Farelerde yayılan depolarizasyonları görselleştirmek ve kaydetmek için görüntüleme ve elektrofizyolojiyi birleştirmek

Özet

Bu protokol, hafif bir travmatik beyin hasarını takiben yetişkin farelerde yayılan depolarizasyonları güvenilir bir şekilde tespit etmek için görüntüleme ve elektrofizyolojinin kombinasyonunu gösterir.

Özet

Yayılan Depolarizasyonlar (SD'ler), beyinde gri madde boyunca yavaş yayılmaları nedeniyle genellikle fark edilmeyen büyük olaylardır. SD tespiti zor olabileceğinden, birden fazla yöntem kullanılarak en iyi şekilde doğrulanır. Bu protokol, SD'leri çoğu laboratuvarın güvenilir ve kolay bir şekilde benimseyebileceği bir şekilde tespit etmek için görüntüleme ve elektrofizyolojiyi birleştirme yöntemlerini açıklar. SD'ler travmatik beyin yaralanmaları, inme, subaraknoid kanamalar, iskemi ve migren aurasını takiben ortaya çıkar. Tarihsel olarak, SD'ler, yavaş hücre dışı kaymayı ve yüksek frekanslı aktivitedeki depresyonu çözebilen DC amplifikatörleri kullanılarak kaydedilmiştir. Bununla birlikte, DC amplifikatörlerin kronik in vivo kayıtlar için kullanılması neredeyse imkansızdır. Bu protokol, SD'nin yayılan dalgasını tespit etmek için gerekli olan non-invaziv görüntüleme ile birlikte yüksek frekanslı depresyonu doğrulamak için in vivo elektrofizyoloji kayıtları için ortak bir AC amplifikatörü kullanır. Bu yöntemler, beyin hasarını takiben SD'lerin varlığını veya yokluğunu doğrulamak için çoğu deneysel yaklaşım için güvenilir bir şekilde benimsenebilir ve / veya değiştirilebilir.

Giriş

Yayılan depolarizasyonlar (SD'ler), travmatik beyin hasarı (TBI), inme, subaraknoid kanamalar, iskemi ve migren aura^{1 dahil olmak üzere çeşitli nörolojik durumlarla ilişkilidir}. SD'ler, inmelerde doku hasarının ilerlemesinde rol oynamaktadır ve TBIs². Doku kaybı ilerlemesinin altında yatan kesin mekanizma belirsizliğini korumaktadır^3,4. Bununla birlikte, SD'ler, nöronların metabolik talepleri yeterli oksijen ve glikoz ile karşılanmadığında ortaya çıkar, çünkü ATP'ye bağımlı sodyum-potasyum pompasının işlevi iyon gradyanlarını korumak için yetersiz hale gelir. SD'lerin doku kaybındaki rolünü anlamak için, bunları ölçmek ve incelemek için kesin tekniklere ihtiyaç vardır, bu da bilimsel bilgiyi ilerletmek için çok önemlidir. SD'ler, deneysel tasarım ve/veya enstrümantasyon sınırlamaları nedeniyle sıklıkla tespit edilemeyen önemli nörolojik olaylardır.

Yayılan depolarizasyonların (SD'ler) yaralanma ilerlemesindeki rolü şu anda aydınlatılmaktadır, ancak hafif travmatik beyin yaralanmalarındaki (mTBI'ler) rolleri belirsizliğini korumaktadır. Bu yazıda açıklanan teknikleri kullanan son çalışmalar, SD'lerin kapalı kafatası mTBI fare modellerinde, açık doku hasarı veya kanama olmadığında bile başlatıldığını göstermiştir^{5, 6}. Bu çalışmalar, SD'lerin akut nörolojik bozukluklara ve nöroinflamasyona katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Ek olarak, mTBI ile indüklenen SD'lerin varlığı, akut davranışsal eksikliklerle yakından ilişkilidir^6,7. Bu nedenle, SD'lerin tüm TBI modellerinde başlatılması muhtemeldir, ancak rollerinin onay olmadan tespit edilmesi zordur. SD'lerin varlığının doğrulanması, mTBI'lerin sonuçlarının doğru bir şekilde değerlendirilmesi için çok önemlidir.

Yayılan depolarizasyonlar (SD'ler), "DC kayması" olarak bilinen hücre dışı potansiyelde önemli bir düşüş ve yüksek frekanslı aktivite^{8 depresyonu ile tanımlanır}. "DC kayması"nın çözülmesi genellikle saniyeler sürer (~10 s)⁹. "DC kaymasını" yakalamak için bir DC amplifikatörü ve gümüş tel elektrotlar gereklidir. Bununla birlikte, in vivo elektrofizyoloji genellikle hareket artefaktlarını azaltmak için düşük frekanslı olayları filtrelemek üzere tasarlanmış AC amplifikatörleri ile gerçekleştirilir. Ne yazık ki, bu düşük frekanslı filtreleme aynı zamanda "DC kaymasını" da ortadan kaldırır. Ek olarak, gümüş toksiktir ve kronik kayıtlar için uygun değildir. Yaygın olarak kullanılan AC amplifikatörler, yüksek frekanslı aktivitenin depresyonunu algılayabilir, ancak eşlik eden "DC kayması" olmadan, bir SD'nin varlığını doğrulamak zordur.

Yayılan depolarizasyonlar (SD'ler) çeşitli görüntüleme teknikleri kullanılarak da tespit edilebilir. En yaygın olarak, SD'ler, sağlam kafatasından serebral kan akışını ölçen lazer benek kontrast görüntüleme ile görüntülenir¹⁰. SD'ler serebral vaskülatürü ve kan akışını önemli ölçüde etkiler. Fareler dışındaki çoğu türde, SD'ler, SD^{11'in ön kenarı ile hareket eden yayılan bir hiperperfüzyon dalgasını indükler}. SD'ler ayrıca kalsiyum veya glutamat floresan indikatörleri^{12 kullanılarak da görüntülenebilir}, ancak bunun için dokuya boyalar veya genetik olarak kodlanmış floresan indikatörler yüklenmesi gerekir^12,13. İlginç bir şekilde, SD^{14 ile ilişkili içsel optik sinyaller (iOS) nedeniyle SD'ler çıplak gözle gözlemlenebilir}. iOS, NAD(P)H ve FADH^15,16, doku şişmesi^{17 gibi otofloresan moleküllerden} ve serebral kan akışındaki potansiyel değişikliklerden oluşan karmaşık sinyallerdir. Karmaşıklıklarına rağmen, iOS sinyalleri güvenilirdir ve vahşi tip fareler^{18'de yakalanabilir}. Bu teknik, özel virüslere veya transgenik hayvanlara ihtiyaç duymadan herhangi bir laboratuvarda uygulanabildiğinden, bu protokol iOS'u görüntüleme yöntemini açıklar.

Bu yöntemin genel amacı, eşzamanlı görüntüleme ve elektrofizyoloji kullanarak hafif bir travmatik beyin hasarını (mTBI) takiben yayılan bir depolarizasyonun (SD) varlığını veya yokluğunu deneysel olarak doğrulamaktır. Gelişmiş yükselteçler tarafından kolaylaştırılan in vivo elektrofizyoloji, yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bununla birlikte, bu amplifikatörler karakteristik "DC kaymasını" algılayamaz. Bu nedenle, bu protokolde açıklandığı gibi, SD'lerin varlığını veya yokluğunu güvenle doğrulamak için görüntüleme teknikleri kullanılır. Görüntüleme ve elektrofizyolojiyi birleştirmenin avantajı, görüntülemenin SD'nin yayılmasını tespit edebilmesi, elektrofizyolojinin ise ilişkili yüksek frekanslı depresyonu tanımlayabilmesidir.

Genel olarak, bu yöntem travmatik beyin hasarını (TBI) takiben yayılan depolarizasyonların (SD'ler) varlığını araştırmak için uygundur. Uygulaması, TBI ve SD'lerden sonra kortikal ağ fonksiyonunun anlaşılmasını artırabilir. Bu protokol, kapalı bir kafatası darbe modelinden kontrollü kortikal darbe, sıvı perküsyonu veya ağırlık düşüşü gibi diğer modellere uyarlanabilir. Bu protokolün birden fazla laboratuvarda uygulanması, SD'lerin değişen TBI şiddetlerindeki rolünü açıklığa kavuşturabilir. Yerleşik herhangi bir TBI modeli kullanılabilir, ardından bu protokolde açıklanan iOS görüntüleme ve elektrofizyoloji prosedürleri takip edilebilir.

Protokol

Tüm prosedürler, New Mexico Üniversitesi'ndeki Enstitü'nün Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak gerçekleştirildi. C57BL / 6J fareleri ticari bir kaynaktan elde edildi. 8-14 haftalık yaş aralığında eşit sayıda erkek ve dişi fare kullanıldı. Tüm fareler yaklaşık 20 g ağırlığındaydı. Bu çalışmada kullanılan hayvanların, reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Ek Dosya 1 kısaltmaların listesini içerir.

1. Kafatasının görüntüleme ve elektrofizyoloji için hazırlanması

1. Hayvanı% 100 oksijen içinde% 2 -% 3 izofluran içeren bir izofluran indüksiyon kutusunda uyuşturun, böylece bir pençe tutamından ürkmeden uygun anestezi derinliğini sağlayın.
2. Hayvanı stereotaksik bir çerçeveye yerleştirmeden önce preoperatif analjezikler (Yavaş salınan Buprenorfin, 3.25 mg / kg, SQ) uygulayın ve anesteziyi koruyun (% 2 izofluran).
3. Oftalmik merhem ekleyin ve vücut ısısı geri bildirimi olan bir ısıtma yastığı ile hayvanın vücut ısısını koruyun.
4. Kesiğin olacağı kafatasının üzerindeki saçları, oküler fissürün orta hattından lambdaya kadar
tıraş edin.
5. Cildi antiseptik ve dezenfektan bir ovma ve solüsyonla sterilize etmeden önce kırpılmış tüyleri çıkarın. % 70 etanol ile bitirin ve steril bir cerrahi alan sağlamak için üç kez tekrarlayın.
6. # 10 neşter bıçağı kullanarak, rostraldan kaudal e orta hatta bir kesi yapın, hemen ardından insizyona tıbbi sınıf siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi yanlamasına yayın.
7. Kafatasına ek koruma sağlamak için kafatasının üzerine bir veya iki damla daha siyanoakrilat yapıştırıcı ekleyin.
   NOT: Yapıştırıcı uygulaması zamana duyarlıdır, çünkü kafatası 10 saniyeden daha uzun süre havaya maruz kaldığında opaklaşmaya başlayacaktır. Bu, SD'nin görüntüleme yöntemleriyle görselleştirilmesini gizleyecektir.
8. Yapıştırıcı kururken, beyincik üzerindeki kesi boyutunu artırmak için steril cerrahi makas kullanın. Yapıştırıcı ayarlandıktan sonra, kafatası vida elektrotlarının implantasyonuna başlayın.
   1. İmplantasyondan önce kafatası vidalarını bir boncuk sterilizatörü ile 20-30 saniye sterilize edin.
   2. Açık bir görsel pencere sağlamak için kafatası vidalarını SD başlatma bölgesinden uzak bir bölgeye yerleştirin.
      NOT: Birincil görsel korteksteki kronik kayıtlar için üç kafatası vidası kullanılır. İlk vida, bregmadan yaklaşık y = -6.00 mm uzaklıkta, beyincikte yerleştirilir ve referans elektrot görevi görür. Kayıt elektrotları, sol ve sağ hemisferler içinde, bregmadan y = -2.79 mm ve orta hattan x = ±2.5 mm olacak şekilde konumlandırılır.
   3. 0,8 mm boyutunda bir matkap ucu ile kafatasına pilot delikler açın. Alttaki dokuya zarar vermemek için, z'de -0,5 mm idealdir. Paslanmaz çelik tel ile altın pimlere önceden lehimlenmiş #00-90 vidaları kullanın.
   4. Vidaları kafatasına doğru çevirin.1.5-2 tam tur vidayı kafatasından geçirecek ve kortikal yüzeyle temas ettirecektir.
   5. Fazla teli vidanın etrafına sarın ve daha sonra headstage yerleşimi için telde biraz gevşeklik sağlayın.
   6. Aynı prosedürleri kullanarak diğer kafatası vidalarını yerleştirin.
   7. Tüm kafatası vidaları yerine oturduktan sonra, tüm altın pimleri istediğiniz headstage konektörüne takın. Stereotaksik kolu kullanarak konektörü yerinde tutun ve kabloların birbirine değmediğinden emin olarak konektör pimlerini vida başlarının üzerinde yakın tutun.
   8. Kafatası vidalarının önündeki görüntüleme alanını bozmamaya dikkat ederek tüm alanı siyanoakrilat yapıştırıcı ile kapatın.
   9. Altın pimlerin tabanının etrafında diş çimentosu oluşturun ve kafatası vidalarından gelen altın pimlerin kafa aşamasındaki altın pimlere bağlanmadığından emin olun.
   10. Başlık konektörünü, çıkarmadan önce diş çimentosunun kurulaşmasına izin verin.
   11. Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve iyileşmesi için ev kafesine geri koyun. Standart ameliyat sonrası bakımı takip edin ve anesteziden iyileşirken hayvanları bir ısıtma yastığı üzerinde tutun.
       NOT: Ameliyattan sonra, hayvanlar tek başına barındırıldı ve günlük olarak ağrı açısından izlendi. Analjezi için yerel kurumsal yönergeleri izleyin. Yavaş salınan bir buprenorfin kullanıyorsanız, ağrıyı izleyin ve potansiyel olarak 72 saatte ek bir doz verin.
9. Muhafaza ve zenginleştirme dahil olmak üzere elektrotlara takılabilecek tüm nesneleri çıkarın. Yiyecek ve suya ad libium erişimi olan standart yatak takımları kullanın.
   NOT: Ameliyat ve kayıt arasında iki günlük bir iyileşme süresi tanıyın.

2. İçsel optik sinyal (iOS) görüntüleme ve AC-elektrofizyoloji ile yayılan depolarizasyonların tespiti

1. Hayvanları %100 oksijen içinde %2 izofluran ile anestezikleştirin.
   NOT: Bu prosedürün görüntüleme kısmı ~ 5 dakika sürmeli ve izofluran maruziyet miktarı tutarlı olmalıdır.
2. Hayvanı stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin. Burun konisi aracılığıyla, oksijende% 1 -% 2 izofluran bulundurun.
   NOT: İzofluranın SD'leri azalttığı bilindiği için uygun anestezi derinliğini korumak çok önemlidir. Deney boyunca 60-70 nefes / dk'nın sürdürülmesi önerilir.
3. Hayvanı kameranın altına yerleştirin ve odak halkasını ayarlayarak kameranın kortikal yüzeye odaklandığından emin olun.
4. Şeffaflığı artırmak için görüntüleme alanına mineral yağ sürün.
5. Bilgisayarları, LED panel kartını ve elektrofizyoloji ekipmanını açın.
   NOT: LED panel kartı, tepe ışıkları kapalıyken görüntüleme penceresini aydınlatmak için hayvanın önüne yerleştirildiğinde en iyi şekilde çalışır. Işık, 2,400K soğuk sıcaklık ayarıyla ~ 95 lux (% 4000 güç) olarak ayarlandı.
6. Micro-Manager^{19,20,21,22 kullanarak iOS için ayarı yükleyin}.
   1. Fareyi kameranın altında görüntülemek ve hayvanın kafatasını kameranın altında ortalamak için Canlı düğmesine basın. "Canlı" penceresini kapatın.
   2. Multi-D Acq tuşuna basın.
   3. Çok Boyutlu Alım penceresinde, istediğiniz zaman noktalarını seçin.
      NOT: 250 ms'lik aralıklarla 750 görüntü sayımı önerilir.
   4. Görüntüleri istediğiniz dosya yoluna ve ad önekine kaydedin.
7. Hayvandan gelen altın pimleri headstage konektörüne ve ardından headstage'e bağlayın.
8. Intan yazılımı için yük ayarı.
   1. Dosya formatı seç simgesine tıklayın ve açılır pencerede Sinyal Türü Formatı Başına Bir Dosya'yı seçin. Bu, dosyayı MATLAB'da daha fazla kullanım için bir ".dat" olarak kaydedecektir.
   2. Donanım Bant Genişliği altındaki BW sekmesinde, 0.13-500 Hz amplifikatör bant genişliğini seçin.
   3. Filtre Ekranı Seçici altında, en geniş sinyal aralığını kapsayacak şekilde GENİŞLİ'yi seçin.
   4. Kaydetmek istediğiniz dosya yolunu seçmek için Dosya Adı Seç simgesine tıklayın.
9. Elektromanyetik bir çarpma tertibatı kullanarak darbe gerçekleştirin.
   NOT: Çarpma tertibatı ayarları 4 m/s darbe hızı ve 5 mm sapmadır.
   1. Çarpma tertibatını açın ve ucu geri çekmek ve uzatmak için 3 yönlü düğmeyi hafifçe vurarak ucun geri çekildiğinden ve uygun şekilde uzadığından emin olun. Hayvanı ucun altına yerleştirmeden önce uç uzatılmalıdır.
   2. Hızlı hareket ederek, hayvanı bir köpük yatağa yerleştirin ve yatağı ucun altına kaydırın.
   3. Çarpma tertibatı ucunu orta hatta ve 1 mm bregma rostralına hizalayın.
   4. Çarpma tertibatının ucunu, hayvanın başının üst kısmına sıkıca değene kadar indirin.
      NOT: Ucu kafanın içine doğru itmeyin.
   5. Çarpma tertibatı ucunu geri çekmek için kolu itin ve ardından darbe kolunu etkinleştirmeden önce manuel olarak 5 mm indirin.
   6. Hayvanı hemen köpük yataktan çıkarın ve SD çarpmadan itibaren başlatıldığı için 5 saniye içinde görüntüleme için hayvanı kameranın altına yerleştirin.
10. Çok Boyutlu Alım penceresinde Acquire! seçeneğine tıklayarak iOS görüntülemeyi başlatın. Tüm SD'yi yakalamak için 4 dakika boyunca görüntü.
11. Intan yazılımındaki Kayıt simgesine tıklayarak elektrofizyoloji kaydını başlatın.
12. Hayvanı köpük pedden çıkarın ve hayvanın açık bir arenada veya ev kafesinde iyileşmesine izin verin.
    NOT: Kortikal ağ fonksiyonunun iyileşmesine izin vermek için elektrofizyolojinin en az 1 saat boyunca kaydedilmesi önerilir.
13. Kaydın tamamlanmasının ardından, hayvanı baş kısmından çıkarıntage ve konektör ve hayvanı kafesine geri yerleştirin.
    NOT: Her darbe ve kayıt oturumu arasında 24 saat izin verilmesi önerilir. Hayvan, kayıt seansları dışında tüm süre boyunca ev kafesinde kalabilir.

3. iOS görüntü görselleştirme ve niceleme

1. ImageJ^{19,20,21,22 içinde}, Dosya > İçe Aktar > Görüntü dizisine tıklayarak görüntü yığınını açın.
2. Hareket veya başka herhangi bir yapaylık olmadığından emin olmak için görüntüler arasında manuel olarak kaydırın.
3. SD'nin grafiğini oluşturmak için, imleci kullanarak bir kare çizerek bir ROI oluşturun.
   NOT: 30 x 30 piksellik bir kare kullanılması önerilir. Herhangi bir şekil veya boyut kullanılabilir, ancak ROI boyutunun hayvanlar arasında değişmediğinden emin olun.
4. Görüntü > Yığınları > Çizim Z Ekseni Profili'ne tıklayarak bir çizim oluşturun. Yeni oluşturulan grafikte canlı düğmesine tıklayın. SD'nin görüntü yığınına geri dönün ve grafik SD eğrisini gösterene kadar ROI'yi hareket ettirin. Grafik, başlangıçta bir yükseliş, ardından taban çizgisinin altına bir düşüş ve birkaç dakika içinde taban çizgisine yavaş bir dönüş ile bir Günah dalgası gibi görünmelidir.
   NOT: Grafikler, rastgele birimler (AU) veya temel ortalama olarak ilk birkaç görüntü kullanılarak yüzde taban çizgisi olarak ifade edilebilir.
5. Oluşturulan çizim üzerinde, diğer grafik oluşturma yazılımlarında veya Matlab'da çizilebilecek değerlerin bir listesini oluşturmak için Liste'ye tıklayın.
6. Görselleştirme için, gri tonlamalı görüntüyü ImageJ'de Image > Fire>'daki Arama Tablolarına bir arama tablosuna dönüştürün.

4. Elektrofizyoloji analizi

NOT: Elektrofizyoloji verilerini görselleştirmek ve analiz etmek için Buzsaki laboratuvarının uzmanlığının ve MATLAB tarafından oluşturulan kodlarının yoğun bir şekilde kullanılması önerilir. Analiz, kurumsal bir aktivasyon kodu ile MATLAB'ın ve GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode) aracılığıyla Buzsaki lab "Buzcode" zip dosyasının indirilmesini gerektirecektir.

1. İntan elektrofizyoloji yazılımında, dışa aktarılan ham verilerin ".dat" formatında kaydedildiğinden emin olun.
   NOT: Matlab, MathWorks web sitesinden yüklenebilir. Matlab'ın satın alınması ve kullanılması için kurumsal veya bireysel bir aktivasyon kodu gereklidir. Bu analizi gerçekleştirmek için Matlab'da kod çalıştırmayla ilgili bazı önceki deneyimler gereklidir.
2. Verileri Matlab.
   içine yüklemek için Buzaki kod bz_LoadBinary işlevini kullanın NOT: Örnek "'data' = bz_LoadBinary ('tam veri dosyası yolu','frekans', örnekleme frekansı, nChannels, kanal sayısı);
3. 60 Hz.
   'da ortalanmış bir çentik filtresi kullanarak AC gürültüsünü filtreleyin NOT: Örnek notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, veri);
4. Yayılan depolarizasyonları (SD'ler) analiz etmek ve görselleştirmek için COSBID grubunun tavsiyelerine uygun olarak 0,5-100 Hz aralığında bir bant geçiren filtre kullanarak yüksek frekanslı aktiviteyi izole edin.
5. MatLab'da pspectrum komutunu kullanarak güç spektrogramını hesaplayın.
6. Görselleştirmek için, yüksek frekansı ve güç spektrogramını aynı zaman ölçeğinde ve tek bir sütunda çizin.
   NOT: Grafiklerden, yüksek frekanslı depresyonun ve güç kaybının bir uzantısı olacaktır.

Sonuçlar

Şekil 1, deney düzeneğinin grafiksel bir temsilini göstermektedir. Kayıt yapan kafatası vidaları birincil görsel kortekse yerleştirilir ve bir kafatası vida elektrodu serebellar vermise toprak elektrodu olarak yerleştirilir. Kafatası vidaları ve altın pimler, siyanoakrilat yapıştırıcı ve diş çimentosu kullanılarak kafatasına sabitlenir. Etki ve görüntüleme için yer bırakmak için diş çimentosunu kafatasının kaudal kısmı ile sınırlamak çok önemlidir. Orta hatta ortalanmış ve bregma'ya yaklaşık 1 mm rostral olan çarpma yeri Şekil 1'de belirtilmiştir.

Temsili içsel optik sinyaller (iOS) görüntüleri Şekil 2A'da gösterilmiştir. Gri tonlamalı görüntüler, yayılan depolarizasyonların (SD'ler) görselleştirilmesini geliştirmek için bir Yangın Arama Tablosu kullanılarak dönüştürülür. IOS, NAD(P)H, FADH ve doku yansıması dahil olmak üzere çeşitli sinyalleri kapsar ve bu sinyallerin yorumlanmasını ve karşılaştırılmasını zorlaştırır. Büyük kaplar, süper yapıştırıcı penceresinden (oklarla gösterilir) net bir şekilde görülebilmelidir, Şekil 2A'daki kesikli çizgi SD'nin yayılan dalgasını işaretler. SD'leri gerçek zamanlı olarak gözlemlemek zor olsa da, görüntüler hızlandırıldığında daha belirgin hale gelirler (bkz. Ek Video 1). Bazı küçük dallar vazokonstriksiyon nedeniyle "kaybolmuş" gibi görünebilir (Şekil 2A). Görüntü yığınından çıkarılan küçük bir ilgi alanı (ROI), Şekil 2B'ye benzer bir Z ekseni grafiği vermelidir. Elektrofizyoloji kayıtlarından, çıkarılan yüksek frekanslı sinyal, Şekil 2C,D'nin üst panellerine benzemelidir. Bu kayıtlar, hafif travmatik beyin hasarından (mTBI) hemen sonra başlatıldı ve hayvanlar 4 dakikalık iOS görüntüleme sırasında izofluran anestezisi altında kaldı. İzofluranın çıkarılmasından sonra, Şekil 2C'de (kırmızı kutu) gösterildiği gibi, sahte hayvanlarda yüksek frekanslı aktivite bir dakika içinde hızlı bir şekilde geri dönmelidir. Tersine, bir SD meydana gelirse, yüksek frekanslı aktivite iyileşmeden önce birkaç dakika boyunca basılı kalacaktır (Şekil 2D, kırmızı kutu). Figure 2C,D'nin alt panelleri, her yüksek frekanslı çizim için hesaplanan gücü (V²) gösterir. Bu güç grafikleri, güçteki hızlı artışla (kırmızı kutuların sağ kenarı ile gösterilir) yüksek frekanslı aktivitenin bastırılmasını ve geri kazanılmasını tanımlamaya yardımcı olur.

Şekil 1: Darbe ve kafatası vidalarının deney düzeneği ve yeri. Kafatasının sırt yüzeyi bir deri kesisi ile açığa çıkar. Kafatası ve cilt, şeffaflığı artırmak için siyanoakrilat yapıştırıcı ile kapatılmıştır. Zemin için bir çapak deliği y = -6.00 ve bregma'dan x = 0'da delinir. Elektrotları kaydetmek için çapak delikleri bregmadan y = -2.79 ve x = ±2.5'e yerleştirilir. Paslanmaz çelik vidalar kafatasından geçirilir ve kaplanmamış paslanmaz çelik tel ile altın pimlere lehimlenir. Darbe ve görüntüleme için yeterli alan sağlamak için kafatası yüzeyinin diş çimentosu ile aşırı kaplanmasını önlemek için özen gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Temsili iOS görüntüleri ve AC kayıtları. (A) Kan damarlarını gösteren oklara sahip temsili iOS görüntüleri. Gri tonlamalı görüntüler, daha iyi görselleştirme için ImageJ'deki Fire arama tablosuna dönüştürülür. Noktalı siyah çizgi, iOS'ta artan yoğunlukta bir dalga olarak görselleştirilen yayılan SD'yi belirtir. SD, tüm görüntü yığınında hızlı bir şekilde kaydırılırken açıkça görülebilir. iOS sinyali, NAD(P)H ve FADH'nin mitokondriyal üretimi ve nöronal ödem dahil olmak üzere SD ile ilişkili çeşitli fizyolojik ve metabolik değişiklikleri yansıtır. Kara kutu, (B) içindeki izlemeyi oluşturmak için kullanılan ilgi bölgesini (ROI) vurgular. Ölçek çubuğu: 1 mm. (B) Taban çizgisinin yüzdesi olarak ifade edilen iOS SD'nin temsili izlemesi. iOS sinyali yükselir ve yaklaşık 60 saniye içinde taban çizgisine yakın bir yere geri döner. iOS sinyallerindeki değişiklikler küçük olsa da (yaklaşık% 10), SD'yi tanımlamak için yeterlidir. Hem sahte (C) hem de SD (D) hayvanlar için AC kayıtlarında, üstteki izler yüksek frekanslı aktiviteyi gösterir ve alttaki izler gücü (V²) temsil eder. Mavi kutular izofluran anestezi dönemlerini gösterirken, kırmızı kutu izofluran ve SD'den yüksek frekanslı aktivitenin iyileşme süresini gösterir. SD'nin neden olduğu uzun süreli depresyon, tek başına izofluranı (sahte) takiben aktivitenin hızlı geri kazanılması ile tezat oluşturur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: Yayılan dalga görselleştirmesi. Yayılan dalganın görsel olarak tanımlanmasını kolaylaştırmak için video dosyası yaklaşık 8 kat hıza kadar hızlandırılır. Gri tonlamalı görüntü, Fire arama tablosuna dönüştürüldü ve ImageJ'de bir .AVI dosyası olarak kaydedildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Kısaltmaların listesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Yayılan depolarizasyonlar, travmatik beyin hasarı (TBI), felç ve migren dahil olmak üzere çeşitli hastalık modellerinde çok önemlidir¹. SD'lerin doğru tespiti, akut davranış eksikliklerindeki ve/veya hafif travmatik beyin yaralanmalarını (mTBI'lar) takiben nöroimmün sistemin aktivasyonundaki rollerini anlamak için ^{gereklidir23,24}. Tek bir yöntem kullanıldığında SD'lerin kaybolması riskini azaltmak amacıyla, SD'lerin etkili bir şekilde görselleştirilmesi ve kaydedilmesi için çok yöntemli bir yaklaşım gereklidir.

Tekniklerin birleştirilmesi, yayılan depolarizasyonların (SD'ler) doğrulanmasını sağlarken, her tekniğin potansiyel tuzakları olabilir. Bu protokolde açıklanan görüntüleme tekniklerine çoğu laboratuvar erişebilir ve Zepeda ve meslektaşları²⁵ tarafından detaylandırılmıştır. Opak pencereler sonuçsuz görüntülere yol açabileceğinden, kraniyal pencerenin hazırlanması çok önemlidir²⁶. Bu sorun, siyanoakrilat yapıştırıcı uygulanmadan önce kafatasının havaya maruz kalması en aza indirilerek azaltılabilir. Ek olarak, görüntülemeden önce bir damla mineral yağ ile pencerenin şeffaflığı iyileştirilebilir. Hareket artefaktları SD onayını da karmaşıklaştırabilir, bu nedenle bu artefaktları en aza indirmek net video elde etmek için çok önemlidir. Bunu ele almak için, görüntüleme işlemi boyunca hayvanı izofluran altında tutmak önemlidir²⁷. Burun konisinin kullanılması, hayvanın çarpma tertibatı ile kayıt kurulumu arasında verimli bir şekilde aktarılmasını kolaylaştırır. SD yayılımının mümkün olduğu kadar çoğunu yakalamak için çarpmadan sonra hayvanı hızlı bir şekilde burun konisinin altına geri yerleştirmek çok önemlidir. Bu hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) modelinde, yaklaşık 4 dakikalık kayıt genellikle tüm SD'yi yakalamak için yeterlidir. Bununla birlikte, daha şiddetli TBI'larda, doku hasarı ile spontan SD'ler üretilebilir²⁸. Sürekli görüntüleme bu spontan SD'leri tespit edebilir, ancak genişletilmiş izofluran anestezisi yüksek frekanslı depresyonu gözlemlemeyi zorlaştırabilir. Spontan SD'ler, yüksek frekanslı aktivitede ek depresyonlar ile elektrofizyoloji ile tespit edilebilir, ancak depresyon ve SD arasındaki ilişkiyi görüntüleme olmadan doğrulamak zordur.

Open-Ephys ve Intan yükselteçlerinin geliştirilmesiyle, in vivo elektrofizyoloji artık birçok laboratuvarın erişimine açıktır. Tüm elektrofizyolojik kayıtlar, kafatası vidalarının ve/veya elektrotların implantasyonunu gerektirir. Bu protokolde, iyileşmeyi desteklemek için kafatası vidalarının implantasyonu ile kayıt arasında iki günlük bir gecikme süresi vardır. Bu süre beynin implantasyondan tamamen kurtulması için yeterli olmasa da, kafatası vidaları beyin dokusuna nüfuz etmediği için minimum hasar olmalıdır. Ek olarak, siyanoakrilat ile kapatılmış kafatasının şeffaflığı zamanla azalır, bu nedenle optimum şeffaflığı elde etmek için görüntüleme mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır. Elektrofizyoloji için 60 Hz gürültüyü en aza indirmek çok önemlidir. Deney alanının AC gücünden izole edildiğinden ve Intan'a uygun şekilde topraklandığından emin olun. Hareket artefaktları tamamen ortadan kaldırılamasa da, baş aşamasındaki ivmeölçerler, işlem sonrası hareket periyotlarının belirlenmesine ve ortadan kaldırılmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu teknikler hafif travmatik beyin yaralanmalarını (mTBI'lar) takiben SD iyileşmesi ve kortikal ağ fonksiyonu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.

Bu tekniklerin bir sınırlaması, hayvanların görüntüleme sırasında anestezi altında olmasıdır. Bununla birlikte, çoğu TBI modeli anestezi gerektirir ve uzatılmış anestezinin deneysel tasarımı önemli ölçüde etkilemesi olası değildir. İzofluran, yüksek frekanslı aktiviteyi önemli ölçüde azaltır²⁷. İzofluran maruziyeti görüntüleme periyodunun ötesine geçerse, SD'yi takiben yüksek frekanslı aktivite iyileşmesinin saptanmasını zorlaştırabilir. Bu nedenle, Şekil 2'de gösterildiği gibi, yüksek frekanslı aktivitenin geri kazanımını karşılaştırmak için deneysel tasarıma sahte veya izofluran tek başına bir grubun dahil edilmesi kritik öneme sahiptir. Diğer bir sınırlama, elektrofizyoloji kayıtlarının DC kaymasını algılamamasıdır. DC kaymasının genliği ve süresi, doku sağlığının ve SD^28'den iyileşmenin göstergeleridir. Bununla birlikte, SD'lerin bu tekniklerle doğrulanması, TBI araştırmalarına ilişkin değerli bilgiler sağlamaya devam edecektir.

Tüm TBI modellerinin yayılan depolarizasyonlar (SD'ler) üretmesi kuvvetle muhtemel olduğundan, tüm TBI araştırmacıları burada açıklanan tekniklerden faydalanacaktır. TBI alanı, SD'lerin yaralanma, yaralanma ilerlemesi, nöroimmün aktivasyon ve iyileşmedeki rolünün anlaşılmasından önemli ölçüde kazanç sağlayacaktır. Son araştırmalar, SD'lerin davranışsal eksikliklere katkıda bulunduğunu ve nörolojik bozukluğun altında yatan bir mekanizma olabileceğini düşündürmektedir ^5,7. Bu protokolde özetlenen teknikler, TBH ve SD arasındaki bağlantının aydınlatılmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniklerin gelecekteki uygulamaları inme, epilepsi ve migren dahil olmak üzere diğer araştırma alanlarına da uzanabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
# 00-90 x .118 Makine Vidası	ABD Mikro Vida	00.90-118-M-SS-P, Amazon
0.8 mm çaplı matkap	ucu PCB Matkap Ucu	WYTP21, Amazon
16-A Sahne Altı Intan		C3335
2.1 mm Çapak mikro matkap ucu	Güzel Bilim Araçları	19007-21
AC amplifikatör	Intan	RHD kayıt sistemi
C57BL / 6J fareler ve nbsp;	Jackson Laboratuvarı	Jax # 000664
CCD kamera	Mightex	TCE-1304-U
Uzatma lensi	Zeikos	ZE-ETN
Ethiqa XR (yavaş salınan Buprenorfin)	Midwest Veteriner Malzemeleri	Ürün Numarası 267.10000.3
Altın konektör pimi (dişi)	A-M Sistemleri	520100
Altın konektör pimi (erkek)	A-M Sistemleri	520200
ImageJ2/Fiji	Resim J	NA
Çarpma Tertibatı Bir	Leica	39463930
LED panel kartı	Supon	L122t
MATLAB	MathWorks	Kurumsal veya bireysel aktivasyon kodu
Tıbbi sınıf siyanoakrilat yapıştırıcı	MasterBond	MB287
Mikro Yönetici Kamera Yazılımı	Image J	NA
Tırnak matkabı / parlatıcı	Makartt Tırnak Matkap Elektrikli Tırnak Törpüsü	JD700
Omnetic konektörler	Omnetics	A79014-001
RHX Veri Toplama Yazılımı	Intan	NA
Paslanmaz Çelik kaplamasız tel (0.005 ")	A-M Sistemleri	792800
Stereotaksik Çerçeve	Kopf Aletleri	1923-B
Teets 'soğuk kürlenen' diş çimentosu	A-M sistemleri	525000, 526000
XLR kamera objektifi	Nikon	NIKKOR 50 mm f/1.8-16