Yöntem makalesi

Retinylidene Proteininin Üretilmesinde A Vitamini Membran Reseptörleri ve Opsin Proteininin Ligandları ile Etkileşimlerinin İncelenmesi için Metodoloji

DOI:

10.3791/67036

⸱

4 Ekim 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences, University of Minnesota, 2High Throughput Screening Laboratory, Institute for Therapeutics Discovery & Development, University of Minnesota

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, A vitamini membran reseptörlerinin ve fotoreseptör opsin'in ilgili fizyolojik ligandları ile protein-ligand etkileşimlerini incelemek için iki kantitatif yöntem tanımlanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyetle alınan A vitamini / all-trans retinolün (ROL) vücut boyunca dağılımı, periferik dokularda retinoid fonksiyonunu sürdürmek ve görsel fonksiyon için retinylidene proteinini üretmek için kritik öneme sahiptir. RBP4-ROL, kanda bulunan retinol bağlayıcı protein 4 (RBP4) ile ROL kompleksidir. Karaciğerde Retinol Bağlayıcı Protein 4 Reseptörü 2 (RBPR2) ve gözde Retinoik Asit 6 Retinol (STRA6) tarafından imile edilen iki zar reseptörü dolaşım RBP4'ü bağlar ve bu mekanizma ROLÜ'nün hücrelere içselleştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Reseptör-ligand kinetiğini araştırmak için yöntemler oluşturmak, retinoid homeostazı için A vitamini reseptörlerinin fizyolojik fonksiyonunu anlamak için esastır. Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) deneylerini kullanarak, fizyolojik ligandı RBP4 ile A vitamini membran reseptörlerinin bağlanma afinitelerini ve kinetik parametrelerini analiz edebiliriz.

Bu metodolojiler, A vitamini eksikliğinin patolojik durumlarını anlamak için kritik olan RBPR2 ve STRA6'daki RBP4 bağlayıcı motiflerin yeni yapısal ve biyokimyasal bilgilerini ortaya çıkarabilir. Gözde, içselleştirilmiş ROL, retiniliden proteini rodopsin oluşturmak için fotoreseptörlerde opsine bağlanan görsel kromofor olan 11-cis retinal'e metabolize edilir. Işığın emilmesi, 11-cis retinalin cis-trans izomerizasyonuna neden olur, bu da rodopsinde konformasyonel değişikliklere ve ardından fototransdüksiyon kaskadının aktivasyonuna neden olur. Azalan serum ve oküler ROL konsantrasyonları, retiniliden protein oluşumunu etkileyebilir ve bu da rodopsin yanlış lokalizasyonuna, apoprotein opsin birikimine, gece körlüğüne ve fotoreseptör dış segment dejenerasyonuna neden olarak Retinitis Pigmentosa veya Leber Konjenital Amauroz'a yol açabilir.

Bu nedenle, retinadaki G proteinine bağlı reseptör opsin-11-cis retina kompleksini ölçmek için spektrofotometrik metodolojiler, yukarıda belirtilen patolojik durumlarda retina hücre dejenerasyonunun mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu kapsamlı metodolojilerle araştırmacılar, insanlarda görsel fonksiyonun sürdürülmesi için kritik olan fotoreseptörlerde retiniliden protein konsantrasyonlarının üretilmesi ve sürdürülmesi için kritik olan sistemik ve oküler retinoid homeostazın korunmasında diyetle alınan A vitamini tedarikini daha iyi değerlendirebileceklerdir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyetle elde edilen Vitamin A/all-trans retinol/ROL, görme fonksiyonunda rol oynayan önemli bir bileşendir 1,2. Diyetle alınan A vitamininin bir metaboliti olan kromofor 11-cis retinal, fotoreseptörlerde retiniliden proteini, rodopsin oluşturmak için G proteinine bağlı reseptör (GPCR) opsinine bağlanır. Işık göze düştüğünde, rodopsinin konfigürasyonu, 11-cis-retinal bileşeninin all-trans-retinal'e dönüştürülmesi yoluyla temel bir değişikliğe uğrar. Bu konfigürasyon değişikliği, çubuk fotoreseptörleri içinde bir fototransdüksiyon kaskadını tetikleyerek, ışığı bir elektrik sinyaline dönüştürür ve bu sinyal, optik sinir 3,4,5,6,7,8,9,10 aracılığıyla beyindeki görsel kortekse iletilir . Azalan serum ve oküler ROL konsantrasyonları, retiniliden protein oluşumunu etkileyebilir, bu da opsin yanlış lokalizasyonuna, apoprotein opsin birikimine, gece körlüğüne ve fotoreseptör OS dejenerasyonuna neden olarak körlüğe neden olabilen Retinitis Pigmentosa veya Leber Konjenital Amauroz'a yol açabilir 3,10.

All-trans retinol, diyetle alınan A vitamininin temel taşıma şeklidir ve tüm fonksiyonel retinoidlerin ve diyetle alınan A vitamini metabolitlerinin türetildiği kaynaktır. Karaciğer, diyetle alınan A vitamini depolaması için birincil organ olarak görev yapar. Hepatik retinol, retinol bağlayıcı protein 4 (RBP4) ile kompleksi olarak serum yoluyla taşınır. Esas olarak karaciğerde eksprese edilen RBP4, 11,12,13,14,15,16,17 dolaşımına giren retinol substratı ve transtiretin (TTR) ile bir holo-kompleks oluşturur. 1970'lerde RBP4 için bir hücre yüzeyi reseptörünün raporu, retinoidlerin hücrelerin içine ve dışına taşınmasına yardımcı olan zar taşıma proteinleri hipotezine yol açtı. RBP4'e bağlı retinol (RBP4-ROL) için hücre yüzeyi reseptörü, gözün retina pigment epitelinde (RPE) Retinoik Asit 6 Retinol (STRA6) tarafından STimüle edilmiş olarak tanımlandı. STRA6, dolaşım holo-RBP4 kompleksine bağlanır ve fotoreseptörler18,19 tarafından kullanılmak üzere RBP4'e bağlı retinol'ü RPE boyunca hareket ettirir. STRA6'daki mutasyonlar, azalmış oküler ROL konsantrasyonları ile ilişkili sayısız hastalığa ve fenotipe yol açabilir. Gelişim sırasında STRA6 mutasyonları, Matthew-Wood sendromu20,21,22,23,24,25,26,27 ile ilişkili fenotiplerle örtüşen anoftalmi, mikroftalmi ve diğer oküler olmayan semptomlara yol açabilir. STRA6, gözdeki RPE gibi farklı organ ve dokularda eksprese edilir, ancak tüm dokularda eksprese edilmez26,27. Retinoid depolamanın birincil bölgesi karaciğer olmasına rağmen, STRA6 karaciğerde eksprese edilmez.

Alapatt ve meslektaşları, Retinol Bağlayıcı Protein 4 Reseptörü 2'nin (RBPR2) RBP4'ü yüksek afinite ile bağladığını ve RPE28'deki STRA6'ya benzer şekilde karaciğerde RBP4'e bağlı retinolün alımından sorumlu olduğunu keşfettiler. RBPR2'nin STRA6 29,30,31 ile yapısal homolojiyi paylaştığı bildirilmiştir. RBP4'ün, RBPR294 ve STRA295 ile STRA296 arasında kısmen korunmuş bir amino asit bağlama alanı olan RBPR2 üzerindeki S2, Y6 veL29,30,31 kalıntılarına bağlanması önerilmektedir. Bu çalışmalardan, bir veya daha fazla hücre dışı bağlanma kalıntısı/alanı içeren STRA6 ve RBPR2 gibi A vitamini membran reseptörlerinin dolaşım RBP4-ROL ile etkileşime girdiği öne sürülmüştür. Bu nedenle membran reseptörleri, karaciğer ve göz gibi hedef dokulara ROL içselleştirmesi için dolaşım RBP4'e reseptör bağlanmasında önemli bir rol oynar.

Bu çalışmanın ilk bölümünde, iki A vitamini membran reseptörünün (RBPR2 ve STRA6) fizyolojik ligandları RBP431 ile etkileşimini araştırmak için Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) kullandık. Proteinin ligand komplekslerine bağlanma afiniteleri ve birleşme/ayrışma kinetiği, SPR kullanılarak gerçek zamanlı olarak ölçülebilir. Bu metodoloji, A vitamini eksikliğinin patolojik durumlarını anlamak için kritik olan RBPR2 ve STRA6'daki RBP4 bağlayıcı motifler hakkında kritik kinetik, yapısal ve biyokimyasal bilgiler sağlamayı amaçlamıştır31,32. Yukarıda bahsedildiği gibi, dolaşım ROL, fotoreseptörlerde retiniliden proteini, rodopsin oluşturmak için opsin'e bağlanan kromofor 11-cis retinalini oluşturmak için STRA6 aracılığıyla RPE'ye içselleştirilir33. Retinitis Pigmentosa veya Leber Konjenital Amaurosis oküler patolojik durumlarında indirgenmiş retinylidene proteini, rodopsin mekanizmalarını anlamak için kritik olan murin retinal lizatlarında GPCR-opsin ve ligand 11-cis retinal kompleksini ölçmek için spektrofotometri metodolojileri kullandık34. Genel olarak, bu protokoller, mutant RBP4, STRA6 veya RBPR2'nin sistemik ve oküler A vitamini homeostazını etkilemedeki fizyolojik sonuçlarını veya mutant rodopsin veya retinoid döngü proteinlerinin görsel işlev üzerindeki etkisini in vitro olarak incelemek için uygulanabilir35,36.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Yüzey plazmon rezonansı (SPR) metodolojisi

  1. Fare RBP4 proteininin hazırlanması ve saflaştırılması
    1. Tam uzunlukta fare RBP4 (msRBP4) cDNA (NCBI Referans Dizisi: NM_001159487.1) oluşturmak için astarlar tasarlayın. MSRBP4 cDNA'yı bir pET28a His-tag Kanamisine dirençli ekspresyon vektörüne klonlayın ve BL-21 DE3 hücrelerinde eksprese edin (Malzeme Tablosu).
    2. BL-21 DE3 yetkin hücrelerini (üreticinin protokolüne göre) bağlanmış msRBP4-pET28a vektörü ile dönüştürün ve ardından Kanamisin 50 μg/mL30,37 içeren Luria-Bertani (LB) et suyu Agar plakalarına plakalayın. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde inkübe edin ve ertesi gün pozitif koloniler için tarama yapın.
    3. Tek bir koloni seçin ve 50 μg/mL Kanamisin içeren 5 mL LB suyunda 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
    4. 50 μg / mL Kanamisin içeren 500 mL LB suyundaki ikincil kültür için,% 1 hacimce birincil kültür kullanın (adım 1.1.3'ten itibaren) ve 37 ° C'de 3-4 saat inkübe edin; Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu kontrol edin. İdeal olarak, gece boyunca 24 ° C'de 0,5 mM IPTG ile protein ekspresyonunu indüklemek için OD değeri 0,6 ile 1 arasındaysa devam edin.
    5. MSRBP4 ekspresyonunu ve stabilitesini optimize etmek için 0,1-1 mM ve 16-30 °C sıcaklık aralığında birden fazla IPTG konsantrasyonu kullanın.
    6. Kültürü (adım 1.1.5'ten itibaren) 16.000 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti buz üzerinde tutun.
    7. Peleti lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, %0.1 (h/h) Triton X-100, %10 Gliserol, 0.5 mM PMSF ve Proteaz İnhibitörleri [pH 8.0]) ile homojenize edin. 250 Watt çıkışlı ve% 40-50 20 kHz çıkış frekansına sahip bir homojenizatör kullanarak lizatı 15 s AÇIK ve 30 s KAPALI döngüsü için sonikleştirin. 5x tekrarlayın.
    8. Hücre kalıntılarını ve parçalanmamış hücreleri 20 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüjleme ile çıkarın. Lizatın süpernatantını tampon dengelenmiş bir nikel NTA kolonundan geçirin.
    9. Kolonu 30 mM imidazol içeren lizis tamponu (adım 1.1.8'den itibaren) ile yıkayın.
    10. Fraksiyonlarda, 250 mM imidazol içeren tampon kullanarak bağlı msRBP4 proteinini elüte edin. Ayrıştırılmış fraksiyonları çalıştırın ve protein miktarını metanol:su:asetik asit (45:45:10) çözeltisi içinde Coomassie Brilliant Blue R-250 ile boyanmış %12 SDS poliakrilamid jel ile görsel olarak izleyin ve Coomassie lekesi metanol:su:asetik asit (45:45:10) içermeyen çözelti ile lekeyi çıkarın.
    11. Kullanılmayan fraksiyonları bir araya getirin ve havuzlanan fraksiyonları 10 kDa MWCO'luk 10K diyaliz kaseti ile diyaliz edin.
    12. Diyalize edilen fraksiyonun kalitesini %12'lik bir SDS-PAGE jel üzerinde değerlendirin ve protein konsantrasyonunu ölçün.
      NOT: SPR analizinde Apo-RBP4 proteini kullanılmıştır. Holo-RBP4 (RBP4-retinol) oluşturmak için, başka bir yerde yayınlanan ayrıntılı protokollere bakın 36,37.
  2. RBPR2 ve STRA6 peptitlerinin RBP4 ile yapı ve etkileşim için Triptofan floresan testi ve dairesel dikroizm (CD) spektroskopisi ile ilk doğrulaması
    1. Triptofan floresan deneyi
      1. Tek tek peptitler ve proteindeki triptofan amino asit kalıntılarını belirlemek için rekombinant RBP4 proteininin ve RBPR2 ve STRA6'nın ayrı peptitlerinin yapısal bileşimini değerlendirmek için çevrimiçi protein bileşimi analiz aracını (https://web.expasy.org/protparam/) kullanın ve amino asit dizisini tek harfli koda yapıştırın.
      2. Hesaplama parametreleri düğmesine tıklayın ve triptofan (Trp) kalıntıları için amino asit bileşimini değerlendirin.
        NOT: Triptofan kalıntıları, analiz edilen tek tek peptitlerde veya proteinlerde bulunmalıdır.
      3. Tek tek RBPR2 ve STRA6 peptitlerini çeşitli mikromolar konsantrasyonlarda seyreltin ve oda sıcaklığında 96 oyuklu bir plakada 5 dakika boyunca 3 μg msRBP4 ile ayrı ayrı inkübe edin. Karışımı 290 nm'de heyecanlandırın ve emisyonu 300 nm'den 400 nm dalga boyuna kadar tarayın.
      4. Verileri Blank (yalnızca tampon, peptit ve protein yok) ve peptit kontrol koşulu (protein yok) ve çizim ile normalleştirin.
        NOT: Düşük ila yüksek peptit konsantrasyonuna maruz kaldığında triptofan floresan artışı, iki ayrı peptit ve RBP4 proteini arasında pozitif bir etkileşim olduğunu düşündürür.
    2. Dairesel dikroizm (CD) spektroskopisi
      1. Tek tek peptitleri ve rekombinant RBP4 proteinini 1x PBS tamponu, pH 7.0 içinde seyreltin. Aşağıda açıklandığı gibi bir kalite kontrolü için 0,1 ila 10 μg/mL arasında çeşitli konsantrasyonlarda RBPR2 ve STRA6 peptitleri ve RBP4 proteini kullanın.
      2. 0,1 cm yol uzunluğunda bir küvete tek tek seyreltilmiş peptitler ve protein ekleyin ve bir CD spektrofotometresi (195-250 nm) kullanarak CD absorbansını / eliptikliğini ölçün. Ortalama kalıntı eliptikliğini (θ) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın.
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S, mθ cinsinden CD sinyalini temsil eder; mRw, ortalama kalıntı kütlesini temsil eder; c, proteinin mg/mL cinsinden konsantrasyonunu temsil eder; ve L, cm cinsinden yol uzunluğunu temsil eder.
      3. CD Spektroskopisi ile Protein Kıvrımı Tahminine BeStSel İkincil Yapı Analizini kullanarak molekül yapısındaki yüzde değişimi hesaplayın (https://bestsel.elte.hu).
        NOT: İkincil yapı, etkileşim çalışması ve etkileşimlerin sonucu için çok önemli olan uygun katlama ve korunmuş onayları gösterir. Etki alanının öngörülen yapısını inceleyin ve etkileşim etüdü ile daha fazla ilerleyin.

2. A vitamini membran reseptörlerinin (RBPR2 ve STRA6) fizyolojik ligandları RBP4 ile bağlanma afinitelerini ve kinetik parametrelerini belirlemek için SPR analizi

  1. RBP4'ün CM5 Çip yüzey kurulumunda immobilizasyonu için, altın bir yüzeye kovalent olarak tutturulmuş ~ 100 nm boyutuna uzatılmış bir karboksimetil dekstran bağlayıcı taşıyan SPR sensör çipini kullanıyoruz. 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC) varlığında, N-hidroksisüksinid (NHS), çipin yüzeyindeki karboksil gruplarını, amino asitlerin ve proteinlerin amin grupları ile kendiliğinden reaksiyona giren N-Hidroksisüksinamid esterlere dönüştürür ve ligandı çipin yüzeyine kovalent olarak bağlanmaya zorlar (Malzeme Tablosu).
    1. Saflaştırılmış msRBP4 proteinini Sensör çipi üzerinde hareketsiz hale getirin (Şekil 1 ve Şekil 2). Yazılım Çalıştır menüsünde, Sihirbazı seçin ve immobilizasyon seçeneğine devam edin. Ligandı (adım 1.1'den elde edilen msRBP4 proteini) immobilizasyon tamponunda (10 mM Sodyum asetat tamponu, pH 5.0) 10 μg / mL'ye (4 μL ligand + 396 μL tampon) seyreltin ve birleştirme reaktiflerini şişelerde alikotlayın. Yazılım kontrolünden İmmobilizasyon Kurulum sihirbazı penceresini açın, CM5 Çipi'ni seçin ve kinetik etütte 30 RU Rmax elde etmek için Akış hücresi 2'yi ve hedef seviye 1.200 Yanıt Birimi (RU) seçeneğini belirleyin ve Yıkama solüsyonu: Etanolamin. RBP4 adını girin ve İleri'ye tıklayın.
      NOT: İsteğe bağlı: Daha önce çalışan tampon PBST (%0,05 Tween 20 deterjan çözeltisi içeren fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi) ile astarlama yapıldıysa, çalıştırmadan önce astarlama seçeneği için Sistem Hazırlıkları iletişim kutusu gerekli değildir.
    2. Raf konumu iletişim kutusunda, Rafı Çıkar'ı tıklatın. Rafı alın ve her reaktif için atanmış hacimlere sahip şişeleri yerleştirin: 156 μL msRBP4, 177 μL etanolamin, 89 μL EDC, 89 μL NHS ve boş bir şişe. Numune şişelerinin bulunduğu rafı yerleştirin ve Tamam ve İleri'ye tıklayın.
    3. Prepare Run Protocol (Çalıştırma Protokolünü Hazırla) iletişim kutusunda, Start (Başlat) ve Save (Kaydet) öğesine tıklayın.
  2. RBPR2 ve STRA6 peptitleri kinetik test kurulumu
    1. Fare RBPR2, mutant RBPR2 ve STRA6 peptitlerini (daha önce31 kimyasal olarak sentezlenmiş ve Malzeme Tablosunda listelenmiştir) 0.8-26.6 μM aralığında çalışan tamponda seri olarak seyreltin.
    2. Kontrol yazılımını açın ve Kinetik/Benzeşim sihirbazı'nı seçin. Dosya | Şablonu açın ve Kinetik/Benzeşim'i seçin. Enjeksiyon dizisi iletişim kutusu akış yolunu 2-1 girin (aktif olarak Akış hücresi 2 ve referans olarak Akış hücresi 1), Çip Tipi CM5'i kontrol edin ve İleri'ye tıklayın. Kurulum iletişim kutusunda, Başlangıç döngülerini çalıştır seçeneğini işaretleyin, Solution: buffer and cycles: girin ve İleri'ye tıklayın.
    3. Enjeksiyon parametreleri iletişim kutusunda, numune parametreleri için değerleri girin: temas süresi: 120 s, akış hızı 30 μL/dak, Ayrışma süresi 300 s; rejenerasyon parametreleri için: Rejenerasyon çözeltisi adını girin: Glisin-HCl (pH 2.5), temas süresi: 30 s, akış hızı: 30 μL/dak ve İleri'ye tıklayın.
    4. Örnekler iletişim kutusunda, peptitlerin adını, moleküler ağırlığını ve konsantrasyonlarını girin ve ileri'ye tıklayın. Raf konumu iletişim kutusunda, seyreltilmiş peptitleri 1 ila 100 μM ve ~230 μL Tampon, ~120 μL Tampon ve ~1.000 μL Glisin, pH 2.5 gibi çeşitli konsantrasyonlarda ayrı ayrı ~120 μL numuneler olarak Raf üzerindeki konumlara atayın. Rafı Çıkar'a tıklayın ve tüm şişeleri yerleştirin. İleri'ye tıklayın ve Çalıştırma Protokolünü Hazırla iletişim kutusunda Başlat'a tıklayın, bir dosya adı girin ve Kaydet'e tıklayın (Şekil 2).
    5. Yazılımda, Başlat menüsüne tıklayın ve Değerlendirme'yi seçin. Dosyayı yazılımda açmayı seçin ve açılır seçim menüsünden, ms RBP4 ve mutant msRBPR2 ve msSTRA6 peptitlerinin ilişkilendirme ve ayrışma fazları için Referans hücresi Boş çıkarılmış Aktif sensörgramı analiz etmek için Fc2-1'i seçin.
    6. Açılır Kinetik/Benzeşim düğmesine tıklayın ve Yüzeye bağlı'yı seçin; Eğrileri Seç iletişim kutusunu açmak için, tablodaki sütunu dahil et seçeneğini işaretleyin ve İleri'ye tıklayın. Boş çıkarılmış sensorgramları göstermek için Veri iletişim kutusunu seçin; Kinetik ve Benzeşim'e tıklayın, varsayılan parametreleri koruyun ve eğri uydurma için Sığdır seçeneğine tıklayın. Denge ayrışma sabiti Kd ve Ka veya Kilişkilendirme oranı ve K ayrışma oranı üzerinde Kd veya Kiçin Rapor sekmesini inceleyin. Kinetik veri sensörgramını sekmeyle ayrılmış .txt biçimde kaydedin ve grafikleri çizmek için değerleri kullanın (Şekil 3).
    7. Afinite kinetik sabiti Kd'yi (dengede reseptörlerin yarısına bağlanan ligand konsantrasyonu) belirlemek için, yazılımda kullanılan Evaluation to XY grafiğinden oluşturulan .txt formatındaki veri sütunlarını kopyalayıp yapıştırın. Analiz ve Doğrusal Olmayan regresyon (eğri uyumu) seçeneğine tıklayın, veri sütununu kontrol edin ve Tamam'a tıklayın. Parametre iletişim kutusunda, aşağıdaki formülle Bağlama doygunluğu ve Bir siteye özel bağlama uydurma modeli'ne tıklayın:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Bmax'ın maksimum bağlanma bölgesi sayısı (Yanıt Birimi) olduğu yerde, X peptitlerin konsantrasyonudur ve Y bağlanmadır (Yanıt birimi) (Şekil 3).

3. Retina lizatlarında GPCR-11-cis retinal protein kompleksini ( retinylidene protein rhodopsin) ölçmek için spektrofotometri metodolojisi

  1. Yetişkin WT-C57BL/6J farelerden oluşan önceden belirlenmiş fare grubunu karanlık odaya taşıyın.
  2. Karanlık, fareleri gece boyunca 12-16 saat boyunca uyarlayın ve kırmızı ışık altında, fareyi bir ötenazi odasına yerleştirin ve regülatör üzerindeki CO2 gaz vanasını ~ 5 dakika boyunca 5 L / dk'ya açın. Geriye doğru çekilen boyun ve kuyruğa baskı uygulayarak ölümü sağlayın (servikal çıkık).
  3. Göz kürelerini enüklee edin ve gözleri 20 mM bis-tris propan (1,3-bis (tris (hidroksimetil) metilamino) propan içeren buz gibi soğuk bir tamponda homojenize edin; BTP) pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA ve proteaz inhibitörü ile (Malzeme Tablosu).
  4. Homojenatı 4 ° C'de 16000 x g'de 15 dakika santrifüjleyin, suda çözünür sitozolik proteinler içeren süpernatanı atın. Peletlenmiş membran ve membran proteinlerini 20 mM n-dodesil-β-d-maltosit (DDM), 20 mM bis-tris propan (BTP) pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA içeren tampon içinde ve proteaz inhibitörü ile dönen bir platform üzerinde 4 ° C'de 1 saat boyunca yeniden askıya alın ve çözündürün.
  5. Yeniden çözünmüş membran fraksiyonunu 16000 x g, 4 ° C'de 1 saat santrifüjleyin. Süpernatanı 30 μL Rho 1D4 antikor boncukları ile karıştırın ve dönen bir platform üzerinde 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  6. Manyetik bir stand kullanarak, boncuklar kullanarak açılır menüyü ayırın, süpernatanı atın ve boncukları tampon 20 mM bis-tris propan (BTP) pH 7.4, 500 mM NaCl ve 2 mM DDM ile yıkayın.
  7. Rodopsin proteinini, 0.2 mg/mL 1D4 peptit (-TETSQVAPA) içeren 20 mM bis-tris propan (BTP) pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM DDM tamponu ile oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübe ederek elde edin (Şekil 4 ve Şekil 5).
  8. Aspektrofotometre ile hızlı bir tarama ayarında dikdörtgen, alt mikro, kuvars, 2 mm açıklık, 10 mm yol uzunluğu, 50 μL küvet kullanarak 200 nm ila 800 nm arasında absorbans için elute analiz edin.
    NOT: Yalnızca yüksek kaliteli Kuvars küvetler kullanın (Şekil 4).
  9. Kaliteyi doğrulamak ve belirlemek için elute'u kontrol edin ve 1 dakika boyunca parlak ışığa maruz bırakın, ardından adım 3.8'i tekrarlayın.
  10. Boş absorbansı çıkarın ve analiz edilen absorbans spektrumlarının 11-cis retinal bağlı opsin için 500 nm'de, ışığa maruz kalan all-trans retinal bağlı opsin için 380 nm'de ve ligand içermeyen Apo-Opsin proteini için 280 nm'de absorbans ile oranını hesaplayın (Şekil 6). Ligand retinal içermeyen serbest opsin, 500 nm'de bir temel absorbans sağlar.
  11. Rodopsin konsantrasyonunu ölçmek için Beer-Lambert Yasasını kullanın:
    A=ε· C·l veya C=A/ε·l
    Burada A absorbans, ε molar sönme katsayısı (rodopsin ε500 = 40.600 M−1 cm−1 serbest Apo Opsin ε280 = 81.200 M−1 cm−1 için), C konsantrasyon ve l yol uzunluğudur.
  12. Liganded-Opsin'i yüzde olarak ölçmek için A280/A500 oranını kullanın.
  13. Boş çıkarılmış absorbans spektrumlarını çizin ve serbest opsin değerini32 hesaplayın.
  14. 500 = 40600 M−1 cm−1 ε yok olma katsayısını kullanarak rodopsin konsantrasyonunu hesaplayın. Ligand içermeyen opsin konsantrasyonu,280 = 81.200 M−1 cm−1 ε yok olma katsayısı kullanılarak Beer-Lambert Yasası ile hesaplanır.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A vitamini membran reseptörlerinin ve fotoreseptör opsin'in ilgili fizyolojik ligandları ile protein-ligand etkileşimlerini incelemek için kantitatif yöntemler tanımlanmıştır. Rekombinant fare RBP4, E. coli'de ve bir SPR Çipi üzerinde konjuge bir ligand olarak kullanılan saflaştırılmış proteinde ifade edilmelidir. Bir ~40 amino asit peptidinin kimyasal olarak sentezlenmiş RBPR2, STRA6 ve mutant S294A RBPR2 "SYL motifi RBP4 etkileşimli hücre dışı bölgesi", bağlanma kinetiğini ölçmek için çeşitli konsantrasyonlarda analit olarak kullanılır ve denge doygunluğu Kd etkileşimin (Şekil 1 ve Şekil 2).

RBPR2 ve STRA6 için bir ligand olarak rekombinant RBP4 proteini,sırasıyla KD ~ 22.38 μM ve ~ 26.73 μM'de ölçülen bu peptitlerdeki etkileşime giren bölgelere doğru bir bağlanma afinitesi gösterdi. Amino asit motifi "SYL", hem RBPR2 hem de STRA6'da bu etkileşimlerin stabilize edilmesinde önemli bir rol oynar ve tahmin edildiği gibi, mutant peptit S294A, ~ 114.9 μM'likKD'yi artırmıştır, bu da mutant-RBPR2 peptit gereksinimlerinin kopya sayısının arttığını düşündürmektedir. STRA6 yoluyla gözde retinol alımı ve çeşitli retinoidlere dönüşüm, 11-cis retinalin kromofor olarak son dönüşümü ve Rhodopsin'in Lizin 296 kalıntısına bağlanması, foton algılama ve görme için fonksiyonel bir reseptör yapar. Rhodopsin'i oluşturmak için protein Opsin'e 11-cis retinal kovalent bağlanma, belirli karakteristik absorbans özellikleri sergiler. Protein emilimi 280 nm'de gerçekleşir ve serbest Retinol emilimi ~ 325 nm'dir. Bununla birlikte, 11-cis Retinal veya Rhodopsin absorbanslı holo-Opsin, 500 nm dalga boyunda meydana gelir.

Düşük sistemik retinol veya RBPR2 veya STRA6'daki bir mutasyonla retinol alımındaki kusur nedeniyle bu karmaşık oluşumdaki herhangi bir kusur, kromofor 11-cis retinal içermeyen Serbest Opsin veya apoprotein opsin birikimine yol açar ve karakteristik absorbans kaymalarını 500 nm'de düşük absorbansa değiştirir. Absorbansı ölçerek ve absorbans 280 nm ve 500 nm dalga boyu oranını kullanarak, ligandlı Opsins veya Rhodopsin'i tahmin etmek mümkündür. Kısa bir ışığa maruz kalma yoluyla, 500 nm'de 11-cis retinal bağlı Opsin absorbansının 380 nm'de tüm trans-retinal bağlı Opsin (Meta II rodopsin) absorbansına foto-izomerizasyonunu çapraz kontrol etmek mümkündür (Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6). Deneysel bir düzenekte, artefakt ve kirletici madde olasılığı yüksektir; bulunan iki ana artefakt kaynağı, aletlerden kasıtsız ışığa maruz kalma ve kirletici moleküllerin RPE veya lensten çıkarılamaması ile düşük konsantrasyonlu tuz yıkamasıdır (Şekil 7).

figure-results-1
Şekil 1: Yüzey Plazmon Rezonansı çalışma alanı. Gerekli malzemeler ve SPR enstrümantasyonuna genel bakış. (A) SPR Talaş yükleme iskelesi. (Bir') -NH2, -SH, -CHO, -OH veya -COOH grupları aracılığıyla immobilizasyon için karboksimetillenmiş dekstran kovalent olarak bağlanmış altın yüzeyli CM5 çipi. (B) Numune yükleme robotik enjektör rafı. (B') tip 3 lastik kapaklar. (B'') Numune alikotları için 7 mm plastik şişeler. (C,D) Dengeleme / çalışma tampon rezervuarı ve atık toplama tankı. (E) Biacore yazılım kontrol paneli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Yüzey Plazmon Rezonansına şematik genel bakış ve sensorgram elde etme adımları. Adım 1: CM5 Çip yüzeyi, 1.200 yanıt birimi hedefiyle RBP4 proteini ile hareketsiz hale getirildi. 2 Adım: RBPR2 peptitlerinin çeşitli konsantrasyonları analit olarak çalıştırılır ve bu biyomoleküler etkileşim, altın çip yüzeyindeki elektron yük yoğunluğunu değiştirir ve belirli bir açıda veya rezonans açısında ışık yansımasında değişmeye/azalmaya yol açar. Adım 3: Yıkama, yüzey plazmon fenomenini tersine çevirerek yansıma yoğunluğunun tersine dönmesine ve sensorgramın taban çizgisine düşmesine yol açar. Bu etkileşimlerin kinetiği, ilişkilerin ayrışma sabitlerini ve gücünü belirlemek için daha fazla kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Yüzey Plazmonu: Fizyolojik ligandı RBP4 ile bireysel A vitamini reseptör bağlama alanı peptitlerinin rezonans bağlanma çalışmaları. (A) CM5 Çip yüzeyinde RBP4'ün elde edilen immobilizasyonunu gösteren yazılım istemi. (B,C,D) Çeşitli konsantrasyonlarda peptit-ligand RBPR2-RBP4, STRA6-RBP4 ve mutant S294A RBPR2-RBP4 etkileşimlerinin sensogramları. (B',C',D') Bağlanma Kinetiği ve denge Kd tayini, bağlama modelinin farkını ve yakınlığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Opsin-11-cis retinal absorbans çalışma alanı ve enstrümantasyona genel bakış. (A) Soğutmalı tezgah üstü santrifüj, tüm LED göstergeler bürokrasiyle kaplı; (B) UV görünür spektrofotometre, kırmızı bantla kaplı bir LED göstergesi; (B') Dikdörtgen ultra mikro hücre, kuvars küvet ve manyetik stand. (C) Uygulama yazılımını taramak; (D) spektrofotometre bölme kapağı sürgülü olarak açılır, analiz için küvet tutucu ve bölme kapağı kapalıdır. (E) Tek bir kırmızı ışık kaynağı altında numune hazırlama için monitör KAPALI durumdayken ışık KAPALI ayarı. (F) Numune hazırlama ve çözündürme için soğutmalı döndürücü. (G) Numune absorbans ölçümü için monitör AÇIK durumdayken ışık KAPALI ayarı. (H) XY-Grafiğinde absorbans analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Opsin-11-cis retinal absorbans metodolojisinin iş akışına genel bakış. Adım 1: Tek bir kırmızı ışık kaynağı altında karanlığa adapte olmuş farelerden alınan retinalar, retina zarı fraksiyonları elde etmek için izole edilir, homojenize edilir ve çözündürülür. Adım 2-4: Bir dizi santrifüjlemede, pelet, deterjan yokluğunda ve DDM deterjan tamponunun varlığında çözündürülür. Adım 5-6: Antikor çekme ve saflaştırma için hazır retinal fotoreseptörler ve diğer zar proteinlerini içeren çözündürülmüş pelet. 7 Adım: Absorbans analizi için hazır VAPA 1D4-peptid kullanılarak ayrıştırılmış Opsin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Rodopsin absorbans spektrumları. (A) 500 nm tepe absorbansını gösteren 1D4 saflaştırılmış rodopsin kullanılarak koyu uyarlanmış fare retina ekstresi ve (B) 380 nm tepe absorbansını gösteren 1D4 saflaştırılmış rodopsin kullanılarak ışığa maruz kalan retina ekstresi. (C) Rodopsin saflaştırmasının kalitesini ve boyut dağılımını gösteren 1D4 rodopsin antikoru kullanılarak western blot. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Rodopsin absorbans spektrumları artefaktıdır. (A) Karanlığa uyarlanmış göz ekstraktının absorbans spektrumlarındaki artefakt, 380 nm'de absorbans zirvesi ile gösterilir; Aletlerin LED göstergelerinden istenmeyen ışığa maruz kalması veya karanlık oda kapı ışık engelleyicisinin arızalanması Rodopsin proteininin ağartılmasına neden olur. (B) Yüksek tuz tamponu ile yetersiz yıkama, RPE, lens veya göz ekstraktından elde edilen diğer kaynaklardan gelen kirleticilerin birikmesine neden olarak yüksek emicilik spektrumu yayılımına ve artefaktlara yol açar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Görme fonksiyonu için fotoreseptörlerde retiniliden proteini üretmek için kritik olan A vitamini membran reseptörleri (RBPR2 ve STRA6) ve Opsin proteini ile ilgili ligandları (RBP4 ve 11-cis retinal) arasındaki etkileşimlerin şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: İçsel triptofan floresan yoğunlukları. Çeşitli konsantrasyonlarda RBPR2 ve STRA6 peptitleri ile etkileşime girdikten sonra RBP4'ün içsel triptofan kalıntılarının yönelimlerindeki etkileşim ve değişimin ön kanıtı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: RBPR2 ve RBP4 protein-protein yerleştirme ve etkileşimi. Arayüz kalıntıları PyMOL'de görselleştirilir ve RBPR2'nin membran içindeki oryantasyonu, sunucu aracı https://opm.phar.umich.edu/ kullanılarak görselleştirilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S3: Protein-protein yerleştirme etkileşiminin ve olası temas bölgelerinin in-silico analizi için boru hattı. Analiz işlem hattı, 1'den 6'ya kadar olan adımlar arasında Python komut dosyası çalıştırma ve PyMOL komut satırı kullanım sırasını gösterir ve etkileşim sitelerinin elde edilmesinin güvenilirliğini sağlar. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S4: RBP4, RBPR2 ve STRA6 peptitlerinin bileşimini gösteren CD spektroskopisi ikincil yapı analizi. Pasta grafiği, molekülde bulunan ikincil yapıların paylarını gösterir. BeStSel İkincil Yapı aracı kullanılarak, Dairesel Dikroizm Spektroskopisi (https://bestsel.elte.hu) ile Protein Kıvrımı Tahmini analiz edildi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoldeki kritik adımlar
SPR Metodolojisi
In silico modelleme ve yerleştirme analizi: RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) ve STRA6'nın tahmin edilen yapısı ve msRBP4 PDB veritabanı için bilinen yapı (RSCB PDB ID: 2wqa), yerleştirme çalışması29,31 için kullanılmalıdır. Ek olarak, A vitamini reseptörleri (RBPR2 ve STRA6) üzerindeki varsayılan bağlanma bölgelerinin ligandı (RBP4) ile etkileşimini doğrulamak için in vitro yöntemler (hücre kültürü) kullanılmalıdır29,31 (Ek Şekil S1, Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S3). CD spektroskopisi kullanarak peptitlerin kalitesini belirleyin. Daha önce, uzak UV CD spektrumu için, 1 mm dikdörtgen hücre 0.1 μg / μL ~ 200 μL (3-4 μg RBP4 proteini, 32 μM RBPR2 ve 32 μM STRA6 peptitleri)kullanıldı 31 (Ek Şekil S4). Azot gazı akışı, emisyon Xenon lambaları altında zararlı ozon oluşumunu önlemek ve 200-300 nm'de arka plan emilimini azaltmak için kullanılmalıdır. Varsayılan parametre kullanılarak, spektrum 185 nm ila 300 nm arasında ölçüldü. Taban çizgisi, Boşluk ile çıkarma yapılarak düzeltilmelidir. Alfa sarmalı ve beta levha içeriği, alfa sarmalının 222 nm'deki negatif tepe noktaları gibi absorbans özelliğine dayalı olarak hesaplanır.

Veritabanındaki (https://www.uniprot.org) RBPR2 ve STRA6 proteinlerini ve topolojik alan verilerini analiz edin, hücre dışı bölgelerden önceden bilinen olası etkileşim bölgelerini doğrulayın ve peptitleri kimyasal olarak sentezlemek için ~ 40-50 amino asit dizisini kullanın. Çalışma, saflaştırılmış rekombinant fare RBP4 (msRBP4) proteini ve reseptör-ligand etkileşimlerini incelemek için önerilen RBP4 bağlanma kalıntılarını kapsayan kimyasal olarak sentezlenmiş RBPR2 ve STRA6 peptitlerini gerektirir 18,19,29,31. Peptitleri kısa listeye almadan önce, etkileşen A vitamini reseptör proteinlerinin hücre dışı peptit dizisi, in silico (bilgisayar tabanlı protein-ligand yerleştirme) analizi31 kullanılarak belirlenmelidir. SPR testi, reseptör-ligand etkileşimlerinin kinetiğini anlamak için yapılır. İn-silico bilgisayar tabanlı tahlillerle veya in-vitro analizlerle tahmin edilen etkileşim yerlerini bilmek çok önemlidir. Bu çalışmada, tasarlanan peptit, RBP4 ile etkileşime girdiği bilinen zar proteinleri RBPR2 ve STRA6'nın hücre dışı bölgesine atıfta bulunmaktadır. Doğru sonuçlar elde etmek ve olası artefaktları ve negatif SPR sensörgramlarını önlemek için tamponları, peptit konsantrasyonlarını ve çözünürlüğü standartlaştırmak çok önemlidir. Rodopsin absorbans çalışmaları için, retinal lizat izolasyonu, artefaktları ve istenmeyen absorbans zirvelerini önlemek için sıkı karanlık koşullar ve yıkama adımları gerektirir (Şekil 7).

RBP4, RBPR2, STRA6 ve bir mutant S294A-RBPR2 peptitlerinin31 bağlanmasında A vitamini taşıyıcıları üzerindeki SYL motifinin önemini anlamak için, iki amino asit arasındaki karboksil ve amino gruplarının yoğunlaşma reaksiyonu kullanılarak kimyasal olarak sentezlendi. Protokol, sıralı amino asitlerin ankraj reçinesine kesin adım adım eklenmesini takip etti. Amino asit sentezi işlemi, N-terminal amino asit biriminin korunması ve korunmasının kaldırılması için kimyasal modifikasyonlara uğrar, bu da senteze ve peptit polimer oluşumuna izin verir. Tamamlandığında, peptit reçineden geri kazanılır ve saflaştırılır. RBP4 proteini ve A vitamini reseptör peptitlerinin etkileşimlerinin ilk doğrulaması, dahili bir Triptofan Floresan testi kullanılarak doğrulanmalı ve bir CD spektrometresi kullanılarak kontrol edilmelidir (Ek Şekil S1). Rekombinant RBP4 proteininin fare STRA6 (msSTRA6), fare RBPR2 (msRBPR2) ve kontrol peptitleri ile ilk etkileşim kalitesi, intrinsik triptofan floresan testi kullanılarak doğrulanmalıdır (Ek Şekil S1). İçsel triptofan floresan testi, reseptör ve ligandın bağlanması üzerine floresan için proteinlerdeki triptofan amino asit kalıntılarının söndürülmesini veya arttırılmasını değerlendirmek için kritik bir deneysel prosedürdür. Ölçülen floresan, etkileşimin bir sonucu olarak yerel ortamdaki değişimin doğrudan bir göstergesidir.

Yöntemlerin değiştirilmesi ve sorun giderme
Çalışan arabelleklerle SPR'yi optimize edin: 1x Fosfat Tamponlu Salin (Tween 20) veya 1x HEPES (P20). Çökeltileri önlemek için, seyreltilmiş peptitler kullanımdan önce santrifüjlenmeli ve filtrelenmelidir. Rodopsin emilimini çeşitli yüksek tuz tamponları (300-500 mM NaCl) ile standartlaştırın. Rodopsin absorbans zirvelerini karanlıkta 500 nm'de doğrulamak için, numuneleri 30 saniye boyunca ışığa maruz bırakın ve absorbans tepe noktasının 380 nm'ye kayması ve aşağı çekmenin etkinliği yoluyla kaliteyi sağlamak için ölçümü tekrarlayın.

Yöntemlerin sınırlamaları
SPR, iki proteinin etkileşimi hakkında spesifik bilgi sağlayabilir; Bununla birlikte, etkileşim üçüncü bir bilinmeyen bileşen gerektiriyorsa, verilerin anlaşılması karmaşık hale gelebilir. Molekülün konformasyonundaki değişiklik, etkileşimde tanımlanamamış olarak kalacaktır. RBP4 proteini retinol (apo-RBP4) yokluğunda hazırlandığından, ölçülen apo-RBP4'ün reseptörlerine bağlanmasıdır. Bu nedenle, retinol yüklü RBP4 (holo-RBP4), apo-RBP435,36 ile karşılaştırıldığında RBPR2 ve STRA6 reseptörleri için değişmiş bir afiniteye sahip olabilir. İlginç bir şekilde, STRA6 için apo- ve holo-RBP4 afiniteleri daha önce her iki mikromolar aralıkta da gösterilmişti ve apo- ve holo-RBP4'ün STRA6 reseptörü35'e bağlanmaları arasında istatistiksel bir fark gözlenmedi. Rodopsin absorbans metodolojisi, gözde ligandlanmamış opsin (apoprotein opsin) varlığını tanımlayabilir, ancak nedensel mekanizmayı/mekanizmaları tanımlayamaz.

Rodopsin absorbans spektrumları
KRİTİK KONTROL NOKTASI: 11-cis retinalin all-trans retinal'e foto-izomerizasyonu oldukça hassas ve anlıktır32. Rodopsin (holo-Opsin) miktar tayini, karanlıkta (500 nm) uygun Opsin ve 11-cis retinal içeriğini ölçmek için veya Meta II Rhodopsin (380 nm) olarak ışığa uyarlanmış koşullar altında sıkı karanlık koşullar altında yapılmalıdır32. Bu nedenle fareler, ağartılmamış rodopsin32'yi ölçmek için 12-16 saat karanlık bir odada karanlıkta adapte edilmelidir. Bu amaçla, karanlık oda tamamen karanlık olmalı, giriş kapısı karartma bezi ile kaplı ve tüm ekipmanlar üzerinde harici LED ışık kaynakları kırmızı bantla kapatılmalıdır. Dizüstü bilgisayar ekranını kırmızı plastik bir örtüyle örtün ve gerekene kadar kapalı tutun. Üstten kırmızı ışık kaynağı da gereklidir.

KRİTİK ADIM: 300-500 nm dalga boyu absorbansına sahip olan ve opsin absorbans ölçümüne potansiyel olarak müdahale edebilecek lens veya RPE proteinlerini veya molekül kirleticilerini uzaklaştırmak için çeşitli yüksek tuz konsantrasyonlarında yıkama adımlarını standartlaştırın.

Yöntemlerin mevcut/alternatif yöntemlere göre önemi
Retinol dağılım mekanizmaları için sistemik retinoid kullanımını, çoklu doku katkılarını ve retinol bağlayıcı protein reseptörlerindeki mutasyonların etkisini incelemek için uygun bir yaklaşım yoktur. Bu protokol, Apo-Opsin ile fotoreseptörlerde retinol tükenmesindeki eksik bağlantıları anlamak ve doldurmak ve RBPR2-RBP4 reseptör-ligand etkileşimleri yoluyla karaciğer retinoid depo kullanımı için iki temel teknik kullanır (Şekil 3, Şekil 6 ve Şekil 8).

Yöntemin belirli araştırma alanlarındaki önemi ve potansiyel uygulamaları
SPR ve absorbansa dayalı rodopsin spektroskopisi testleri, retiniliden proteininin (rodopsin) üretilmesi için sistemik ve oküler A vitamini homeostaz mekanizmalarını incelemek için anlamlı bir strateji sağlar. Özetle, bu teknikler ve deneysel yaklaşımlar, diyet retinoidlerinin karaciğerden göze zar reseptörüne bağlı taşınmasının kinetiğini açıklayabilir ve rodopsin oluşumunu kolaylaştırabilir (Şekil 8). Ayrıca, A vitamini reseptörleri ve opsin proteinlerindeki mutasyonların, özellikle de ilgili ligandlarına bağlanmada, mekanizmaların ve oküler sonuçların anlaşılmasına yardımcı olurlar. Bu etkileşimler, görsel işlev için çok önemli olan retinylidene proteininin oluşumunu etkileyebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir. Fon sağlayıcıların çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanmasında, analizinde veya yorumlanmasında; makalenin yazımında veya sonuçların yayınlanması kararında.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rodopsin absorbans protokolü hakkındaki tavsiyesi için Dr. Beata Jastrzebska, Ph.D. (Farmakoloji Anabilim Dalı, Case Western Reserve Üniversitesi, OH). Bu çalışma bir NIH-NEI hibesi (EY030889 ve 3R01EY030889-03S1) ve kısmen Minnesota Üniversitesi başlangıç fonları tarafından GPL'ye desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-D QuantKiti Cytiva80648356
Amin KaplinKiti CytivaBR100050
Biacore değerlendirme yazılımıBiacore S200Sürüm 1.1
Biacore Sensör çipi CM5CytivaBR100530
Bis tris propanSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 yetkili hücrelerThermo BilimselEC0114
CD spektrofotometreJascoJ-815 Spektropolarimetre
Glisin HCLFisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prizma ve nbsp;Model uydurma, veri analizi,
LB et suyu, FisherBioreagentsBP1426-500
n-dodesil-β-d-maltosit (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM,
pET28a, His-tag, Kanamisine dirençli ekspresyon vektörü Addgene69864-3
Plazmid saflaştırma kitiQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K diyaliz kasetiThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-500%0.05
UV vis SpektrofotometreAgilent Cary 60 UV-Vis
Peptid adıPeptide dizisiHPLC-saflıkMass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Mouse
Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK ile uyumludur		90.84%Uyumlu
Fare Rbpr2 mutantı S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Uyumlu
,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411(2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676(2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987(2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229(2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236(2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371(2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099(2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657(2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293(2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169(2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207(2017).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Vitamin A Resept rleriRetinol Ba lay c ProteinY zey Plazmon RezonansLigand Ba lanma Kineti iRodopsin KantifikasyonuFototransd ksiyon KaskadSpektrofotometrik AnalizRetinoid HomeostazOpsin Ligand Etkile imi

İlgili makaleler