Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare Beyninden Toksinlerin Lenfatik Uzaklaştırılmasının Uyarılması için Uykunun Elektroensefalografik Kontrolleri Altında Fotobiyomodülasyon

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67035

⸱

28 Haziran 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Saratov State University, 2Institute of Physics, Department of Optics and Biophotonics, Saratov State University, 3Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, doğal derin uyku sırasında yaşlı ve anestezi uygulanmamış BALB/c erkek farelerin beyninden toksinlerin (örneğin, çözünür amiloid beta) lenfatik olarak uzaklaştırılması için elektroensefalografik kontrol altında transkraniyal fotobiyomodülasyonun non-invaziv ve taşınabilir teknolojisini sunmaktadır.

Özet

Meningeal lenfatik damarlar (MLV'ler), toksinlerin beyinden atılmasında önemli bir rol oynar. Alzheimer ve Parkinson hastalıkları, beyin tümörleri, travmatik beyin yaralanmaları ve intrakraniyal kanamalar dahil olmak üzere MLV anormallikleri ile ilişkili çeşitli beyin hastalıklarının tedavisinin ilerlemesinde MLV fonksiyonlarının uyarılması için yenilikçi teknolojilerin geliştirilmesi umut verici bir yöndür. Uyku, beynin drenaj süreçlerinin en aktif olduğu doğal bir durumdur. Bu nedenle, uyku sırasında beynin drenajının ve MLV'lerin uyarılması en belirgin terapötik etkilere sahip olabilir. Ancak, bu tür ticari teknolojiler şu anda mevcut değildir.

Bu çalışma, uykunun elektroensefalografik (EEG) kontrolü altında, toksinlerin (örneğin, çözünür amiloid beta (Aβ)) yaşlı BALB/c farelerinin beyninden foto-stimülasyonunu foto-stimülasyon etmek için tasarlanmış yeni bir taşınabilir transkraniyal fotobiyomodülasyon (tPBM) teknolojisi sunmaktadır. Teknoloji, farelerin motor aktivitesini koruyarak anestezi olmadan bir ev kafesinin doğal durumunda kullanılabilir. Bu veriler, MLV fonksiyonlarında ve beynin drenaj süreçlerinde yaşa bağlı değişikliklerin düzeltilmesi ve beyin dokularının metabolitlerden ve toksinlerden etkili bir şekilde temizlenmesi için non-invaziv ve klinik olarak umut verici foto teknolojilerin geliştirilmesi için yeni umutlar açmaktadır. Bu teknoloji, hem uyuyan beynin işlevlerinin klinik öncesi çalışmaları hem de uyku ile ilgili beyin hastalıkları için klinik olarak ilgili tedaviler geliştirmek için tasarlanmıştır.

Giriş

Meningeal lenfatik damarlar (MLV'ler), beyin dokularından toksinlerin ve metabolitlerin uzaklaştırılmasında önemli bir rol oynar 1,2,3. Tümörler, travmatik beyin yaralanmaları, kanamalar ve nörodejeneratif süreçler dahil olmak üzere çeşitli beyin hastalıklarında MLV'lerin hasarına, bu patolojilerin ilerlemesine yol açan MLV fonksiyonlarında bir azalma eşlik eder 1,2,3,4,5,6. Bu nedenle, MLV'lerin uyarılması için yöntemlerin geliştirilmesi, beyin hastalıklarının tedavisi için etkili teknolojilerin ortaya çıkmasında yeni ufuklar açmaktadır. Son zamanlarda, etkili transkraniyal fotobiyomodülasyon (tPBM) için non-invaziv teknoloji, MLV'leri uyarmak ve kan ve Aβ gibi toksinleri beyinden uzaklaştırmak için önerilmiştir 5,7,8,9,10,11,12. Derin uykunun beyindeki lenfatik drenaj süreçlerinin aktivasyonu için doğal bir faktör olduğunu belirtmek ilginçtir13,14. Bu gerçeğe dayanarak, uyku sırasında MLV'lerin tPBM'sinin uyanıklık 9,11,12,15 sırasındakinden daha etkili terapötik etkilere sahip olabileceğini varsaymak mantıklıdır. Bununla birlikte, şu anda uyku sırasında tPBM için ticari bir teknoloji yoktur16. Ek olarak, tPBM'nin terapötik etkilerini incelemek için hayvan deneyleri, beyne ışığı doğru bir şekilde iletmek için gerekli olan anestezi altında gerçekleştirilir. Bununla birlikte, anestezi beynin drenajını önemli ölçüde etkiler ve bu da araştırma sonuçlarının kalitesini düşürür17.

Aβ, normal nöral aktivitenin metabolik bir ürünüdür18. Kültürlenmiş sıçan kortikal nöronlarında kurulduğu gibi, Aβ onlardan hücre dışı boşluğa yüksek oranlarda salınır (Aβ için 2-4 molekül / nöron / s)19. Hücre dışı ve perivasküler boşluklarda bulunan çözünmüş Aβ formunun nöronlar ve sinapslar20 için en toksik olduğuna dair kanıtlar vardır. Çözünür Aβ, 1-2.5 saat21 sırasında insan beyninden hızla temizlenir. MLV'ler, yaşla birlikte azalan ve yaşlı beyinde Aβ birikimine yol açan çözünür Aβ'nınbeyinden 1,7 uzaklaştırılması için tünellerdir 1,22. Beyindeki Aβ seviyelerinin hücre dışı anormalliklerinin yaşlanmadaki bilişsel performansla ilişkili olduğuna ve Alzheimer hastalığının (AD) gelişimi ile ilişkili olduğuna dair kanıtlar vardır23,24. Bu nedenle, yaşlı ve yaşlı kemirgenler, AD25,26 dahil olmak üzere amiloidoz çalışması için transgenik modellere alternatif olarak kabul edilir.

Bu çalışma, Aβ'nın beyinden periferik lenfatik sisteme (derin servikal lenf düğümleri, dcLN'ler) lenfatik klirensini uyarmak için farklı yaşlardaki anestezi uygulanmamış erkek BALB/c farelerinde derin veya hızlı olmayan göz hareketi (NREM) uykusunun elektroensefalografik (EEG) kontrolü altında orijinal ve taşınabilir bir tPBM teknolojisi sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm prosedürler, "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu", Bilimsel Amaçlarla Kullanılan Hayvanların Korunmasına İlişkin 2010/63/EU sayılı Direktif ve Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğretim Bakanlığı'nın (13.11.1984 tarihli 742 sayılı Sayılı) Saratov Devlet Üniversitesi Biyoetik Komisyonu tarafından onaylanan yönergelerine (Protokol No. 7, 22.09.2022).

1. Donanım montajı

  1. 1,5 mm x 2 mm boyutlarında 1,5 mm kalınlığında bir folyo textolite parçası kesin. Bu bölüm, ışık yayan diyot (LED) baskılı devre kartı (PCB) olarak anılacaktır (Şekil 1C).
  2. Şekil 1'de gösterildiği gibi bir LED'i bir PCB'ye lehimleyin.
  3. İki telli bakır teli bir LED'in pimlerine lehimleyin ve ardından bunları bir manşonla örtün.
  4. Çerçevenin 3B modelini yazdırın (Şekil 1A); çerçeveye bir LED (Şekil 1B) ve mıknatıslar (Şekil 1D) yerleştirin; farenin kafasına bir rondela (Şekil 1E) yerleştirin.
  5. Devreyi monte etmek için (Şekil 2), aşağıdaki adımları izleyin.
    1. İlk olarak, direnci bağlayın (Şekil 2; R1) Arduino üzerinde bir LED anot ile 5 V bağlantı noktası arasında.
    2. Ardından, metal oksit yarı iletken alan etkili transistöre (MOSFET) bir LED katot bağlayın (Şekil 2; Q1) boşaltın. Ardından MOSFET kaynağını toprağa bağlayın.
    3. Aşağı çekme direncini bağlayın (Şekil 2; R2) MOSFET kapısı ile toprak arasında. Son olarak, MOSFET kapısını Arduino üzerindeki pin 3'e bağlayın.
  6. Arduino'ya bir sıvı kristal ekran (LCD) tuş takımı kalkanı bağlayın.
  7. Kılıfın, kapak plakasının ve düğmelerin 3B modellerini yazdırın. LCD tuş takımı kalkanı, MOSFET ve LED konektörlü Arduino kartını Şekil 3'te gösterildiği gibi kasaya yerleştirin.

2. Yazılım kılavuzu (Şekil 4)

  1. Arduino taslağını (.ino dosyası) indirin ve Arduino entegre geliştirme ortamı (IDE) (Ek Kodlama Dosyası 1) aracılığıyla açın.
  2. Doğru iletişim (COM) bağlantı noktasını seçin ve bellenimi flaşlayın.
  3. Arayüz iki sütun içerir. Bu sütunlar arasında gezinmek için Sol ve Sağ düğmelerini kullanın. Seçim göstergesi sütunun solunda bulunur.
  4. Ekranın sol tarafındaki sütun, darbe genişlik modülasyonu (PWM) görev döngüsü seçim alanıdır. Görev döngüsünü ayarlamak için Yukarı ve Aşağı düğmelerini kullanın. 17 dakikalık bir seansta karşılık gelen %2/%4/%6 PWM görev döngüsü ile 10/20/30 Dj/cm2 PBM dozuna ulaşın.
  5. Ekranın sağ sütunu RUN/Off alanıdır. Bu sütunu seçmek için, tuş takımındaki Sağ düğmeye basın ve ardından Seç'e basın. İşlem çalışırken, etkinlik göstergesi yanıp sönecek ve ÇALIŞTIR düğmesindeki metin KAPALI olarak değişecektir.
    NOT. Fareler, EEG elektrotlarının implantasyonu, floresan Aβ enjeksiyonu için sağ lateral ventriküle kronik bir kateterin implantasyonu ve PBM için bir plakanın yerleştirilmesi dahil olmak üzere 10 günlük bir süre boyunca deneyler için hazırlanır.

3. EEG kayıt sisteminin implantasyonu (Şekil 5)

  1. Fareyi tartın ve uyluğa intramüsküler enjeksiyon yoluyla Zoletil 100 ve Xylanite (sırasıyla 100 mg / kg; 10 mg / kg) karışımı ile uyuşturun.
  2. Arka ayak geri çekilme refleksleri ve kuyruk sıkışma tepkisi durduğunda, fareyi bir ısıtma yastığı üzerinde stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin (Şekil 5A).
  3. Ameliyat sırasında gözbebeklerinin kurumasını önlemek için göz kapaklarına oftalmik merhem sürün. Gerektiğinde bu prosedürü tekrarlayın.
  4. Bir tıraş makinesi kullanarak burun kemiklerinden oksipital kemiklere kadar olan bölgedeki başı tıraş edin ve açıkta kalan cildi önce alkolle sterilize edin.
  5. Düz diseksiyon makası kullanarak kafa derisini kesin, mikro forseps ile tutun, kafatasını fasyadan temizleyin ve pamuklu çubuklarla kurulayın. Gerekirse, hemostatik ajanları kullanın.
  6. 1,3 mm çapında bir matkap kullanarak, koordinatlar boyunca her iki taraftaki temporal kemiklerde 2 delik açın: ilk vida çifti için AP = -1 mm ve ikinci vida çifti için AP = -3 mm.
  7. EEG vidalarını tel uçlu olarak 5 dakika boyunca alkole yerleştirin. Daha sonra, EEG vidalarını salin solüsyonuna yerleştirin.
  8. Elektrotlu dört gümüş kaplama vidayı 1 mm derinliğe kadar deliklere yerleştirin (Şekil 5B).
  9. Vidaları, onlardan uzanan elektrotlar hayvanın burnuna doğru yerleştirilecek şekilde dental akrilik kullanarak kafatasının yüzeyine sabitleyin (Şekil 5C). Diş akriliğinin 15 dakika sertleşmesine izin verin.
  10. Dental akrilik kullanarak hayvanın burnuna bir EEG kayıt sensörü takın. Diş akriliğinin 30 dakika sertleşmesine izin verin (Şekil 5D).
  11. EMG elektrotlarını kavisli cımbız kullanarak orbicularis oculi kasının arkasına yerleştirin ve diş akrilik ile sabitleyin. Diş akriliğinin 15 dakika sertleşmesine izin verin (Şekil 5E).
  12. EEG elektrotlarını sensörün gümüş kaplama girintisine bağlayın ve bir lehimleme istasyonu kullanarak lehimleyin. Daha sonra, dental akrilik kullanarak EEG elektrotlarını sabitleyin (Şekil 5F).
  13. Ameliyattan sonra, hayvan anesteziden tamamen iyileşene kadar vücut ısısını korumak için fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin.
  14. Daha sonra, fareyi ameliyattan sonra 10 gün boyunca analjezi için ibuprofen (200 mL suda 40 mg / kg) ile yiyecek ve suya ücretsiz erişimi olan ayrı bir ev kafesine koyun.

4. PBM için bir plakanın implantasyonu

  1. Fareyi tartın ve EEG kayıt sisteminin implantasyonundan 7 gün sonra uyluğa intramüsküler enjeksiyonla Zoletil 100 ve Xylanite (sırasıyla 100 mg / kg; 10 mg / kg) karışımı ile uyuşturun.
  2. Arka ayak geri çekilme refleksleri ve kuyruk sıkışma tepkisi durduğunda, fareyi stereotaktik bir sisteme sabitleyin.
  3. Ameliyat sırasında gözbebeklerinin kurumasını önlemek için göz kapaklarına oftalmik merhem sürün. Gerektiğinde bu prosedürü tekrarlayın.
  4. Diş akrilik ve Dumont forseps kullanarak kafatasının oksipital kemiğine 5 mm çapında metal bir plaka sabitleyin. Diş akriliğinin 15 dakika sertleşmesine izin verin (Şekil 6).

5. Kronik bir kateterin hazırlanması

  1. İnsülin iğnesi üzerinde, eğimli ucun yanından 2 cm uzakta bir segment işaretleyin.
  2. İnsülin iğnesini, eğimli ucun yanından işaretli segmente kadar iğne tutucusuna sabitleyin.
  3. İğnenin kalan tüm uzunluğu boyunca 2 cm-PE-10 polietilen kateter yerleştirin.
  4. Kateteri tuzlu su çözeltisiyle doldurun ve kapatmak için plastik bir kapakla örtün.

6. Sağ lateral ventrikül içine kronik bir kateter implantasyonu

  1. PBM için plakanın implantasyonundan sonra, bir matkap kullanarak AP = -0.5 mm ve ML = 1.2 mm koordinatlarında, 1.5 mm çapında bir trepanasyon deliği açın.
  2. PE-10 polietilen kateteri stereotaktik bir tutucuya yerleştirin ve fare kafatasına yerleştirin (DV = 2 mm). Daha sonra diş akrilik kullanarak sabitleyin. Diş akriliğinin 15 dakika sertleşmesine izin verin (Şekil 7).
  3. Ameliyattan sonra, hayvan anesteziden tamamen iyileşene kadar vücut ısısını korumak için fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin.
  4. Daha sonra, fareyi ameliyattan sonra 10 gün boyunca analjezi için ibuprofen (200 mL suda 40 mg / kg) ile yiyecek ve suya ücretsiz erişimi olan ayrı bir ev kafesine koyun.

7. NREM uykusunun EEG kontrolü altında tPBM

  1. Herhangi bir ticari EEG kayıt sistemini farenin kafasındaki konektöre bağlayın ve PWM görev döngüsünün gereksinim değerini ayarlayın.
  2. EEG sinyalini izleyin ve delta ritim aktivitesini bekleyin. NREM uykusu görülürse, PBM işlemini başlatın ve NREM uykusu hızlı göz hareketi (REM) uykusuna veya uyanıklığa geçerse işlemi durdurun. Doz, gerekli değere ulaşana kadar her etkileşimde artar.
  3. Gerekli PBM dozu elde edildiğinde seans sona erer.

8. Fare beyninden Aβ'nın lenfatik olarak çıkarılmasının konfokal görüntülenmesi

  1. İnsülin iğnesine 10 cm'lik bir kateter bağlayın.
  2. 29 G iğneli bir Hamilton şırıngası kullanarak, katetere 5 μL'lik bir hacimde bir floresan beta-amiloid (FAβ) infüzyonu hazırlayın. Kateterin bir Hamilton şırıngasında kalmasına izin verin.
  3. Farenin elini sabitleyin ve kateteri bir iğne aracılığıyla implante edilen kronik katetere bağlayın.
  4. Kateteri bir mikroenjektöre bağlayın. Daha sonra, fareyi ayrı bir kutuya yerleştirin;
  5. Mikroenjektör menüsünde enjeksiyon hızı 0.1 μL/dk'yı seçin ve Başlat düğmesine basın.
  6. Sağ lateral ventriküle FAβ enjeksiyonu yapın.
  7. FAβ uygulamasından sonra, algoritmayı izleyerek 61 dakika boyunca bir LED kullanarak PBM yapın: 17 dakika - ışık ve 5 dakika - 61 dakikadan fazla duraklayın.
  8. PBM'den sonra, serebral damarları kuyruk yoluyla etiketlemek için intravenöz olarak herhangi bir izleyici enjekte edin.
  9. Enjeksiyondan sonra, CO2 ötenazi odasını kullanarak farelere ötenazi yapın.
  10. Keskin, düz bir makas kullanarak, trakea boyunca deride küçük bir enine kesi yapın ve cildi düz keskin olmayan cımbızla tutun.
  11. Düz makas kullanarak boynun tüm uzunluğu boyunca uzunlamasına bir kesi yapın.
  12. Kavisli cımbız kullanarak tükürük bezlerini alın ve bunları bağ dokusundan dikkatlice ayırın. Kesiğin açık kısmına bir yara ekartörü yerleştirin ve çevredeki dokuları geri itecek şekilde sabitleyin.
  13. Boynun her iki tarafından iki kavisli cımbız kullanarak trakea ve kleidomastoid kas arasındaki alanı inceleyin.
  14. Her iki tarafta derin servikal lenf nodu (dcLN) tespit edildiğinde, künt uçlu düz cımbız kullanarak dcLN'leri çıkarın ve bağ dokusundan kesin.
  15. DcLN'leri tuzlu su çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin ve yatay olarak yönlendirilmiş kapak camı (25 mm × 50 mm × 0,17 mm) ile örtün.
  16. Tüm dcLN'lerin görüntülerini elde etmek için herhangi bir ticari konfokal mikroskop kullanın.

9. Beyin dokularının lizatlarında Aβ analizi

  1. Numuneleri tahlil için hazırlayın.
    1. CO2 ötenazi odasını kullanarak farelere ötenazi yapın.
    2. Farenin kafasını kesin, cildi kafasından çıkarın ve kasları kafatasından çıkarın.
    3. Büyük oksipital foramenden işitme kanalına kadar keskin, düz bir makasla iki kesi yapın.
    4. Düz cımbız kullanarak kafatasının ventral kısmını, oksipital kemiği ve orta kulak boşluklarını oluşturan kemikleri ayırın.
    5. Cımbız kullanarak beyni parietal ve frontal kemiklerden ayırın.
    6. Düz makas kullanarak üst çeneyi çıkarın ve koku alma ampullerini kesin.
    7. Beyni fizyolojik çözeltiye yerleştirin.
    8. Fazla kanı iyice çıkarmak için beyni soğuk fosfat tamponlu tuzlu suda durulayın ve homojenizasyondan önce tartın.
    9. Taze hazırlanmış bir proteaz inhibitör karışımı ile 1,5 mm KH2PO4, 8 mm Na2HPO4, 3 mm KCl, 137 mm NaCl ve% 0,1 Tween20, 10 mM EDTA içeren bir parçalama tamponu pH 7.2 hazırlayın.
    10. Beyni taze lizis tamponunda (200-500 mg doku örneği için 1 mL lizis tamponu) buz üzerinde bir cam homojenizatör ile homojenize edin.
    11. Çözelti netleşene kadar elde edilen bir süspansiyonu ultrasonik bir hücre bozucu ile sonikleştirin.
    12. Homojenatları 10.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    13. Süpernatanı tek kanallı bir mekanik pipet (100-1000 μL) kullanarak toplayın ve hemen veya alikot edin ve ≤-20 °C'de saklayın.
  2. Aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: 450 nm ± 10 nm filtreli mikroplaka okuyucu; mikrosantrifüj tüpleri; yüksek hassasiyetli ve tek kullanımlık uçlara sahip tek veya çok kanallı pipetler; mikroplakayı lekelemek için emici kağıt; yıkama çözeltisi için kap; 0,01 mol/L (veya 1x) fosfat tamponlu salin (PBS); ve deiyonize veya damıtılmış su.
  3. Reaktifleri hazırlayın.
    1. Kitin bileşenlerini ve s'yi getirinampkullanmadan önce oda sıcaklığına (RT; 18-25 °C).
    2. Standardı 1.0 mL standart seyreltici ile sulandırın, RT'de 10 dakika tutun ve hafifçe çalkalayın (köpürmeyin). Standart stok çözeltisi 300 pg/mL'dir. 0.6 mL standart seyreltici hacmi içeren 5 tüp hazırlayın ve üçlü bir seyreltme serisi yapın.
    3. Seyreltilmiş standardın 5 noktasını (300 pg / mL, 100 pg / mL, 33.33 pg / mL, 11.11 pg / mL ve 3.70 pg / mL) ve son tüpleri yalnızca standart seyreltici (0 pg / mL) içeren boş olarak ayarlayın.
    4. Kullanmadan önce Algılama reaktifi A ve Algılama reaktifi B'nin stok çözeltilerini hızla azaltın. Çalışma konsantrasyonunu hazırlamak için Test Seyreltici A ve B ile 100 kat seyreltin.
    5. 600 mL yıkama solüsyonu (1x) yapmak için 20 mL konsantre yıkama solüsyonunu (30x) 580 mL deiyonize veya damıtılmış su ile seyreltin.
    6. Çözeltinin gerekli dozajını sterilize edilmiş uçlarla aspire edin ve kalan çözeltiyi tekrar şişeye dökmeyin.
  4. Testi gerçekleştirin.
    1. Seyreltilmiş bir standart, boş ve numune için kuyucukları belirleyin.
    2. Standart noktalar için 5 kuyu ve boş için bir kuyu hazırlayın.
      1. İlgili kuyucuklara sırasıyla standart, boş ve numune seyreltmelerinin her birine 50 μL ekleyin. Ardından, hemen her bir kuyucuğa 50 μL Algılama reaktifi A ekleyin.
      2. Plakayı hafifçe sallayın (bir mikroplaka çalkalayıcı önerilir) ve bir plaka kapatıcı ile örtün. Plakayı 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Algılama reaktifi A bulanık görünebilir. Çözeltiyi RT'ye ısıtın ve homojen görünene kadar hafifçe karıştırın.
    3. Solüsyonu aspire edin ve her bir kuyuyu bir fışkırtma şişesi, çok kanallı pipet, manifold dağıtıcı veya otomatik yıkayıcı yardımıyla 350 μL 1x yıkama solüsyonu ile yıkayın. Plakayı 1-2 dakika rahatsız etmeden bırakın. Kalan sıvıyı tüm kuyucuklardan tamamen çıkarmak için plakayı emici kağıda oturtun. Bu işlemi 3 kez tekrarlayın.
    4. Son yıkamadan sonra, kalan yıkama tamponunu aspire edin veya boşaltın. Plakayı ters çevirerek ve emici kağıda sürerek yıkama solüsyonunun tamamen çıkarıldığından emin olun.
    5. Her bir oyuğa 100 μL Algılama reaktifi B çalışma solüsyonu ekleyin ve plakayı plaka kapatıcı ile kapladıktan sonra 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    6. Aspirasyon/yıkama adımlarını toplam 5 dakika boyunca tekrarlayın.
    7. Her bir oyuğa 90 μL substrat çözeltisi ekleyin ve plakayı yeni bir plaka kapatıcı ile örtün. Işıktan koruyarak 37 ° C'de 10-20 dakika inkübe edin (30 dakikayı geçmeyin). Substrat çözeltisini ekledikten sonra sıvı maviye dönecektir.
    8. Reaksiyonu sonlandırmak için her oyuğa 50 μL'lik bir durdurma çözeltisi ekleyin. Durdurma solüsyonunun eklenmesi sıvıyı sarıya çevirecektir. Sıvıyı karıştırmak için plakayı yan tarafına hafifçe vurun. Renk değişimi tutarsızsa, iyice karıştırmayı sağlamak için plakaya hafifçe vurun.
    9. Plakanın altındaki suyun ve parmak izinin tamamen çıkarıldığından ve sıvı yüzeyinde kabarcık oluşmadığından emin olun. Ardından, plakayı hemen 450 nm'de bir mikroplaka okuyucuda okuyun.
  5. Sonuçları hesaplayın.
    1. Her standart, kontrol ve numune için yinelenen okumaların ortalamasını belirleyin. Y ekseninde Aβ 1-42 konsantrasyonu ve x ekseninde absorbans günlüğü ile standart bir eğri çizin.
    2. Regresyon analizi ile belirlenebilen noktalar arasında en uygun eğriyi çizin.
    3. Seyreltilmiş numuneler kullanılmışsa, standart eğriden elde edilen konsantrasyonu seyreltme faktörü ile çarpın.
      NOT: ELISA için bu çalışmada Aβ 1-42 tayini için bir kit kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İlk adımda, çalışma, uyanık yetişkin (2-3 aylık, 26-29 g) erkek BALB/c farelerinde floresan Aβ'nın beyinden dcLN'lere lenfatik olarak uzaklaştırılmasının uyarılması için etkili ışık dozunun (1050 nm LED) oluşturulmasına odaklanmıştır. Işık dozları 10 J/cm2, 20 J/cm2 ve 30 J/cm2 olarak rastgele seçildi ve tPBM'nin farklı boyaların ve kırmızı kan hücrelerinin beyinden uzaklaştırılması üzerindeki etkileri üzerine yaptığımız önceki çalışmalara dayanarak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

MLV'ler, özellikle MLV fonksiyonu azalan yaşlı deneklerde, beynin drenajının modülasyonu ve beyindeki hücresel kalıntıların ve atıkların uzaklaştırılması için yenilikçi teknolojilerin geliştirilmesi için önemli bir hedeftir 1,22. Homeostatik bir durumda, derin uyku, beyin dokusu temizliğinin doğal aktivasyonu ile ilişkilidir13,14. Bu nedenle, derin uyku sırasında MLV'lerin uyarılmasının uyanıklık sırasınd...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, Rusya Bilim Vakfı'ndan (No. 23-75-30001) bir hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.1 Tween20Helicon,  RusyaSB-G2009-100ML
KateterScientific Commodities Inc., ABDPE-10, 0,28 mm İç Çap ve süreler; 0,61 mm Dış Çap
CO2 odasıBağlayıcı, AlmanyaCB-S 170
Konfokal mikroskopNikon, JaponyaA1R MP
Dental akrilikZermack, Polonya-RusyaVillacryl S, V130V4Z05
DrillForedom, RusyaSR W-0016
Dumont forsepsStoelting, ABD52100-07
Evans Mavi boyaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD206334
HamiltonHamilton Bonaduz AG, İsviçre29 G iğne
IbuprofenSintez OJSC, RusyaN/A  Analjezik ilaç
İnsülin iğnesiINSUPEN, İtalya31 G, 0.25 mm x 6 mm
Levomekol antibakteriyel merhemNizhpharmD06C Günde 1 kez 40 mg / g dozunda harici kullanım için
Mikro forsepsStoelting, ABD52102-02P
MikrosantrifüjGyrozen, Güney KoreGZ-1312
MikroenjektörÇalma, ABD53311
Keskin olmayan cımbızçalma, ABD52108-83P
PINNACLE sistemiPinnacle Technology, ABD8400-K3-SLFarelerin EEG (2 kanal) ve EMG (1 kanal) kaydı için sistem
Tıraş makinesiBraunSerisi 3310s
Tek ve çok kanallı pipetlerEppendorf, AvusturyaEpp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Sodyum klorürKraspharma, RusyaN/A
Stereotaksik çerçeveÇalma, ABD51500
Düz diseksiyon makasıÇalma, ABD52132-10P
TetrasiklinJSC Tatkhimfarmpreparaty, RusyaN/AGöz merhemi
CımbızStoelting, ABD52100-03
Ultrasonik hücre bozucuBiobase, ÇinUSD-500
Yara ekartörüStoelting, ABD52125
XylanitNita-Farm, RusyaN/AKas gevşetici
Zoletil 100Virbac Sante Animale, FransaN/AGenel anestezi
Lehimleme istasyonu AOYUE, Çin N/A

Kaynaklar

  1. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  2. Chen, J., et al. Meningeal lymphatics clear erythrocytes that arise from subarachnoid hemorrhage. Nat Commun. 11, 3159(2020).
  3. Zou, W., et al. Blocking meningeal lymphatic drainage aggravates Parkinson's disease-like pathology in mice overexpressing mutated α-synuclein. Transl Neurodegener. 8, 7(2019).
  4. Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30 (3), 229-243 (2020).
  5. Dong-Yu, L., et al. Photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents for therapy of intraventricular hemorrhage. Nat Comm. 14 (1), 6104(2023).
  6. Bolte, A., et al. Meningeal lymphatic dysfunction exacerbates traumatic brain injury pathogenesis. Nat Commun. 11 (1), 4524(2020).
  7. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Mechanisms of phototherapy of Alzheimer's disease during sleep and wakefulness: the role of the meningeal lymphatics. Front Optoelectron. 16, 22(2023).
  8. Dongyu, L., et al. Photostimulation of lymphatic clearance of β- amyloid from mouse brain: new strategy for the therapy of Alzheimer's disease. Front Optoelectron. 16, 45(2023).
  9. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Mechanisms of phototherapy of Alzheimer's disease during sleep and wakefulness: the role of the meningeal lymphatics. Front Optoelectron. 16, 22(2023).
  10. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Intranasal delivery of liposomes to glioblastoma by photostimulation of the lymphatic system. Pharmaceutics. 15 (1), 36(2023).
  11. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Night photostimulation of clearance of beta-amyloid from mouse brain: New strategies in preventing Alzheimer's disease. Cells. 10 (12), 3289(2021).
  12. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Technology of the photobiostimulation of the brain's drainage system during sleep for improvement of learning and memory in male mice. Biomed Opt Express. 15 (1), 44-58 (2024).
  13. Fultz, N., et al. Coupled electrophysiological, hemodynamic, and cerebrospinal fluid oscillations in human sleep. Science. 366 (6465), 628-631 (2019).
  14. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
  15. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Phototherapy of Alzheimer's disease: Photostimulation of brain lymphatics during sleep: A systematic review. Int J Mol Sci. 24 (13), 10946(2023).
  16. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Brain waste removal system and sleep: Photobiomodulation as an innovative strategy for night therapy of brain diseases. Int J Mol Sci. 24 (4), 3221(2023).
  17. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Sci Adv. 5 (2), 5447(2019).
  18. Fukumoto, H., et al. Primary cultures of neuronal and non-neuronal rat brain cells secrete similar proportions of amyloid beta peptides ending at A beta40 and A beta42. Neuroreport. 10 (14), 2965-2969 (1999).
  19. Moghekar, A., et al. Large quantities of Abeta peptide are constitutively released during amyloid precursor protein metabolism in vivo and in vitro. J Biol Chem. 286 (16), 15989-15997 (2011).
  20. Wells, C., Brennan, S., Keon, M., Ooi, L. The role of amyloid oligomers in neurodegenerative pathologies. Int J Biol Macromol. 181, 582-604 (2021).
  21. Savage, M., et al. Turnover of amyloid beta-protein in mouse brain and acute reduction of its level by phorbol ester. J Neurosci. 18 (5), 1743-1752 (1998).
  22. Ahn, J., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
  23. Stevens, D., et al. Regional amyloid correlates of cognitive performance in ageing and mild cognitive impairment. Brain Commun. 4 (1), 016(2022).
  24. Ma, C., Hong, F., Yang, S. Amyloidosis in Alzheimer's disease: Pathogeny, etiology, and related therapeutic directions. Molecules. 27 (4), 1210(2022).
  25. Kobro-Flatmoen, A., Hormann, T., Gouras, G. Intracellular amyloid-β in the normal rat brain and human subjects and its relevance for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 95 (2), 719-733 (2023).
  26. Ahlemeyer, B., Halupczok, S., Rodenberg-Frank, E., Valerius, K., Baumgart-Vogt, E. Endogenous murine amyloid-β peptide assembles into aggregates in the aged C57BL/6J mouse suggesting these animals as a model to study pathogenesis of amyloid-β plaque formation. J Alzheimers Dis. 61 (4), 1425-1450 (2018).
  27. Zhinchenko, E., et al. Pilot study of transcranial photobiomodulation of lymphatic clearance of beta-amyloid from the mouse brain: Breakthrough strategies for nonpharmacologic therapy of Alzheimer's disease. Biomed Opt Express. 10 (8), 4003-4017 (2019).
  28. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Transcranial photobiomodulation of clearance of beta-amyloid from the mouse brain: Effects on the meningeal lymphatic drainage and blood oxygen saturation of the brain. Adv Exp Med Biol. 1269, 57-61 (2021).
  29. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photobiomodulation of lymphatic drainage and clearance: Perspective strategy for augmentation of meningeal lymphatic functions. Biomed Opt Express. 11 (2), 725-734 (2020).
  30. Zhinchenko, E., et al. Photostimulation of extravasation of beta-amyloid through the model of blood-brain barrier. Electronics. 9 (6), 1056(2020).
  31. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photostimulation of cerebral and peripheral lymphatic functions. Transl Biophotonics. 2 (1-2), e201900036(2020).
  32. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photomodulation of lymphatic delivery of liposomes to the brain bypassing the blood-brain barrier: New perspectives for glioma therapy. Nanophotonics. 10 (12), 3215-3227 (2021).
  33. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photomodulation of lymphatic delivery of Bevacizumab to the brain: The role of singlet oxygen. Adv Exp Med Biol. 1395, 53-57 (2022).
  34. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Transcranial photosensitizer-free laser treatment of glioblastoma in rat brain. Int J Mol Sci. 24 (18), 13696(2023).
  35. Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biol. 13, 39-59 (2017).
  36. Spitler, R., Berns, M. Comparison of laser and diode sources for acceleration of in vitro wound healing by low-level light therapy. J Biomed Opt. 19 (3), 038001(2014).
  37. Sato, K., Watanabe, R., Hanaoka, H., Nakajima, T., Choyke, P., Kobayashi, H. Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and Lasers in near infrared photoimmunotherapy. Oncotarget. 7 (12), 14324-14335 (2016).
  38. Keshri, G., Gupta, A., Yadav, A., Sharma, S., Singh, S. Photobiomodulation with pulsed and continuous wave near-infrared laser (810 nm, Al-Ga-As) augments dermal wound healing in immunosuppressed rats. PLoS One. 11 (11), e0166705(2016).
  39. Kim, H., et al. Pulse frequency dependency of photobiomodulation on the bioenergetic functions of human dental pulp stem cells. Sci Rep. 7 (1), 15927(2017).
  40. Chen, Z., et al. The pulse light mode enhances the effect of photobiomodulation on B16F10 melanoma cells through autophagy pathway. Lasers Med Sci. 38 (1), 71(2023).
  41. Mezey, E., et al. An immunohistochemical study of lymphatic elements in the human brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (3), e2002574118(2021).
  42. Chang, J., et al. Characteristic features of deep brain lymphatic vessels and their regulation by chronic stress. Research. 6, 0120(2023).
  43. Prineas, L. W. Multiple sclerosis: Presence of lymphatic capillaries and lymphoid tissue in the brain and spinal cord. Science. 203 (4385), 1123-1125 (1979).
  44. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Pilot identification of the Live-1/Prox-1 expressing lymphatic vessels and lymphatic elements in the unaffected and affected human brain. bioRxiv. , 458990(2021).
  45. Semyachkina-Glushkovskaya, O., Postnov, D., Kurths, J. Blood-brainbarrier, lymphatic clearance, and recovery: Ariadne's thread in labyrinths of hypotheses. Int J Mol Sci. 19 (12), 3818(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Fotobiyomodülasyon TedavisiMeningeal Lenfatik DamarlarEEG Uyku İzlemeBeyin DrenajıAmiloid Beta TemizliğiTranskranyal PBMKonfokal MikroskopiNREM Uyku StimülasyonuFare Beyni ToksinleriNon-İnvaziv Beyin Tedavisi
Fare Beyninden Toksinlerin Lenfatik Uzaklaştırılmasının Uyarılması için Uykunun Elektroensefalografik Kontrolleri Altında Fotobiyomodülasyon
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.