Yöntem makalesi

Mitokondri ve Lizozomlar Arasındaki Etkileşimlerin Görselleştirilmesi için Çift Renkli İlişkili Işık ve Elektron Mikroskobu

DOI:

10.3791/67020

⸱

27 Eylül 2024

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, sırasıyla mEosEM ve APEX2 ile etiketlenmiş mitokondri ve lizozomların etkileşimini görselleştirmek için bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu kullanmak için bir mekanizmayı açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri ve lizozomlar gibi hücresel organeller dinamik yapılar sergiler. Yapısal analiz için transmisyon elektron mikroskobunun daha yüksek çözünürlüğüne rağmen, dinamik organellerin hedefe özgü etiketleme ile görselleştirilmesi için ışık mikroskobu gereklidir. Aşağıdaki protokol, mitokondri ve lizozomlar arasındaki etkileşimleri gözlemlemek için çift renkli bağıntılı ışık ve elektron mikroskobunu (CLEM) birleştiren bir yöntemi açıklar. Bu çalışmada mitokondriler mEosEM (Mito-mEosEM) ile, lizozomlar ise TMEM192-V5-APEX2 ile işaretlendi. CLEM görüntülerinden elde edilen sonuçlar, dış stres koşulları altında mitokondri ve lizozomlar arasındaki etkileşimlerdeki değişiklikleri gözlemlememizi sağlar. Lizozomal fonksiyonu inhibe eden bafilomisin (BFA) ile tedavi, mitokondri ve lizozomlar arasındaki temasta bir artışa neden oldu ve lizozomların içinde sıkışmış parçalanmış mitokondri oluşumuna yol açtı. Tersine, lizozomlardan kolesterol ihracatını engelleyen U18666A ile tedavi, lizozomların mitokondri ile çevrilileşmesine neden oldu ve bu da farklı bir etkileşim şeklini gösterdi. Bu çalışma, sabit hücrelerde mitokondri ve lizozomlar arasındaki etkileşimleri gözlemlemek için etkili bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, çift renkli problarla CLEM görüntüleme, organel dinamiklerinin ve bunların hücre fonksiyonu ve patolojisi üzerindeki etkilerinin gelecekteki araştırmaları için güçlü bir araç sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri ve lizozomlar, hücresel homeostazın sürdürülmesi için gerekli olan başlıca zara bağlı organellerdir. Mitokondri, fisyon ve füzyon olayları tarafından modüle edilen oldukça dinamik hücresel organellerdir1. Genel olarak, mitokondri hücrenin güç merkezi olarak adlandırılır ve oksidatif fosforilasyon, ATP üretimi ve kalsiyum2 gibi metabolit depolanmasındaki önemli rolleri ile bilinir. Mitokondri, enerji metabolizmasındaki rollerine ek olarak, apoptoz3,4, kalsiyum sinyalleme5,6 ve lipid metabolizması7,8 dahil olmak üzere bir dizi başka hücresel sinyalleşme sürecinde yer alır. Benzer şekilde, lizozomlar, protein bozunması, otofaji, endositoz ve fagositoz9 yoluyla hücresel temizliği korumak için hücresel geri dönüşüm merkezleri olarak birden fazla rol oynayan oldukça dinamik hücresel organellerdir. Lizozomlar, bozunmadaki rollerinin yanı sıra, besin algılama, homeostaz10, lipid metabolizması11 ve hücresel farklılaşma12 gibi hücresel fizyolojide de rol oynarlar.

Bireysel hücresel organellerin işlevleri üzerine çok sayıda çalışmanın varlığına rağmen, son araştırmamız, hem hücresel fizyolojiyi hem de patolojiyi etkilediği gösterilen mitokondri ve lizozomlar arasındaki daha az anlaşılan karışmaya odaklanmıştır. Mitokondri ve lizozomlar arasındaki temaslar, kanser hücreleri, nöronlar ve indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde gözlenmiştir 13 ve bunlar esas olarak hücresel stres altında veya Parkinson hastalığı13,14 ve Charcot-Marie-Tooth hastalığı15 gibi nörodejeneratif hastalıklarda gözlenir. Mitokondri ve lizozomlar arasındaki temas, iyon alışverişi yoluyla metabolik homeostazın korunmasında önemli bir rol oynar (örneğin, Ca2+)16, kolesterol17 ve iki organel arasında iron18. Ayrıca, mitokondri ve lizozomlar arasındaki temas, hücresel organellerin kalite kontrolünde çok önemli bir rol oynar. Örneğin, hasarlı mitokondri, otofagozomlar tarafından yutuldukları ve bozunma için lizozomlara iletildikleri mitofaji süreci yoluyla bozunma için hedeflenebilir. Sonuç olarak, işlevsiz mitokondrinin uzaklaştırılması, hücreye veya normal mitokondriye daha fazla zarar vermeden önce kolaylaştırılabilir. Mitokondri ve lizozomlar arasındaki bu etkileşim, hücresel homeostazı korumak ve işlevsiz organellerin birikimini önlemek için çok önemlidir. Böylece, yalnızca hasarlı mitokondri seçici olarak çıkarılır ve sağlıklı mitokondrinin hücre içinde en iyi şekilde çalışmasına izin verilir.

Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), ışık mikroskobu (LM) ve elektron mikroskobunun (EM) avantajlarını birleştirerek farklı ölçeklerde ayrıntılı yapısal bilgi sağlayarak bir araştırma yöntemi olarak son zamanlarda dikkat çeken bir görüntüleme tekniğidir. CLEM'de, bir numune önce belirli ilgi alanlarını belirlemek için LM kullanılarak görüntülenir, ardından fiksasyon, dehidrasyon ve gömme gibi EM numune hazırlama adımları takip edilir. Aynı numune daha sonra bir elektron mikroskobu altında gözlemlenir. Canlı hücre CLEM yöntemleri yakın zamanda bildirilmiş olsa da19,20,21,22, son derece dinamik biyolojik örneklerin optik görüntülerini sabit hücrelerin elektron mikroskobu görüntüleriyle tek bir düzlemde doğru bir şekilde birleştirmek zor olmaya devam etmektedir. Mitokondri ve lizozomlar gibi oldukça dinamik organeller için, ışık mikroskobu altında canlı olarak gözlemlendiklerinde kesin lokalizasyonları değişebilir ve fiksasyon için gereken kısa gecikme süresinde bile hareket etmeye devam ederler.

Bu nedenle, bu protokolde, iyonların değişimi yoluyla metabolik homeostazın korunmasında önemli bir rol oynayan mitokondri ve lizozomlar arasındaki etkileşimi görselleştirmek için fiksatif solüsyonlar içinde bile aktif kalan iki farklı moleküler etiket kullanıldı (örneğin, Ca2+)16, kolesterol17 ve iron18 bu organeller arasında. TMEM192-V5-APEX2 ve Mito-mEosEM yapıları, hem EM hem de LM seviyelerinde kültürlenmiş hücrelerde mitokondri ve lizozomların etkileşimlerini gözlemlemek için kullanıldı. Mitokondri için, mEosEM etiketi, fiksatif bir çözeltide EM numune hazırlama sırasında floresan sinyalini koruma yeteneği ve OsO423 nedeniyle seçilmiştir. Lizozomlar için, yaklaşık 28 kDa'lık bir protein olan APEX2 etiketi, hem EM hem de LM seviyelerinde spesifik bir proteinin lokalizasyonunu incelemek için kullanıldı24. Hidrojen peroksit varlığında, APEX2'nin substratı olan Amplex-Red, etiketin hedeflediği yerde konfokal mikroskopi ile gözlemlenebilen çözünmez bir polimer oluşturur. Bu protokolde, sabit hücrelerde lizozomlar ve mitokondri arasındaki etkileşimlerin yapısını görselleştirmek için çift renkli CLEM kullanıldı.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Numune hazırlama için adım adım iş akışı Şekil 1.

1. Hücre kültürü ve transfeksiyon

  1. 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu ve 100 U/mL penisilin ve streptomisin içeren DMEM içeren 35 mm cam ızgara tabanlı kültür kaplarında 1 × 10 5 hücre yoğunluğunda HeLa hücrelerinin kültürü.
  2. Hücrelerin tohumlanmasından bir gün sonra, üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon reaktifini kullanarak hücreleri TMEM192-V5-APEX2 ve Mito-mEosEM plazmitleri ile %30-40 birleşimde birlikte transfekte edin (her biri 1 μg TMEM192-V5-APEX2 ve 3 μL transfeksiyon reaktifi ile Mito-mEosEM plazmit DNA'sı). Transfeksiyondan sonra, hücreleri 18 saat boyunca DMSO veya U18666A (2 μg / mL) ve Bafilomisin A1 (100 nM) ile tedavi edin.

2. Konfokal mikroskobik görüntüleme

  1. Hücreleri Bafilomisin ve U18666A ile 18 saat işlemden geçirdikten sonra, kültür ortamını çıkarın ve hemen 250 μL ılık (30 °C-37 °C) fiksatif çözelti (0,1 M sodyum kakodilat çözeltisi [pH 7.0] içinde %2,5 glutaraldehit ve %2 paraformaldehit) ekleyin. Sabitleyiciyi hemen çıkarın, 1,5 mL taze sabitleyici ile değiştirin ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Ardından, hücreleri 1 mL buz gibi soğuk 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda 3 x 10 dakika yıkayın.
    NOT: Aldehit dumanları toksiktir. Tüm deneyler havalandırmalı bir çeker ocakta yapılmalıdır.
  2. Aldehiti söndürmek için 1 mL soğuk 20 mM glisin çözeltisi ekleyin ve 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. Soğuk 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda 3 x 10 dakika yıkayın.
  3. 0.1 M kakodilat çözeltisine 10 mM H2O2 ekleyerek 300 μM Amplex-Red içeren taze bir çözelti hazırlayın. Numune kabına 500 μL Amplex-Red solüsyonu ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
  4. Amplex-Red solüsyonunu çıkarın ve 0,1 M sodyum kakodilat tamponu ile 3 x 10 dakika durulayın.
  5. Amplex-Red boyamadan sonra, 3 x 3 karo tarama modunda ilgilenilen hücrelerin etrafındaki alanı görüntülemek için konfokal bir mikroskop kullanın. 40x (veya 60x) objektif kullanarak ızgarayı ve ızgara çanağındaki harfleri tanımlamak ve kaydetmek için hem diferansiyel girişim kontrastını (DIC) hem de floresan sinyalini yakalayın.
    NOT: Bu genel bakış görüntüleri, plastiğe gömülü numunelerdeki belirli hedef hücreleri tanımlamak için bir harita görevi görür.
  6. 40x (veya 60x) objektif kullanarak hedef hücreleri yüksek büyütmede görüntüleyin ve bir Z-yığını görüntüsü elde edin.
    NOT: Bu yüksek büyütmeli görüntü, bağıntılı bir görüntü oluşturmak için bir elektron mikroskobu görüntüsünün üzerine bindirilir.

3. EM bloğu için numune hazırlama

  1. LM görüntülemeden sonra, 1 saat boyunca 4 ° C'de son fiksasyon için 1 mL %1 indirgenmiş osmiyum tetroksit (eşit hacimde %2 sulu osmiyum tetroksit ile 0.3 M kakodilat tamponunda %3 potasyum ferrosiyanür eklenerek hazırlanır) ekleyin ve ardından 4 °C'de damıtılmış su ile 3 x 10 dakika durulayın.
    NOT: Osmiyum tetroksit dumanları zehirlidir. Tüm deneyler havalandırmalı bir çeker ocakta yapılmalıdır.
  2. Oda sıcaklığında damıtılmış su ile 3 x 10 dakika durulayın, ardından oda sıcaklığında her seferinde 15 dakika (%50, %60, %70, %80, %90, %95, %100 ve %100) kademeli bir etanol serisinde kurutun.
  3. Etanolü epoksi reçine ile 3:1, 1:1 ve 1:3 hacim oranlarında karıştırın ve her karışımdan toplam 300 μL hazırlayın. Her bir epoksi reçineyi tabağa dökün ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe etmesine izin verin. Ardından, gece boyunca emprenye etmek için %100 epoksi reçine kullanın.
  4. Gömme kapsülünü veya PCR tüpünü taze epoksi reçine ile doldurarak hazırlayın, tüpü veya kapsülü ilgilenilen bölgeye baş aşağı yerleştirin ve polimerize olması için 60 °C'de 48 saat fırına koyun.

4. Kesit alma ve TEM görüntüleme

  1. Epoksi reçine tamamen polimerize olduktan sonra, alt camı sıvı nitrojene batırarak polimer bloktan ayırın.
  2. Numune bloğunu ultramikrotomun numune tutucusuna yerleştirin ve düzeltme bloğuna yerleştirin. Reçineyi, ilgilenilen nesnenin etrafında trapez veya dikdörtgen bir şekle kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.
  3. Kesilmiş numune bloğunu numune tutucuya yerleştirin ve elmas bıçağı ayarlayın. Numune bloğunun ön kenarının elmas bıçağın kenarına tam olarak paralel olduğundan emin olun.
  4. Bir ultramikrotom kullanarak, düz gömülü hücrelerden yaklaşık 60-70 nm ultra ince kesitler kesin. Seri bölümleri formvar kaplı bir yuva ızgarasında toplayın ve sıcak bir plaka üzerinde kurutun.
  5. Kontrast boyası ile bölümü 2 dakika ve kurşun sitrat ile 1 dakika boyayın.
  6. Gözlem için ızgarayı TEM numune tutucusuna yerleştirin. Işık mikroskobundan alınan DIC görüntüsüne dayanarak ilgilenilen hedef hücreyi tanımlayın. 1.700x büyütmede döşenmiş, üst üste binen görüntüleri kullanarak tüm hücre alanını görüntüleyin.

5. imageJ Fiji kullanarak görüntü birleştirme.

  1. Görüntü birleştirmeye başlamak için imageJ Fiji25'i başlatın ve Dosya | Yeni | TrakEM2 (boş) | Yeni bir TrakEM226 projesi oluşturmak için depolama klasörünü seçin (Şekil 2A1).
  2. Ham döşeme görüntüsü verilerini çalışma alanına sürükleyip bırakarak döşeme görüntüsü veri kümesini açın (Şekil 2A2).
  3. Farenin sağ tuşuna tıklayın ve Hizala | Bu katmandaki tüm görüntüleri monte et | elastik (doğrusal olmayan blok yazışmaları) ve ardından varsayılan değerleri kabul etmek için Tamam'a tıklayın kalan parametreler (Şekil 2A3).
  4. Farenin sağ tuşuna tıklayın ve Dışa Aktar | Dikişli bir görüntü oluşturmak için Düz Görüntü Oluştur'a tıklayın, ardından Dosya | Görüntüyü kaydetmek için Farklı Kaydet'i tıklatın.

6. Floresan görüntüsünü yeniden boyutlandırma

  1. Fotoğraf büyütme yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın). Dosya'ya tıklayın | Floresan görüntüsünü açın ve seçin.
  2. Elektron mikroskobu görüntüsüyle aynı boyutta olacak şekilde genişlik ve yüksekliği girin ve yeniden boyutlandırma yönteminde uygulanacak algoritmayı seçin (Şekil 2B1).
  3. Dosya'ya tıklayın | Yeniden boyutlandırılan görüntüyü kaydetmek için AS kaydet.

7. Big Warp eklentisi ile yer işareti tabanlı görüntü kaydı

  1. ImageJ Fiji'yi açın ve yeniden boyutlandırılmış floresan mikrografını (FM görüntüsü) ve dikişli elektron mikrografını (EM görüntüsü) sürükleyip bırakın.
  2. Eklentiler'e tıklayın | Büyük Veri Görüntüleyici | Kaydı başlatmak için Büyük Sarma düğmesine tıklayın, ardından hareketli görüntü olarak FM görüntüsünü ve hedef görüntü olarak EM görüntüsünü seçmek için açılır menüye tıklayın (Şekil 2C1).
    NOT: Her FM ve EM görüntüsü, yer işaretlerini görüntülemek için üç yeni açılır pencereye (BigWrap hareketli Görüntü, BigWrap sabit görüntü ve Yer İşaretleri) sahip olacaktır.
  3. Yakınlaştırma (fare tekerleği), görüntü döndürme (sol düğmeyi basılı tutarken fareyi hareket ettirme) ve hareket ettirme (sağ düğmeyi basılı tutarken fareyi hareket ettirme) gibi işlevleri kullanarak FM ve EM görüntülerini karşılaştırın ve ardından Yer İşareti modunu açmak için klavyedeki boşluk çubuğuna basın ve FM ve EM görüntülerinde tanımlanan en az üç yer işaretini işaretlemek için farenin sol düğmesine basın ( Şekil 2C2, pembe noktalar ve kırmızı ok).
  4. Tanımlanan tüm yer işaretlerini işaretledikten sonra Dosya | Hareketli Görüntüyü Dışa Aktar | Tamam ve dönüştürülmüş FM görüntüsüyle yeni bir açılır pencere görünecektir (Şekil 2C3).
    NOT: Yeni oluşturulan açılır pencere, yer işaretine göre dönüştürülmüş bir FM görüntüsüdür. Hizalamayı gözden geçirin ve gerekirse, yer işaretlerini ekleyerek veya değiştirerek ve dönüştürmeyi yeniden hesaplayarak ayarlamalar yapın.
  5. Dosya'ya tıklayın | Dönüştürülen FM görüntüsünü kaydetmek için Farklı Kaydet.

8. CLEM görüntülerinin üst üste bindirilmesi

  1. ImageJ'de, dönüştürülen FM görüntüsünü ve dikilen EM görüntüsünü sürükleyip bırakın.
  2. Resme Tıklayın | Türü | Hem LM hem de EM görüntüleri için aynı görüntü türünü ayarlamak için 8 Bit Renk (Figure 2D1).
    NOT: EM görüntüsü aşağıdaki sırayla iki kez dönüştürülmelidir: 8 bit -> RGB Renk -> 8 bit Renk.
  3. Resme Tıklayın | Renkli >| Açılır menüden sırasıyla FM ve EM görüntülerini seçerek görüntüleri bileşik bir görüntüde birleştirmek için Kanalları Birleştir (Şekil 2D2).
  4. Dosya'ya tıklayın | CLEM görüntüsünü kaydetmek için Farklı Kaydet'i tıklatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çift renkli CLEM protokolünü kullanarak mitokondri ve lizozomlar arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için Mito-mEosEM ve TMEM192-V5-APEX2'yi kullandık. Sabit hücreler önce bir ışık mikroskobu kullanılarak görüntülendi, ardından EM örnekleme ve görüntüleme yapıldı. İlişkili görüntülerin sonuçları Figure 3A,B ve Figure 4A'da gösterilmiştir. Yukarıda açıklanan protokolü takiben, dış stres altında mitokondri ve lizozomlar arasındaki etkileşimdeki değişiklikleri gözlemleyip gözlemleyemeyeceğimizi kontrol ettik.

Bir lizozomal V-ATPaz inhibitörü olan BFA ile hücrelerin tedavisi, otofajiyi inhibe ederek mitokondriyal kalitenin azalmasına ve mitokondri ile lizozomlar arasındaki etkileşimlerin artmasına neden olur27. BFA ile tedavi edilen hücrelerde, DMSO ile tedavi edilen kontrol hücrelerine ( kıyasla lizozomlar (Şekil 3B) içinde hapsolmuş mitokondri gözlemledik. Parçalanmış elektron yoğun mitokondri ve lizozomlar içindeki hücresel bölmeleri tek başına elektron mikrograflarında ayırt etmek zor olsa da, ilişkili görüntülerde kolayca ayırt edilebilirler (Şekil 3B1,B2). DMSO ile tedavi edilen hücrelerin mitokondrilerinde gözlenen mitokondriyal bozulma yapısı (Şekil 3A1,A2; mavi ok) lizozomlarla ilgili değildir ve floresan görüntüsündeki büyük bir mitokondri içinde hapsolmuş bir lizozom gibi görünen yapı, mitokondrinin lizozomu çevrelediği bir yapıdır (Şekil 3A2; kırmızı ok).

Daha sonra, kolesterolün lizozomlardan dışarı hareketini engelleyen iyi bilinen bir NPC1 inhibitörü olan U18666A'un (18 saat boyunca 2 μg/mL) etkilerini test ettik28. U18666A ile tedavi edilen hücreler, mitokondri ve lizozomlar arasında doğrudan etkileşimin arttığını göstermiştir (Şekil 4). Ek olarak, U18666A ile tedavi edilen numunelerde mitokondri ve lizozomlar arasındaki temaslar, BFA ile muamele edilen numunelerdekilerden farklıydı. BFA ile tedavi edilen HeLa hücrelerinde, parçalanmış mitokondri, daha önce bildirilen bir mitofaji morfolojisi olan lizozomda tamamen hapsolur12,29. Bununla birlikte, U18666A tedavi edilen grupta, TMEM192 pozitif lizozomların bir kısmı mitokondri tarafından yutulmuş gibi görünmektedir (Şekil 4D,E)30,31.

figure-results-1
Şekil 1: Genetik olarak etiketlenmiş bir floresan probu kullanılarak TEM tabanlı CLEM'e şematik genel bakış. (A) HeLa hücreleri, 35 mm'lik cam ızgara tabanlı kültür kaplarında büyütüldü. (B) Sabit hücreler APEX2 proteini tarafından Amplex-Red ile etiketlendi. (C) Floresan görüntüler konfokal mikroskop ile elde edildi. Büyük bir genel bakış görüntüsünü ve hedef hücrenin yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü yakalamak için motorlu bir aşama ve döşeme tarama işlevi kullanıldı. Büyük görüntü, plastiğe gömülü örneklerde hedef hücrenin konumunu belirlemek için bir navigasyon haritası görevi görür. (D) Sabitleme sonrası ve dehidrasyon gömmeye devam edin. (E) Gömme, lamel üzerindeki hedef hücre üzerine reçine ile doldurulmuş bir PCR tüpü veya BEEM kapsülü kullanılarak yapıldı. (F) Reçine polimerizasyonundan sonra, lamel çıkarıldığında bloğun alt yüzeyinde baskılı bir ızgara deseni bırakılmıştır. (G) Hedef hücre, reçine yüzeyindeki baskılı desen ile tanımlandı ve hedef hücre, bir ultramikrotom kullanılarak yaklaşık 60 nm kalınlığında kesitlendi. (H) Seri kesitler, formvar kaplı bakır yarıklı bir ızgara üzerinde toplanmıştır. (I) Izgaralar, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Kısaltmalar: TEM = transmisyon elektron mikroskobu; CLEM = bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu; ROI = ilgi alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: imageJ Fiji kullanılarak CLEM görüntüsünün işlenmesi ve oluşturulması. (A1) Fiji ve TrakEM2'nin ana GUI'si. (Cevap 2) TEM ile elde edilen döşeme görüntüsü veri kümesinin 1.700x büyütmede içe aktarılması. (Cevap 3) TrakeEM2'nin görüntü hizalama yöntemini kullanarak dikişli bir görüntünün hizalaması ve örneği. (B1-B3) Fotoğraf büyütme yazılımı kullanarak küçük ışık mikrografının büyük yüksek kaliteli görüntülere dönüştürülmesi. (C1-C3) Big Wrap eklenti yazılımını kullanarak ışık mikroskobu görüntüleri ile elektron mikroskobu görüntüleri arasında kayıt için iş akışı. (D1-D3) İlişkili bir mikroskop görüntüsünü sentezlemek için dönüştürülmüş bir FM görüntüsünü ve bir EM görüntüsünü üst üste bindirme işlemi. Kısaltmalar: TEM = transmisyon elektron mikroskobu; CLEM = bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu; FM = floresan mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Bafilomisin A1 ile veya bafilomisin olmadan tedavi edilen mitokondriyal ve lizozomal temas bölgelerinin CLEM görüntüleri. HeLa hücreleri Mito-mEosEM (mitokondri; yeşil) ve TMEM192-APEX2 (lizozomlar; kırmızı) ile birlikte transfekte edildi ve daha sonra Amplex-Red boya ile boyandı. (A) Tedavi edilmemiş HeLa hücreleri. Floresan sinyalinden (sol panel) gelen moleküler bilgiler ve TEM (orta panel) tarafından elde edilen ultrastrüktürel bilgiler, mitokondriyal sinyal ve morfolojiye dayalı olarak üst üste bindirildi (sağ panel). (A1,A2) Tedavi edilmeyen HeLa hücrelerinde, mitokondriyal iç zar bozulur (mavi ok) veya mitokondri ve lizozomlar birbirine çok yakındır (kırmızı ok). (B1,B2) 18 saat boyunca bafilomisin A1 ile muamele edilen HeLa hücrelerinde, lizozomlarda bozulmamış mitokondrinin yakalanması ile karakterize mitofaji gözlenmiştir (yeşil ok). Ölçek çubukları = 1 μm (A1,A2,B1,B2). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: U18666A Mito-mEosEM ve TMEM192-V5-APEX2'nin (Amplex-Red etiketli) iki renkli CLEM görüntüleri ile tedavi edilen mitokondriyal ve lizozomal temas bölgelerinin CLEM görüntüleri (A) Mito-mEosEM ve -V5-APEX2 (Amplex-Kırmızı etiketli) U18666A tedavi altında HeLa hücrelerini ifade etti (18 saat boyunca 2 μg/mL). (A1,A2) Kırmızı oklar, mitokondri ve lizozomlar arasındaki temas yerlerini gösterir. Ölçek çubukları = 1 μm. (B1-B3,C1-C3) Kırmızı ok, seri görüntülerle mitokondri ve lizozomlar arasındaki organeller arası füzyonun görünümünü gösterir. Ölçek çubukları = 500 nm (B1-B3). Ölçek çubukları = 1 μm (C1-C3). (D,E) Mitokondri ve lizozomlar arasındaki füzyon bölgelerinin yüksek büyütmeli TEM görüntüleri. Sahte renkler, mitokondri (yeşil) ve lizozom (kırmızı) arasında ayrım yapmak için kullanılır. Ölçek çubukları = 100 nm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, genetik olarak kodlanmış mEosEM ve APEX2 etiketlerini kullanarak sabit hücrelerde mitokondri ve lizozomların etkileşimini gözlemlemek için çift renkli CLEM'i tanımlar. Son birkaç on yılda, mikroskopideki ilerlemeler, organel ağlarındaki değişiklikleri gözlemleme yeteneğini büyük ölçüde geliştirdi32,33 ve organel etkileşimlerinin incelenmesi giderek daha ilginç hale geldi. Mitokondri ve lizozomlar 34,35,36 arasındaki oldukça dinamik temaslardaki değişiklikleri gözlemlemek için süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılmıştır. Bununla birlikte, süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılmasına rağmen, iç ve dış mitokondriyal membranların (yaklaşık 22 nm) ve cristae bağlantılarının (yaklaşık 28 nm) kalınlığındaki değişiklikleri ayırt etmek zordur37. Transmisyon elektron mikroskobu, biyolojik numunelerin yapısını çok yüksek çözünürlükte gözlemleyebilme avantajına sahiptir, ancak görüntülerin yalnızca siyah beyaz olarak görüntülenebilmesi dezavantajına sahiptir, bu da karmaşık görüntülerde organellerin ayırt edilmesini zorlaştırır. Protokolümüzde, iki farklı organelin etkileşimini farklı renklerle boyayarak izlemek için ışık ve elektron mikroskobunun avantajlarını birleştiren bir CLEM yöntemi kullandık. Özellikle, çift renkli CLEM, Şekil 3'te gösterildiği gibi, lizozomlar içindeki mitokondriyal bozunma süreci olan mitofajiyi gözlemlemek ve analiz etmek için paha biçilmez bir araçtır.

Canlı hücre görüntüleme tipik olarak fizyolojik koşullar altında gerçekleştirilir ve araştırmacıların dinamik hücresel süreçleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemesine olanak tanır. Bununla birlikte, elektron mikroskobu teknikleri genellikle fiksasyon ve boyama dahil olmak üzere zaman alıcı numune hazırlama prosedürleri gerektirir. Canlı hücre görüntüleme ile elektron mikroskobu numunesi hazırlama arasındaki zaman gecikmesi, tekniğin zamansal çözünürlüğünü sınırlar ve potansiyel olarak gözden kaçan dinamik hücresel olaylara neden olabilir. Canlı hücre CLEM sınırlamasının üstesinden gelmek için, mEosEM probu23 ve kimyasal boyanın (Amplex-Red), zorlu fiksatif ortamlarda bile floresan sinyalini kaybetmeden APEX2 yakınlık etiketleme enzimi38 tarafından boyandığı çift renkli bir CLEM yöntemi geliştirdik. Önceki bir canlı hücre CLEM çalışmasında39, canlı hücre görüntülemeden sonra TEM örneklemesindeki zamansal çözünürlük sorunları ve numune hazırlamadaki teknik sınırlamalar nedeniyle floresan sinyalleri ve EM görüntüleri arasında tutarsızlıklar bulundu. Bununla birlikte, yeterli bir süre boyunca sabit hücrelerin floresan görüntülerini elde ederek (yüksek büyütmede tüm hücrelerin z-yığını görüntülemesi), zamansal çözünürlük sorununu çözebilir ve LM ve EM görüntüleri arasındaki korelasyonu iyileştirebiliriz (Şekil 3 ve Şekil 4).

Başarılı CLEM sonuçları için bir diğer önemli faktör, LM görüntüsünün EM görüntüsüne nasıl doğru bir şekilde kaydedileceğidir. Bunu yapmak için, hedef hücrelerin etrafında bir navigasyon haritası oluşturmak için önce ışık mikroskobu görüntüleme sırasında DIC ve floresan görüntüleme modlarının bir kombinasyonunu kullandık. Bu navigasyon haritasını kullanarak, ultramikrotom ve TEM üzerindeki ilgili hücreleri kolayca tanımlayabildik. İkincisi, yüksek büyütmede tüm hücrelerin TEM karo görüntülerini elde ederek, görüntü kaydı için kullanılabilecek birçok yer işareti elde edebildik. Deneyimlerimize göre, yer işaretlerinin sayısı ne kadar yüksek olursa, Big Warp eklentisindeki LM ve EM görüntülerinin hizalama doğruluğu o kadar iyi olur.

Bu çalışmada, lizozomlar ve mitokondrilerin etkileşim alanlarını yüksek çözünürlüklü CLEM sonuçlarıyla gösterdik. Ek olarak, çift renkli prob, mitokondri ve lizozomlar arasında kesin ayrım yapılmasına izin verdi. Ancak bu yöntemin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, Amplex-Red'in APEX2 enzimi tarafından proksimal etiketlenmesi sırasındaki reaksiyon süresi çok uzunsa, Amplex-Red hedef protein konumundan38 daha geniş yayılacak ve boyanacaktır. İkincisi, lizozomun mitokondride yutulduğu alanın kalınlığı (z ekseni hacmi) oldukça küçüktür, bu nedenle iki organel zarının füzyonu 50 nm kalınlığındaki bir seri kesitte belirlenemez. Ayrıca, bir optik bölümün z eksenini ışık mikroskobu ile ve mekanik bir bölümün ultramikrotom ile doğru bir şekilde hizalanması önemli bir zorluktur. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, çift renkli CLEM, geleneksel elektron-tomografi40 veya seri kesit hacmi-CLEM41 ile birlikte kullanılabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Bilim ve Bilgi ve İletişim Teknolojileri Bakanlığı (24-BR-01-03) tarafından finanse edilen Kore Beyin Araştırma Enstitüsü aracılığıyla KBRI temel araştırma programı tarafından desteklenmiştir. TMEM192-V5-APEX2 plazmitleri Hyun-Woo Rhee (Seul Ulusal Üniversitesi) tarafından sağlanmıştır. TEM verileri, KBRI'deki Beyin Araştırmaları Çekirdek Tesislerinde elde edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kimyasallar ve reaktifler
%25 Gluteraldehit ElektronMikroskobu Bilimleri16200Aldehit dumanları son derece zehirlidir. Sadece çeker ocakta kullanın.
% 30 Hidrojen peroksit çözeltisiMerck107210
% 4 Paraformaldehit çözeltisiBiosesangPC2031-100-00ldehit dumanları son derece zehirlidir. Sadece çeker ocakta kullanın.
Amplex KırmızıThermoFisherA12222
Epon 812 ElektronMikroskobu Bilimleri14120
EtanolMerck100983
Fugene HDPromegaE2311Plazmit transfeksiyonu
GlisinSIGMAG8898
Kurşun Sitrat %3Elektron Mikroskobu Bilimleri22410
Osmiyum tetroksit %4 sulu çözeltiElektron Mikroskobu Bilimleri16320Çok toksiktir. Sadece çeker ocakta kullanın.
Potasyum hekzasiyanoferrat(II) trihidrat SIGMAP3289
Sodyum kakodilat trihidratSigma-AldrichC0250-500G
Uranil asetatElektron Mikroskobu Bilimleri22400
UranyLess EM lekeElektron Mikroskobu Bilimleri22409
Plazmid yapı
Mito-mEosEMaddgene132706DOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  et al.N/ADOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
Tools
0.22 um şırınga filtresiSartorius16534
35 mm Izgaralı lamel çanakMattekP35G-1.5-14-CGRD
BEEM GömmeKapsüller Ted Pella130
Formvar Desteklenen Tek yuvalı bakır ızgaraTed Pella01705
Elmas bıçakDiATOMEDU4530
Ultra-mikrotomLeicaARTOS 3D
Mikroskoplar
Ters konfokal mikroskopiNikonA1 Rsi/Ti-E
Transmisyon elektron mikroskobuFEITecnai G2
Yazılım ve Algoritmalar
Fiji/Image JNIH / açık kaynakhttps://imagej.nih.gov/ij/
ImageJ BigWarp yazılım paketiNIH / açık kaynakhttps://imagej.net/plugins/bigwarp
Photozoom Pro 8 BenVistahttps://www.benvista.com/photozoompro

Alternatif yazılım
Görüntü Boyutlandırıcı : https://imageresizer.com/
Gigapiksel AI: https://www.topazlabs.com/gigapixel
ON1 yeniden boyutlandırma : https://www.on1.com/products/resize-ai/

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
  2. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nat Cell Biol. 20 (7), 745-754 (2018).
  3. Lopez, J., Tait, S. W. G. Mitochondrial apoptosis: Killing cancer using the enemy within. Br J Cancer. 112 (6), 957-962 (2015).
  4. Wang, C., Youle, R. J. The role of mitochondria in apoptosis*. Annu Rev Genet. 43, 95-118 (2009).
  5. Rossi, A., Pizzo, P., Filadi, R. Calcium, mitochondria and cell metabolism: A functional triangle in bioenergetics. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1068-1078 (2019).
  6. Giorgi, C., Marchi, S., Pinton, P. The machineries, regulation and cellular functions of mitochondrial calcium. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 713-730 (2018).
  7. Talari, N. K., et al. Lipid-droplet associated mitochondria promote fatty-acid oxidation through a distinct bioenergetic pattern in male wistar rats. Nat Commun. 14 (1), 766(2023).
  8. Enkler, L., et al. Arf1 coordinates fatty acid metabolism and mitochondrial homeostasis. Nat Cell Biol. 25 (8), 1157-1172 (2023).
  9. Trivedi, P. C., Bartlett, J. J., Pulinilkunnil, T. Lysosomal biology and function: Modern view of cellular debris bin. Cells. 9 (5), 1131(2020).
  10. Mony, V. K., Benjamin, S., O'Rourke, E. J. A lysosome-centered view of nutrient homeostasis. Autophagy. 12 (4), 619-631 (2016).
  11. Thelen, A. M., Zoncu, R. Emerging roles for the lysosome in lipid metabolism. Trends Cell Biol. 27 (11), 833-850 (2017).
  12. Ma, X., et al. Mitochondria-lysosome-related organelles mediate mitochondrial clearance during cellular dedifferentiation. Cell Rep. 42 (10), 113291(2023).
  13. Kim, S., Wong, Y. C., Gao, F., Krainc, D. Dysregulation of mitochondria-lysosome contacts by gba1 dysfunction in dopaminergic neuronal models of Parkinson's disease. Nat Commun. 12 (1), 1807(2021).
  14. Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of pink1, parkin, and mitochondrial fidelity in parkinson's disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
  15. Wong, Y. C., Peng, W., Krainc, D. Lysosomal regulation of inter-mitochondrial contact fate and motility in charcot-marie-tooth type 2. Dev Cell. 50 (3), 339-354.e4 (2019).
  16. Peng, W., Wong, Y. C., Krainc, D. Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial Ca(2+) dynamics via lysosomal trpml1. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19266-19275 (2020).
  17. Juhl, A. D., et al. Quantitative imaging of membrane contact sites for sterol transfer between endo-lysosomes and mitochondria in living cells. Sci Rep. 11 (1), 8927(2021).
  18. Khalil, S., et al. A specialized pathway for erythroid iron delivery through lysosomal trafficking of transferrin receptor 2. Blood Adv. 1 (15), 1181-1194 (2017).
  19. Russell, M. R., et al. 3d correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. J Cell Sci. 130 (1), 278-291 (2017).
  20. Van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. Correlative light-electron microscopy (clem) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections. Nat Methods. 5 (11), 973-980 (2008).
  21. Loginov, S. V., et al. Correlative organelle microscopy: Fluorescence guided volume electron microscopy of intracellular processes. Front Cell Dev Biol. 10, 829545(2022).
  22. De Beer, M., et al. Visualizing biological tissues: A multiscale workflow from live imaging to 3D cryo-CLEM. Microscopy and Microanalysis. 27 (S2), 11-12 (2021).
  23. Fu, Z., et al. Meosem withstands osmium staining and epon embedding for super-resolution clem. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
  24. Lam, S. S., et al. Directed evolution of apex2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Cardona, A., et al. Trakem2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), e38011(2012).
  27. Redmann, M., et al. Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons. Redox Biol. 11, 73-81 (2017).
  28. Lu, F., et al. Identification of npc1 as the target of u18666a, an inhibitor of lysosomal cholesterol export and ebola infection. eLife. 4, e12177(2015).
  29. Jung, M., Choi, H., Mun, J. Y. The autophagy research in electron microscopy. Appl Microsc. 49 (1), 11(2019).
  30. Hao, T., et al. Hypoxia-reprogramed megamitochondrion contacts and engulfs lysosome to mediate mitochondrial self-digestion. Nat Commun. 14 (1), 4105(2023).
  31. Hoglinger, D., et al. Npc1 regulates ER contacts with endocytic organelles to mediate cholesterol egress. Nat Commun. 10 (1), 4276(2019).
  32. Jung, M., Mun, J. Y. Mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy. J Vis Exp. (149), e59750(2019).
  33. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3d architecture using fib-sem. Microscopy (Oxf). 70 (2), 161-170 (2021).
  34. Wang, H., et al. Lysosome-targeted biosensor for the super-resolution imaging of lysosome-mitochondrion interaction. Front Pharmacol. 13, 865173(2022).
  35. Chen, Q., et al. Quantitative analysis of interactive behavior of mitochondria and lysosomes using structured illumination microscopy. bioRxiv. , (2018).
  36. Wong, Y. C., Ysselstein, D., Krainc, D. Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial fission via rab7 gtp hydrolysis. Nature. 554 (7692), 382-386 (2018).
  37. Perkins, G., et al. Electron tomography of neuronal mitochondria: Three-dimensional structure and organization of cristae and membrane contacts. J Struc Biol. 119 (3), 260-272 (1997).
  38. Sharma, N., Jung, M., Mishra, P. K., Mun, J. Y., Rhee, H. -W. Flex: Genetically encodable enzymatic fluorescence signal amplification using engineered peroxidase. Cell Chem Biol. 31 (3), 502-513.e506 (2024).
  39. Jung, M., Choi, H., Kim, J., Mun, J. Y. Correlative light and transmission electron microscopy showed details of mitophagy by mitochondria quality control in propionic acid treated sh-sy5y cell. Materials (Basel). 13 (19), (2020).
  40. Mourik, M. J., et al. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. 124, Academic Press. 71-92 (2014).
  41. Hegermann, J., et al. Volume-clem: A method for correlative light and electron microscopy in three dimensions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (6), L778-L784 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Correlative Light MicroscopyMitochondria Lysosome InteractionDual Color CLEMOrganelle DynamicsConfocal MicroscopyTransmission Electron MicroscopyHeLa CellsMitochondrial Quality ControlOrganelle Labeling

İlgili makaleler