İnce Tabaka Kromatografisi-Doğrudan Biyootoografi ile Biyokontrol için Doğal Ürünlerin Biyotahlil Kılavuzluğunda Tanımlanması

Mantar tarımsal patojenleri, dünya çapında mahsul kalitesinde ve veriminde önemli kayıplara neden olarak, istikrarlı bir küresel gıda üretim sisteminin ekonomik ve tedarik zorluklarına katkıda bulunur ^1,2. Patojen hasarı, enfeksiyona dirençli çeşitlerin ıslahı ve patojen^{çoğalmasını bastırmak} için ürün rotasyonları ve arazi yönetimi uygulamaları dahil olmak üzere entegre ürün yönetim sistemleri kullanılarak önlenebilir^. Bu yöntemler ekinlere verilen zararı azaltsa da, kimyasal pestisitler genellikle tarladaki mantar üreme yapılarını aktif olarak öldürmek ve hasarı ve verim düşüşlerini daha da önlemek için birlikte kullanılır. Etkili olmasına rağmen, kimyasal pestisit kullanımı, çevredeki ekosistemlere zarar verme, toprak verimliliğinde düşüş, ilişkili insan sağlığı riskleri ve patojen direncinin gelişmesi gibi birçok dezavantaja sahiptir, ikincisi her yıl daha yüksek dozlarda pestisitlere ihtiyaç duyulmasına neden olur ^5,6,7.

Mikrobiyal bazlı haşere ve patojen yönetimi ürünleri uzun zamandır sentetik pestisitlere potansiyel alternatifler veya tamamlayıcı olarak kabul edilmektedir. 1900'lerin başından beri, Bacillus thuringiensis , tarımsal zararlıları ve patojenleri kontrol etmek için tohum muamelesi, yaprak spreyi ve doğrudan toprak işlemede yaygın olarak kullanılmaktadır⁸. Bu tür ürünler biyopestisitler olarak adlandırılmıştır ve hedef bir haşere veya patojeni öldürebilen, bastırabilen veya canlılığını azaltabilen doğal olarak oluşan mikroorganizmalar veya biyokimyasallar olarak karakterize edilir. Biyopestisitler, bir patojenin büyümesini çeşitli mekanizmalar yoluyla kontrol edebilir, ancak en yaygın olarak bunu ikincil metabolitlerin salgılanması yoluyla yapar⁹. Genellikle doğal ürünler olarak adlandırılan ikincil metabolitler, birincil metabolizmada yer almazlar, ancak diğer mikroorganizmaları geride bırakmak için evrimsel bir avantaj olarak üretilirler¹⁰.

Biyopestisitler, sentetik muadillerine göre birçok avantaj sunar. Sentetik haşere yönetimi ürünlerine kıyasla çevre, fauna ve insanlar için düşük toksisite riski oluştururlar ^9,10. Biyopestisitlerin çoğu binlerce yıldır çevrede doğal olarak var olduğundan, çevrede mikrobiyal metabolitler için biyolojik bozunma yolları mevcuttur, bu da toprak veya ekosistem kontaminasyonu olasılığını sınırlar ve sentetik pestisitlerin çevreye bu kadar zararlı olmasına katkıda bulunan kalma sürelerini azaltır¹¹. Ek olarak, patojen enfeksiyonunu hafifletmek için kullanılan birçok biyopestisit, besin biyoyararlanımını artırabilen ve bitki sistemik direncini indükleyebilen bitki büyümesini teşvik edici özellikler de sergiler¹².

En yaygın olarak, biyopestisitler mikrobiyal inokulum şeklinde uygulanır ve NP'ler canlı mikroorganizmalar tarafından yerinde salgılanır ^12,13. Böyle bir durumda, bir biyopestisitin aktivitesinin kaynağını belirlemek çok değerlidir. Bunu yapmak, biyopestisitin etki mekanizması hakkında bilgi sağlar, bir mikroorganizmanın patentli olarak korunması için bir dava oluşturulmasına yardımcı olur ve yapıları yeniyse önemli bir bilimsel etkiye sahip olabilir. Bununla birlikte, en önemlisi, biyoaktif kaynağın tanımlanması, bir sonraki biyopestisit ürünü için formülasyon olasılıkları hakkında bilgi verir. NP'nin kendisi aktifse, mikroorganizma büyük ölçekli biyopestisit üretimi için bir biyomolekül fabrikası olarak kullanılabilir. Ek olarak, biyokontrol için araştırılan birçok NP'nin insan tıbbında da potansiyel uygulamaları vardır ve bu da onları ekonomik olarak daha da değerli kılmaktadır⁸.

İnce tabaka kromatografisi-doğrudan biyootografi (TLC-DB) testleri, biyopestisit metabolitlerin biyoaktivite kılavuzluğunda izolasyonu ve tanımlanması için ucuz ve basit bir yöntemdir. Teknik, fitokimyasalların biyoaktivite testini ham bitki ekstraktlarından ayırmak için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, mikrobiyal ekstraktların analizi için de büyük bir potansiyele sahiptir¹⁴. TLC, ham bir mikrobiyal ekstraktta NP'lerin hızlı ve ucuz bir şekilde ayrılmasını sağlar ve bir ortam patojeni süspansiyonu ile kaplandıktan sonra, aktif metabolitler içeren bölgeler kolayca görselleştirilir. Bu bölgeler plakadan kazınabilir ve bilinen metabolitleri tanımlamak için kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile kimyasal analiz için ekstrakte edilebilir. Daha önce bildirilen bileşiklerle eşleşmeyen metabolitler, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ve X-ışını kristalografisi¹⁵ gibi teknikler kullanılarak yapı aydınlatma çalışmalarına tabi tutulmak üzere sıvı kromatografisi yoluyla daha büyük miktarlarda izole edilebilir.

Bu makale, Bacillus spp. ve tarımsal patojen Sclerotinia sclerotiorum ile TLC-DB kullanarak biyopestisit NP'leri keşfetmek ve tanımlamak için bir model sistemi açıklamaktadır. Şekil 1 , TLC-DB prosedürüne şematik bir genel bakış sağlar.

Şekil 1: TLC-DB prosedürünün 4-7 adımlarına şematik genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Mikrobiyal biyokontrol adaylarının seçilmesi

1. Rekabet plakası tahlillerini kullanarak, ilgilenilen patojene karşı antagonizma gösteren mikrobiyal izolatları seçin.
   NOT: Bu protokolü göstermek için Bacillus atrophaeus, mojavensis ve subtilis türleri de dahil olmak üzere S. sclerotiorum'a karşı antagonizma sergileyen dokuz Bacillus izolatı seçilmiştir.

2. Medya hazırlığı

1. Litre suya 39 g orta maddeyi çözerek patates dekstroz agar (PDA) hazırlayın.
2. Bir litre suya 45 g ortam ekleyerek Pseudomonas F agar'ı hazırlayın.
3. Litre suya 24 g orta ve 0.24 g agar ekleyerek% 1 agar ile patates dekstroz suyu (PDB) hazırlayın.
4. Maya-glikoz-manganez (YGM) suyu hazırlayın. 100 mL su içinde 2.5 g KH₂PO₄ ve 2.5 g K₂HPO₄ ve 0.58 g MnS04 içeren bir tuz çözeltisinden oluşan bir tampon çözelti oluşturun. 100 mL su içinde H₂0, 0.5 g NaCl ve 0.05 g FeSO 4.7H₂0.
   1. Daha sonra, metal tuzlarının çözelti içinde çökelmemesini sağlamak için 1 g maya özütü, 1.25 g dekstroz, 400 mL su, 5 mL tampon çözeltisi, 5 mL tuz çözeltisi ve 90 mL su ekleyin.
5. Ortamı otoklavla sterilize edin, agarı 100 x 15 mm Petri plakalarına dökün ve kullanmadan önce oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

3. Patojen hazırlama

1. Beş tabak Sclerotinia sclerotiorum'u PDA (adım 2.1'de hazırlanan) üzerinde kültürleyin ve 3 gün boyunca 25 ° C'de inkübe edin.

4. Doğal ürün özü hazırlama

1. Her bakteri izolatını Pseudomonas F Agar (adım 2.2'de hazırlanmıştır) üzerinde kültürleyin ve tek tek koloniler gözlenene kadar büyütün.
2. Tek bakteri kolonilerini santrifüj veya kültür tüplerinde 25 mL YGM ortamına subkültür yapın ve 3 gün çalkalayarak inkübe edin.
3. Her ekstraktın 5 mL alikotunu 1 L YGM'ye aktarın ve aynı koşullarda 3 gün daha inkübe edin.
4. Hücreleri peletlemek için her kültürü 3000 x g'da 25 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
5. Kültür ortamından metabolitleri çıkarmak için süpernatanı üç kez boşaltın ve etil asetat ile yıkayın.
6. Döner buharlaştırma kullanarak her birinin etil asetat tabakasını birleştirin ve kurutun.
7. Ekstraktı minimum metanol içinde yeniden çözün, küçük bir sintilasyon şişesine aktarın ve döner buharlaştırma ile tekrar kurutun.
   NOT: Ekstrakt yağlı veya reçineli bir malzemeye kurursa, doğru bir şekilde tartılabilen kuru bir toz elde etmek için malzemeyi liyofilize edin.

5. TLC plaka hazırlama

1. 20 cm x 20 cm TLC plakayı, plakanın altından 2 cm ve üstünden 2 cm bir çizgi çizerek hazırlayın. Alt satıra, 2 cm aralıklarla dokuz nokta yerleştirin. Üst çizginin üzerine 4 cm aralıklarla dört nokta yerleştirin.
2. Her ekstraktın 5 mg'ını 15 μL metanol içinde çözün ve bir pipet kullanarak alt satırda işaretlenmiş dokuz noktaya her ekstrakttan 5 μL uygulayın. Her bir ekstrakt noktasını TLC plakasında kurumaya bırakın ve aynı noktaya 5 μL daha alikot uygulayın. Tüm malzeme TLC plakasına yüklenene kadar tekrarlayın.
3. TLC plakasını, çözücü plakanın üstünden 2 cm uzakta işaretlenen çizgiye ulaşana kadar (yaklaşık 45 dakika) 1: 2 diklorometan ve metanol çözeltisi kullanarak gelişmekte olan bir tankta geliştirin.
4. Geliştirildikten sonra, TLC plakasını çıkarın ve çözücü çizgisinin üzerinde işaretlenmiş dört nokta üzerinde bir dizi pozitif kontrol uygulayın. Aynı kontrolün dört konsantrasyonu kullanılır. S. scl. için 0.5 μg/mL, 5 μg/mL, 50 μg/mL ve 500 μg/mL Higromisin B pozitif kontrollerdir.
5. Tüm çözücü plakadan buharlaşmadan önce, etanol ile sterilize edilmiş bir TLC plaka kutusuna yerleştirin.

6. Doğrudan biyootografi testi

1. Tahlilde kullanılacak malzemeleri (kromatografi püskürtücünün cam bileşenleri, metal spatula, dört yaprak kağıt havlu, selüloz veya filtre kağıdı, su ve ortam) teneke ile kaplı büyük bir beherde otoklavlayın.
   NOT: Kağıt malzemeler (kağıt havlu, selüloz kağıt) otoklavda ıslanmamak için kalay folyoya sarılmalıdır.
2. Etanol ile sterilize edilmiş PTFE boru kullanarak bir hava kaynağı, basınç göstergesi ve kromatografi püskürtücü bağlayın. Kromatografi püskürtücü ile manometre arasına bir HEPA filtresi bağlayın.
3. Steril metal spatula kullanarak beş patojen plakasının misel matını steril bir spatula kullanarak 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın.
   NOT: Gerekirse miselin yerinden çıkmasına yardımcı olmak için az miktarda sıvı et suyu kullanın ve steril bir pipetle aktarın.
4. 50 mL santrifüj tüpüne agar ve steril cam boncuklarla modifiye edilmiş 25 mL PDB ekleyin ve misel matını parçalamak için 5 dakika vorteksleyin.
5. Büyük misel parçalarının kromatografi püskürtücüyü tıkamamasını sağlamak için iğne ucu olan steril bir şırınga kullanarak misel süspansiyonunu bir kromatografi püskürtücüsüne aktarın.
6. Ortam süspansiyonunu uygularken plaka ile el temasını azaltmak için önceden geliştirilmiş TLC plakalarını laminer akışlı bir başlıkta steril kağıt havluların üzerine yerleştirin.
7. Hava basıncını yaklaşık 4 bar'a yükseltin ve TLC plakasına üç kat süspansiyon uygulayın, böylece plakanın uygulamalar arasında tamamen kurumasını sağlayın.
   NOT: Üç katmanın en uygun miktar olduğu bulunmuştur. Bundan daha azı ve patojenin büyümesi için yeterli ortamı yoktur. Bundan daha fazlası, ortam çok kalındır ve bu da aktif metabolitlerle patojen temasına izin vermeyebilir.
8. Sterilize edilmiş bir plastik tabak kutusuna 500 mL steril su ekleyin ve nemi tutmak için her iki tarafa sterilize edilmiş katlanmış selüloz levhalar veya filtre kağıdı yerleştirin.
9. Doldurulmuş tahlil plakasını kutudaki dört boş Petri kabına yerleştirin.
10. Testi 3 gün ila 1 hafta boyunca veya pozitif kontroller ve inhibisyon bölgesi (ZOI'ler) dışında TLC plakası boyunca eşit bir misel tabakası eşit şekilde büyüyene kadar inkübe edin.

7. Sıvı kromatografisi kütle spektrometresi analizi

1. Tamamlanan tahlili fotoğraf kullanarak görüntüleyin.
2. Alt satırdan ZOI'ye olan mesafeyi, alt satırdan üst satıra olan mesafeye bölerek her bir inhibisyon bölgesi için tutma faktörünü hesaplayın.
3. Silikayı inhibisyon bölgelerinden kazıyın ve mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.
4. Her tüpe 500 μL metanol ekleyin ve metabolitleri silikadan çıkarmak için girdap yapın.
5. 10 dakika boyunca 20 ° C'de 8.500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı küçük bir şişeye aktarın.
6. Döner buharlaştırma veya bir nitrojen akışı altında kuruyana kadar buharlaştırın.
7. Ekstraktı bir LC şişesinde 50 μL metanol içinde yeniden süspanse edin.
8. LC-MS ile inhibisyon bölgesindeki metabolitleri analiz edin ve ham ekstrakttaki hangi metabolitlerin patojenin¹⁶ inhibisyonundan sorumlu olduğunu belirlemek için bunları ham ekstrakttaki metabolitlerle karşılaştırın.
9. Kaynak mikroorganizmanın cinsini ve türünü ve ZOI'de tanımlanan kitleleri kullanarak, metabolitleri tanımlamak için literatürü ve Antibase ve Doğal Ürünler Sözlüğü gibi ilgili veritabanlarını araştırın.

Mikrobiyal ekstraktların TLC ile ayrılması üzerine, metabolitler TLC plakası boyunca dikey olarak dağıtılmalıdır. Görünür ışık altında, görünür ışık aralığında emilmeyen metabolitleri görmek zor olabilir. Bu nedenle, UV ışığı altında görüntüleme, Şekil 2A, B'de görüldüğü gibi metabolitlerin ayrılmasını görmeye yardımcı olabilir. İnkübasyon süresinden sonra, patojen, Şekil 2C'de gösterildiği gibi, pozitif kontroller ve aktif metabolitlerin bulunduğu inhibisyon bölgeleri dışında tüm plaka boyunca eşit şekilde büyüyor gibi görünmelidir.

Şekil 2: Mikrobiyal ekstraktların TLC ile ayrılması. (A) Mantar aşısı uygulamasından önce görünür ışık altında ve (B) 320 nm UV ışığı altında görüntülenen dokuz Bacillus özütü içeren geliştirilmiş TLC plakası. (C) Pozitif kontroller etrafında büyümenin inhibe edildiği durumlar ve her bir ekstraktın ZOI'si dışında, plaka boyunca gözlenen patojen büyümesi ile tamamlanmış biyootografi testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İnhibisyon bölgelerinden ekstrakte edilen metabolitler, LC-MS ile analiz edilir ve patojene karşı antagonizmadan sorumlu NP'leri belirlemek için ham ekstrakt ile karşılaştırılır. Eşleşen metabolitler, bir eşleşme olarak kabul edilmek için aynı tutma süresine ve moleküler iyon türlerine sahip olmalıdır. Aktif metabolitler tanımlandıktan sonra, bakteri kültürü, yapısal kimya veya biyolojik çalışma için ilgilenilen aktif metabolitleri izole etmek için toplu olarak büyütülebilir.

Dr. Susan Boyetchko, bu çalışmanın sunulmasından önce vefat etti (8 Şubat 2023). Diğer tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.