Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Retinal Organoidlerin Mikroglia ile Birleştirilmesi

2.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67016

⸱

26 Temmuz 2024

 ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Mikroglia, retinada bulunan benzersiz yerleşik bağışıklık hücreleridir ve çeşitli retinal dejeneratif hastalıklarda çok önemli roller oynar. Retinal organoidlerin mikroglia ile ko-kültür modelinin oluşturulması, retina hastalıklarının patogenezinin ve gelişim sürecinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabilir.

Özet

İnsan retinasının sınırlı erişilebilirliği nedeniyle, retina organoidleri (RO'lar), retina gelişim mekanizmasını ve retina hastalığının oluşumunu ortaya çıkarabilecek insan retina hastalığını incelemek için en iyi modeldir. Mikroglia (MG), retina ve merkezi sinir sisteminde (MSS) benzersiz yerleşik makrofajlardır ve önemli bağışıklık fonksiyonlarına hizmet eder. Bununla birlikte, retinal organoidler, farklılaşma kökenleri yumurta sarısı kesesi olduğu için mikrogliadan yoksundur. Bu retina hastalıklarında mikroglianın spesifik patogenezi belirsizliğini korumaktadır; Bu nedenle, mikroglia içeren bir retinal organoid modelinin kurulmasının gerekli olduğu ortaya çıkmaktadır. Burada, insan kök hücrelerinden türetilen mikroglia ile birlikte kültürlenmiş bir retinal organoid modelini başarıyla oluşturduk. Bu makalede, mikroglia ayrımı yapıldı ve daha sonra erken evrede retinal organoidlerle birlikte kültürlendi. Bağışıklık hücrelerinin dahil edilmesi olarak bu model, retina ve CNS ile ilişkili hastalıkların patogenezi ve tedavisi hakkında derinlemesine araştırmaları kolaylaştırmak için retina hastalığı modellemesi ve ilaç taraması için optimize edilmiş bir platform sağlar.

Giriş

İnsan retinasının sınırlı kaynağı olarak, insan kök hücrelerinin üç boyutlu (3D) retinal organoidlere farklılaşması, retinayı simüle etmek için umut verici bir in vitro modeli temsil eder1. Retinada fotoreseptörler, retinal ganglion hücreleri, bipolar hücreler, Müller hücreleri, yatay hücreler ve astrositler2 dahil olmak üzere farklı hücre tipleri içerir. Bu model, hem retina gelişim mekanizmalarının hem de retina hastalıklarının patogenezinin öykünmesini ve incelenmesini sağlar. Bununla birlikte, yönlü farklılaşma yöntemi nedeniyle, retinal organoidler, yolk kesesinden mikroglia ve mezodermden perivasküler hücreler gibi farklı germ katmanlarından kaynaklanan diğer birçok hücre tipinden yoksun olan nöroektoderm3'ten türetilmiştir 4,5,6.

Şu anda, retinitis pigmentosa7, glokom8 ve retinoblastoma9 gibi birçok retina hastalığının retinadaki mikroglia ile yakından ilişkili olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, uygun araştırma modellerinin olmaması nedeniyle, mikroglia ile bu hastalıklar arasındaki ilişkiyi gösteren spesifik mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Fareler retina hastalıklarını incelemek için uygun bir model olarak hizmet ederken, son çalışmalar fare ve insan mikrogliası arasında yaşam süresi, proliferasyon oranı ve insan homolog genlerinin yokluğu açısından önemli farklılıklar olduğunu vurgulamıştır10,11. Bu bulgular, fare modellerinden elde edilen sonuçların tamamen güvenilir olmayabileceğini ve mikroglia içeren insan retinal organoidlerinin oluşturulmasının önemini vurguladığını öne sürdü.

Son birkaç on yılda, retinal organoidlerin 3 boyutlu farklılaşması için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir12,13. Retinal organoidler içinde mikroglia'nın ko-kültür çalışmasını kolaylaştırmak için, yapışık kültürden süspansiyon kültürüne geçişi içeren bir farklılaşma yöntemi seçtik. Bu yaklaşım, mikroglia'nın retinal organoidlere başarılı bir şekilde dahil edilmesini ve en az 60 gün boyunca korunmasını sağlar14.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Capital Medical Üniversitesi, Pekin Tongren Hastanesi Kurumsal Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. HESC'nin hücre hattı H9, WiCell Araştırma Enstitüsü'ndendi. Deneyden önce hücre kültürü ortamını oda sıcaklığında (RT) 30 dakika önceden ısıtın.

1. İnsan mikrogliasının oluşumu

  1. Hücre yoğunluğu %80-90'a ulaşana kadar hESC'leri kök hücre ortamında kültürleyin. Her kuyucuğa en az 1 x 106 hücre tohumlayın.
  2. Kök hücre ortamını aspire edin ve hücreleri 1x DPBS (1 mL / 6 oyuklu plakanın oyuğu) ile durulayın. Bir sonraki adım 2 x 107-1 x 108 hücre gerektirir. Yeterli değilse, aşağıdaki adımları uygulamak için 2-5 kuyucuklu hücreleri birleştirin.
  3. 37 ° C'lik bir inkübatörde (1 mL / 6 oyuklu plakanın 1 mL / oyuğu) yaklaşık 5 dakika boyunca 0.5 mM EDTA çözeltisini kullanarak kök hücre kolonilerini ayırın.
  4. 5 dakika sonra koloni morfolojisini kontrol edin. Koloni kenarları gevşek boşluklarla hafifçe kıvrıldığında, hücreler farklılaşmaya ve EDTA'yı aspire etmeye hazırdır. Değilse, hücreleri 37 ° C'de 1-2 dakika daha inkübe edin. 8 dakikadan daha uzun süre kuluçkaya yatırmayın.
  5. 6 μL 10 mM ROCK inhibitörü Y-27632 çözeltisi ile 6 mL Ortam A (Tablo 1) kullanarak her bir oyuktaki hücreleri nazikçe durulayın. Hücreleri durulamaya yardımcı olmak için tabağın altına hafifçe vurun. Günü 0. gün olarak ayarlayın.
    NOT: Hücreleri pipetlemeyin. Hücreler ertesi gün embriyoid cisimcikleri (EB'ler) oluşturacaktır.
  6. 24 saat sonra, EB oluşumunu doğrulamak için hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. EB'leri 10 mL'lik bir pipet ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpe toplayın ve EB'lerin 5 dakika içinde dibe çökmesini bekleyin.
  7. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve EB'leri 6 mL taze Ortam A ile yeniden süspanse edin ve bunları 6 oyuklu plakadan oluşan yeni bir düşük yapışma kuyusuna aktarın. 37 °C'lik bir inkübatörde kültür.
    NOT: 1. günde kuyu transferinin amacı, EB oluşumu sürecinde hücre büyümesinin durumunu etkileyebilecek çok sayıda ölü hücrenin etkisini azaltmaktır.
  8. Taze Orta A'yı 4. güne kadar her gün yenileyin (6 mL / 6 oyuklu plakanın kuyusu).
  9. 4. günde, 10 cm'lik bir tabağı% 5 CO2, 37 ° C'lik bir inkübatörde en az 1 saat boyunca 3 mL% 0.1 balık jelatin çözeltisi ile kaplayın.
    NOT: Kaplama süresi 1 saatten az ise, aşağıdaki adımların gerçekleştirilmesi zordur.
  10. EB'leri 10 mL'lik bir pipet ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpe dikkatlice toplayın ve EB'lerin 5 dakika içinde dibe çökmesini bekleyin.
  11. % 0.1 jelatin çözeltisini çıkarın ve 10 cm'lik kabı 5-6 mL 1x DPBS ile bir kez durulayın. DPBS'yi çıkarın.
  12. EB'leri 15 mL santrifüj tüpte 15 mL Orta B (Tablo 1) ile nazikçe yeniden süspanse edin ve bunları kaplanmış 10 cm'lik tabağa aktarın. 1 hafta boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde kültür.
    NOT: İlk 7 gün içinde tabağı hareket ettirmeyin.
  13. 49. güne kadar (15 mL / 10 cm tabak) haftada bir kez taze Orta B ile yenileyin ve hücreleri haftada bir kez mikroskop altında inceleyin.
    NOT: 49. günden sonra, kültür kabındaki süpernatantta birkaç salgı hücresi bulunabilir.
  14. Süpernatan hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
  15. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücreleri 2 mL taze Orta B ile yeniden süspanse edin ve 6 oyuklu plakadan oluşan yeni bir düşük yapışma kuyusuna aktarın. % 5 CO2, 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
    NOT: Önümüzdeki 7 gün içinde plakayı hareket ettirmeyin. Mikroglia, düşük yapışma kuyusunun dibine yapışabilir.
  16. 56. günde, Orta C (Tablo 1) (2 mL / 6 oyuklu plaka) ile değiştirin. Mikroglia, düşük yapışma özelliğinin dibine iyi yapışır ve mikroskop altında dallanmış görünecektir.
    NOT: Orta C'yi her 3 günde bir değiştirerek (2 mL / 6 oyuklu plakanın kuyusu), mikroglia yaklaşık 15 gün boyunca Orta C'de yetiştirilebilir.

2. İnsan RO'larının üretilmesi ve RO'ların mikroglia ile birlikte kültürlenmesi

  1. Hücre yoğunluğu %80-90'a ulaşana kadar hESC'leri kök hücre ortamında kültürledi. Her kuyucuğa en az 1 x 106 hücre tohumlayın.
  2. Kültür hücresine Dispase (1 mL / 6 oyuklu plakanın kuyusu) ekleyin. 37 °C'de 5 dakika inkübe edin. Dispase çözeltisini kuyudan aspire edin.
  3. Kuyuya Orta D (Tablo 1) (1 mL / 6 oyuklu plakanın kuyusu) ekleyin. Hücreyi 10 μL'lik bir pipetle küçük parçalar halinde kesin.
  4. Tüm hücre parçalarını ve ortamı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde nazikçe toplayın.
  5. 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
  6. Hücreleri 200 μL soğuk matriste nazikçe yeniden süspanse edin. 1.5 mikrosantrifüj tüpünü 20 dakika boyunca bir inkübatöre taşıyın. Matris oda sıcaklığında (RT) katılaşacağı için hızlı çalışın. İnkübatörde 20 dakika sonra, matris katılaşacaktır.
  7. 15 mL Orta D ile 10 cm'lik bir tabak hazırlayın. Orta D ile Matrisi tekrar süspanse edin ve Petri kabını hafifçe sallayın.
  8. Ardından, çanağı 5 gün boyunca bir kuluçka makinesine koyun. Plakayı hareket ettirmeyin. Günü 0. gün (RO) olarak ayarlayın. Hücreler 3 gün içinde yapışacaktır.
  9. 5. günde (RO'lar) ve 10. günde (RO'lar), ortamı Orta D ile yenileyin.
  10. 12. günde (RO'lar), ortamı çıkarın ve her yemeğe 5 dakika boyunca 3 mL Dispase ekleyin.
  11. Dispase'ı aspire edin ve 15 mL Orta E ekleyin (Tablo 1).
  12. Mikroglia hasadı: 56. günde (MG'ler), Orta C'yi nazikçe aspire edin, Accutase (6 oyuklu bir plakanın 1 mL / oyuğu) ekleyin ve 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
  13. Mikroglia hücrelerini 5 mL'lik bir pipet ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpe toplayın. Hücreleri RT'de 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  14. Süpernatanı nazikçe aspire edin ve mikrogliayı 1 mL Orta E ile askıya alın. 12. günde sindirilmiş RO'lara mikroglia ekleyin.
    NOT: 12. günde (RO'lar), hücreler yapışkandır. 13. günde (RO'lar), hücreler Orta E'de asılı olarak bulunur. Ortam, 12. günden (RO'lar) 19. güne (RO'lar) sarıya dönerse, ortamı Orta E ile yenileyin.
  15. 19. günde (RO'lar), plakayı hafifçe döndürerek organoidleri yemeğin ortasına toplayın. Medium E'yi nazikçe aspire edin ve medium'u Medium F ile yenileyin.
  16. Orta F ile organoidleri yeni bir süspansiyon kabına aktarın.
  17. Ortamı haftada bir kez değiştirin ve deneyler için organoidleri seçin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Retinal organoidler üretme prosedürü önceki çalışmamızdaaçıklanmıştır 15. Burada, mikroglia ve ko-kültür mikroglia ve retinal organoidlerin temsili sonuçlarını gösteriyoruz.

Burada, mikroglia farklılaşmasının her aşamasını gösteriyoruz (Şekil 1A). 0. gün, kök hücre kültürünün aşamasını temsil eder. Daha sonra kök hücreler sindirildi ve EB oluşumu için kültürlendi. İşlemin ilk 4 gününde hücreler EB'leri oluşturacaktır (Ş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İnsan retinasının sınırlı mevcudiyeti nedeniyle, retinal inflamatuar yanıtların mevcut anlayışı neredeyse hayvan modellerinden gelmektedir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için retinal organoidler farklılaştırıldı. Retinal organoid modellerin geliştirilmesi, hastalık modellemesi ve terapötik gelişim için insan retinasının karmaşıklığını özetlemeyi amaçlayan aktif bir araştırma alanı olmuştur. Birkaç çalışma, insan pluripotent kök hücrelerindenbaşarılı bir şekilde retinal organoidlerin üretildiği...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu çalışmanın tarafsızlığını etkileyebilecek herhangi bir üyelik, üyelik, hibe veya finansal holdingden haberdar değildir.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82101145) ve Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (Z200014) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AcctuaseKök Hücre Teknolojileri07920
Gelişmiş DMEM/F12Termo12634-010
Anti-CRX(M02)abnovaH00001406-M02Antikoru; üreticinin talimatlarına göre seyreltme
Anti-IBA1Abcamab5076Antikoru; üreticinin talimatlarına göre seyreltme
B27Ömrü Teknolojiler17105-041
Dispase (1U/mL)Kök Hücre Teknolojileri07923
DMEM temelGibco10566-016
DMEM/F12Gibco10565-042
DPBSGibcoC141905005BT
EDTATermo15575020
F12Gibco11765-054
FBSBiyolojik Sanayi04-002-1A
JelatinSigmaG7041-100GKatı
GlutamaxGibco35050-061
H9 hücre hattıWiCell Araştırma Enstitüsü
IL-3RD Sistemleri 203-IL-050
IL-34PeproTech200-34-50UG
KSRGibco10828028
MatrisCorning356231
M-CSFRD Sistemleri 216-MC-500 
MEM Esansiyel Olmayan Amino AsitÇözeltisi SigmaM7145
N2Yaşam Teknolojileri17502-048
NörobazalGibco21103-049
Kalem / strepGibco15140-122
Kök hücre ortamı Kök Hücre Teknolojileri5990
TaurinSigmaT-8691-25G
X-VIVOLONZA04-418Q
Y27632SelleckS1049
ve beta; -merkaptoetanolYaşam Teknolojileri21985-023

Kaynaklar

  1. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).
  2. Zhang, X., Jin, Z. B. Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (170), e62298(2021).
  3. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  4. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  5. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
  6. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  7. O'koren, E. G., et al. Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration. Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).
  8. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).
  9. Xu, J., et al. Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs. Glia. 72 (5), 872-884 (2024).
  10. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), eaal3222(2017).
  11. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  12. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  13. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  14. Gao, M. L., et al. Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ. Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).
  15. Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct human retinoblastoma in vitro. J Vis Exp. (188), e62629(2022).
  16. Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
  17. Usui-Ouchi, A., et al. Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche. Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).
  18. Chichagova, V., et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Mikroglia Entegrasyonuİnsan Kök HücreleriKo-Kültür ModeliRetinal Hastalık ModellemesiMikroglia Diferansiyasyonuİmmünofloresan AnaliziFotoreseptör MarkörüMikroglial MarkörMerkezi Sinir Sistemi
Retinal Organoidlerin Mikroglia ile Birleştirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.