Yöntem makalesi

Gilts'te Laparotomi ile Embriyo Transferi Ameliyatı

1.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66984

⸱

18 Ekim 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Estudos sobre o Genoma Humano e Células-Tronco, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, 2Instituto do Coração (Incor), Hospital das Clínicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 3Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo

Bu makalede

Özet

Bu protokol, klonlanmış domuz embriyolarını solungaçlar halinde laparotomi yoluyla transfer etmek için kullanılan cerrahi tekniğin uygulanmasını açıklar.

Özet

Bu protokol, biyomedikal araştırmalar için genetiği değiştirilmiş domuzların üretiminde yaygın olarak kullanılan bir yöntem olan klonlanmış domuz embriyolarının yumurta kanalına aktarılması için cerrahi tekniği göstermeyi amaçlamaktadır. Somatik hücre nükleer transferi (SCNT) ile üretilen klonlanmış embriyoların 2. günde 4 hücreye kadar olan aşamalarda yumurta kanalına transferi için dokuz solungaça hormonal senkronizasyon ve laparotomi uygulandı. Gebelik tanısı transplantasyon ameliyatından 30 gün sonra ultrason muayenesi ile konuldu. Ameliyat edilen dokuz yaldızdan altısı ultrason muayenesinde hamilelik belirtileri gösterdi. Bununla birlikte, ekografi ile değerlendirildiği gibi fetal gelişimde herhangi bir ilerleme olmadığından, biyolojik materyalin toplanması ve üreme sisteminin değerlendirilmesi için solungaçlara 60. günde nekropsi yapıldı. Rahim boynuzlarında, yumurtalıklarda ve yumurta kanallarında yapışıklıklar gözlendi. Ötenazi yapılan solungaçların ikisinin uterus lümeninden, gebelik yaşları 12 ila 20 gün arasında değişen bir ve dört embriyonik yapı elde edildi. Muhtemelen transfer edilen embriyoların sayısı ve kalitesi de dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden etkilenen klonlanmış domuz embriyolarının transferinin düşük verimlilik oranına atfedilen canlı domuz yavrularının olmamasına rağmen, sunulan cerrahi tekniğin hızlı ve güvenli olduğu kanıtlanmıştır.

Giriş

Domuzlar, insanlara anatomik, fizyolojik ve genetik benzerlikleri nedeniyle biyomedikal araştırmalar için mükemmel bir deneysel modeldir1. Bu hayvanlar, insanlara nakledildiğinde düşük reddedilme riskini destekleyen organlar, hücreler veya dokular üretmek amacıyla ksenotransplantasyon ile ilgili araştırmalarda sıklıkla kullanılmıştır. Ksenotransplantasyon araştırması, insan nakli için organ arzını artırmayı ve böylece hastaların bekleme listesini azaltmayı amaçlamaktadır2.

Ksenotransplantasyon için domuz üretimi, genetik olarak düzenlenmiş domuz hücrelerinden klonların üretimi de dahil olmak üzere birkaç adımı içerir. Genetiği değiştirilmiş klonlanmış embriyoların in vitro üretiminden sonra, embriyolar, uterus fizyolojisini yeni conceptus3'ün alımı ve gebeliği için hazırlamak için senkronize bir kızgınlık döngüsü ile bir dişi domuzun üreme sistemine aktarılır.

Domuzlarda embriyo transferi non-invaziv veya invaziv yöntemlerle yapılabilir4. Non-invaziv yöntemler arasında herhangi bir cerrahi müdahale gerektirmeyen transservikal transfer yer almaktadır. Bununla birlikte, bu yöntem daha sonraki gelişim aşamalarında (yani morula veya blastosist aşamaları) embriyoların transferi ile sınırlıdır ve kateter yerleştirme yerinin veya embriyo birikiminin kesin olarak belirlenmesine izin vermez5. Laparoskopi ve laparotomi, invaziv embriyo transferi yöntemleri olarak kabul edilir. Laparoskopi daha az invazivdir ancak spesifik ve maliyetli ekipman gerektirir ve üreme yapılarını manipüle etmedeki zorluk ve kullanılan kateter tipi gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak etkinliği önemli ölçüde değişir (%20'den azdan %80'in üzerine kadar) 4,6. Bu nedenle, laparoskopi ile transfer, laparotomi ile cerrahi transfer yöntemlerine kıyasla hala daha az verimlidir4.

Dişi domuzlarda laparotomi yoluyla embriyo transferi ameliyatı nispeten basit ve hızlı bir işlemdir ve tipik olarak yaklaşık 30 dakika sürer. Ancak inhalasyon anestezi aparatı ile donatılmış bir cerrahi merkezde ve uzman bir ekiple yapılmalıdır. Ticari domuz türleri (Landrace, Large White veya bunların melezleri gibi) için, hayvanların hatırı sayılır ağırlığı (yaklaşık 130-150 kg) nedeniyle yaldızları kaldırmak için vinçler ve geniş, sağlam bir ameliyat masası gibi özel ekipmanlar gereklidir.

Ameliyatın başarılı olması için embriyoların önceden gelişim aşamaları açısından değerlendirilmesi gerekir. 4 hücreye kadar olan embriyoların rahim tüpüne transfer edilmesi önerilir. Morula ve blastosist gibi 4 hücrenin ötesindeki aşamalardaki embriyolar rahim boynuzunatransfer edilmelidir 7,8.

Dünya çapındaki araştırma grupları, genetiği değiştirilmiş klonlanmış domuz embriyolarının üretimini ve cerrahi transferini gerçekleştiriyor olsa da, bu prosedürü videolar aracılığıyla gösteren iyi tanımlanmış protokoller hala yoktur. Bu yaklaşım, gebeliğin başarısı için çok önemlidir, çünkü teknik, tubal ostiumun lokalizasyonunu ve embriyoları içeren pipetin yerleştirilmesini içeren, embriyoların yumurta kanalının tam konumuna hassas bir şekilde yerleştirilmesini gerektirir. Bu teknik, tüm prosedürün açıklayıcı videoları ile daha iyi anlaşılabilir. Bu nedenle, bu makale, ksenotransplantasyon veya diğer ilgili amaçlar için kullanılacak genetiği değiştirilmiş domuzların gelecekteki üretimi için önemli bir ön koşul olan klonlanmış embriyoların solungaçların yumurta kanalına aktarılması için laparotomi ameliyatını göstermeyi amaçlamaktadır.

Protokol

Bu çalışma, São Paulo Üniversitesi Veterinerlik ve Hayvan Bilimleri Fakültesi Araştırmalarında Hayvan Kullanımı Etik Kurulu, 6088030523 numaralı protokol tarafından onaylanmıştır. Brezilya'nın São Paulo eyaleti, Itu şehrinde bulunan Água Branca çekirdek domuz çiftliğinden dokuz yedi aylık yaldız, ikinci kızgınlık tespitinden hemen sonrakullanıldı 9. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hayvan hazırlama

  1. Cerrahi işlemden önce hayvanları 12 saat aç bırakın ve su erişimini 4 saat kısıtlayın.
  2. 40 mm x 12 mm'lik bir iğne kullanarak, aynı 50 mL şırıngada 10 mg / kg ketamin ve 0.2 mg / kg midazolam hazırlayın. İlaç uygulamasını kolaylaştırmak, hayvandan güvenli bir mesafeyi korumak ve serbestçe hareket etmesine izin vermek için şırıngayı bir IV uygulama setine takın.
  3. Anestezik öncesi ilacı, dış kulak kanalına kaudal olan trapezius kasına intramüsküler enjeksiyon yoluyla uygulayın.
  4. Kulak damarını 20 G'lik bir kateter ile kanüle edin ve 10 mL / kg / s oranında% 0.9 NaCl çözeltisi ile intraoperatif sıvı tedavisi için bir makrodrip uygulama setine bağlayın.
  5. İntravenöz olarak 4 mg / kg propofol ile anestezi indükleyin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
  6. Bir laringoskop ve bir manşet10 ile 9 numara orotrakeal tüp kullanarak hayvanın orotrakeal entübasyonunu gerçekleştirin.
  7. % 1.5 ila% 2 izofluran inhalasyonu ile anesteziyi koruyun. Ek olarak, dakikada 100 ila 120 atış arasında tutulması gereken kalp atış hızı, %99 ile %100 arasında tutulması gereken oksijen satürasyonu, kas gevşemesi, hareket yokluğu ve reflekslerin değerlendirilmesi gibi fizyolojik parametreleri değerlendirerek anesteziyi izleyin.
    NOT: Vücut ısısı da 37.5-38.5 °C arasında kalacak şekilde izlenmeli ve kontrol edilmelidir. Gerektiğinde, parametrelerin kontrolünü sağlamak için izoflurana ek olarak propofol kullanılabilir. Fentanil hidroklorür, her 20 dakikada bir 0.02 mg / kg'lık bir dozda analjezik olarak uygulanmalıdır. Tüm parametreler her 5 dakikada bir kaydedilmelidir.
  8. Perioperatif analjezi tek doz 0.002 mg / kg fentanil intravenöz ve 4 mg / kg tramadol hidroklorür ile intramüsküler olarak gluteal veya trapezius kasına uygulayın.
  9. Kalp atış hızının intraoperatif izlenmesi için kardiyak elektrotları torasik bölgeye yerleştirin. Her 5 dakikada bir kalp atış hızını, rektal sıcaklığı ve oksijen doygunluğunu kaydedin.

2. Cerrahi prosedür

  1. Yaldızı sırt yaslanacak şekilde ameliyat masasına yerleştirin.
  2. Cerrahi alanın kontaminasyonunu en aza indirmek için hayvanın bacaklarını prosedürel eldivenlerle örtün.
  3. Cerrahi bir kesme makinesi kullanarak sondan bir önceki meme bezi çifti arasında ventral kaudal abdominal epilasyon işlemi gerçekleştirin.
  4. Klorheksidin emdirilmiş antiseptik bir fırça ile preoperatif cilt antisepsisi yapın, göbek skar bölgesinden son meme bezi çiftine kadar dairesel hareketler yapın. Klorheksidini temiz, nemli bir kompres ile çıkarın.
  5. Cerrahın ve asistanın cerrahi antisepsi yaptığından ve ameliyat için steril cerrahi önlük ve eldiven giydiğinden emin olun.
    NOT: Hayvan, ameliyat bölgesinden ayrı bir hazırlık alanında ameliyat için hazırlanmalıdır.
  6. Ameliyat masasını, Malzeme Tablosunda listelenen uygun ve önceden sterilize edilmiş aletlerle hazırlayın.
  7. Steril gazlı bez ve klorheksidin antiseptik kullanarak, bölgeyi kılçık şeklinde temizleyerek, kesi bölgesinden başlayarak ve yanal olarak genişleyerek son cerrahi alan antisepsisini gerçekleştirin.
  8. Bu işlemi klorheksidin antiseptik ile üç kez tekrarlayın ve ardından işlemi alkolik klorheksidin ile tekrarlayın.
  9. Hayvanı steril bir cerrahi örtü ile tamamen örtün ve makas kullanarak, örtü fenestratize edilmemişse, cerrahi örtüde yaklaşık 10 x 20 cm² dikdörtgen bir açıklık oluşturun.
  10. Cerrahi örtüyü sondan bir önceki kasık meme bezi çiftinin üzerine yerleştirin. Cerrahi örtüyü hayvanın derisine sabitlemek için 4 Backhaus kelepçesi yerleştirin.
  11. Cildi bir neşter ile kesin ve yaklaşık 10 cm uzunluğunda bir kesi oluşturun.
  12. Hemostatik forseps ve/veya emilebilir sütür boyutu 2 ile deri altı damarların hemostazını elde edin.
  13. Deri altı dokusunu parmaklarınızla veya ince uçlu makas yardımıyla inceleyin, karın kaslarındaki linea alba'ya ulaşmak için kesiyi derinleştirin.
    NOT: Linea alba'yı daha sert ve lifli bir alan olarak hissetmek için karnın orta hattını palpe edin; Rectus abdominis kaslarının ayrılmasını gözlemleyin ve linea alba'yı doğru bir şekilde tanımlamak için diseksiyon sırasında doku kıvamındaki değişikliği not edin11.
  14. Allis forseps ile kas sistemini kavrayın ve bir neşter ile linea alba'da bir kesi yapmak için kaldırın.
  15. Yapışıklıkların varlığını değerlendirmek için işaret parmağını insizyona sokun. Diğer organlara ve alttaki yapılara zarar vermemek için kesiği linea alba kaudal ve kraniyal olarak künt/künt veya ince/künt makasla dikkatlice uzatın.
  16. Rahim boynuzlarını ve/veya yumurtalıkları bulmak ve dışlamak için cerrahın bir elinin karın boşluğuna sokulabilmesi için yeterli uzunlukta bir kesi yapın. İşlem sonunda karın boşluğuna girişi ve kas sisteminin tek bir tabaka halinde dikilmesini kolaylaştırmak için bir Gosset ekartörü kullanılabilir.
  17. Rahim boynuzlarından biri yumurtalıklardan önce bulunuyorsa, rahim boynuzunun ucuna ve ipsilateral yumurtalığa ulaşana kadar nazikçe takip edin. Bu prosedür sırasında, rahim içinde gebeliği tehlikeye atabilecek sıvı varlığını değerlendirin.
  18. Yumurtalığı bulduktan sonra, yavaşça çekin ve dikkatlice açığa çıkarın. Yaldızın senkronizasyonunun beklendiği gibi olup olmadığını değerlendirmek için yumurtlama öncesi foliküller, hemorajik corpora lutea, siklik corpora lutea ve corpus albicans'ın varlığını değerlendirin.
  19. Yumurtalığı kaplayan uterus tüpünün fimbriyalarını nazikçe çıkarın, mukozasını temizleyin ve uterus tüpünün ostiumunu bulun.
    NOT: Cerrah fimbriaların ostiumunu tanımlamakta zorlanırsa, embriyoları içeren Tomcat kateterini yerleştirmek için kan damarlarını delmekten kaçınarak yuvarlak gövdeli bir dikiş iğnesi ile yumurta kanalının ampullası üzerinde bir cep yapılabilir.
  20. Embriyoları içeren bir Tomcat kateterini, uterus tüpünün ampulla bölgesine ulaşana kadar fimbriaların ostiumuna dikkatlice yerleştirin.
  21. Embriyo içeren sıvıyı uterus tüpüne itmek için Tomcat kateterine 1 mL'lik bir şırınga takın. Yumurtalığı fimbriae ile örtün ve karın boşluğuna geri koyun.
  22. Kontralateral uterus boynuzunu ve yumurtalığı bulun ve 2.17-2.21 adımlarını tekrarlayın.
  23. Karın boşluğu içindeki yapıları yeniden konumlandırın ve abdominorafiye başlamadan önce yapışmaları önlemek için 1 L salin solüsyonu veya ısıtılmış Ringer laktat solüsyonu (39 °C) ekleyin.
  24. Karın kaslarını emilebilir sütür ile 2 numara "X" dikişte (Sultan) dikişsiz dikişle dikin.
  25. Emilebilir sütür boyutu 2 kullanılarak sürekli bir yatak sütürü ile cilt altı dokusuna yaklaştırın.
  26. Cildi 2 numara naylon sütürle kesintili basit dikişler, cerrahi zımbalar veya etil-siyanoakrilat yapıştırıcı ile kapatın. Bu prosedürde yapıştırıcı kullanımını tercih ettik.
  27. Cerrahi yarayı hidrojen peroksit içine batırılmış gazlı bezle temizleyin ve cerrahi yapıştırıcının cerrahi yara üzerine sabitlenmesini arttırmak için bir kompres ile kurulayın. Rifamisin veya Pearson merhemi uygulayın, gazlı bezle örtün ve son olarak cerrahi yapıştırıcı uygulayın.
    NOT: Yara 5 gün boyunca pansuman ile kapalı kalmalıdır.

3. Ameliyat sonrası bakım

  1. Luna ve ark.12 tarafından önerilen ölçeğe göre, hayvanları en az önümüzdeki 3 ardışık gün boyunca karakteristik klinik ağrı belirtileri açısından değerlendirin.
    NOT: Bu ölçek, duruş, etkileşim ve çevreye ilgi, aktivite, iştah ve etkilenen bölgeye dikkat gibi farklı seviyelerde ağrı yaşarken domuzlar tarafından sergilenen farklı davranışlara dayanmaktadır. Puan, değerlendirilen her parametre için sergilenen davranış türüne bağlı olarak 0 ile 3 arasında değişir. Değerlendirmenin sonunda, tüm puanların toplamı hayvanın yaşadığı ağrının yoğunluğunu yansıtır, burada 0 ağrıyı temsil etmez ve 18 çok yoğun ağrıyıtemsil eder 12.
  2. Ağrıyı, enflamatuar süreçleri ve enfeksiyonu önlemek için postoperatif bakım olarak 3 gün boyunca günde bir kez intramüsküler olarak (gluteal veya servikal kasta) tek bir doz 15 mg / kg amoksisilin ve 0.4 mg / kg% 2 meloksikam uygulayın.
    NOT: Kullanılan ağrı ölçeğinde ağrı skoru 6'ya eşit veya daha büyükse (0'dan 18'e kadar puan), anti-enflamatuar ve antibiyotiğe ek olarak günde bir kez kas içine (gluteal veya servikal kasta) 5.000 mg / hayvan sodyum dipiron uygulayın. Alternatif olarak, yerel IACUC kılavuzlarında belirtildiği gibi analjezi gerçekleştirin.
  3. Ameliyattan sonraki 6. günde, %2 alkolik klorheksidin solüsyonuna batırılmış gazlı bezle yara temizliği için cerrahi yapıştırıcıyı çıkarın ve 10. güne kadar topikal Pearson merhemi uygulayın, bu süre içinde dikiş çıkarılması veya kullanılıyorsa cerrahi zımbaların çıkarılması önerilir.

4. Gebeliğin ultrasonografik gebelik tanısı

  1. Embriyo transferi ameliyatından 30 gün sonra ultrason cihazı (frekans aralığı 4.5 ila 8.5 MHz) ile transabdominal gebelik ultrasonografik değerlendirmesi yapın.
  2. Proba ultrason jeli uygulayın ve mediale bakacak şekilde kasık karın bölgesinin yakınına yerleştirin.
    NOT: Rahim lümenindeki sıvı nedeniyle yuvarlatılmış yankısız embriyonik veziküllerin görselleştirilmesi gebeliği gösterir. Rahim içi sıvının görüntülenememesi veya embriyonik veziküllerin tanımlanması olmadan rahim içi sıvının varlığı, gebeliğin olmadığını düşündürür.

5. Hayvanların ötenazisi

NOT: Ultrasonografik incelemede gebelik yaşına karşılık gelen büyüklük ve görünümde fetüsler sunmayan solungaçlara ötenazi yapın.

  1. 40 mm x 12 mm'lik bir iğne kullanarak, intravenöz uygulama setine bağlı aynı 50 mL şırıngada 15 mg / kg ketamin ve 2 mg / kg midazolam çekin ve preanestezik ilaç olarak dış kulak kanalına kaudal servikal bölgedeki trapezius kasına intramüsküler olarak uygulayın.
  2. Auriküler veni 20 G'lik bir kateter ile kanüle edin ve bradikardi oluşana kadar bir bolusta intravenöz olarak 4 mg / kg propofol ile anestezi uygulayın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
  3. Daha sonra, intravenöz olarak 10 ila 20 mL% 19.1 potasyum klorür uygulayın. Kardiyak bölgeye bir stetoskop yerleştirerek solunum hareketlerinin yokluğunu, soluk mukoza zarlarını, kornea refleks kaybını ve kalp atışlarının yokluğunu gözlemleyerek kardiyopulmoner arresti onaylayın.
  4. Nekropsiye edilmiş dişilerden13 her türlü intrauterin içeriği (embriyonik doku, sıvı veya mukoza salgıları) toplayın ve olası patojenleri tespit etmek için mikrobiyolojik analiz ve ayrıca klonların genotipik karakterizasyonu için (gerekirse) iletin. Corpora lutea, yumurtalık kistleri, anormal sekresyonlar ve uterus, yumurtalıklar ve yumurta kanallarında yapışıklıkların oluşumunu görsel olarak kontrol edin14.

Sonuçlar

Bu makale, klonlanmış embriyoların solungaç kanalına transfer edilmesi için yapılan laparotomi cerrahisini göstermeyi amaçlamaktadır. Tüm hayvanlar, anestezi iyileşmesi sırasında herhangi bir intraoperatif olay veya komplikasyon olmaksızın yeterli bir anestezi düzleminde kaldı. Ameliyat bittikten sonra yaldızların ayağa kalkması ortalama 2-3 saat sürdü.

Tüm cerrahi işlemler ortalama 44 dk sürdü. Dokuz yaldız ameliyat edildi, yaldız başına ortalama 185 klonlanmış embriyo transfer edildi ve toplam 1.664 embriyo bilateral olarak transfer edildi (Tablo 1). Yumurtalıkların lokalizasyonu, dışsallaşması ve embriyoları içeren Tomcat kateterinin yumurta kanalının ostiumuna sokulması ameliyatın en hassas anlarına karşılık geldi. Tüm solungaçların yumurtalıkları ameliyat sırasında incelendi ve tümü, yumurtlama olaylarından kısa bir süre sonra embriyo transferlerini gerçekleştirmeyi amaçlayan, gerçekleştirilen östrus senkronizasyon protokolü için beklenenle tutarlı olarak, yakın zamanda yumurtlanmış hemorajik foliküller sundu. Tüm prosedürler intraoperatif olaylar olmadan gerçekleşti.

Ameliyat sonrası hiçbir hayvan yoğun ağrı belirtisi göstermedi, ağrı ölçeğinde ortalama ağrı skoru 0.33, 0.33, 3.67, 1.33, 4.67, 2.00 ve 0.33 (0 ile 18 arasında değişen) ameliyat sonrası 3 gün boyunca ameliyat edilen yaldızların her biri için gerçekleştirildi (Tablo 2). Ameliyat edilen solungaçların sadece 1'inde ameliyat sonrası 12. günde deri altı sıvı birikimi (seroma) görüldü ve cerrahi yaranın yakınında lokalize enfeksiyon ve iltihap bulguları vardı. Ultrason eşliğinde 40 mm x 1.6 mm'lik bir iğne ile sıvıyı boşalttıktan sonra, iltihaplı bölgeye 7 gün boyunca günde 30 dakika soğuk kompres uyguladıktan, ceftiofur (enjeksiyonlar arasında 72 saat ara ile 3 kas içi enjeksiyon) ve% 2 meloksikam (0.4 mg / kg SID, kas içinden, 3 gün boyunca) uygulandıktan sonra, yara fistül edildi ve kalan mukopürülan içerik boşaltıldı, hayvanın tamamen iyileşmesine neden olur. Ameliyat edilen diğer solungaçlar, yara temizliği için değiştirilmesine veya çıkarılmasına gerek kalmadan 5 gün boyunca cerrahi pansumanla birlikte kaldı, bu sadece ameliyat sonrası 6. ila 10. gün arasında yapıldı.

2, 8 ve 9 nolu solungaçlarda uterus lümeninde sıvı birikimi ve embriyonik vezikül oluşumu gözlenmedi (Şekil 1A). Bu nedenle, bu hayvanların gebelik tanısı negatif olarak kabul edildi. Diğer solungaçlarda intrauterin sıvı birikimi ve embriyonik veziküllerin oluşumu görüldü ve iyi tanımlanmış yankısız yuvarlak yapılar olarak görüntülendi (Şekil 1B-D). Gebeliğin 32. gününde embriyonik veziküllerin içinde erken gelişim evresindeki embriyonik yapıya göre hiperekoik bir bölge tanımlamak mümkün olmuştur (Şekil 1E,F).

Negatif bir gebelik tanısı veya gebeliğin ilerlememesinden sonra, solungaçlara ötenazi yapıldı ve üreme sistemi analiz edildi. 1, 2, 3 ve 4 numaralı solungaçlarda yumurtalık, yumurta kanalları ve uterus boynuzu bölgelerinde az ya da çok yapışıklıklar, 8 nolu saldızda ise over kistleri gözlenmiştir (Şekil 2). Gebelik yaşı yaklaşık 12-20 günlük gebelik ile uyumlu dört embriyonik yapı yaldızlı 3'ün uterusundan, bir yapı ise yaldızlı 7'nin rahminden elde edildi (Şekil 3). Embriyonik doku fragmanlarının analizi, embriyonik ölüme veya düşüklere neden olabilen Parvovirus, Leptospira sp., Erysipelothrix rhusiopathiae ve Porcine Circovirus tip 2 ve 3'ün (PCV2 / PCV3) tespiti için negatif sonuçlandı.

Ultrason dizisi, böbrek yapısı analizi, tıbbi görüntüleme, tanı prosedürü, böbrek çalışması.
Şekil 1: Cerrahi işlemden 30 gün sonra embriyo alıcısının uterusunun ultrasonografik görüntüleri. (A) İçinde sıvı bulunmayan, negatif bir gebelik tanısını karakterize eden yaldızlı 2'nin uterusu. İçinde sıvı bulunan embriyonik veziküller (yıldızlar) içeren yaldızlı 1 (B), yaldızlı 3 (C) ve yaldızlı 4 (D)'nin gravid uterusu. Yaldızlı 3 (E) ve yaldızlı 7 (F) gravid uterusu, embriyonik vezikül içinde hiperekoik bir yapı (ok) gösterir ve gebeliğin 32. gününde erken fazda fetal oluşumu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Diseksiyon süreci, anatomik çalışma, işaretli örnek segmentleri, eğitim araştırma diyagramı.
Şekil 2: Üreme sisteminin analizi. Yaldız 1 (A), yaldız 2 (B), yaldız 3 (C), yaldız 4 (D), yaldız 5 (E), yaldız 6 (F), yaldız 7 (G), yaldız 8 (H) ve yaldız 9 (I). Oklar rahim boynuzları, yumurtalıklar ve yumurta kanallarındaki yapışıklıkları vurgular ve ok uçları yumurtalık kistlerini vurgular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Biyolojik doku örneklerini ve anatomik çalışma için petri kabındaki örneği gösteren diseksiyon görüntüleri.
Şekil 3: Gebelik tanısı. Ultrasonografik incelemede gilt 3 (A-D) ve gilt 7 (E)'den çıkarılan erken evre embriyolarda pozitif gebelik tanısı ve embriyonik veziküller içinde hiperekoik yapılar görülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Yaldız başına transfer edilen embriyo sayısı ve türü, tanı konan gebelikler ve ameliyat edilen yaldızların nekropsisinden sonra elde edilen embriyo sayısı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Ağrı belirtilerinin sunumu ile ilgili olarak ameliyat edilen giltlerin her birine atanan değerler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Tarif edilen cerrahi yöntem daha önce klonlanmış domuzların veya genetiği değiştirilmiş klonlanmış domuzların üretimi ile çalışan diğer araştırma grupları tarafından gerçekleştirilmiştir ve bu tekniğin uygulanmasından sonraki doğum raporları 15,16,17,18,19,20. Çeşitli hücre hatlarından üretilen SCNT embriyolarının gebelik ve doğum oranları %20-30 arasında değişmektedir (2017'den bu yana 264 transferden), çöp başına ortalama 3,2 ± 0,4 domuz yavrusu doğar 3,21. Bu tekniğin düşük verimliliği ile ilgili olarak, alıcı dişi domuzlar için kullanılan senkronizasyon protokolü, alıcı dişi domuzlar ile transfer edilen embriyoların evresi arasındaki senkronizasyon, embriyo biriktirme yeri, SCNT ve üretilen embriyolar için kullanılan oositlerin kalitesi, çekirdek donör somatik hücrelerinin kalitesi ve hücresel evresi ve transfer edilen embriyo sayısı21 gibi çeşitli faktörler vardır.

Bu çalışmaya göre, tarif edilen cerrahinin, klonlanmış embriyoların (4 hücreli aşamaya kadar) solungaçlar halinde cerrahi transferini gerçekleştirmek için etkili, hızlı ve güvenli olduğu kanıtlanmıştır, bu da pozitif ultrasonografik gebelik tanıları ve nekropsi sonrası uterus lümeni içindeki embriyonik yapıların görüntülenmesi ile sonuçlanmıştır, gebelik yaşı yaklaşık 12-20 gün arasındadır22. SCNT embriyolarını dişi domuzların yumurta kanalına aktarmak için daha az invaziv bir başka yöntem laparoskopi içerir. Bununla birlikte, bu tekniğin etkinliği, yapıların anatomisi, kullanılan kateter tipi ve embriyo biriktirme yeri gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak %20'den az ile %80'in üzerine kadar önemli ölçüde değişmektedir 4,6,23,24,25,26,27. Laparoskopi ile 2-4 blastomer domuz embriyosunu infundibulum yoluyla 6 dişi domuza transfer ederken, Wieczorek ve ark.4 işlem sonrası 28-31 gün sonra pozitif gebelik elde edememiş ve bu sonuç kateterin yumurta kanalına yerleştirilmesinde zorluklar, yumurta kanalına sığ kateter yerleştirilmesi ve kateter ile infundibulum perforasyonu oluşması ile ilişkiliydi. Bu nedenle, laparotomi yoluyla dişi domuzların yumurta kanalına embriyo transferi yöntemi hala en verimli gibi görünmektedir.

Dişi domuzlarda embriyo transferi için laparotomi prosedürü ile ilişkili cerrahi risk küçüktür; bununla birlikte, Landrace ve Büyük Beyaz ırkların ticari domuzlarında yaygın olarak görülen anestezi sırasında malign hipertermi olasılığını not etmek önemlidir28. Bu durumda, ameliyat edilen solungaçların hiçbiri anestezi sırasında malign hipertermi klinik belirtileri göstermedi. Ayrıca deri altı bölgedeki daha büyük damarlardan küçük lokal kanama riski de vardır, bu da hemostatik forseps veya emilebilir dikiş ile dikiş atılarak kolayca durdurulabilir. Makas ile linea alba'da bıçak ve uzatma kesisi ile neşter ile yapılan kesi sırasında mesane veya bağırsak halkaları gibi karın boşluğunun herhangi bir organının yanlışlıkla kesilmesi olasılığı da ortaya çıkabilir. Bu durumda, cerrah, alttaki yapıların kesilmesini veya yırtılmasını önlemek için linea alba'nın kesilmesi ve karın kaslarının dikilmesi sırasında çok dikkat etmelidir.

Cerrahın el becerisi, yumurtalıkların uygun şekilde manipüle edilmesi ve yumurtalık pedikülünün damarlarının yırtılmasını önleyerek dikkatli bir şekilde dışlanması için gereklidir. Yumurtalık(lar)ın yerini belirlemede zorluk olduğunda, rahim boynuzlarından birini bularak ve yumurtalık yakınındaki rahim-tubal bileşkede rahim boynuzunun ucuna ulaşana kadar uzantısını takip ederek işleme başlamak mümkündür. Bu organların aşırı manipülasyonuna bağlı yumurtalık ve rahim yapışıklıklarından kaçınmak için özen gösterilmelidir. Ameliyat sırasında bu yapıları laktasyonlu Ringer solüsyonu veya tuzlu su solüsyonu ile 39 °C'de nemlendirmek, yapışma oluşumunu önlemeye yardımcı olabilir29. Rahim tüpünün manipülasyonu, özellikle fimbriae bölgesinde, gerilme ve yırtılmayı önlemek için çok hassas bir şekilde yapılmalıdır. Uterusun aşırı manipülasyonunu önlemek ve ameliyat süresini kısaltmak için uterus tüplerinden sadece birine tek taraflı embriyo transferi yapılabilse de, özellikle rahim tüplerinden birinin kazara yırtılması veya embriyonun doğru yerde birikmesi ile ilgili şüphelerin olduğu durumlarda bilateral transfer daha güvenli ve avantajlı olabilir. Ayrıca, tek taraflı transfere kıyasla daha yüksek gebelik oranları ve doğan domuz yavrusu sayısını teşvik ettiği için bilateral transfer daha fazla önerilmektedir16,30. Kistlerin varlığı, yumurtalık kistleri olan kadınların% 10'una kadar anöstriste kalırken, kızgınlığa düzenli veya düzensiz dönüş ile ilişkilidir. Stres, hormonal protokollerin kullanımı veya genetik miras gibi çeşitli nedenlerle ilişkilidir31,32. Olgumuzda foliküler kistler, hormon üreticisinin ısı senkronizasyonu için önerdiği doz ve uygulama süresine uyulmasına rağmen ortaya çıkmıştır.

Fimbriaların açılmasıyla uterus tüpünün ostiumunun nasıl yerleştirileceğini bilmek, embriyoların uygun yere doğru şekilde yerleştirilmesi için temel öneme sahiptir. Embriyo birikiminin yeri ile ilgili hatalardan kaçınmak için, mezbaha örneklerinde çözelti (örneğin su) ile doldurulmuş Tomcat kateterinin uterus borusunun ostiumundan geçişi konusunda önceden eğitim yapılması önerilir. Pipet doğru yere yerleştirildiğinde, çözelti enjekte edildikten sonra uterus tüpünün hacminde bir artış gözlemlemek mümkündür. Embriyolarla birlikte aktarılan sıvı miktarı ne kadar az olursa, hamilelik şansının o kadar iyi olduğunu belirtmekte fayda var33. Cerrah rahim tüpünün ostiumunu bulmakta çok zorlanırsa, yumurta kanalı üzerinde bir cep yapmak ve kateteri içinden geçirmek mümkündür. Bu son yöntem daha hızlı olmasına ve yumurta kanalının daha az manipülasyonunu içermesine rağmen, cerrahın kan damarlarından kaçınması ve kateterin yumurta kanalının lümenine doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olması gerekir.

Bu cerrahi işlemden ameliyat sonrası enfeksiyon oluşma riski düşük olsa da hayvanların barındırıldığı alanın temizlik düzeyi, cerrahi işlemin süresi, pansumanın yeterli süre sürdürülmesi, koruyucu antibiyotik tedavisi ve antienflamatuarlar gibi ilaçların doğru reçete edilmesi gibi faktörlere bağlı olarak ortaya çıkabilir. Ameliyat edilen solungaçlardan birinde gözlenen enfeksiyonun ortaya çıkması için en makul hipotez, hayvan anesteziden sonra ayağa kalktıktan kısa bir süre sonra pansumanın düşmesi ile ilgilidir. Her ne kadar bu yaldızın cerrahi yarasının günlük temizliği, tuzlu su çözeltisine batırılmış gazlı bez ve Pearson merheminin topikal uygulaması ile gerçekleştirilmiş olsa da, böyle bir prosedür, bölgeye soğuk su uygulaması, drenaj, sistemik antibiyotik tedavisi ve ek 3 günlük anti-enflamatuar tedavi gerektiren, artan kontaminasyonu önlemek için yeterli değildi. Deri altı enfeksiyonu ortaya çıksa bile, bu yaldız ultrasonografik incelemede gebelik belirtileri gösterdi.

Önceki ameliyatlarda cildi kapatmak için naylon iplikler ve cerrahi zımbalar kullandıktan sonra, dikişleri çıkarırken stresi azaltmak ve kalan iplik veya zımbaları önlemek için etil-siyanoakrilat yapıştırıcı kullanmayı seçtik. İpliklerin veya zımbaların varlığı, püstül oluşumu ile küçük lokal iltihabı teşvik eder. Etil-siyanoakrilat yapıştırıcı, cerrahi prosedürlerde zaten güvenli bir şekilde kullanılmış ve etkili, toksik olmayan ve bakterisidal olduğu kanıtlanmıştır34,35. Cerrahi işlemden kısa bir süre sonra pansumanın düşmesine neden olan yaldız hariç, tüm hayvanlar komplikasyon olmadan mükemmel yara iyileşmesi gösterdi.

Açıklamalar

Yazarların hiçbiri herhangi bir çıkar çatışmasını açıklamaz

Teşekkürler

Sao Paulo Üniversitesi (FMVZ/USP), Sao Paulo, Brezilya, FAPESP (hibe 2022/11459-3, Sao Paulo Araştırma Vakfı), EMS Pharma, CNPq (hibe 405254/2022-9) ve Água Branca domuz yetiştiriciliği, Itu, Sao Paulo, Brezilya.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.25 mL samanjenerik-Cerrahimalzeme
1 mL şırıngaDescarpack341001Cerrahi malzeme
10 mL şırıngaDescarpack324601Cerrahi malzeme
20 mL şırıngaDescarpack324801Cerrahi malzeme
3 mL şırıngaDescarpack324201Cerrahi malzeme
5 mL şırıngaDescarpack324401Cerrahi malzeme
60 mL şırıngaDescarpack323201Cerrahi malzeme
9 mm endotrakeal tüpRusch112482-000090Cerrahi malzeme
Allis forsepsjenerik-Cerrahialet
Amox LAJA Saú de HayvanMAPA tescili: 8.781/2004Farmasötik ilaç
Bakhaus forsepsjenerik-Cerrahialet
Kateteri 20GDescarpack362401İntravenöz erişim için
kateter CetaminAgener Uniã oMAPA kaydı: SP-000292-5.000011 Anestezi
İletken klinik jelRMCANVISA kaydı: 80122200013Cerrahi malzeme
Dipyrone D-500ZoetisMAPA kaydı: SP0000728-46Farmasötik ilaç
Tek kullanımlık neşter n. 22WiltexANVISA kaydı: 10150470565Cerrahi alet
Tek kullanımlık steril sünger fırçaRioquimica7.89778E+12Cerrahi asepsi
Kolay Tarama: GoIMVESCG01Ultrason
Endozime AW PlusRuhof34514Cerrahi aletler için deterjan
Fentanil (Fentanest)Cristá liaANVISA kaydı: 1029800810159Anestezik
Gosset ekartörjenerik-Cerrahialet
Halstead-sivrisinek hemostatik forsepsjenerik-Cerrahialet
İyileştirici merhem - Unguento Pearson PearsonSAMAPA kaydı: SP0000094-16Farmasötik ilaç
hidrojen peroksit çözeltisiRioquimicaANVISA kaydı: 218690015Cerrahi malzeme
İzofloranBiochimicoANVISA kaydı: 100630222Anestezik
IV Damla seti ekstansörjenerik-Sıvıtedavisi
IV Makro damla setiDescarpack410301Sıvı tedavisi
Laktofur (ceftiofur)Ourofino SAMAPA kaydı: SP0000051-50Farmasötik ilaç
Laringoskop-Cerrahi alet
Maxicam 2%Ourofino SAMAPA kaydı: SP0000051-69Farmasötik ilaç
Mikro gözenekli yapıştırıcı 5 cm x 10 cm  Jenerik1530Cerrahi malzeme
MidazolamHipolaborANVISA kaydı: 1134301430035Anestezik
Çok Yönlü IV İnfüzyon SetiDescarpack413201Sıvı tedavisi
İğnesi 40 mm x 1,2 mmDescarpack353601İlaç ve anestezik uygulamak için steril iğne.
İğne 40 mm x 1,6 mmWiltexANVISA kaydı: 10150470664İlaç ve anestezik uygulamak için steril iğne.
İğne tutucujenerik-Cerrahialet
Naylon 2 sütür trheadShalon MedicalN502CTI40Cerrahi malzeme
Sıradan kalemjenerik-Notalmak için düzenli kalem
Fizyolojik çözüm% 0.9 500 mL torbaJP FarmaMS: 1.0491.0070Sıvı tedavisi
Poliglikolik asit 2 sütür ipliğiAtramatG4099-75HCerrahi malzeme
Potasyum klorürSamtecANVISA kaydı: 1559200010139Parenteral ilaç
Prosedür eldivenleriDescarpack122401Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD)
Propofol (Provive)Uniã o Quí mikaANVISA kaydı: 1049714490057Anestezik
Ringer laktat çözeltisi 500 mL torbaJP FarmaMS:1.0491.0061Sıvı tedavisi
Riohex %0.5 kleksidin alkol çözeltisiRioquimica218690356Cerrahi asepsi
Riohex yüzey aktif madde içeren %2 kloreksidin çözeltisiRioquimica218690356Cerrahi asepsi
Kafa derisi 21 GDescarpack421201Cerrahi malzeme
Ayakkabı kılıflarıjenerik-KişiselKoruyucu Donanım (KKD)
Steril kompreslerCremerANVISA kaydı: 10071150065Cerrahi malzeme
Steril gazlı bez pedProcitexANVISA kaydı: 80245210083Cerrahi malzeme
Steril cerrahi örtüler 140 cm x 90 cm Venkuri7010003Cerrahi malzeme
Steril cerrahi örtüler 150 cm x 190 cm PolarFixF00208Cerrahi malzeme
Steril cerrahi eldivenlerMucamboCA: 39.317Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD)
Stetoskopjenerik-Cerrahiekipman
Cerrahi başlıkDescarpack93201Kişisel Koruyucu Donanım (KKD)
Cerrahi önlükDescarpack231101Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD)
Cerrahi maskeDescarpack110701Kişisel Koruyucu Donanım (KKD)
Cerrahi makas künt-küntjenerik-Cerrahialet
Cerrahi makas keskin-keskinjenerik-Cerrahialet
Cerrahi zımbaTradevet-Cerrahimalzeme
Tekbond süper yapıştırıcıTek Bond78072720030Cerrahi malzeme
Termometrejenerik-Cerrahiekipman,
Üç MuslukSolidor374Cerrahi malzeme
Tramadol hidrokloridAgener Uni & atilde; oMAPA kaydı: SP-000292-5.000002Anestezik
Şeffaf film pansumanSkinupperANVISA kaydı: 82307460014Cerrahi malzeme
Su geçirmez yapıştırıcı 10 cm x 4,5 cm Jenerik364828Cerrahi malzeme
:, , :,

Kaynaklar

  1. Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), 5758(2021).
  2. Xi, J., et al. Genetically engineered pigs for xenotransplantation: Hopes and challenges. Front Cell Dev Biol. 10, 1093534(2023).
  3. Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim Sci. 3, 826324(2022).
  4. Wieczorek, J., et al. Laparoscopic embryo transfer in pigs - comparison of different variants and efficiencies of the method. Pol J Vet Sci. 26 (2), 295-306 (2023).
  5. Martinez, E. A., et al. Design, development, and application of a non-surgical deep uterine embryo transfer technique in pigs. Anim Front. 3 (4), 40-47 (2013).
  6. Wieczorek, J., et al. A new concept in minimally invasive embryo transfer. Ann Anim Sci. 20 (4), 1289-1308 (2020).
  7. Brussow, K. P., Torner, H., Kanitz, W., Ratky, J. In vitro technologies related to pig embryo transfer. Reprod Nutr Dev. 40 (5), 469-480 (2000).
  8. Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim. Sci. 3, 826324(2022).
  9. Langendijk, P., vanden Brand, H., Soede, N. M., Kemp, B. Effect of boar contact on follicular development and on estrus expression after weaning in primiparous sows. Theriogenology. 54 (8), 1295-1303 (2000).
  10. Costea, R., Ene, I., Pavel, R. Pig sedation and anesthesia for medical research. Animals. 13, 3807(2023).
  11. Vierstraete, M., Der Vekens, N. V. an, Beckers, R., Renard, Y., Muysoms, F. Descriptive anatomy of the porcine ventral abdominal wall as a basis for training ventral hernia repair techniques. J Abdom Wall Surg. 3, (2024).
  12. Luna, S. P. L., et al. Validation of the UNESP-Botucatu pig composite acute pain scale (UPAPS). PLoS One. 15 (6), e0233552(2020).
  13. Arruda, P. H. E., Gauger, P. Optimizing sample selection, collection, and submission to optimize diagnostic value. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 98-111 (2019).
  14. Althouse, G. C., Kauffold, J., Rossow, S. Diseases of the reproductive system. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 373-392 (2019).
  15. Hao, Y., et al. Porcine skin-derived stem cells can serve as donor cells for nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 101-109 (2010).
  16. Rim, C. H., et al. The effect of the number of transferred embryos, the interval between nuclear transfer and embryo transfer, and the transfer pattern on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 143 (1-4), 91-96 (2013).
  17. Choi, K., et al. Production of heterozygous alpha 1,3-galactosyltransferase (GGTA1) knock-out transgenic miniature pigs expressing human CD39. Transgenic Res. 26 (2), 209-224 (2017).
  18. Shim, J., et al. Human immune reactivity of GGTA1/CMAH/A3GALT2 triple knockout Yucatan miniature pigs. Transgenic Res. 30 (5), 619-634 (2021).
  19. Glanzner, W. G., Rissi, V. B., Bordignon, V. Somatic cell nuclear transfer in pigs. Methods Mol Biol. 2647, 197-210 (2023).
  20. Kim, J. H., et al. Analysis of production efficiency of cloned transgenic Yucatan miniature pigs according to recipient breeds with embryo transfer conditions. Theriogenology. 218, 193-199 (2024).
  21. Navarro-Serna, S., Piñeiro-Silva, C., Romar, R., Parrington, J., Gadea, J. Generation of Gene Edited Pigs. , 71-130 (2022).
  22. Geisert, R. D., et al. Rapid conceptus elongation in the pig: An interleukin 1 beta 2 and estrogen-regulated phenomenon. Mol Reprod Dev. 84 (9), 760-774 (2017).
  23. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
  24. Hazeleger, W., Kemp, B. Recent developments in pig embryo transfer. Theriogenology. 56 (8), 1321-1331 (2001).
  25. Youngs, C. R. Factors influencing the success of embryo transfer in the pig. Theriogenology. 56 (8), 1311-1320 (2001).
  26. Wieczorek, J., Koseniuk, J., Mandryk, I., Poniedziałek-Kempny, K. Piglets born after intrauterine laparoscopic embryo transfer. Pol J Vet Sci. 18 (2), 425-431 (2015).
  27. Brüssow, K. P., Rátky, J., Antosik, P., Kempisty, B., Jaśkowski, J. M. Embryo transfer in swine - an indispensable key for the application of reproduction techniques. Electron J Pol Agric Univ. 21 (3), (2018).
  28. Cadwallader, J. A., Alley, M. R. Malignant hyperthermia in a crossbred landrace-large white pig. N Z Vet J. 23 (9), 207-211 (1975).
  29. Fatehi Hassanabad, A., et al. Prevention of postoperative adhesions: A comprehensive review of present and emerging strategies. Biomolecules. 11 (7), 1027(2021).
  30. Shi, J., et al. Influence of embryo handling and transfer method on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 154, 121-127 (2015).
  31. Castagna, C. D., et al. Ovarian cysts and their consequences on the reproductive performance of swine herds. Anim Reprod Sci. 81 (1-2), 115-123 (2004).
  32. Knox, R. V. Factors influencing follicle development in gilts and sows and management strategies used to regulate growth for control of estrus and ovulation. J Anim Sci. 97 (4), 1433-1445 (2019).
  33. Galvin, J. M., Killian, D. B., Stewart, A. N. V. A procedure for successful nonsurgical embryo transfer in swine. Theriogenology. 41 (6), 1279-1289 (1994).
  34. Lins, R. D. A. U., et al. Use of cyanoacrylate in the coaptation of edges of surgical wounds. An Bras Dermatol. 87 (6), 871-876 (2012).
  35. Horvath-Pereira, B. deO., et al. Case report: An innovative non-invasive technique to manage shell injuries in C. carbonarius. Front Vet Sci. 9, 930419(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Laparotomi CerrahisiKlonlanm Domuz EmbriyolarSomatik H cre ekirdek TransferiGilt SenkronizasyonuOvidukt TransferiGestasyonel TanCerrahi Yap kl klarPostoperatif Bak mUterin Kornular

İlgili makaleler