430-439 (2019).
- Lin, B. B. Resilience in agriculture through crop diversification: Adaptive management for environmental change. BioSci. 61 (3), 183-193 (2011).
- Piquerez, S. J., Harvey, S. E., Beynon, J. L., Ntoukakis, V. Improving crop disease resistance: Lessons from research on arabidopsis and tomato. Front Plant Sci. 5, 671(2014).
- Damalas, C., Koutroubas, S. Current status and recent developments in biopesticide use. Agriculture. 8 (1), 13(2018).
- Syed Ab Rahman, S. F., Singh, E., Pieterse, C. M. J., Schenk, P. M. Emerging microbial biocontrol strategies for plant pathogens. Plant Sci. 267, 102-111 (2018).
- Tudi, M., et al. Exposure routes and health risks associated with pesticide application. Toxics. 10 (6), 335(2022).
- Santos, E. N., et al. Bacillus thuringiensis: From biopesticides to anticancer agents. Biochimie. 192, 83-90 (2022).
- Kumar, J., Ramlal, A., Mallick, D., Mishra, V. An overview of some biopesticides and their importance in plant protection for commercial acceptance. Plants. 10 (6), 1185(2021).
- Marrone, P. Pesticidal natural products - status and future potential. Pest Manag Sci. 75 (9), 2325-2340 (2019).
- Ayilara, M. S., et al. Biopesticides as a promising alternative to synthetic pesticides: A case for microbial pesticides, phytopesticides, and nanobiopesticides. Front. Microbiol. 14, 1040901(2023).
- Abdelaziz, A. M., et al. Biocontrol of soil borne diseases by plant growth promoting rhizobacteria. Trop. Plant Pathol. 48 (2), 105-127 (2023).
- Zhao, Z., Liu, D., Ruan, L., Wang, T., Liang, Z. Antifungal mechanism of Bacillus amyloliquefaciens SC-B15 and its application in cereal mildewproof and grape preservation. Food Biosci. 56, 103287(2023).
- Jamshidi-Aidji, M., Dimkic, I., Ristivojevic, P., Stankovic, S., Morlock, G. Effect-directed screening of bacillus lipopeptide extracts via hyphenated high-performance thin-layer chromatography. J Chromatogr A. 1605, 460366(2019).
- Prichystal, J., Schug, K. A., Lemr, K., Novak, J., Havlicek, V. Structural analysis of natural products. Anal Chem. 88 (21), 10338-10346 (2016).
- De Souza, C. G., et al. Simultaneous quantification of lipopeptide isoforms by UPLC-MS in the fermentation broth from Bacillus subtilis CNPMS22. Anal Bioanal Chem. 410 (26), 6827-6836 (2018).
- Dewanjee, S., Gangopadhyay, M., Bhattacharya, N., Khanra, R., Dua, T. Bioautography and its scope in the field of natural product chemistry. J Pharm Anal. 5 (2), 75-84 (2015).
- Choma, I., Jesionek, W. TLC-direct bioautography as a high throughput method for detection of antimicrobials in plants. Chromatography. 2 (2), 225-238 (2015).
- Attia, R., et al. Thin-layer chromatography-bioautographic method for the detection of arginase inhibitors. J Sep Sci. 43 (12), 2477-2486 (2020).
- Legerska, B., Chmelova, D., Ondrejovic, M. TLC-bioautography as a fast and cheap screening method for the detection of alpha-chymotrypsin inhibitors in crude plant extracts. J Biotechnol. 313, 11-17 (2020).
- Agatonovic-Kustrin, S., Doyle, E., Gegechkori, V., Morton, D. W. High-performance thin-layer chromatography linked with (bio)assays and FTIR-ATR spectroscopy as a method for discovery and quantification of bioactive components in native Australian plants. J Pharm Biomed Anal. 184, 113208(2020).
- Hilaire, V., et al. New method for screening anti-leishmania compounds in plants extracts by HPTLC-bioautography. J Chromatogr B. 1188, 123061(2022).
- Stankovic, J., et al. HPTLC-direct bioautography-guided isolation of isogeranic acid as the main antibacterial constituent of Artemisia santonicum essential oil. J Serb Chem Soc. 84 (12), 1355-1365 (2019).
- Su, Y., Qi, Y., Cai, L. Induction of sporulation in plant pathogenic fungi. Mycology. 3, 195-200 (2012).
- Wedge, E., Nagle, D. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J Nat Prod. 63, 1050-1054 (2000).
Yeniden basım ve izinler
