Bu protokol, klonlanmış domuz embriyolarını solungaçlar halinde laparotomi yoluyla transfer etmek için kullanılan cerrahi tekniğin uygulanmasını açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bu protokol, klonlanmış domuz embriyolarını solungaçlar halinde laparotomi yoluyla transfer etmek için kullanılan cerrahi tekniğin uygulanmasını açıklar.
Bu protokol, biyomedikal araştırmalar için genetiği değiştirilmiş domuzların üretiminde yaygın olarak kullanılan bir yöntem olan klonlanmış domuz embriyolarının yumurta kanalına aktarılması için cerrahi tekniği göstermeyi amaçlamaktadır. Somatik hücre nükleer transferi (SCNT) ile üretilen klonlanmış embriyoların 2. günde 4 hücreye kadar olan aşamalarda yumurta kanalına transferi için dokuz solungaça hormonal senkronizasyon ve laparotomi uygulandı. Gebelik tanısı transplantasyon ameliyatından 30 gün sonra ultrason muayenesi ile konuldu. Ameliyat edilen dokuz yaldızdan altısı ultrason muayenesinde hamilelik belirtileri gösterdi. Bununla birlikte, ekografi ile değerlendirildiği gibi fetal gelişimde herhangi bir ilerleme olmadığından, biyolojik materyalin toplanması ve üreme sisteminin değerlendirilmesi için solungaçlara 60. günde nekropsi yapıldı. Rahim boynuzlarında, yumurtalıklarda ve yumurta kanallarında yapışıklıklar gözlendi. Ötenazi yapılan solungaçların ikisinin uterus lümeninden, gebelik yaşları 12 ila 20 gün arasında değişen bir ve dört embriyonik yapı elde edildi. Muhtemelen transfer edilen embriyoların sayısı ve kalitesi de dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden etkilenen klonlanmış domuz embriyolarının transferinin düşük verimlilik oranına atfedilen canlı domuz yavrularının olmamasına rağmen, sunulan cerrahi tekniğin hızlı ve güvenli olduğu kanıtlanmıştır.
Domuzlar, insanlara anatomik, fizyolojik ve genetik benzerlikleri nedeniyle biyomedikal araştırmalar için mükemmel bir deneysel modeldir1. Bu hayvanlar, insanlara nakledildiğinde düşük reddedilme riskini destekleyen organlar, hücreler veya dokular üretmek amacıyla ksenotransplantasyon ile ilgili araştırmalarda sıklıkla kullanılmıştır. Ksenotransplantasyon araştırması, insan nakli için organ arzını artırmayı ve böylece hastaların bekleme listesini azaltmayı amaçlamaktadır2.
Ksenotransplantasyon için domuz üretimi, genetik olarak düzenlenmiş domuz hücrelerinden klonların üretimi de dahil olmak üzere birkaç adımı içerir. Genetiği değiştirilmiş klonlanmış embriyoların in vitro üretiminden sonra, embriyolar, uterus fizyolojisini yeni conceptus3'ün alımı ve gebeliği için hazırlamak için senkronize bir kızgınlık döngüsü ile bir dişi domuzun üreme sistemine aktarılır.
Domuzlarda embriyo transferi non-invaziv veya invaziv yöntemlerle yapılabilir4. Non-invaziv yöntemler arasında herhangi bir cerrahi müdahale gerektirmeyen transservikal transfer yer almaktadır. Bununla birlikte, bu yöntem daha sonraki gelişim aşamalarında (yani morula veya blastosist aşamaları) embriyoların transferi ile sınırlıdır ve kateter yerleştirme yerinin veya embriyo birikiminin kesin olarak belirlenmesine izin vermez5. Laparoskopi ve laparotomi, invaziv embriyo transferi yöntemleri olarak kabul edilir. Laparoskopi daha az invazivdir ancak spesifik ve maliyetli ekipman gerektirir ve üreme yapılarını manipüle etmedeki zorluk ve kullanılan kateter tipi gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak etkinliği önemli ölçüde değişir (%20'den azdan %80'in üzerine kadar) 4,6. Bu nedenle, laparoskopi ile transfer, laparotomi ile cerrahi transfer yöntemlerine kıyasla hala daha az verimlidir4.
Dişi domuzlarda laparotomi yoluyla embriyo transferi ameliyatı nispeten basit ve hızlı bir işlemdir ve tipik olarak yaklaşık 30 dakika sürer. Ancak inhalasyon anestezi aparatı ile donatılmış bir cerrahi merkezde ve uzman bir ekiple yapılmalıdır. Ticari domuz türleri (Landrace, Large White veya bunların melezleri gibi) için, hayvanların hatırı sayılır ağırlığı (yaklaşık 130-150 kg) nedeniyle yaldızları kaldırmak için vinçler ve geniş, sağlam bir ameliyat masası gibi özel ekipmanlar gereklidir.
Ameliyatın başarılı olması için embriyoların önceden gelişim aşamaları açısından değerlendirilmesi gerekir. 4 hücreye kadar olan embriyoların rahim tüpüne transfer edilmesi önerilir. Morula ve blastosist gibi 4 hücrenin ötesindeki aşamalardaki embriyolar rahim boynuzunatransfer edilmelidir 7,8.
Dünya çapındaki araştırma grupları, genetiği değiştirilmiş klonlanmış domuz embriyolarının üretimini ve cerrahi transferini gerçekleştiriyor olsa da, bu prosedürü videolar aracılığıyla gösteren iyi tanımlanmış protokoller hala yoktur. Bu yaklaşım, gebeliğin başarısı için çok önemlidir, çünkü teknik, tubal ostiumun lokalizasyonunu ve embriyoları içeren pipetin yerleştirilmesini içeren, embriyoların yumurta kanalının tam konumuna hassas bir şekilde yerleştirilmesini gerektirir. Bu teknik, tüm prosedürün açıklayıcı videoları ile daha iyi anlaşılabilir. Bu nedenle, bu makale, ksenotransplantasyon veya diğer ilgili amaçlar için kullanılacak genetiği değiştirilmiş domuzların gelecekteki üretimi için önemli bir ön koşul olan klonlanmış embriyoların solungaçların yumurta kanalına aktarılması için laparotomi ameliyatını göstermeyi amaçlamaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu çalışma, São Paulo Üniversitesi Veterinerlik ve Hayvan Bilimleri Fakültesi Araştırmalarında Hayvan Kullanımı Etik Kurulu, 6088030523 numaralı protokol tarafından onaylanmıştır. Brezilya'nın São Paulo eyaleti, Itu şehrinde bulunan Água Branca çekirdek domuz çiftliğinden dokuz yedi aylık yaldız, ikinci kızgınlık tespitinden hemen sonrakullanıldı 9. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Hayvan hazırlama
2. Cerrahi prosedür
3. Ameliyat sonrası bakım
4. Gebeliğin ultrasonografik gebelik tanısı
5. Hayvanların ötenazisi
NOT: Ultrasonografik incelemede gebelik yaşına karşılık gelen büyüklük ve görünümde fetüsler sunmayan solungaçlara ötenazi yapın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu makale, klonlanmış embriyoların solungaç kanalına transfer edilmesi için yapılan laparotomi cerrahisini göstermeyi amaçlamaktadır. Tüm hayvanlar, anestezi iyileşmesi sırasında herhangi bir intraoperatif olay veya komplikasyon olmaksızın yeterli bir anestezi düzleminde kaldı. Ameliyat bittikten sonra yaldızların ayağa kalkması ortalama 2-3 saat sürdü.
Tüm cerrahi işlemler ortalama 44 dk sürdü. Dokuz yaldız ameliyat edildi, yaldız başına ortalama 185 klonlanmış embriyo transfer edildi ve topl...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tarif edilen cerrahi yöntem daha önce klonlanmış domuzların veya genetiği değiştirilmiş klonlanmış domuzların üretimi ile çalışan diğer araştırma grupları tarafından gerçekleştirilmiştir ve bu tekniğin uygulanmasından sonraki doğum raporları 15,16,17,18,19,20. Çeşitli hücre hatlarından üretil...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların hiçbiri herhangi bir çıkar çatışmasını açıklamaz
Sao Paulo Üniversitesi (FMVZ/USP), Sao Paulo, Brezilya, FAPESP (hibe 2022/11459-3, Sao Paulo Araştırma Vakfı), EMS Pharma, CNPq (hibe 405254/2022-9) ve Água Branca domuz yetiştiriciliği, Itu, Sao Paulo, Brezilya.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.25 mL saman | jenerik-Cerrahi | malzeme | |
| 1 mL şırınga | Descarpack | 341001 | Cerrahi malzeme |
| 10 mL şırınga | Descarpack | 324601 | Cerrahi malzeme |
| 20 mL şırınga | Descarpack | 324801 | Cerrahi malzeme |
| 3 mL şırınga | Descarpack | 324201 | Cerrahi malzeme |
| 5 mL şırınga | Descarpack | 324401 | Cerrahi malzeme |
| 60 mL şırınga | Descarpack | 323201 | Cerrahi malzeme |
| 9 mm endotrakeal tüp | Rusch | 112482-000090 | Cerrahi malzeme |
| Allis forseps | jenerik-Cerrahi | alet | |
| Amox LA | JA Saú de Hayvan | MAPA tescili: 8.781/2004 | Farmasötik ilaç |
| Bakhaus forseps | jenerik-Cerrahi | alet | |
| Kateteri 20G | Descarpack | 362401 | İntravenöz erişim için |
| kateter Cetamin | Agener Uniã o | MAPA kaydı: SP-000292-5.000011 | Anestezi |
| İletken klinik jel | RMC | ANVISA kaydı: 80122200013 | Cerrahi malzeme |
| Dipyrone D-500 | Zoetis | MAPA kaydı: SP0000728-46 | Farmasötik ilaç |
| Tek kullanımlık neşter n. 22 | Wiltex | ANVISA kaydı: 10150470565 | Cerrahi alet |
| Tek kullanımlık steril sünger fırça | Rioquimica | 7.89778E+12 | Cerrahi asepsi |
| Kolay Tarama: Go | IMV | ESCG01 | Ultrason |
| Endozime AW Plus | Ruhof | 34514 | Cerrahi aletler için deterjan |
| Fentanil (Fentanest) | Cristá lia | ANVISA kaydı: 1029800810159 | Anestezik |
| Gosset ekartör | jenerik-Cerrahi | alet | |
| Halstead-sivrisinek hemostatik forseps | jenerik-Cerrahi | alet | |
| İyileştirici merhem - Unguento Pearson Pearson | SA | MAPA kaydı: SP0000094-16 | Farmasötik ilaç |
| hidrojen peroksit çözeltisi | Rioquimica | ANVISA kaydı: 218690015 | Cerrahi malzeme |
| İzofloran | Biochimico | ANVISA kaydı: 100630222 | Anestezik |
| IV Damla seti ekstansör | jenerik-Sıvı | tedavisi | |
| IV Makro damla seti | Descarpack | 410301 | Sıvı tedavisi |
| Laktofur (ceftiofur) | Ourofino SA | MAPA kaydı: SP0000051-50 | Farmasötik ilaç |
| Laringoskop | - | Cerrahi alet | |
| Maxicam 2% | Ourofino SA | MAPA kaydı: SP0000051-69 | Farmasötik ilaç |
| Mikro gözenekli yapıştırıcı 5 cm x 10 cm | Jenerik | 1530 | Cerrahi malzeme |
| Midazolam | Hipolabor | ANVISA kaydı: 1134301430035 | Anestezik |
| Çok Yönlü IV İnfüzyon Seti | Descarpack | 413201 | Sıvı tedavisi |
| İğnesi 40 mm x 1,2 mm | Descarpack | 353601 | İlaç ve anestezik uygulamak için steril iğne. |
| İğne 40 mm x 1,6 mm | Wiltex | ANVISA kaydı: 10150470664 | İlaç ve anestezik uygulamak için steril iğne. |
| İğne tutucu | jenerik-Cerrahi | alet | |
| Naylon 2 sütür trhead | Shalon Medical | N502CTI40 | Cerrahi malzeme |
| Sıradan kalem | jenerik-Not | almak için düzenli kalem | |
| Fizyolojik çözüm% 0.9 500 mL torba | JP Farma | MS: 1.0491.0070 | Sıvı tedavisi |
| Poliglikolik asit 2 sütür ipliği | Atramat | G4099-75H | Cerrahi malzeme |
| Potasyum klorür | Samtec | ANVISA kaydı: 1559200010139 | Parenteral ilaç |
| Prosedür eldivenleri | Descarpack | 122401 | Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD) |
| Propofol (Provive) | Uniã o Quí mika | ANVISA kaydı: 1049714490057 | Anestezik |
| Ringer laktat çözeltisi 500 mL torba | JP Farma | MS:1.0491.0061 | Sıvı tedavisi |
| Riohex %0.5 kleksidin alkol çözeltisi | Rioquimica | 218690356 | Cerrahi asepsi |
| Riohex yüzey aktif madde içeren %2 kloreksidin çözeltisi | Rioquimica | 218690356 | Cerrahi asepsi |
| Kafa derisi 21 G | Descarpack | 421201 | Cerrahi malzeme |
| Ayakkabı kılıfları | jenerik-Kişisel | Koruyucu Donanım (KKD) | |
| Steril kompresler | Cremer | ANVISA kaydı: 10071150065 | Cerrahi malzeme |
| Steril gazlı bez ped | Procitex | ANVISA kaydı: 80245210083 | Cerrahi malzeme |
| Steril cerrahi örtüler 140 cm x 90 cm | Venkuri | 7010003 | Cerrahi malzeme |
| Steril cerrahi örtüler 150 cm x 190 cm | PolarFix | F00208 | Cerrahi malzeme |
| Steril cerrahi eldivenler | Mucambo | CA: 39.317 | Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD) |
| Stetoskop | jenerik-Cerrahi | ekipman | |
| Cerrahi başlık | Descarpack | 93201 | Kişisel Koruyucu Donanım (KKD) |
| Cerrahi önlük | Descarpack | 231101 | Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD) |
| Cerrahi maske | Descarpack | 110701 | Kişisel Koruyucu Donanım (KKD) |
| Cerrahi makas künt-künt | jenerik-Cerrahi | alet | |
| Cerrahi makas keskin-keskin | jenerik-Cerrahi | alet | |
| Cerrahi zımba | Tradevet-Cerrahi | malzeme | |
| Tekbond süper yapıştırıcı | Tek Bond | 78072720030 | Cerrahi malzeme |
| Termometre | jenerik-Cerrahi | ekipman | , |
| Üç Musluk | Solidor | 374 | Cerrahi malzeme |
| Tramadol hidroklorid | Agener Uni & atilde; o | MAPA kaydı: SP-000292-5.000002 | Anestezik |
| Şeffaf film pansuman | Skinupper | ANVISA kaydı: 82307460014 | Cerrahi malzeme |
| Su geçirmez yapıştırıcı 10 cm x 4,5 cm | Jenerik | 364828 | Cerrahi malzeme |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.