Yöntem makalesi

Transepitelyal Elektriksel Empedans İzleme ile Gözenekli Substrat Bazlı Elektroporasyon

DOI:

10.3791/66971

⸱

27 Eylül 2024

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 3Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gözenekli substrat elektroporasyonu (PSEP), tutarlı, yüksek verimli iletimi yüksek hücre canlılığı ile eşleştirir. Transepitelyal elektrik empedans (TEEI) ölçümlerinin tanıtılması, PSEP'in ara süreçleri hakkında bilgi sağlar ve etiketsiz teslimata olanak tanır. Bu makalede, PSEP dağıtım deneylerini ve TEEI ölçüm analizini aynı anda gerçekleştirmek için bir yöntem tartışılmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gözenekli substrat elektroporasyonu (PSEP), yüksek verim ve tutarlı teslimat sağlayan yeni ortaya çıkan bir elektroporasyon yöntemidir. Diğer birçok hücre içi doğum türü gibi, PSEP de başarılı doğumu belirlemek için büyük ölçüde floresan belirteçlere ve floresan mikroskobuna dayanır. Elektroporasyon işleminin ara adımları hakkında bilgi edinmek için, entegre transepitelyal elektriksel empedans (TEEI) izlemeye sahip bir PSEP platformu geliştirilmiştir. Hücreler, gözenekli zarlara sahip ticari olarak temin edilebilen eklerde kültürlenir. 12 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra, tamamen birleşik bir hücre tek tabakasının oluşumuna izin vermek için, ekler PSEP cihazının kuyucuklarında bulunan transfeksiyon ortamına yerleştirilir. Hücre tek katmanları daha sonra kullanıcı tanımlı bir dalga formuna tabi tutulur ve dağıtım verimliliği floresan mikroskobu ile doğrulanır. Bu iş akışı, PSEP süreci hakkında ek veri toplamak için darbeli ve floresan mikroskobu arasındaki TEEI ölçümleriyle önemli ölçüde geliştirilebilir ve bu ek TEEI verileri, teslimat verimliliği ve uygulanabilirliği gibi teslimat ölçümleriyle ilişkilendirilir. Bu makalede, TEEI ölçümleriyle PSEP gerçekleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporasyon, hücrelerin bir elektrik alanına maruz bırakıldığı, hücre zarında proteinler, RNA ve DNA dahil olmak üzere kargolarıngeçebileceği geçici gözenekler oluşturduğu bir tekniktir 1,2. En yaygın kullanılan versiyon toplu elektroporasyondur (BEP). BEP, bir küvetin milyonlarca hücre içeren bir elektrolit ile doldurulması, elektrolitin yüksek voltaja maruz bırakılması ve yükün difüzyon veya endositoz1 yoluyla hücrelere girmesine izin verilmesiyle gerçekleştirilir. BEP'in yüksek verim ve ticari olarak temin edilebilen çok sayıda sistem dahil olmak üzere birçok avantajı vardır. Ancak, BEP dağıtımında sınırlamalar vardır. Elektrotlara göre tutarsız hücre konumlandırması ve bitişik hücrelerden gelen elektrik alan koruması, BEP 3,4 sırasında elektrik alanına maruz kalmada önemli değişkenliğe neden olur. BEP için gereken yüksek voltaj ayrıca hücre canlılığı üzerinde önemli bir olumsuz etkiye sahiptir5. 2011'dekibaşlangıcından bu yana6, gözenekli substrat elektroporasyonu (PSEP) adı verilen bir elektroporasyon yöntemine artan bir ilgi olmuştur, ancak bazen lokalize elektroporasyon ve nano veya mikro elektroporasyon 1,7,8 dahil olmak üzere başka isimlerle anılmaktadır. BEP'in hücre süspansiyonunun aksine, PSEP gözenekli bir substrata yapışan hücreler üzerinde gerçekleştirilir. İnsan hücre hatlarının9 çoğunluğu için sadece yapışık bir durum tercih edilmekle kalmaz, aynı zamanda substrattaki gözenekler de elektrik akımına odaklanır ve transmembran elektrik potansiyelini (TMP) hücre zarının10,11 belirli bölgelerine lokalize eder. Bu lokalizasyon, uygulanan voltajda önemli bir azalmaya, hasarı azaltmaya ve hücre canlılığını artırmaya izin verir. Bu etki kombinasyonu, hücre zarı gözenek gelişimini kontrol etmeye yardımcı olarak daha tutarlı ve verimli bir teslimat sağlar 1,5,12.

Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, ilk olarak Vindis ve ark.14 tarafından tanıtılan, ticari olarak temin edilebilen gözenekli membran eklerini13 (Şekil 1A,B) tutmak için altı kuyulu, altın kaplama elektrot dizisine sahip bir PSEP cihazı tanıtıldı. Cihaz, gerçek zamanlı olarak13 olarak transepitelyal elektrik empedansı (TEEI) olarak bilinen hücre tek tabakası boyunca darbeler uygulayabilir ve elektrik empedansını ölçebilir. Cihazın kullanıcı arayüzü, elektroporasyon dalga formu ve polaritesi üzerinde tam kontrol sağlar. Daha da önemlisi, gerçek zamanlı empedans ölçümleri, etiketsiz teslimat15 olarak bilinen bir kavram olan pahalı reaktiflere veya floresan işaretleyicilere ihtiyaç duymadan teslimat sonuçlarını tahmin etmek için kullanılabilir.

PSEP platformu iki ana özel elektrik bileşeninden oluşur: darbe üreteci ve TEEI ölçüm ekipmanını barındıran cihazın ana gövdesi ve gözenekli alt tabakaların yerleştirildiği ve elektroporasyonun gerçekleştiği elektrot dizisi. Tüm özel elektronikler ve 3D baskılı bileşenler için diyagramlar GitHub'da bulunabilir: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. Özel elektroniklere ek olarak, platformun düzgün çalışması için bir bilgisayar da gereklidir. Özel yazılımın çalışması için MATLAB (sürüm 2021a veya üzeri) ve analiz için verileri depolamak ve verilere erişmek için Microsoft Excel gerekir. Program, özel elektronikleri kontrol eder ve ayarları yapmak için grafik kullanıcı arayüzü (GUI) sağlar. Bu programlar ayrıca GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI'da da kullanıma sunuldu.

Ön veriler, bu işlemin farklı yapışık hücre türleri için mümkün olduğunu göstermektedir (Şekil 1C), ancak bu makale yalnızca Brooks ve ark.13 tarafından bu hücre hattı için optimal olduğu tespit edilen parametreleri kullanarak A431 hücrelerinin hazırlanmasını tartışacaktır. Ek olarak, propidyum iyodür (PI) kargosu sitotoksik olduğundan, ilki dağıtım verimliliğini ölçmek için yüksek konsantrasyonlu bir PI transfeksiyon ortamı ve ikincisi daha uzun zaman ölçeklerinde TEEI'yi ölçmek için yalnızca hücre kültürü ortamı olmak üzere iki deney gerçekleştirilir. Bu deneyler, sonuçların ilişkilendirilmesine izin veren aynı elektroporasyon dalga formlarını kullanır (Şekil 1D).

figure-introduction-1
Şekil 1: Elektrot dizisi montaj şeması ve temel veriler. (A) Elektrot dizisinin bir kuyusu içindeki bir ekin CAD modeli. (B) Elektrot dizisinin CAD modeli. (C) Seçili hücre hatları için PSEP'e bağlı empedans artışı, hücre hattı başına n = 3. Hata çubuğu: ortalamanın standart hatası. (D) Teslimat verimliliği vs. TEEI korelasyon verilerini artırır. Dağıtım verimliliği, dağıtım deneylerinden hem PI hem de kalsein görüntülerinde etiketlenen hücre sayısının Hoechst ile tanımlanan toplam hücre sayısına bölünmesiyle hesaplandı. Hücre sayısı, voltaj başına n = 6 olan özel bir CellProfiler işlem hattı kullanılarak belirlendi. Hata çubuğu: (x ve y ekseni) ortalamanın standart hatası. Bu figür Brooks ve ark.13'ten izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Reaktiflerin ve hücre kültürünün hazırlanması

  1. 500 mL'lik bir Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) kabına 50 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mL penisilin-streptomisin ekleyerek hücre kültürü ortamını hazırlayın. Kontaminasyon riskini azaltmak için on bir adet 50 mL'lik alikot üretin ve 4 °C'de soğutun.
  2. Üreticinin talimatlarına göre fosfat tamponlu salin (PBS) stok çözeltisinde 1 mL 25 μg / mL insan plazma fibronektini oluşturun.
  3. Değişen kargo konsantrasyonları ile deneylere izin vermek için DMEM stok çözeltisinde 15 mL 0.1 mg / mL propidyum iyodür oluşturun.
  4. Hazırlanan hücre kültürü ortamının 12 mL'sini içeren bir T75 şişesinde A431 hücrelerinin kültürü. % 50 birleşmeyi sağlamak için hücreler her 1-2 günde bir geçirildi.

2. Numune hazırlama

  1. Fibronektin kaplama
    1. On iki kesici uç ve iki adet 24 oyuklu plaka seçin. Ekleri bir kuyucuklu plakaya yerleştirin ve altılı iki sıra oluşturun. İkinci kuyu plakasını daha sonraya kadar bir kenara koyun.
    2. 1.5 mL'lik bir tüpte 52 μL fibronektin stok çözeltisi ve 1.248 μL PBS'yi karıştırarak 1.300 μL 1 μg / mL fibronektin çözeltisi oluşturun.
    3. Her bir eke 100 μL fibronektin çözeltisi dağıtın. Ekleri kuyu plakasında 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
  2. Optimize edilmiş hücre yoğunluğu için hücre konsantrasyonunun ayarlanması
    1. Fibronektin inkübasyonu tamamlanmadan yaklaşık 1 saat önce, hücre ekstraksiyonu için A431 hücrelerinin T75 şişesini inkübatörden çıkarın.
    2. Şişedeki ortamı bir aspiratör ile çıkarın ve 5 mL PBS ile yıkayın. PBS'yi aynı şekilde çıkarın ve 3 mL Tripsin ekleyin. Hücreleri tamamen ayırmak için şişenin kenarına dokunmadan önce 3-4 dakika inkübe edin.
    3. Şişeye 6 mL hücre kültürü ortamı ekleyin, kalan hücreleri ayırmak için bir pipetle kuvvetlice karıştırın ve içeriği 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 100 x g ve 20 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    4. Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek hücre kültürü ortamını ve Tripsin'i bir aspiratör kullanarak santrifüj tüpünden çıkarın. Santrifüj tüpüne 1 mL ortam ekleyin ve hücre peletini parçalamak ve hücreleri yeniden süspanse etmek için ileri geri pipetleyin (kabarcık oluşturmadan).
    5. 10 μL hücre süspansiyonu, 40 μL hücre kültürü ortamı ve 50 μL tripan mavisi boyayı 200 μL'lik bir tüpe pipetleyin ve iyice karıştırın.
    6. Boya karışımından 10 μL çıkarın ve bir hemositometreye enjekte edin. 15 mL santrifüj tüpündeki toplam hücre sayısını tahmin etmek için boya karışımının %10 seyreltmesini kullanarak hücreleri sayın.
      NOT: Bu protokol için 5.000.000 hücre/mL'lik bir konsantrasyon varsayalım.
    7. İstenen tohumlama yoğunluğunu kesici uç zarının yüzey alanıyla çarpın, süspansiyondaki sayılan hücreler/mL'ye bölün ve ek başına gerekli mikrolitre hücre süspansiyonunu hesaplamak için 1.000 ile çarpın.
      1. Gerekli toplam hücre süspansiyonu miktarını bulmak için, bu rakamı 10 ile çarpın (9 örnek için yeterli hücre sağlamak için, çünkü 12 ekin 3'ü hücresiz kontroller olacaktır) ve en yakın tam sayıya yuvarlayın. Bu durumda, bu deney için toplam 135 μL hücre süspansiyonu gereklidir.
    8. Önceden hesaplanan 135 μL hücre süspansiyonunu ayrı bir 15 mL santrifüj tüpünde 1.865 μL hücre kültürü ortamı ile karıştırarak 2.000 μL ayarlanmış hücre çözeltisi oluşturun.
  3. Tohumlama hücreleri
    1. Fibronektin inkübasyonu tamamlandıktan sonra her bir parçadan fazla fibronektini çıkarın.
    2. Her bir parçaya 100 μL steril damıtılmış su ekleyerek ekleri iki kez yıkayın. Ekler arasında tutarlı bir yıkama süresi sağlamak için suyu, eklendiği sırayla çıkarın.
    3. Her bir kesici parçaya 100 μL hücre kültürü ortamı ekleyerek ek parçayı tekrar yıkayın. Uçlar arasında tutarlı bir yıkama süresi sağlamak için medyayı eklendiği sırayla çıkarın.
    4. Hücre örnek ekleri
      1. Her bir kesici uça 200 μL ayarlanmış hücre çözeltisi pipetleyerek hücreleri tohumlayın. Kesici uçlar arasında tutarlı bir birleşme sağlamak için, hücre çözeltisini dağıtımdan önce santrifüj tüpünde karıştırın ve dağıtımdan sonra her bir ek parçanın içinde tekrar karıştırın.
    5. Negatif kontrol ekleri
      1. Her bir inserte 200 μL hücre kültürü ortamı pipetleyin. Hücre numunesi ekleriyle tutarlı kalmak için, her bir ekin içindeki hücre kültürü ortamını karıştırmak için pipeti kullanın.
  4. Etiketleme ve inkübasyon
    1. Kalıcı bir işaretleyici kullanarak ikinci kuyu plakasını üç kuyu genişliğinde (üç nüsha halinde çalışan koşullar için) iki sütuna bölen bir çizgi çizin. Her sütunu satırlara ayırın. Kılavuzdaki her bölgeyi ilgili parametrelerle etiketleyin.
    2. Deney için bir ek almak üzere her kuyucuğa 1 mL hücre kültürü ortamı ekleyin. Ekleri hazırlama kuyusu plakasından etiketli deney kuyusu plakasındaki uygun yerlerine aktarın ve 37 °C'de en az 12 saat inkübe edin.

3. Deneysel prosedür

  1. Teslimat deneyi
    1. Elektrot dizisindeki her bir oyuğa 0.1 mg / mL PI çözeltisinin 1.5 mL'sini pipetleyin. Elektrot dizisindeki her bir oyuğa bir kesici uç yerleştirin ve ek parçanın ayaklarını, ek parçanın üst yüzeyi ile aynı hizada olacak şekilde hizalama oluklarına yerleştirin (Şekil 1A,B).
    2. Üst elektrot baskılı devre kartını (PCB) elektrot dizisi yuvalarının üstüne vidalayın ve elektrot dizisini PSEP cihazına bağlayın.
    3. Sıcaklığın dengelenmesi için elektrot dizisini en az 1 saat boyunca 37 °C inkübatöre yerleştirin.
    4. GUI'nin sol üst köşesindeki "Membran"ın yanındaki açılır menüye tıklayın ve 400 nm GBO'ya tıklayın. "Elektrolit", "Hücreler", "Hücre Tohumlama Yoğunluğu" ve "Hücre Süresi" için bu adımı tekrarlayın ve sırasıyla DMEM, A431, 200 ve 12'yi seçin.
      NOT: Bu değerler yalnızca kayıt tutma amaçlıdır ve aygıtın işlevini etkilemez. Lütfen doğru veri takibi için bu değerleri gerektiği gibi ayarladığınızdan emin olun.
    5. Varsayılan darbe sonrası ölçüm süresini 1 dakika olarak değiştirmek için GUI'nin sağ tarafındaki Darbe Sonrası Süre (dk) düzenleme alanına 1 yazın. Diğer tüm ayarları varsayılan durumda bırakın.
      NOT: Varsayılan darbe parametreleri, 30 volt, 20 Hz, 1 ms süre ve 200 darbeli bir kare dalga biçimi oluşturur. Varsayılan TEEI ölçüm parametreleri 0,5 volt ve 100 Hz, 1,000 Hz, 10,000 Hz ve 100,000 Hz'dir.
    6. Çalıştır düğmesine tıklayın ve istendiğinde 1-3 ve 4-6 numaralı kuyular için uygun adları girin. Denemeyi başlatmak için Tamam'a tıklayın.
    7. Elektrot dizisini inkübatörden çıkarın ve programın yürütülmesi bittiğinde ekleri deney kuyusu plakasındaki orijinal konumlarına geri aktarın.
    8. 200 μL'lik bir tüpte 2 μL Hoechst 33342 ve 5 μL kalsein'yi 123 μL hücre kültürü ortamı ile karıştırın.
    9. Her bir darbe sonrası eke 10 μL leke solüsyonunu nazikçe pipetleyin ve ekleri 5 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.
    10. Kuyu plakasını 5x büyütme objektifine sahip bir floresan mikroskobun plaka tutucusuna aktarın. Parlak alan ve her lekenin floresansını kullanan görüntü. Kamerayı tetiklemeden önce eki objektifin üzerinde ortalayın.
      NOT: PI, kalsein ve Hoechst 33342 için uyarma dalga boyları sırasıyla 558 nm, 495 nm ve 353 nm'dir. Emisyon dalga boyları sırasıyla 575 nm, 519 nm ve 465 nm'dir.
  2. TEEI ölçüm deneyi
    1. Elektrot dizisindeki her bir oyuğa 1.5 mL hücre kültürü ortamını pipetleyin. Hücre numune eklerini 1-3 numaralı kuyucuklara yerleştirin ve kontrol eklerini 4-6 numaralı kuyucuklara yerleştirin, ek parçanın ayaklarını hizalama oluklarına yerleştirin, böylece ek parça kuyunun üst yüzeyi ile aynı hizada olur.
    2. Üst elektrot PCB'sini elektrot dizisi yuvalarının üstüne vidalayın ve elektrot dizisini PSEP cihazına bağlayın.
    3. Sıcaklığın dengelenmesi için elektrot dizisini en az 1 saat boyunca 37 °C inkübatöre yerleştirin.
    4. GUI'nin sol üst köşesindeki "Membran"ın yanındaki açılır menüye tıklayın ve 400 nm GBO'ya tıklayın. "Elektrolit", "Hücreler", "Hücre Tohumlama Yoğunluğu" ve "Hücre Süresi" için bu adımı tekrarlayın ve sırasıyla DMEM, A431, 200 ve 12'yi seçin.
      NOT: Bu değerler yalnızca kayıt tutma amaçlıdır ve aygıtın işlevini etkilemez. Lütfen doğru veri takibi için bu değerleri gerektiği gibi ayarladığınızdan emin olun.
    5. Kalan tüm ayarları varsayılan durumda bırakın.
      NOT: Varsayılan darbe parametreleri, 30 volt, 20 Hz, 1 ms süre ve 200 darbeli bir kare dalga biçimi oluşturur. Varsayılan TEEI ölçüm parametreleri 0,5 volt ve 100 Hz, 1,000 Hz, 10,000 Hz ve 100,000 Hz'dir.
    6. Çalıştır düğmesine tıklayın ve istendiğinde 1-3 ve 4-6 numaralı kuyular için uygun adları girin. Denemeyi başlatmak için Tamam'a tıklayın.
    7. Elektrot dizisini inkübatörden çıkarın ve programın yürütülmesi bittiğinde ekleri deney kuyusu plakasındaki orijinal konumlarına geri aktarın.
    8. 200 μL'lik bir reaksiyon tüpünde 2 μL Hoechst 33342, 5 μL kalsein ve 10 μL PI'yi 113 μL hücre kültürü ortamı ile karıştırın.
    9. Her bir darbe sonrası eke 10 μL leke solüsyonu pipetleyin ve ekleri 5 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.
    10. Kuyu plakasını 5x objektif lensli bir floresan görüntüleme mikroskobunun plaka tutucusuna aktarın. Parlak alan ve her lekenin floresansını kullanan görüntü. Kamerayı tetiklemeden önce ek parçayı lensin üzerinde ortalayın.
      NOT: PI, kalsein ve Hoechst 33342 için uyarma dalga boyları sırasıyla 558 nm, 495 nm ve 353 nm'dir. Emisyon dalga boyları sırasıyla 575 nm, 519 nm ve 465 nm'dir.

4. Veri analizi

  1. CellProfiler işlem hattı ile görüntü verilerini analiz etme
    1. Teslim ve TEEI ölçüm deneyi görüntülerini işlemek için GitHub:https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI adresinde sağlanan özel CellProfiler iş akışını kullanın.
  2. TEEI analizi
    1. GUI'deki Analiz sekmesine tıklayın.
    2. GUI'nin altındaki empedans tipi göstergesini TEEI olarak değiştirin.
    3. Veri dosyasındaki tüm deney adlarını göstermek için sol üstteki kutudaki oka tıklayın. TEEI ölçüm deneyinden tüm hücre örneği verilerini seçin.
    4. Veri dosyasındaki tüm deney adlarını göstermek için sağdaki bir sonraki kutuda bulunan oka tıklayın. TEEI ölçümünden tüm kontrol ekleme verilerini seçin.
    5. Çalıştır'a tıklayın. En düşük ölçüm frekansında seçilen hücre örneği verilerini içeren temel bir şekil görünecektir.
    6. GUI'nin sağ tarafındaki örnek seçenekler kutusunda, seçilen tüm ekleme verilerini göstermek için oka tıklayın. Aykırı değerler, uygun verileri seçip aşağıdaki Kaldır'a tıklayarak kaldırılabilir.
      NOT: Kaldır düğmesine son tıklanmasıyla analizden kaldırılan tüm veriler, Geri Al düğmesi tarafından geri alınabilir.
    7. İstenen veriler şekilde gösterildiğinde bir sonraki şekle geçmek için Bitti'ye tıklayın.
    8. Kalan hücre örnek verileri ve kontrol verileri için 4.2.6 ve 4.2.7 adımlarını tekrarlayın. Nihai veri seti "Bitti" tıklanarak onaylandığında, tam analiz rakamı görünecektir.
    9. Analiz rakamını kaydedin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verilen protokol, özellikle A431 hücre hattı ve PI kargosu için elektroporasyonun ara süreçlerini incelemek ve teslimat tahminleri yapmak için TEEI ölçümlerini kullanmak için bir yöntem oluşturur. Bu protokolün modifikasyonu makalede daha ayrıntılı olarak tartışılmış olsa da, belirli değerler değişebilse de, yanıttaki genel eğilimlerin tutarlı kaldığını belirtmek önemlidir. Örneğin, ilk taban çizgisinin altına düşen TEEI verileri hücre ölümüne karşılık gelirken, TEEI değerindeki minimumun üzerindeki maksimum artış, dağıtım verimliliğinekarşılık gelir 13. Bu genel eğilimler ve etkileri aşağıda incelenmiştir.

Şekil 2A'da gösterildiği gibi, PSEP platformu kullanılırken bir dizi TEEI ölçümü ve hücre görüntüleme eğilimi ortaya çıkabilir. Bu protokolün ideal sonucu, Şekil 2Ai'de gösterilen optimize edilmiş sağlıklı verilere benzer bir eğri üretmektir. Bu, ideal sonuç olarak karakterize edilir, çünkü taban çizgisinin altına düşme yoktur, bu da eğer varsa, çok az hücre ölümüne işaret eder. Ek olarak, optimize edilmiş sağlıklı eğri, TEEI'de minimumdan en büyük artışa sahiptir ve bu da yüksek derecede teslimat verimliliğini gösterir13. Bu çıkarımlar, ihmal edilebilir hücre ölümünü ve sağlıklı, tamamen birleşmiş bir hücre tek tabakasını ortaya çıkaran hücre tek tabakasının PSEP sonrası görüntülenmesi ile desteklenir (Şekil 2Aiii). Ayrıca, aynı PSEP dalga biçimlerini kullanan başarılı bir teslimat deneyi, Şekil 2B'de gösterilen görüntülerle karakterize edilebilir. Uygun elektroporasyon, dalga formu uygulaması ve kargo konsantrasyonu, yüksek derecede teslimat tutarlılığı ve hücre canlılığı ile sonuçlanır.

Hücre tek tabakasının sağlığı ve birleşmesi, TEEI tabanlı dağıtım tahminlerinin başarılı bir şekilde uygulanması için kritik öneme sahiptir16,17. Optimize edilmiş bir dalga formuyla bile, sağlıksız veya eksik bir hücre tek katmanı, Şekil 2Aii'deki optimize edilmiş sağlıksız verilerle gösterildiği gibi, azalmış bir TEEI yanıtı ile sonuçlanır. Bununla birlikte, bu sonuç için görüntülerin (Şekil 2Avi) hala Brooks ve ark.13 tarafından verilen TEEI yanıtının yorumuna karşılık geldiğine dikkat edin. Taban çizgisinin altında herhangi bir düşüş yoktur, bu da sıfıra yakın hücre ölümünü gösterir (Şekil 2C, D). Ek olarak, minimumdan azaltılmış artış, tek katmandaki daha az hücre toplam PI dağıtımını azalttığından, teslimat verimliliği üzerinde olumsuz bir etkiye karşılık gelir (Şekil 2C,D).

Optimize edilmemiş bir dalga formu uygulanırsa, TEEI yanıtında daha da önemli düşüşler görmek mümkündür. Toplam enerjiye ve uygulandığı zaman dilimine bağlı olarak, optimize edilmemiş dalga formları, düşük verimlilikten hücre tek tabakasının neredeyse tamamen yok olmasına kadar değişen sonuçlar üretebilir (Şekil 2Ai,iii,v). Hem optimize edilmemiş hem de çok optimize edilmemiş eğriler, taban çizgisinden önemli bir azalma gösterir ve bu da önemli hücre ölümünü gösterir. Bununla birlikte, giderek daha fazla optimize edilmeyen dalga biçimleri, hücre geri kazanımını engelleyerek dağıtım verimliliğinin azalmasına neden olur.

Dağıtım verimliliği, dağıtım deneylerinden hem PI hem de kalsein görüntülerinde etiketlenen hücre sayısının Hoechst ile tanımlanan toplam hücre sayısına bölünmesiyle hesaplandı. Ölüm, TEEI ölçüm deneylerinde PI ile işaretlenen hücrelerin alınması ve Hoechst ile tanımlanan toplam hücre sayısına bölünmesiyle hesaplandı. Hücre sayısı, her iki ölçüm için de özel bir CellProfiler işlem hattı kullanılarak belirlendi.

figure-results-1
Şekil 2: TEEI yanıt eğrileri ve yaygın durumlar için görüntüleme. (A) (i) Optimize edilmiş ve optimize edilmemiş koşullar için TEEI değişim yüzdesini gösteren TEEI yanıt verileri. (ii) Optimize edilmiş dalga biçimi koşulları altında sağlıklı ve sağlıksız tek katmanlar arasındaki TEEI yanıtı karşılaştırması. (III-V) Hücre ölümünü (kırmızı) ve canlı hücreleri (yeşil) gösteren optimize edilmiş ve optimize edilmemiş dalga formu koşulları için potansiyel sonuçların temsili görüntülemesi. (vi) Hücre ölümünü (kırmızı), canlı hücreleri (yeşil) gösteren optimize edilmiş dalga formu koşulları uygulandıktan sonra sağlıksız tek tabakanın temsili görüntülemesi. (B) Başarılı PI dağıtımını (kırmızı), canlı hücreleri (yeşil) ve çekirdek konumlarını (mavi) gösteren resimler. Tüm görüntüler netlik için aydınlatıldı. Ölçek çubukları: 1000 μm. (C) TEEI, verilen voltajlar için PSEP öncesi taban çizgisinden PSEP sonrası minimuma düşer ve PSEP sonrası minimumdan PSEP sonrası tepe noktasına yükselir. (D) Verilen voltajlar için dağıtım verimliliği ve hücre ölüm yüzdeleri. Hata çubukları SEM'i temsil eder (n = 6). (C,D) Brooks ve ark.13'ten izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2C , her bir PSEP dalga biçimi voltajı için TEEI'nin minimumdan artışlarının ve taban çizgisinden düşüşlerin çizildiğini göstermektedir. TEEI artışı, azalmadan önce yaklaşık 20 volt zirve yapan parabolik bir ark oluştururken, taban çizgisinden TEEI düşüşü, voltaj arttıkça katlanarak artar. Şekil 2D'deki teslimat verimliliği ve ölüm yüzdeleri, teslimat verimliliği parabolik olarak ark yapan, yaklaşık 30 volt civarında zirve yapan ve dalga biçimi voltajı arttıkça ölümün katlanarak arttığı bu eğilimleri yansıtmaktadır.

TEEI artışına neden olan altta yatan mekanizma için bir hipotez, bir elektrik alanının18,19 uygulanmasının neden olduğu bir fenomen olan negatif yüklü substrat mikro kanalları yoluyla elektro-ozmozdur. TEEI yanıtının, elektro-ozmotik sıvı akışına bağlı hücre şişmesinden kaynaklanan mekanik uyarana bağlı olup olmadığına, elektroporasyon20 ile meydana geldiği bilinen bir faktöre veya dalga formunun kendisinin elektriksel uyaranına bağlı olup olmadığı, tek tabakanın sağlığı ve eksiksizliği, elektroporasyon için gerekli olan hücre zarı boyunca uygun voltaj düşüşünü elde etmek için çok önemlidir. Bu nedenle bu yöntemde en kritik adımlar hücre tohumlanması ve düzgün hücre tek tabakası oluşumunun sağlanması ile ilgili adımlardır. Bu, hücre tek tabakasının görüntülenmesi ve temel TEEI değeri ile doğrulanabilir. A431 hücreleri için ortalama TEEI yaklaşık 7 Ω cm· iken, HEK293T hücrelerin ortalaması 5 Ω cm²'den biraz daha düşüktür (Şekil 2Aii), muhtemelen hücre-hücre bağlantı alanında farklılıklara neden olan morfolojik farklılıklar nedeniyle.

Gözenekli substrat elektroporasyonu için gerekli olan elektrik alanı nedeniyle, elektroliz meydana gelecek ve elektrotların12,21 paslanmasına neden olacaktır. Bu, özellikle alt elektrot için belirgindi, çünkü bu deneyde pozitif yüklü PI vermek için pozitif olarak yüklendi. Deney yoluyla, önemli olumsuz etkilerin değiştirilmesi gerekmeden önce alt PCB'nin yaklaşık 20 kez kullanılabileceğibelirlendi 13. Elektrot dizisini yeniden kullanım üzere temizlemek için, kalan hücre kültürünü veya transfeksiyon ortamını bir aspiratör kullanarak odalardan çıkarın. Her bir odayı dörtte üçünü %70 etanol ile doldurun ve üst elektrot PCB'sini elektrot dizisine yerleştirin, böylece üst elektrotlar suya batırılır. Etanolü çıkarmadan ve elektrot dizisini kuruması için bir kenara koymadan önce etanolü en az 10 dakika elektrot dizisinde bırakın.

Alt tabakaları çıkararak, ek parçayı sterilize ederek ve alt tabakayı başka bir kaynaktan alınan bir alt tabaka ile değiştirerek satın alınan ek parçaları yeniden kullanmak mümkündür. Aynı gözenek yoğunluğuna ve çapına sahip 6 oyuklu kesici uçlar ticari olarak temin edilebilir ve dört adet 24 oyuklu kesici uç boyutlu yedek alt tabakayı hasat etmek için kullanılabilir. Daha önce kullanılan ekler sterilize edildikten sonra, taze bir Petri kabına 10 μL ultraviyole ışıkla sertleşmiş epoksi ekleyin. Alt yüzeyi kaplamak için ek parçanın alt tabaka tarafını epoksi havuzuna batırın ve ek parçadaki deliğin üzerine dikkatlice yeni bir alt tabaka yerleştirin. Bağlantıda boşluk olmadığından emin olmak için epoksinin tam bir halka oluşturduğunu görsel olarak doğrulayın. UV ışığı altında 30 saniye kürleyin ve yeniden kullanmadan önce yeni alt tabakalara zarar vermemek için yenilenmiş ekleri 24 oyuklu temiz bir plakada saklayın.

Daha önce belirtildiği gibi, gözlenen TEEI artışının birden fazla hücre tipinde meydana geleceği varsayılırken, her ikisi de yapışık hücreler olan A431 ve HEK293T hücre hatları13 (Şekil 1C) ile gösterilmiştir. Yöntem, farklı gözenek özelliklerine sahip zarların seçilmesi, fibronektin kaplamanın konsantrasyonun ayarlanması yoluyla başka bir hücre dışı matris proteini ile değiştirilmesi veya yükün değiştirilmesi yoluyla farklı hücre hatları seçilerek değiştirilebilir. Bununla birlikte, deneyin kurulumunda herhangi bir değişiklik yapılırsa, dalga biçimini yeniden optimize etmek gerekebilir. Dalga biçimini optimize etmek için, üç numuneden oluşan her bir grup arasında voltaj gibi yalnızca bir dalga biçimi parametresinin değiştirildiği bir TEEI ölçüm deneyi yapılabilir. En az dokuz sağlıklı numune üzerinde TEEI'deki en büyük artışı belirleyerek en uygun voltajı seçin. Bir sonrakine geçerken yeni optimize edilmiş değerleri kullanarak her dalga formu parametresi için bu işlemi tekrarlayın. Dalga biçimi parametreleri için birden fazla yerel optimum olabileceğini unutmayın (yani, bir darbe süresi için en uygun voltaj, başka bir darbe süresi için en uygun voltaj olmayabilir, vb.).

Gözenekli substrat elektroporasyonunun faydaları geniş kapsamlıdır. Diğer hücre içi dağıtım yöntemleri önemli bir süredir mevcut olsa da, çok azı yüksek verimi PSEP'in sahip olduğu yüksek derecede kontrol ile birleştirmiştir 1,13. Ek olarak, platformun TEEI ölçümlerini kullanması, elektroporasyon işleminin ara adımlarına bir bakış sağlar. TEEI okumaları hücrelerin durumunu söyler, elektroporasyon parametrelerinin seçimine rehberlik eder ve belirli hücre davranışları ve mekanizmaları hakkında daha fazla bilgi sağlar13,17. TEEI ölçümleri sayesinde, platform aynı zamanda etiketsiz teslimat13 yeteneğine de sahiptir, bu da her deney yapıldığında pahalı biyobelirteçlere ve reaktiflere olan ihtiyacın azalmasıyla hızlı optimizasyona olanak tanır. Hücre içi dağıtım alanına yapılan bu katkılar, onu temel biyolojik araştırmalar ve biyomedikal uygulamalar için bir dağıtım platformu olarak en iyi aday haline getirmektedir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), NIH Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüleri P20GM113126 (Nebraska Entegre Biyomoleküler İletişim Merkezi) ve P30GM127200 (Nebraska Nanotıp Merkezi), Nebraska İşbirliği Girişimi ve Voelte-Keegan Biyomühendislik Desteği'nden sağlanan finansman desteğini kabul ediyoruz. Cihaz, kısmen Nebraska Araştırma Girişimi tarafından finanse edilen NanoEngineering Research Core Facility'de (NERCF) üretildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL Konik Santrifüj TüpüThermo Scientific339651
2 Çipli Tek Kullanımlık HemositometreBulldog BioDHC-N01
75 cm2 Doku Kültürü ŞişesifisherbrandFB012937
A431 HücreleriATCCCRL-1555
CalceinInvitrogenC3099
Sınıf II Tip A2 Biyogüvenlik KabiniLabgardNU-543-600
Özel BileşenlerYangLabhttps://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Tek Kullanımlık Santrifüj Tüpü (50 mL)fisherbrand05-539-6
DMEMGibco11965092
Fetal Sığır SerumuGibcoA5670401
Sıvı Aspirasyon Sistemivakuubrand20727403
HERACELL 240iThermo Scientific51026331
Hoechst 33342Thermo Scientific62249
İnsan Plazma FibronektinSigma-AldrichFIBRP-RO
Ters Floresan MikroskopZeiss491916-0001-000
Ters MikroskopLabomedTCM 400
PBScytivaSH30256.02
PCR Tüpü 200 ve mikro; LSarstedt72.737
Penisilin / StreptomisinGibco15140148
Pipet (0.2-2 & mikro; L)fisherbrand EliteFBE00002
Pipet (100-1000 & mikro; L)fisherbrand EliteFBE01000
Pipet (20-200 & mikro; L)fisherbrand EliteFBE00200
Pipet (2-20 & mikro; L)fisherbrand EliteFBE00020
Propidium İyodürİnvitrojenP1304MP
Reaksiyon Tüpü 1.5 mLSarstedt72.690.300
Sorvall ST 16R SantrifüjThermo Scientific75004240
Thincert (24 kuyulu)Greiner Bio-One662 6410.4 ve mikro; m gözenek çapı, 2x106 cm-2 gözenek yoğunluğu, şeffaf PET
Doku Kültürü Plakası (24 oyuklu)fisherbrandFB012929
Tripan Mavisi ÇözeltisiSigma-AldrichT8154-20mL
TripsinGibco15090046

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brooks, J., et al. High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery. Small. 16 (51), e2004917(2020).
  2. Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts. Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).
  3. Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability. Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).
  4. Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments. Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).
  5. Pan, J., et al. Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation. Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).
  6. Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).
  7. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  8. Patino, C. A., et al. Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering. Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).
  9. Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).
  10. Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells. Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).
  11. Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling. ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).
  12. Brooks, J. R., et al. An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates. Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).
  13. Brooks, J. R., et al. Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery. Small. 20 (25), 2310221(2023).
  14. Vindiš, T., et al. Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate. Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).
  15. Ye, Y., et al. Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel. Micromachines. 11 (9), 856(2020).
  16. Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).
  17. Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology. Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).
  18. Hunter, R. J. Zeta potential in colloid science: Principles and applications. 2, Academic Press. (2013).
  19. Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications. IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).
  20. Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation. Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).
  21. Fox, M. B., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: A review. Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Porous Substrate ElectroporationElectroporation MonitoringFluorescent MicroscopyCell MonolayerDelivery EfficiencyCell ViabilityWaveform ParametersElectrode ArrayCell Culture Inserts

İlgili makaleler