Yöntem makalesi

Yüksek Derecede Diferansiye ve Polarize Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Oksijen Tüketim Oranlarının Uzun Süreli İzlenmesi

6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67038

⸱

16 Ağustos 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2School of Optometry and Vision Science, University of New South Wales, 3Lucid Scientific, 4Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 5Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Retina pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde oksijen tüketim oranlarını (OCR) ölçmek için yeni bir cihaz sunuyoruz. Cihaz, plakalar standart bir hücre kültürü inkübatöründeyken standart hücre kültürü plakaları üzerinde standart ortamla büyütülen RPE üzerinde bir seferde haftalarca OCR'yi ölçebilir.

Özet

Mitokondriyal metabolizma, retinada fotoreseptörün sağkalımı için önemli olan tek bir hücre tabakası olan retina pigment epitelinin (RPE) normal işlevi için kritik öneme sahiptir. RPE mitokondriyal disfonksiyonu, gelişmiş dünyada geri dönüşü olmayan körlüğün önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve retina dekolmanlarının kör edici bir komplikasyonu olan proliferatif vitreoretinopatinin (PVR) ayırt edici bir özelliğidir. RPE dejeneratif koşulları, in vivo RPE'yi taklit etmek için oldukça farklılaşmış ve polarize edilmiş RPE kültür sistemleri tarafından iyi modellenmiştir. Bununla birlikte, mitokondriyal fonksiyonun bir temsilcisi olan oksijen tüketim oranlarının (OCR) izlenmesi, bu tür kültür sistemlerinde zor olmuştur, çünkü ideal RPE polarizasyonunu ve farklılaşmasını destekleyen koşullar kolay OCR ölçümlerine izin vermez.

Burada, RPE'yi standart bir hücre kültürü inkübatöründe optimal büyüme substratları ve fizyolojik kültür ortamı üzerinde tutarken, iyi farklılaşmış RPE kültürlerinde OCR'yi haftalarca izlemek için yeni bir sistem olan Resipher'ı tanıtıyoruz. Bu sistem, hücrelerin üzerindeki ortamda bulunan oksijen konsantrasyonu gradyanını ölçerek OCR'yi hesaplar. Bu sistemin OCR'yi tespit etmek için diğer yöntemlere göre avantajlarını ve RPE kültürlerinde OCR'yi ölçmek için sistemin nasıl kurulacağını tartışıyoruz. Sistemi kullanmayla ilgili önemli ipuçlarını ve püf noktalarını ele alıyor, verileri yorumlama konusunda uyarıda bulunuyor ve beklenmeyen sonuçları gidermeye yönelik yönergeleri ele alıyoruz.

Ayrıca, sistem tarafından algılanan hücrelerin üzerindeki ortamdaki oksijen gradyanına dayalı olarak hipoksi, normoksi veya hiperoksi RPE kültürleri deneyiminin seviyesini tahmin etmek için çevrimiçi bir hesap makinesi de sağlıyoruz. Son olarak, bir PVR modelinde RPE hücrelerinin metabolik durumunu ölçmek ve RPE'nin metabolik olarak hipoksiye nasıl adapte olduğunu anlamak için sistemin iki uygulamasını gözden geçiriyoruz. Bu sistemin yüksek derecede polarize ve diferansiye RPE kültürlerinde kullanılmasının, hem fizyolojik hem de hastalık durumları altında RPE mitokondriyal metabolizması hakkındaki anlayışımızı artıracağını tahmin ediyoruz.

Giriş

Retina pigment epiteli (RPE), retinadaki ışığa duyarlı fotoreseptörler ile kan dolaşımı arasında bir bariyer oluşturan, fonksiyonel olarak postmitotik, oldukça polarize epitel hücrelerinin tek tabakasıdır, koryokapillaris olarak adlandırılan bir kılcal yataktır. Glia destekleyici nöronların rolü gibi, RPE de fotoreseptör dış segmentlerinin fagositozu, besinlerin taşınması ve fotoreseptörler için metabolik destek ve temel büyüme faktörlerinin salgılanması dahil olmak üzere fotoreseptörleri desteklemek için sayısız işlevi yerine getirir ve bunların tümü görsel işlevi sürdürmek için kritik öneme sahiptir.

RPE'nin dejenerasyonu, birkaç yaygın dejeneratif görme bozukluğunun temelini oluşturur. Dünyada tedavi edilemez görme kaybının en yaygın nedenlerinden biri olan yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD), RPE ölür ve bu nedenle üstteki fotoreseptörler ikincil bir dejenerasyona uğrar. Proliferatif vitreoretinopatide (PVR), RPE bunun yerine normalde hareketsiz olan postmitotik durumundan çıkar, çoğalır ve metabolizmasındaki değişikliklerle mezenkimal duruma (epitelyalden mezenkimal geçişe [EMT] olarak adlandırılır) farklılaşır. RPE farklılaşması, fotoreseptörlere RPE desteğinin kaybına neden olurken aynı zamanda daha fibrotik bir durumu tetikler. Bu, hem fotoreseptör dejenerasyonu hem de RPE'nin neden olduğu yara izi ile sonuçlanırve her ikisi de görme kaybını tetikler 1,2.

RPE'nin fotoreseptörlere desteğinin büyük bir kısmı metaboliktir ve metabolik düzensizlik, AMD ve PVR dahil olmak üzere çok sayıda retina hastalığında kritik bir faktördür. RPE, fotoreseptörler ile oksijen ve besin kaynakları olan koryokapillaris arasında düzenleyici bir bariyer görevi görür. Bu nedenle, RPE'nin metabolize etmeyi seçtiği şeye karşı RPE'nin koryokapilleristen fotoreseptörlere geçmeyi seçtiği şey, fotoreseptör metabolizmasını ve sağkalımını güçlü bir şekilde yönetir. Çok sayıda çalışma, RPE'nin normal sağlığı için büyük ölçüde mitokondriyal metabolizmaya bağımlı olduğunu ve fotoreseptörlerin bunun yerine büyük ölçüde glikoliz3'e dayandığını göstermiştir. Bu, fotoreseptörler ve RPE arasında tamamlayıcı, iç içe geçmiş metabolik durumlar kavramını ortaya çıkarmıştır. Spesifik olarak, RPE, tercih edilen fotoreseptör metabolik substratlarının metabolizmasını azaltır ve bunun yerine fotoreseptörlerin tüketmediği metabolitlerle birlikte fotoreseptör metabolizmasının yan ürünlerini kullanır. PVR ve AMD gibi hastalıklarda, kanıtlar RPE'nin daha glikolitik hale geldiğini ve mitokondriyal metabolizmaya daha az bağımlı hale geldiğini güçlü bir şekilde göstermektedir; RPE glikolize doğru bu kayma, ihtiyaç duyduğu metabolitlerin fotoreseptörlerini aç bırakarak dejenerasyonu tetikleyebilir 4,5,6. RPE ve fotoreseptör metabolizmasının ne kadar birbirine bağımlı olduğu ve retina hastalığının altında ne kadar değişmiş metabolizma olduğu göz önüne alındığında, RPE metabolizmasının terapötik amaçlar için modellenmesi ve manipüle edilmesine büyük ilgi vardır.

RPE mitokondriyal metabolizmasını in vivo olarak incelemek ideal olsa da, RPE mitokondriyal metabolizmasının birçok yönü sadece bir in vitro kültür sisteminde pratik olarak incelenebilir. Son birkaç on yılda, yüksek kaliteli RPE kültürlerine doğru önemli ilerlemeler kaydedilmiştir, öyle ki, en dikkatli şekilde tımar edilen RPE kültürleri şu anda insan klinik çalışmalarında hücre replasman tedavisi için kullanılmaktadır7. Bu tür yüksek kaliteli kültürleri korumak için, RPE'nin deneyden aylar önce belirli ortamlarda, belirli substratlarda büyütülmesi gerekir. Bu koşullarla, RPE kültürleri maksimum düzeyde farklılaşır ve polarize edilir, bu da in vivo RPE'ye yaklaşır. Ne yazık ki, şu anda mitokondriyal metabolizmayı özellikle in vivo olarak RPE'den ölçebilecek hiçbir ekipman mevcut değildir. Retina kılcal damar ağının oksijen izlemesi, elektron paramanyetik rezonans (EPR) oksimetre8 kullanılarak in vivo olarak gerçekleştirilmiş olsa da, RPE analizi için bu mümkün değildir. RPE metabolizması in vivo ve in vitro arasındaki farklar iyi tanımlanmamıştır, ancak RPE kültürlerinin RPE'ye benzer şekilde yüksek mitokondriyal aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir in vivo 3,9, bu da RPE mitokondriyal metabolizması hakkında önemli bilgiler edinilebileceğini düşündürmektedir.

Tüm mitokondriyal metabolizma oksijen tüketimine yol açtığından, RPE oksijen tüketim oranlarının (OCR) ölçülmesi mitokondriyal metabolizma için sadık bir vekildir. Maksimum RPE polarizasyonunu ve farklılaşmasını destekleyen koşullar genellikle Denizatı Analizörü gibi şu anda mevcut olan tekniklerle uzun vadeli doğru OCR ölçümlerini engellediğinden, RPE kültürlerinde OCR'yi ölçmek zor olmuştur. Bu yöntem makalesinde, polarizasyonu ve farklılaşmayı maksimum düzeyde destekleyen koşullar altında yetiştirilen RPE'de OCR'nin haftalar boyunca sürekli olarak ölçülmesine izin veren Resipher (bundan böyle "sistem" olarak anılacaktır) olarak adlandırılan yeni bir cihaz tanıtılmaktadır. RPE farklılaşmasını ve polarizasyonunu maksimum düzeyde destekleyen RPE kültür koşullarında OCR'nin bu sistem tarafından ölçülebilme kolaylığı, mevcut OCR ölçüm cihazları arasında benzersizdir.

Bu makale, sistemi RPE kültürleriyle kullanmak için ipuçları ve püf noktaları sağlar, ardından iki özel uygulamanın bir gösterimi yapılır. İlk olarak, PVR'yi taklit eden RPE EMT, dönüştürücü büyüme faktörü-beta'ya (TGFβ) maruz kalarak tetiklenir1,10,11,12. Sistem, EMT süreci sırasında RPE metabolizmasının nasıl geliştiğini izlemek için kullanılır. İkinci olarak, hipoksi'nin RPE metabolizmasındaki rolü bu sistem kullanılarak araştırılmıştır. Hipoksi, koryokapillaris13,14 yaşla birlikte inceldiği için AMD'nin patogenezine önemli bir katkıda bulunur. Bu sistemi hipoksi odalarıyla birleştirmek, yaşlanmaya eşlik eden ince hipoksi ile değişmiş RPE mitokondriyal metabolizmasını modellemeye izin verir. Son olarak, RPE kültürlerinin hipoksik, normoksik veya hiperoksik koşullarda olup olmadığını belirlemeye izin vermek için Resipher verilerini kullanan bir çevrimiçi hesap makinesi tanıtıldı. Bu tür bilgiler, in vitro RPE kültür çalışmalarından RPE metabolizması hakkında herhangi bir sonuç çıkarmak için kritik öneme sahiptir.

Protokol

İnsan birincil veya iPSC-RPE kültürleri oluşturmaya yönelik protokoller için aşağıdaki referanslara bakın 15,16,17,18. Bu protokoller için insan dokusunun edinilmesi ve kullanılması, Michigan Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (HUM00105486) tarafından gözden geçirildi ve izin verildi.

1. Sistemin RPE kültürüne genel uygulaması

  1. Sistemle uyumlu 96 oyuklu plakalarda plaka insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) türevi RPE veya birincil insan RPE hücreleri.
    1. 24 oyuklu hücre kültürü plakalarında halihazırda mevcut olgun kültürlerin yetiştirildiğini varsayarsak, hücreleri bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve ardından 500 μL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin (Malzeme Tablosu). Bir hücre kültürü inkübatöründe 10-40 dakika inkübe edin, hücreler yuvarlanana ve neredeyse ayrılmaya hazır olana kadar her 5-10 dakikada bir kontrol edin.
    2. Hücre kültürü plastiğinden ayırmak için ortamı hücrelerin üzerine nazikçe pipetleyin, ardından 3x hacimde hücre kültürü ortamına (24 oyuk başına 1.500 μL) aktarın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 × g'da bir santrifüjde döndürün.
      NOT: RPE hücre kültürü ortamı tarifi Tablo 1'de detaylandırılmıştır ve daha önce yayınlanmış referanslarda 9,15,16,17,18 mevcuttur.
    3. RPE hücre kültürü ortamındaki hücreleri% 15 fetal sığır serumu (FBS) ile yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemositometre ile sayın.
    4. 96 oyuklu bir plakanın (genellikle 225-300 × 105 hücre/cm2) her bir oyuğu için 74.000 hücreyi, üreticinin talimatlarını izleyerek son derece özel hücre dışı matris kaplama substratları (Malzeme Tablosu) ile kapladıktan sonra tohumlayın.
      NOT: Tohum hücreleri yalnızca Resipher uyumlu bir plaka üzerinde (Malzeme Tablosu) ve yalnızca algılama kapağındaki prob dizisine karşılık gelen kuyucuklarda (32 kanallı kapak için sütun 3, 4, 9 ve 10; bkz. Sistemin algılama kapağı 4, 32 veya 96 kanallı sensörlerle mevcuttur (Şekil 1A-D'deki sensör konumlarına bakın) ve bir dizi standart hücre kültürü plakası uyumludur.
    5. Kenar kuyuları buharlaşmaya eğilimli olduğundan, oksijen mevcudiyetini önemli ölçüde etkiler ve bu nedenle OCR okumaları, tüm kenar kuyularında (96 oyuklu bir plakanın A ve H Sıraları) hücrelerin tohumlanmasını önler. Ayrıca, buharlaşma etkilerini azaltmak için 96 kuyulu plakanın boş kuyularının her birine 200 μL steril su ekleyin.
    6. Hücrelerin yerleşmesine izin vermek için plakayı 10 dakika boyunca sabit bir masa yüzeyinde tutun; Sonra inkübatöre geri koyun. Besiyerini 24-72 saat sonra değiştirin, yerine %5 FBS'li standart RPE kültür besiyeri koyun. En az 4 hafta boyunca kültür, haftada 2 kez medya değiştirme.
      NOT: Hücreler pigmentli, parke taşı ve oldukça kompakt olduklarında deney için hazırdır (Şekil 1E).
  2. Sistemle veri kurulumu ve elde etme
    1. Algılama kapağını boş bir 96 oyuklu alıcı plakaya yerleştirin ve ardından bunu hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. Cihazı algılama kapağına hizalayın ve monte edin ve sağlanan USB kablosuyla Hub'a bağlayın. Bu, bir Resipher "sandviçi" oluşturur (Şekil 2A).
    2. Lucid lab web sitesi uygulamasına (https://lab.lucidsci.com/) gidin ve yeni bir deney oluşturmak için sağ üst köşedeki Yeni Deney düğmesine tıklayın.
    3. Deneyin başlığını adlandırın ve belirli bir çalışma için ilgili deney notlarını girin (örneğin, kullanılan iPSC-RPE'nin geçiş numarası).
    4. Kuyu koşulları ve tedavi grupları oluşturun. Örneğin, ortamdaki farklı serum konsantrasyonlarının OCR üzerindeki etkilerini test ediyorsanız, grup adında Serum'u seçin, ardından kullanılacak ortam serum konsantrasyonlarını girin ve + düğmesine tıklayarak daha fazla serum yüzdesi değeri ekleyin. Hangi kuyucukların belirli bir serum yüzdesi alacağını atayın ve bu kuyucuklar için bir renk deseni seçin. Grup ekle düğmesine tıklayarak gerektiği gibi daha fazla grup ekleyin (örneğin, test edilecek farklı bir deneysel değişken).
    5. Plaka kurulumunu tanımlayın ve ilgili Cihazı ve plaka stilini seçin. Plaka ekle düğmesine tıklayın ve Cihaz'ı seçin; Plaka tipini seçin. Tedaviyi seçin ve ilgili kuyuya tıklayın.
    6. Denemeyi başlatmak için şimdi başlat düğmesini tıklayın. Web sitesindeki göstergenin ve Hub üzerindeki LED'in sabit yeşil olduğunu kontrol edin.
    7. Her sensörün uygun şekilde kalibre edildiğinden ve %5 CO 2 içeren tamamen nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe ~200 μM konsantrasyonda olması gereken atmosferik oksijeni doğru bir şekilde tespit ettiğinden emin olmak için sistemin 15-60 dakika çalışmasına izinverin (Şekil 2Bi).
      NOT: Standart bir hücre kültürü inkübatörü kurulumunda sensörlerden herhangi biri diğer sensörlerin ortalamasından %20'den fazla indirimliyse, sensör arızalı olduğu için veri analizinde bu kuyuyu hariç tutmayı düşünün (Şekil 2Bii).
      NOT: Tüm sensörler, diğer sensörlerin ortalamasından ve standart bir hücre kültürü inkübatörü kurulumunda 200 μM olarak bildirilen beklenen atmosferik O2'den %2'den fazla indirimliyse, algılama kapağı çok fazla kullanılmıştır; yeni bir algılama kapağı ile değiştirin (Şekil 2Biii).
      NOT: Bir deneye başlamadan önce havadaki O2 okumalarının elde edilmesi, daha sonra sorun gidermeyi önemli ölçüde iyileştirir. Bir deney yapıldıktan sonra belirli bir kuyu aykırı değer olarak görünüyorsa ve bu kuyu kalibrasyon dışı bir sensöre sahipse, sorun biyolojik kopyada değil, sensörde olabilir.
    8. Cihazı algılama kapağından çıkarın (ancak USB kablosunu Cihazdan çıkarmayın). Cihazdaki motorun sıfırlanmasını sağlamak için Cihazı inkübatöre baş aşağı yerleştirin. Tüm motor sesleri kesilene kadar (yaklaşık 20-30 s) Cihazı tekrar kullanmayın.
      NOT: Bir deney sırasında, Cihaz algılama kapağı kapalıyken bile, Cihazı her zaman USB kablosuyla Hub'a bağlı tutmak önemlidir. Bu, Cihazın hücre kültürü inkübatör ortamını sürekli olarak izlemesini ve raporlamasını sağlar.
    9. Algılama kapaklı plakayı, RPE kültürlerini içeren 96 oyuklu bir plaka ile birlikte hücre kültürü başlığına geri yerleştirin. Her kuyucuk için temel OCR değerlerini elde etmek için plakadaki ortamı tüm kuyucuklar için aynı ortama ve aynı hacme sahip RPE kültürleri ile değiştirin. Buharlaşmayı önlemeye yardımcı olmak için RPE'siz tüm kuyuları steril suyla doldurduğunuzdan emin olun.
      NOT: Genel olarak, daha düşük ortam hacimlerinin hızlı besin tükenmesine yol açtığını, ancak daha yüksek ortam hacimlerinin kasıtsız hipoksiye yol açtığını gösteren verilere dayanarak, 96 kuyucuk başına 60-100 μL RPE kültür ortamı öneririz9.
    10. Deney sırasında çeşitli noktalarda ihtiyaç duyulacak olan standart kapağın sterilitesini korumak için algılama kapağını hücre kültürlerini içeren plakaya ve hücre kültürlerini içeren plaka üzerindeki standart (Resipher olmayan) kapağı boş 96 oyuklu alıcı plakaya aktarın.
    11. Hücre kültürlerinin bulunduğu plakayı ve algılama kapağını hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. Bir kez daha, Cihazı algılama kapağına hizalayın ve monte edin ve sağlanan USB kablosuyla Hub'a bağlayın ("sandviç"in montajı). Web sitesi arayüzündeki ve Hub'daki göstergelerin tümünün sabit yeşil olduğunu kontrol edin.
      NOT: O2 konsantrasyon verileri hemen görünecek, OCR verileri ise yalnızca yeterli O2 verisi toplandıktan sonra, yaklaşık 1 saat sonra görünecektir.
    12. Temel OCR'yi yakalamak için Cihazın her bir kuyuda OCR'yi en az 12-24 saat ölçmesine izin verin.
      NOT: Taban Çizgisi OCR, hücrelere uygulanan ortam türü de dahil olmak üzere birçok faktöre bağlı olarak farklılık gösterir. Şekil 2C'de, farklı miktarlarda FBS'ye (%0, %5, %15) sahip standart RPE kültür ortamı biraz farklı OCR değerlerine sahiptir. Ayrıca, daha fazla FBS'ye sahip kültürler, mitokondriyal metabolitlerin tükenmesi (eğrinin sağ tarafı) nedeniyle OCR düşmeden önce hücrelere ortam uygulandıktan sonra mitokondriyal aktiviteyi daha uzun süre sürdürebilir.
    13. Bir temel OCR elde edildikten sonra, 1.2.8-1.2.12 adımlarını tekrarlayın, ancak RPE kültürleriyle plaka üzerindeki ortamı kişinin deneysel koşullarına göre değiştirin (tipik olarak, bir ilaç veya farklı ortam koşullarının karşılaştırılması ±).
      NOT: Rutin medya değişiklikleri de aynı şekilde ele alınabilir. Hücre kültürü inkübatörü her açıldığında, sıcaklık, nem, CO2 konsantrasyonları ve inkübatör kapısının açılmasıyla geçici olarak bozulan diğer faktörlere bağlı olduklarından, OCR okumalarında önemli bir bozulma bekleyin. Cihazın algılama kapağından herhangi bir şekilde çıkarılması sırasında, deneyi çevrimiçi olarak duraklatmaya gerek yoktur. Hücre kültürü inkübatörünün kapısı açıldıktan veya problanan plaka üzerindeki ortam değiştirildikten sonra, oksijen gradyanını yeniden oluşturmak ve doğru bir OCR ölçmeye başlamak genellikle 2-4 saat sürecektir.
    14. Veriler elde edildikten sonra, tedavi tarafından tetiklenen Delta OCR'yi belirlemek için deneysel koşul uygulandıktan sonra her bir kuyu için temel OCR'yi OCR'den çıkarın.
    15. Deney tamamlandıktan sonra, algılama kapağını sterilize edin ve yeniden kullanın (tekrarlanan kullanımla performans düşse de 3-5 kez tekrar kullanılabilir). Algılama kapağını sterilize etmek için, tüm kapağı bir hücre kültürü başlığına 10 dakika boyunca %70 etanole daldırın, ardından daldırmadan çıkarın ve kabin probu tarafı yukarı bakacak şekilde dinlendirin (hassas prob uçlarına dokunmaktan kaçının) ve etanol ve suyun tamamen buharlaşmasına izin verin algılama kapağını yeni bir 96 oyuklu alıcı plakaya koymadan önce.
  3. OCR değerlerini hücre numarasına göre normalleştirmek için parlak alan görüntüleri çekin.
    NOT: RPE'deki melanin birikimi, parlak alan mikroskobu kullanılarak canlı kültürlerde basit bir hücre sayısı sayımına dayalı olarak OCR'nin normalleştirilmesini kolaylaştırır.
    1. Cihazı çıkarın ve adım 1.2.8'de olduğu gibi baş aşağı yerleştirin. Hücre kültürü başlığında, RPE kültür plakasındaki algılama kapağını standart 96 oyuklu bir kapakla değiştirin.
    2. Standart bir ters mikroskop kullanarak, her kuyucuğun parlak alan görüntülerini alın.
      NOT: Alanı kuyular arasında bir görüntü tutarlı tutun (kuyudaki göreceli konum ve objektif büyütme).
    3. Hücre kültürü başlığında, RPE kültür plakasındaki standart 96 oyuklu kapağı algılama kapağıyla değiştirin ve daha fazla izleme için inkübatöre geri yerleştirin.
    4. ImageJ veya başka bir yazılımla her bir kuyucuktaki hücre numarasını sayın.
    5. Farklı deney gruplarında OCR'yi hücre numarasına normalleştirin. Sistem, OCR'yi fmol ∙ (mm2) -1∙s-1-kesit birim alanı başına tüketim birimlerinde bildirir. Bu nedenle, hücre başına OCR'yi normalleştirmek için OCR'yi mm2 başına hücre sayısına bölün (kuyu başına hücre sayısı yerine). Eşdeğer olarak, fmol∙s-1∙well-1 birimlerinde OCR elde etmek için sistem tarafından bildirilen OCR'yi kuyunun kesit alanıyla (standart 96 kuyulu bir plaka için yaklaşık 31 mm2) çarpın.
  4. RPE biyoenerjetik parametrelerinin belirlenmesi için kontroller.
    NOT: Sistem ve RPE kültürlerinin mitokondriyal manipülasyonlara öngörülebilir şekillerde yanıt verdiğinden emin olmak için, mitokondriyal oksidatif fosforilasyonun belirli adımlarını hedeflemek için iyi kurulmuş belirli küçük moleküller test edilebilir. Bu testler, Denizatı Analizörü10 kullanılarak bir Mitokondriyal Stres Testinde gerçekleştirilen adımlara benzer ve RPE kültürleri için biyoenerjetik bir profil sağlar.
    1. RPE hücrelerini %5 FBS ile 65 μL standart RPE kültür ortamında kültürleyin ve bir taban çizgisi oluşturmak için 24 saat boyunca OCR'yi ölçün.
    2. Kültürlenmiş ortamı aspire edin ve% 5 FBS ve mitokondriyal ayrıştırıcılarla (3 μM karbonil siyanür-p-triflometoksifenilhidrazon [FCCP] veya 500 nM Bam15, Malzeme Tablosu) 65 μL standart RPE kültür ortamı ekleyin. Gece boyunca kuluçkaya yatırın.
      NOT: Mitokondriyal ayrıştırıcılar OCR'yi önemli ölçüde artırmalıdır. Artan OCR'nin, standart kültür koşullarında 65 μL ortam için yaklaşık 275 fmol∙ (mm2) -1∙s-1 olan teorik maksimum difüzyon sınırlı OCR'de veya yakınında olmadığından emin olun. Yaygın olarak kullanılan farklı medya hacimleri için maksimum OCR, Tartışma bölümünde mevcuttur.
    3. Gece boyunca inkübasyondan sonra, ortamı mitokondriyal ayrıştırıcılarla aspire edin ve %5 FBS'li 65 μL standart RPE kültür ortamı ile değiştirin. İlaçların çıkarılmasından sonra RPE OCR'nin geri kazanımını belirlemek için plakayı 24 saat daha gözlemleyin.
    4. Tedaviden sonra elde edilen OCR'yi tedaviden önce elde edilen OCR'den çıkararak ayrıştırıcıların OCR üzerindeki etkilerini hesaplayın (Şekil 3).
      NOT: Mitokondriyal ayrıştırıcıların eklenmesiyle OCR'deki artış, hücre19'un yedek mitokondriyal solunum kapasitesini gösterir.
    5. Bir Denizatı Analizörü ile Mitokondriyal Stres Testi sırasında tipik olarak yakalanan diğer mitokondriyal parametreleri ölçmek için, yukarıdaki adımların aynısını aşağıdaki bileşiklerle gerçekleştirin (Şekil 4).
      1. ATP'ye bağlı solunumu değerlendirmek için 1 μM'de oligomisin kullanın.
      2. Herhangi bir mitokondriyal olmayan solunumu değerlendirmek için 1 μM'de antimisin A ve rotenon kullanın.
        NOT: FCCP, oligomisin, antimisin A ve rotenon RPE için toksik olabilir. Önemli hücre ölümüne neden olurlarsa, OCR ölçümleri doğru olmayacaktır. Bu nedenle, OCR ölçümleri sadece belirgin bir hücre ölümünün olmadığı bir zaman noktasında, genellikle ilaçlar eklendikten sonraki ilk birkaç saat içinde elde edilmelidir (Şekil 4).

2. EMT geçiren RPE'de mitokondriyal metabolizmadaki değişikliklerin ölçülmesi

  1. Bölüm 1.2'de belirtilen protokolün aynısını izleyin.
  2. Temel OCR ölçümlerini aldıktan sonra EMT'yi indüklemek için, RPE kültürlerine TGF-β2 (10 ng / mL) ekleyin ve OCR'yi 3 hafta boyunca izleyin. Ortamı her 2-3 günde bir taze TGFβ2 ile yenileyin (Şekil 5).
  3. Haftada en az 2 kez, hücre sayısının değişmediğinden emin olmak için bölüm 1.3'teki gibi parlak alan görüntüleri elde edin. Sayım değişirse, OCR değerlerini her bir kutucuktaki hücre numarasına göre normalleştirin.
    NOT: Aynı protokol, hücreler inkübatördeyken kültür periyodu boyunca uzun süreli OCR değişikliklerini izlemek için diğer EMT indükleyicileri için de kullanılabilir.

3. Hipoksik RPE'de mitokondriyal metabolizmadaki değişikliklerin ölçülmesi

NOT: Sistemin hipoksik, normoksik veya hiperoksik koşullar altında uygulanması, "sandviçin" standart bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirilmiş bir hipoksi odasında (Malzeme Tablosu) tutulması dışında, bölüm 1.2 ile aynıdır.

  1. USB type-c kablosunu monte etmek için hipoksi odasının kapağına bir delik açın ve silikon veya macunla kapatın (Şekil 6A).
  2. Algılama kapağını, hücre kültürü plakası ile davlumbaza monte edin ve bunları hipoksi odasına aktarın.
  3. Hipoksi odasına "sandviçi" (plaka, algılama kapağı, Cihaz) yerleştirin. Ayrıca hipoksi odasına, nemin korunmasına yardımcı olmak için steril su içeren bir Petri kabı yerleştirin. Son olarak, hipoksi odasına taşınabilir bir O2 sensörü yerleştirin (Malzeme Tablosu). Kurulum, Şekil 6A'da görüntülenir.
  4. Hazneyi kapatın ve hipoksik O2 konsantrasyonu ve standart hücre kültürü konsantrasyonu CO2 olan bir gaz silindirine bağlayın (örn.% 1O2 ve% 5 CO2).
  5. Oksijen sensörü istenen O2 konsantrasyonunu gösterene kadar, genellikle %1 ile %10 arasında bir yerde, hipoksi odasındaki havayı silindirdeki %1 O2/5% CO2 havası ile yavaşça değiştirin.
    NOT: Taşınabilir O2 sensörünün dengelenmesi için zaman gerekir, bu nedenle silindirden gelen gaz hipoksi odasına yavaşça eklenmelidir.
  6. Hipoksi odasının giriş ve çıkış valflerini kapatın ve tüm odayı inkübatöre aktarın.
  7. Denemeyi bölüm 1.2'deki gibi ayarlayın ve başlatın.
    NOT: Hücrelere eklemeden önce hipoksi odasındaki ortamın önceden dengelenmesi, hücre tek tabakasının gerçek hipoksi yaşaması için geçen süreyi azaltabilir (Şekil 6B).

4. Hücrelerin hipoksik, normoksik veya hiperoksik koşullarda olup olmadığını belirlemek için RPE tek tabakasındakiO2 konsantrasyonunun hesaplanması

NOT: Sistem, tek katmanlı kültür için ilgili önerilen algılama kapağıyla birlikte standart bir plakanın kullanıldığı varsayılarak, varsayılan olarak kuyu tabanının yaklaşık 1 ila 1.5 mm üzerindeki O2 konsantrasyonunu ölçer (bkz. https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). Hücre tek tabakasındaki O2 konsantrasyonu doğrudan ölçülmese de, sistemden gelen veriler RPE seviyesindeki O2 konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılabilir. Spesifik olarak, O2'nin mevcut olduğu medya sütununun üst kısmı ile O2'nin tüketildiği medya sütununun alt kısmı arasında bir oksijen gradyanı olduğunu bilerek, Fick'in Difüzyon Yasaları, hücre tek katmanındaki O2 seviyelerini tahmin etmek için ölçülen OCR oranı ile birleştirilebilir. Bu tahmin için bir hesap makinesi çevrimiçi olarak sağlanır: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (ve https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture'ta açık kaynaklı etkileşimli bir not defteri biçiminde, bu hesap makinesinin kaynak kodu şu adreste bulunabilir: https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

  1. Hesap makinesine erişildiğinde, ortam hacmini mikrolitre cinsinden (örn. 100 μL) girin.
  2. Doymuş oksijen konsantrasyonunu hava-sıvı arayüzüne (hücrelerin üzerindeki ortam sütununun üst kısmı) girin. Bu değer, %5O2 ve %95 nem ile standart atmosfer basıncında ~185 μM'dir.
    NOT: Bu, yalnızca ortam kuyularındaki (kuyunun dibinde hücre olmayan) sistem probları tarafından yapılan O2 ölçümlerinden de belirlenebilir.
  3. Flux girişine, sistem tarafından bildirilen Flux/OCR'yi girin.
  4. Bu değerlere dayanarak, ortam sütunundaki her yükseklikteki kararlı durum oksijen konsantrasyonu hesaplanır ve çizimde gösterilir (Şekil 7). Arsanın x ekseni , kuyu tabanının üzerindeki mm cinsinden yüksekliktir. Y ekseni , bu yükseklikte (μM cinsinden) hesaplananO2 konsantrasyonudur .
  5. Kuyu dibindeki (hücrelerin bulunduğu yer) O2 konsantrasyonu, grafiğin altındaki çizgide rapor edilir.
    NOT: Genel olarak, in vivo RPE'nin %4-9'luk bir O2 konsantrasyonu gördüğü tahmin edilmektedir. Standart atmosfer koşullarında her 10 μMO2 , yaklaşık% 1O2'ye karşılık gelir. Bu nedenle, hücre düzeyindeki normoksia yaklaşık 40-90 μMO2'dir. Medya sütunu ne kadar yüksek olursa, O2 o kadar düşük RPE tek katman9 seviyesinde olacaktır. Böylece, hücreler hipoksik koşullarda görünüyorsa, ortam hacmi azaltılabilir. Hücreler hiperoksik koşullarda görünüyorsa, ortam hacmi arttırılabilir.

Sonuçlar

Resipher deneyi için "sandviç" kurulumu Şekil 2A'da gösterilmiştir. 96 oyuklu plaka üzerindeki 3, 4, 9 ve 10 numaralı sütunlara karşılık gelen 32 problu algılama kapakları, hücre plakası ile Cihaz arasına oturur. Hub'a bağlandıktan sonra Cihaz, algılama kapağını yukarı ve aşağı hareket ettirmek için motorları etkinleştirir ve ortam kolonundaki O2 konsantrasyonunu hücre tek tabakasının üzerindeki bir yükseklik aralığında (tipik olarak 1-1,5 mm) ölçer. Bu nedenle O2 gradyanı, tek tabakanın üzerindeki bu çeşitli yüksekliklerde O2 konsantrasyonları kaydedilerek sürekli olarak ölçülür. Cihaz, gradyan ölçümlerinden ve Fick'in Difüzyon Yasalarını uygulayarak, hücre tek tabakasının oksijen tüketim oranı (OCR) olan prob yükseklik aralığının üstünden altına kadar oksijen akışını otomatik olarak hesaplar. Algılama kapağı, bir kuyunun boş (yalnızca hava), ortamla dolu ancak hücre yok (yalnızca ortam) veya bir hücre tek tabakasının üzerinde ortam (ortam + hücreler) olup olmadığına bakılmaksızın O2'yi algılar. Algılama kapağındaki sensörlerin ne kadar iyi çalıştığına dair bir kalite kontrolü olarak, kapak önce boş (yalnızca hava) 96 oyuklu bir plakanın üzerine yerleştirilebilir. Her kuyucuk için her bir sensör çalışıyorsa, rapor edilen O2 birbiriyle tutarlı olmalı ve standart hücre kültürü inkübatör koşulları altında atmosferde beklenen O2 'ye yakın olan 200 μM'ye yakın olmalıdır. Şekil 2Bi , atmosferik havadaki sekiz probdan elde edilen O2 okumalarını göstermektedir (varsayılan birim dönüşümü, probların 37 °C sıvı içinde olduğunu varsaydığından μM cinsinden konsantrasyon olarak rapor edilir). Bu okumalar sıkı (%±5) ve 200 μM'ye yakındır, bu da sekiz sensörün tümünün iyi çalıştığı anlamına gelir. Şekil 2Bii'de, Şekil 2Bi'deki ile aynı algılama kapağı kullanılıyor, ancak farklı bir Cihaz kullanılıyor. Burada, aykırı değer eğrilerine (kırmızı renkte) dayalı olarak iki hatalı Cihaz sensörü alınır. Bu, Cihazın sorunlu olduğunu ve değiştirilmesi gerektiğini gösterir (veya hatalı sensörlere karşılık gelen kuyular deneyin dışında bırakılmalıdır). Şekil 2Biii'de, Şekil 2Bi ile aynı Cihaz kullanılır, ancak iki farklı algılama kapağı kullanılır. Kapak1 (sol taraf), problar arasında yüksek değişkenliğe sahiptir, bu da genellikle kapağın çok fazla kullanılması nedeniyle kapağın algılama malzemesinin bozulduğunu düşündürür. Lid2 (sağ taraf) yenidir ve sıkı ve 200 μM civarında kümelenmiş okumaları gösterir. Sistemi kullanarak, ortamdaki serum takviyesinin RPE mitokondriyal metabolizması üzerindeki etkisi analiz edilebilir. Şekil 2C'de görüldüğü gibi, artan serum takviyesi seviyeleri, çok daha yüksek RPE OCR seviyelerini tetikledi. Daha da önemlisi, daha yüksek serum takviyesi, mitokondriyal metabolizmanın daha uzun süre sürdürülmesine de izin verdi. Herhangi bir serum takviyesi olmadan bile, OCR, mitokondriyal metabolik substratların tükenmesi OCR'de bir düşüşü tetiklemeden önce yaklaşık 90 saat boyunca sürdürülür. Bu nedenle, olgun, yüksek derecede farklılaşmış ve polarize RPE kültürlerinde besin tükenmesini önlemek için serumsuz ortamlarda bile serumsuz ortamlarda bile 96 kuyucuk başına 100 μL ile ortam değişiklikleri yeterlidir.

OCR oranları, tüm kuyucukların aynı hücre sayısına ve morfolojisine sahip göründüğü kültürlerde bile kuyudan kuyuya önemli ölçüde değişebilir. Bu nedenle, OCR'deki artışların deneysel bir koşula mı yoksa kuyular arasındaki OCR'deki temel farklılıklara mı atfedilebilir olduğunu izole etmek için normalizasyon gereklidir. Normalleştirmenin ilk adımı, protokol bölüm 1.3'te belirtildiği gibi, kuyular arasındaki hücre sayımlarının tutarlı olmasını sağlamaktır. Hücre sayıları kuyucuklar arasında farklılık gösteriyorsa, kuyu için OCR'nin hücre numarasına normalleştirilmesi gerekir. Genel olarak, oldukça olgun ve polarize RPE kültürleri için, kuyucuklar arasındaki hücre sayıları oldukça tutarlıdır9. Bu tür senaryolarda bile, Şekil 3A'da gösterildiği gibi, kuyular arasındaki temel OCR değişebilir. Burada, herhangi bir tedaviden önce temel OCR, kuyucuklar arasında 100 fmol / mm2 / sn kadar değişir. Tedaviden önce OCR'yi ölçerek, daha sonra deneysel tedavi tarafından tetiklenen Delta OCR belirlenebilir ve bu, kuyular arasındaki temel OCR'deki herhangi bir farklılıktan izole edilebilir. Bu durumda, tedaviler iki mitokondriyal ayrıştırıcıyı (FCCP ve BAM15) araç kontrolü ile karşılaştırmaktadır. Normalizasyon için temel OCR kullanıldığında, ayrıştırıcılara karşı kontrole özgü tedavi etkileri belirgin hale gelir ( Şekil 3B ile Şekil 3C'yi karşılaştırın). Genel olarak, OCR'yi değiştirebilen deneyler en az iki aşamaya ayrılmalıdır: temel bir OCR oluşturmak için ilk OCR ve Delta OCR'yi belirlemek için bir tedavi aşaması.

RPE kültürlerinin mitokondriyal manipülasyona beklenen şekillerde yanıt verdiğini doğrulamak ve RPE için biyoenerjetik bir profil oluşturmak için, Agilent'in Denizatı Analizörü üzerindeki Mitokondriyal Stres Testinde kullanılan klasik küçük molekül araçları sistemle birlikte kullanılabilir. İlk olarak, yedek mitokondriyal kapasite, bir mitokondriyal birleştirici19 kullanılarak ölçülebilir. RPE kültürlerinde, mitokondriyal birleştirici BAM15, toksisiteye neden olmadan FCCP'ye kıyasla OCR'de çok daha sağlam ve sürekli bir artış gösterir (Şekil 3C, D). Bazal solunum, ATP'ye bağlı solunum, proton sızıntısı ve mitokondriyal olmayan solunum kapasitesi dahil olmak üzere Denizatı Analizörü Mitokondriyal Stres Testinde bulunan diğer parametreler sistem kullanılarak hesaplanabilir. Denizatı Analizörü, yukarıdaki parametreleri anlamak için spesifik oksidatif fosforilasyon komplekslerini inhibe eden toksinleri sırayla iletmek için enjeksiyon portlarına güvenirken, Resipher bu yeteneğe sahip değildir. Bununla birlikte, her mitokondriyal toksin ayrı kuyucuklara eklenebilir ve araçla muamele edilen kuyucuklar üzerindeki kat değişimine dayalı olarak farklı solunum parametreleri hesaplanabilir. Şekil 4A'da, mitokondriyal birleştirici BAM15, ATP sentaz inhibitörü oligomisin, kompleks I ve III inhibitörleri antimisin/rotenon ve araç kontrolü (DMSO) ile muamele edilen kuyucuklar arasındaki OCR farklılıklarının tümü karşılaştırılmıştır. Bu toksinler daha uzun süreler boyunca hücre ölümüne neden olabileceğinden ve hücre ölümü OCR'yi etkileyeceğinden, OCR okumaları sadece birkaç saatlik tedaviden sonra alınmıştır. Şekil 4B , Şekil 4A'daki son zaman noktalarından tahmin edilen, çubuk grafik biçiminde her bir mitokondriyal olarak aktif küçük molekül ile muamele edilen araç ve kuyular arasındaki OCR farklarını göstermektedir. Şekil 4B'deki OCR değerleri daha sonra Şekil 4C'de görüldüğü gibi RPE kültürü için biyoenerjetik parametreleri hesaplamak için kullanılabilir. Şekil 4C'deki biyoenerjetik profildeki her renk kodlu değer, Şekil 4B'deki aynı renk kodlu değerden gelir. Bu nedenle, ATP'ye bağlı solunum, proton sızıntısı, maksimal mitokondriyal solunum kapasitesi ve mitokondriyal olmayan solunum kapasitesi gibi parametreler OCR sistemi kullanılarak tahmin edilebilir. Mitokondriyal olarak aktif olan her bir küçük molekülün etki şeklinin bir özeti Şekil 4D'de gösterilmiştir.

RPE kültürleri ve RPE biyoenerjetik profilleri için tahlil yapmak üzere kontrol deneyleri üzerinde bu sistemin protokolünü gösterdikten sonra, sistemin RPE biyolojisi ve patolojisine deneysel uygulamaları keşfedilebilir. Retina dekolmanı veya oküler travmadan sonra ortaya çıkan bir durum olan proliferatif vitreoretinopatide (PVR), RPE, epitelden mezenkimal geçişe (EMT) olarak bilinen dramatik bir dönüşüm geçirir, bu sayede oldukça düzenli ve parke taşı benzeri RPE, hücre hücre adezyonlarını kaybeder ve kasılma ve hareketli olan iğ şeklindeki mezenkimal hücrelere dönüşür 1,2. Bu, retina üzerinde retina dekolmanına neden olabilecek teğetsel kasılma kuvvetlerini tetikler. RPE'de EMT'nin klasik indükleyicileri arasında transforme edici büyüme faktörü-beta (TGFβ) ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNFa)10,11,12 bulunur. Üç memeli TGFβ izoformundan TGFβ2, retina1'deki EMT'nin en belirgin ve güçlü indükleyicisidir ve karakteristik olarak altıgen RPE hücrelerinin belirgin bir hücresel uzamasına ve mezenkimal belirteçlerin ekspresyonunun artmasına neden olur. RPE'de TGFβ2 tarafından indüklenen EMT yanıtına, daha önce bir Denizatı XFe9610 kullanılarak gösterildiği gibi, mitokondriyal solunumun baskılanması ve ardından glikolitik kapasitede bir artış eşlik eder. Denizatı gerçek zamanlı biyoenerjetik profiller sağlarken, uzun süreli OCR izlemesine izin vermez. Bu nedenle, bu çalışmada OCR sisteminin ilk uygulamasında (Şekil 5), mitokondriyal solunum, RPE'de TGFβ2 ile EMT'nin indüklenmesiyle üç hafta boyunca izlendi ve PVR sırasında meydana gelen metabolik yeniden programlamanın in vitro modellemesine izin verdi. Bir Denizatı Analizörü kullanılarak RPE EMT'nin tek zaman noktası analizinden farklı olarak, EMT geçiren RPE'nin metabolik durumu birkaç hafta boyunca izlenebilir. RPE'nin TGFβ2'ye tekrar tekrar maruz kalmasının mitokondriyal metabolizmada sürekli ilerleyici bir düşüşe neden olduğu açıktır. Seahorse XF Analizörü kullanılarak yapılan önceki veriler, TGFβ2'nin 24 saat ve 72 saatte maksimum solunum kapasitesini önemli ölçüde azalttığını, ancak bazal OCR seviyelerini10 etkilemediğini gösterdi. 72 saate kadar TGFβ2 ile değişmeyen bazal OCR, bu çalışmada kullanılan OCR sistemi tarafından desteklenmektedir (Şekil 5). Bununla birlikte, bu çalışmadaki OCR sisteminden elde edilen uzun vadeli veriler, TGFβ2'ye 5 gün maruz kaldıktan sonra bazal OCR seviyelerinin düşmeye başladığını ve bazal OCR'deki düşüşün 20 günde en belirgin hale geldiğini ortaya koymaktadır. Bu bulgular, önceki Denizatı zaman noktalarıyla yakalanmayan bazal OCR'deki uzun vadeli değişiklikleri vurgulamaktadır.

İkinci bir uygulamada, sistem hipoksik koşullar altında RPE mitokondriyal metabolizmasını izlemek için kullanılabilir. AMD, koryokapilleris incelmesi ve hipoksi13,20 ile bağlantılı olduğundan, RPE'nin subtoksik hipoksiye yaptığı ayarlamaları anlamak, AMD patogenezi hakkında bilgi sağlamalıdır. Mitokondriyal metabolizmayı izlerken RPE kültürlerini kontrollü hipoksiye tabi tutmak için, sistem bir hipoksi odasına yerleştirilebilir ve bu da bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirilir. Bu kurulumu kolaylaştırmak için, bir hipoksi odasının kapağına küçük bir delik açılır ve sistemin USB kablosunun hipoksi odasının içine ulaşmasını sağlar. Delik macun veya silikon ile kapatılmıştır (Şekil 6A). Atmosferik O2 seviyelerini izlemek ve hipoksi odası contasının sağlam kalmasını sağlamak için hipoksi odasına taşınabilir bir O2 sensörü yerleştirilebilir. Bu kurulum kullanılarak, atmosferikO2 konsantrasyonu ile ortamO2 konsantrasyonu arasındaki denge oranı belirlenebilir. Şekil 6B'de, atmosferik O2 ile dengelenmiş ortam, herhangi bir hücre olmadan, 96 oyuklu bir plaka üzerindeki ayrı oyuklara yerleştirilir ve sadece% 5O2 (~ 50 μM O2) içeren bir hipoksi odasına sokulur. Zamanla, her bir kuyucuğundaki ortam yeni atmosferik konsantrasyon ile dengelenir. Ortam sütunu yüksekliği ne kadar yüksek olursa (daha fazla hacim), dengeleme o kadar uzun sürer. 96 oyuklu bir plakanın kuyusunda 65 μL ortam ile, atmosferik O2 ile denge yaklaşık 5 saat sürer. Bununla birlikte, ortam hacmi 100-200 μL olduğunda denge süresi 10 saatten fazla sürer. Bu sonuçlar, bir hipoksi deneyi sırasında ortamı hücrelere uygulamadan önce ortamın istenen atmosferik O2 konsantrasyonu ile önceden dengelenmesinin önemini vurgulamaktadır.

Hipoksi deneyleri için, hipoksi odasındaki O2 seviyelerinin sabit kalmasını sağlamak önemlidir. 96 oyuklu plakadaki kenar kuyularından birini hücrelerden veya ortamdan uzak tutmak, algılama kapağı sensörlerinden birinin atmosferik O2'yi sürekli olarak izlemesine olanak tanır. Şekil 6C'de, havaya maruz kalan tek bir kuyu ile bu tür bir izleme, hipoksi odasının yavaş bir sızıntıya sahip olduğunu, öyle ki 30 saate kadar hücrelerin atmosferikO2 konsantrasyonlarına yakın olduğunu göstermektedir. Hipoksi deneyleri için son bir kontrol olarak,O2 çözünürlüğünün "taze" ve "koşullanmış" ortamlar arasında farklılık gösterip göstermediğini belirlemek önemlidir. Çözünürlük, başlangıçta hücrelere yerleştirilen ortam ile önemli bir süredir hücrelerde bulunan ortam arasında farklılık gösteriyorsa, hücrelerin üzerindeki ortam sütunundaki O2 gradyanı, hücreler üzerinde zamanla ortam "koşulları" olarak farklılık gösterecektir. Bu da OCR'nin hesaplanmasını etkiler. Şekil 6D'de, boş kuyucuklara sahip 96 oyuklu bir plaka ("hava"), hücresiz ancak taze ortamlı kuyular ("yeni ortam") ve hücresiz ancak daha önce RPE kültürleri üzerinde 48 saat boyunca inkübe edilmiş ortamlı kuyular ("şartlandırılmış ortam") ilk olarak tam dengeyi sağlamak için atmosferik O2'ye yerleştirildi. Plaka daha sonra yaklaşık% 3-4O2 (30-40 μM) oranında bir hipoksi odasına yerleştirildi ve dengelenmesine izin verildi. Son olarak, plaka tekrar atmosferikO2 konsantrasyonlarına geri döndürüldü. Yeni ortam ve koşullandırılmış ortam için O2 konsantrasyon eğrileri aynıdır, bu da yeni ve koşullu ortam arasındaki O2 çözünürlüğünün aynı olduğunu gösterir, besinler tüketildikçe ve yan ürünler ortama salgılandıkça zaman içinde ortam bileşimindeki değişikliklerin O2 çözünürlüğünü anlamlı bir şekilde değiştirmediğini ve bu nedenle istemeden OCR'yi etkilemediğini doğrular.

Ortam sütununun hücrelerin üzerindeki yüksekliği, RPE tek katman9'da O2 kullanılabilirliğini önemli ölçüde etkilediğinden, belirli bir ortam hacminin RPE tek katmanında hipoksi, normoksi veya hiperoksiye neden olup olmadığını belirlemek önemlidir. Sistemden yapılan ölçümler kullanılarak, çevrimiçi bir hesap makinesi (https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (ve https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture'da açık kaynaklı etkileşimli bir not defteri biçiminde) - bu hesap makinesinin kaynak kodu https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator'da) birlikte, RPE tek katmanındaki oksijen konsantrasyonu tahmin edilebilir. Şekil 7'de etkileşimli hesap makinesinin ekran görüntüsü gösterilmektedir. RPE in vivo tipik olarak %4-9'luk birO2 konsantrasyonu görür ve bu da ~40-90 μM'lik bir O2 molar konsantrasyonuna dönüşür.

figure-results-1
Şekil 1: Farklı algılama kapaklarındaki sensörlerin konumu, 32 kanallı algılama kapağı için plaka düzeni ve RPE morfolojisi. (A) 4 Kanallı, (B) 32 Kanallı ve (C) 96 Kanallı kapak seçenekleri için farklı algılama kapaklarındaki sensörlerin konumuna karşılık gelen kuyular. (D) 32 kanallı sensör kapağı için önerilen plaka düzeni. Kenar etkileri nedeniyle, hücreler kenar kuyularına tohumlanmamalı ve bunun yerine bu dört oyuğa (mor) ortam yerleştirilmelidir. Hücreler portakal kuyularına ekilir. Buharlaşma etkilerini önlemek için kalan kuyular steril su (mavi) ile doldurulmalıdır. (E) Altıgen, sıkıca paketlenmiş, pigmentli hücrelere sahip olgun RPE kültürü. Ölçek Çubuğu = 20 μm. Kısaltmalar: RPE = retina pigment epiteli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Resipher sistemi "sandviç" kurulumu ve kalite kontrolü. (A) Algılama kapağı, standart bir 96 kuyulu plaka kapağının yerini alır ve probları ilgili kuyucuklara yerleştirilir. Siyah renkli Cihaz, mıknatıslar aracılığıyla algılama kapağına sıkıca oturur. Şeklin sol tarafındaki resimler, Cihazı ve algılama kapağını doğru yönlerinde göstermektedir. Bununla birlikte, sağ taraftaki fotoğraflar için, Cihaz ve algılama kapağı, alt profillerini daha iyi göstermek için yanlarına döndürülmüştür. (B) Kapakları ve Cihazı algılamak için kalite kontrolü. (i,ıı) Aynı algılama kapağı, 96 oyuklu boş bir alıcı plakasına (yalnızca hava) yerleştirilir ve algılama kapağının üzerine sırayla iki farklı Cihaz yerleştirilir. (i) İlk Cihaz, atmosferik O2 için beklenen, düşük değişkenliğe ve ~200 μM O2 okumalarına sahip sekiz probdan gelen verileri gösterir. (ii) İkinci Cihaz, iki probun anormal bir şekilde okuduğu sekiz probdan (kırmızı noktalar) gelen verileri gösterir. (iii) Bir Cihaz, boş bir 96 kuyulu plaka (yalnızca hava) ile kullanıldı, ancak iki farklı algılama kapağı sırayla test edildi. 16 probdan elde edilen veriler çizildi ve Lid1 (sol taraf) için geniş değişkenlik ve Lid2 (sağ taraf) için düşük değişkenlik gösterdi. (C) Farklı miktarlarda serum içeren 100 μL ortamdaki RPE kültürlerinin OCR grafikleri 120 saat boyunca izlendi. Serum serbest ortamdaki (macenta) RPE hücreleri daha düşük OCR'ye sahiptir ve OCR, daha yüksek miktarda serum içeren ortamdan daha erken düşer. Kısaltmalar: OCR = oksijen tüketim oranı; RPE = retina pigment epiteli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Mitokondriyal ayrıştırıcıların uzun vadeli etkileri, OCR sistemi ile benzersiz bir şekilde gösterilmiştir. (A) İlk OCR'yi (50 saat boyunca oluşturulan), tedavi aşamasını (ilaçların eklenmesinden ~ 20 saat sonra) ve iyileşme aşamasını (ilacın yıkanmasından ~ 20 saat sonra) vurgulayan zaman (saat) içindeki ham OCR verileri. RPE, FCCP (3 μM, N = 4) veya BAM15 (500 nM, N = 4) olmak üzere iki farklı mitokondriyal ayrıştırıcı ile tedavi edildi ve DMSO araç kontrolü (% 0.6, N = 7) ile karşılaştırıldı. Her iz tek bir kuyuyu temsil eder. (B) Tedavi ve geri kazanım aşamaları için çizilen (A)'daki her koşul için tüm kuyuların ortalama OCR'si. Normalizasyon olmadan (Y ekseni mutlak OCR'dir), FCCP ile tedavi etkisinin büyüklüğünü görmek zordur. (C) İşlemden önce her bir OCR izi OCR'sinden çıkarıldığında, bir Delta OCR hesaplanabilir (Y ekseninde çizilir). Bu, kuyular arasındaki temel OCR'deki değişkenliğe rağmen, tedavinin OCR üzerindeki etkilerini izole etmeye izin verir. Delta OCR kullanarak, FCCP'nin etkisi belirginleşir. Ayrıca, FCCP'nin mitokondriyal ayrılma üzerindeki etkisinin, BAM15'e kıyasla ne kadar kısa ömürlü olduğu da ortaya çıkıyor. Son olarak, FCCP ile karşılaştırıldığında, ilaç yıkandıktan sonra bile BAM15'e maruz kalmanın, sürekli daha yüksek OCR'nin yeni bir "uyarlanmış" durumu yarattığı ortaya çıkmaktadır. (D) (B) ve (C)'deki çizimler, normalleştirilmemiş (soldaki grafik, (B)'den) ve normalleştirilmiş (Delta OCR, sağ grafik, (C)'den) veriler arasında doğrudan karşılaştırmaya olanak tanıyan çubuk grafik biçiminde görüntülenir. Kısaltmalar: OCR = oksijen tüketim oranı; RPE = retina pigment epiteli; FCCP = karbonil siyanür-p-triflometoksifenilhidrazon; DMSO = dimetil sülfoksit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Mitokondriyal biyoenerjetik parametrelerini hesaplamak için OCR sisteminin kullanılması. (A) Denizatı Analizörü Mitokondriyal Stres Testinin bir parçası olan aynı küçük molekülleri kullanarak, tedavi aşamasının ilk 2,5 saati boyunca OCR, RPE kültürleri için tasvir edilmiştir. (Soldaki grafik) ATP-sentaz inhibitörü oligomisin (N = 3), kompleks I ve III inhibitörleri antimisin A / rotenon (N = 7) veya araç, DMSO% 0.4 (N = 4). (Sağdaki grafik) Mitokondriyal birleştirici BAM15 (N = 4) veya araç DMSO% 0.6 (N = 4). (B) Her tedavi grubu için son üç zaman puanının ortalaması ((A)'daki kırmızı kutular). (C) Resipher verilerine dayalı simüle edilmiş bir Denizatı Analizörü Mitokondriyal Stres Testi biyoenerjetik profilinin tasviri. Simüle edilen grafikteki renk kodlu veri noktaları, (B) içindeki renk kodlu çubuk grafiklere karşılık gelir. Tüm solunum parametreleri Resipher verileri kullanılarak hesaplanabilir ve küçük moleküller seçilebilir. (D) Şekil 3 ve Şekil 4'te kullanılan reaktiflerin etki şeklinin diyagramı.Kısaltmalar: OCR = oksijen tüketim oranı; RPE = retina pigment epiteli; DMSO = dimetil sülfoksit; AA = Antimisin A; Çürük = Rotenone. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: TGFβ2 tarafından uyarılan epitelyal-mezenkimal geçiş geçiren RPE'nin uzun süreli OCR izlemesi. Olgun primer insan RPE kültürleri her 2-3 günde bir 10 ng/mL TGFβ2 veya araç kontrolü ile tedavi edildi. (A) Gerçek zamanlı OCR ölçümleri, (B) Zaman içinde Delta OCR'nin miktar tayini ile 3 hafta boyunca izlendi (19. gün-6. gün). N = koşul başına 6-7 kuyucuk, eşleşmemiş t-testi, * P < 0.05. Kısaltmalar: OCR = oksijen tüketim oranı; RPE = retina pigment epiteli; TGFβ2 = dönüştürücü büyüme faktörü beta-2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Hipoksiye RPE mitokondriyal yanıtının izlenmesi. (A) OCR sistemi "sandviçi" bir hipoksi odasına monte edildi ve USB kablosu, kapakta açılan bir delik aracılığıyla Hub'a bağlandı ve silikon gres veya macunla kapatıldı. Ayrıca hipoksi odasında, nemi korumak için steril su içeren bir Petri kabı ve taşınabilir bir O2 sensörü bulunur. Hipoksi odasının atmosferi daha düşük birO2 konsantrasyonu ile değiştirildikten sonra tüm sistem bir hücre kültürü inkübatöründe bırakıldı. (B) Ortamın hava-sıvı arayüzünün üzerindeki O2 konsantrasyonlarına dengelenmesi zaman alır. Atmosferik O2'ye dengelenmiş farklı hacimlerde RPE ortamı, 96 oyuklu bir plakanın boş kuyucuklarına (hücre yok) eklendi. Hipoksi odası daha sonra% 5 (50 μM) O2'ye ayarlandı. Her bir kuyucuğun ortamındaki O2 konsantrasyonu 20 saat boyunca izlendi. Daha yüksek ortam hacimlerine sahip kuyular, düşük ortam hacimlerine göre daha yavaş bir şekilde %5 O2'ye dengelenmiştir. N = 8 olur. (C) Sistem, hipoksi odasındaki hava sızıntılarını tespit etmek için kullanılabilir. Hipoksi odası %1O2 ile kuruldu ve algılama kapağı boş kuyucukların üzerine yerleştirildi (sadece hava). Hipoksi odasının giriş ve çıkış portları açık bırakıldı ve hipoksi odası atmosferi ~ 90 saatin üzerindeki atmosferikO2 seviyelerine yeniden dengelendi. (D) Yeni ortam ve süpernatanlar ("şartlandırılmış ortam") benzerO2 çözünürlüğüne sahiptir. Bu, kültürdeyken bileşimi değiştikçe ortamdaki diferansiyel O2 çözünürlüğü endişesini ortadan kaldırır ve bu da zaman içinde OCR okumalarının tutarlılığını etkiler. Aynı hacimde (100 μL) taze ortam ("yeni ortam") veya hücreler üzerinde 48 saat inkübe edilmiş ortam ("şartlandırılmış ortam"), hücresiz bir plakanın kuyucuklarına eklendi. OCR sistemi "sandviçi" başlangıçta atmosferik O2 seviyelerine tabi tutuldu, daha sonra hipoksi odasına (% 3-5 O2 veya 30-50 μM) aktarıldı, daha sonra tekrar atmosferik O2 seviyelerine transfer edildi. Havadaki O2 seviyeleri, boş (sadece hava) kuyularda sondalar tarafından izlendi. İki ortam türü arasındaki her geçiş sırasındaO2 konsantrasyonundaki değişiklik aynıdır, bu da iki ortam türü arasındakiO2 çözünürlüğünün aynı olduğunu gösterir. N = 6 olur. Kısaltmalar: OCR = oksijen tüketim oranı; RPE = retina pigment epiteli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Çevrimiçi bir hesap makinesi ile belirlenen RPE tek katmanındaki O2 konsantrasyonları. Çevrimiçi hesap makinesinin ekran görüntüsü (https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture). RPE tek katmanında bulunan oksijen miktarını belirlemek için hesap makinesinin nasıl kullanılabileceğine ilişkin ayrıntılar için metne bakın. Kısaltmalar: RPE = retina pigment epiteli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Sorun giderme deneyleri: buharlaşma, sağlıksız hücreler ve aşırı OCR dalgalanmaları. (A) Aşırı buharlaşma. Bir kuyu için OCR izlemesinde düzensizlik olduğunda, sistemin çevrimiçi arayüzündeki (Sol) Ortam sekmesine tıklayarak başlayın. Burada nem, sıcaklık ve atmosferik basınç izlenebilir. Hücre kültürü inkübatörünün açılması nemi geçici olarak bozacaktır (eser üzerinde 2 saat ve 28 saate bakın). Bununla birlikte, 30 saatten başlayarak, nem izi, kapı açılmadan bile zamanla sürekli olarak azalır. Bu, hücre kültürü inkübatörü su tepsisinin kuru olduğunu gösterir. Nem veya sıcaklıktaki herhangi bir bozulma OCR okumalarını değiştirecektir. (Sağda) Düşük nem buharlaşmayı şiddetlendirir. Sağdaki izde, hızlı buharlaşma geçiren bir kuyu, sensör probu gezisinin üst ve alt kısmı arasında (RPE tek tabakasının 1 mm ila 1,5 mm üzerinde) O2 konsantrasyonunda giderek daha küçük farklılıklar göstermektedir. Bu, prob ucunun hava-medya arayüzüne yakın olduğunu gösterir. O2 konsantrasyonu, bilinen atmosferik O2 konsantrasyonlarına (~ 200 μM) yakın bir değerde "düz çizgiler" okuduğunda, bu, prob ucunun tamamen ortam kolonunun dışında olduğunu ve yalnızca örnekleme havası olduğunu gösterir. OCR okumaları artık geçerli değildir ve bu tür kuyuların derhal medya değişikliğine ihtiyacı vardır. (B) Sağlıksız hücreler. Her bir kuyunun O2 ve OCR izinin çizilmesi, genellikle hücrelerin sağlıksız olmasından kaynaklanan bir aykırı değer kuyusunun tanımlanmasını sağlar. Burada, mavi iz ile belirlenen kuyu sağlıksızdır. N = 6 kuyu. (C) Kuluçka makinesi kapı açıklıkları ve ortam değişimi. İnkübatör kapısı açıklıkları sırasında atmosferik nem, sıcaklık, basınç ve CO2'deki değişiklikler, herhangi bir ortam değişikliği ile birlikte, kuyuda kurulan dengeO2 gradyanını geçici olarak bozar ve bu grafiklerde erken ve geç anormal O2 ve OCR artışlarına neden olur. N = 6 kuyu. Kısaltmalar: OCR = oksijen tüketim oranı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: Sorun giderme deneyleri: ortam hacmi ve normalleştirme. (A) Ortam ses seviyesi, mümkün olan maksimum OCR'yi sınırlar. Daha yüksek ortam hacimleri, RPE tek katmanında daha düşük O2 kullanılabilirliğine yol açtığından, 96 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğundaki her ortam hacmi maksimum OCR'ye sahiptir. Bu OCR'nin üzerinde, hücreler seviyesindeki O2 esasen %0'dır (anoksik). Bu nedenle, belirli bir ortam hacmi için maksimum teorik OCR'ye yakınsa, ortam sesini düşürmenin faydası vardır, böylece deney boyunca OCR "tavan etkisi" görülmez. Her ortam hacminde (standart 96 oyuklu bir plakada) elde edilebilecek maksimum teorik OCR gösterilir. Tüm değerler, protokol bölüm 4'te tartışılan ve Şekil 7'de gösterilen çevrimiçi hesap makinesi kullanılarak hesaplanmıştır. (B) Uygun normalleştirme. Bir değişkenin başka bir değişkenin mitokondriyal metabolizmayı indükleme yeteneği üzerindeki etkisiyle ilgilenen deneyler için, bir Delta-Delta OCR deney düzeneği idealdir. (B)'deki kurulumda, iki farklı ortamın palmitatın β-oksidasyonunu teşvik etme yeteneği test edilmiştir. Yağ asidinde β-oksidasyon meydana gelirse, mitokondriyal OCR'de önemli bir artış olmalıdır. Bazı ortamlar palmitat β-oksidasyonunu diğer ortamlardan daha iyi teşvik edebilir. OCR grafiğinin sol tarafında, RPE kültürlerinin paralel kuyularına iki farklı ortam (Medya 1 ve Ortam 2) tanıtılır. Temel OCR elde edilir. Daha sonra palmitat, her bir ortam türünü içeren oyukların yarısına eklenir. Bu dört koşul oluşturur: Medya 1 - palmitat, Medya 1 + palmitat, Medya 2 - palmitat, Medya 2 + palmitat. Bu yeni ortam koşullarının her birine verilen OCR yanıtı kaydedilir. Daha sonra, deneysel işlemlerden sonraki OCR değerleri (Tedavi aşaması altındaki kırmızı kesikli kutunun ortalaması), tedaviden önceki temel OCR değerlerinden (Başlangıç aşaması altındaki kırmızı kesikli kutunun ortalaması) çıkarılır ve Delta OCR çubuk grafikleri oluşturulur (sol altta). Son olarak, Ortam 1 ile Ortam 2'nin β oksidasyonu teşvik etme yeteneği bir Delta-Delta OCR çubuk grafiğinde (sağ altta) belirlenir. Burada, "Ortam 1'in Delta OCR'si + palmitat" ile "Ortam 1'in Delta OCR'si - palmitat" arasındaki fark hesaplanır ve "Ortam 2'nin Delta OCR'si + palmitat" ile "Ortam 2'nin Delta OCR'si - palmitat" arasındaki farkla karşılaştırılır. Bu tür deneysel kurulum ve normalleştirme, Medya 1 ile Medya 2'nin β-oksidasyonu teşvik etme üzerindeki etkilerini izole eder; bu normalleştirmenin genel yapısı, bir değişkenin başka bir değişkenin OCR'yi değiştirme yeteneği üzerindeki etkisini ölçen herhangi bir deney için geçerlidir. Kısaltmalar: OCR = oksijen tüketim oranı; RPE = retina pigment epiteli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: RPE hücre kültürü ortamı tarifi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

RPE'nin mitokondriyal metabolizması, AMD ve PVR dahil olmak üzere yaygın kör edici retina hastalıklarının patogenezinde kritik bir rol oynar. RPE mitokondriyal metabolizmasının in vitro olarak modellenmesi, kişinin metabolik durumunu çevre dokularınkinden izole etmesine ve dokuyu kontrollü bir şekilde farklı hastalık simüle eden hakaretlere maruz bırakmasına olanak tanır. RPE mitokondriyal metabolizmasının bu tür in vitro modellemesi, in vivo RPE'ye yakın bir şekilde yaklaşmak için gerekli olan uygun farklılaşma durumuna ve polariteye ulaşan yüksek kaliteli insan primer ve iPSC-RPE kültürlerinin ortaya çıkmasıyla kolaylaştırılmıştır. Bu tür kültürlerde oksijen tüketim oranının (OCR) izlenmesi mitokondriyal metabolizmanın izlenmesi için ideal bir yöntem olsa da, OCR izleme kurulumu genellikle yüksek polarize ve tamamen farklılaşmış RPE için gerekli koşullarda büyüyen kültürleri engeller. Burada, Resipher'ı, yüksek oranda farklılaşmış ve polarize RPE kültürlerinde OCR'nin gerçek zamanlı, uzun vadeli değerlendirmesi yoluyla RPE mitokondriyal metabolizmasını izlemek için yeni bir sistem olarak tanımlıyoruz.

RPE'de OCR'yi izlemek için başka yöntemler de kullanılmıştır. Seahorse XF Analyzer, mitokondriyal fonksiyonun akut manipülasyonları ile OCR'yi kısa süreler boyunca izlemek için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, Denizatı tahlilleri, hücrelerin yüksek RPE polaritesini ve farklılaşmasını desteklemeye elverişli olmayan özel plakalar üzerinde büyütülmesini gerektirir21. Calton, Vollrath ve meslektaşları, mikro gözenekli zarı parçalara ayırarak ve bunları Denizatı plakasına yerleştirerek mikro gözenekli destekler üzerinde büyütülen yüksek derecede farklılaşmış RPE kültürlerinin değerlendirilmesi için Denizatı'nı uyarladılar, ancak bu yöntem hala hücrelerin CO2'ye erişimi olmadığı için kültürlerin kısa süreli, son nokta izlemesi için çalışıyor Test sırasında, tahlil sadece steril olmayan koşullar altında yapılabilir ve mikro gözenekli desteğin kesilmesi, zamanla mikro gözenekli desteğin kenar kısmında ölüm ve işlev bozukluğuna neden olacaktır22. Barofuse, mikro gözenekli destekler üzerinde büyütülen RPE şeritlerinin perfüzyon sistemine yüklenebildiği ve OCR'nin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayan pompasız bir perfüzyon sistemidir23. Calton, Vollrath ve meslektaşları tarafından Denizatı için değiştirilmiş kuruluma benzer şekilde, Barofuse ile RPE değerlendirmesinin ana sınırlamaları, mikro gözenekli destekleri kesme ihtiyacı ve testin kısa vadeli, son nokta doğasıdır. Oksigraf ayrıca metabolik manipülasyonlara yanıt olarak OCR'deki hızlı kinetik değişiklikler için tasarlanmıştır24. RPE kültürleri için kullanılmamıştır ve Denizatı ve Barofuse ile yüksek derecede polarize ve farklılaşmış RPE kültürlerini değerlendirmek için aynı sınırlamalara maruz kalacaktır.

Bu diğer yöntemlerin aksine, burada açıklanan OCR sistemi, RPE, standart bir hücre kültürü CO2 inkübatöründe standart RPE ortamı ile standart koşullar altında standart hücre kültürü plakalarında/substratlarında kültürlenirken OCR'nin izlenmesine izin vererek, yüksek derecede farklılaşmış ve polarize RPE kültürlerinin kolay ve rahat bir şekilde problanmasını sağlar. Sistem tarafından gerçek zamanlı OCR değişiklikleri hakkında veri üretilmesine ek olarak, aynı hücreler OCR izleme süresinin sonunda ek tahliller için kullanılabilir. Bu, bir müdahalenin OCR üzerindeki etkisinin haftalar boyunca tekrar tekrar test edildiği (örneğin, Şekil 5'te RPE EMT indüksiyonu) veya bir müdahaleden uzun vadeli iyileşmenin test edilebileceği (örneğin, Şekil 3'te mitokondriyal ayrılmadan kurtarma) veya ilk müdahaleye yanıt olarak kademeli metabolik değişikliklerin izlenebildiği (örneğin, Şekil 1'de ortam besinleri tükendiğinde serumun OCR üzerindeki etkileri) oldukça esnek deneylere izin verir 2). Bu makaledeki OCR sistemi, yüksek derecede polarize ve farklılaşmış RPE kültürlerinde OCR'yi ölçmek için özellikle uygundur. Bu tür kültürler, sıkı paketleme ve ağır pigmentasyon ile işlevsel olarak postmitotiktir. Bu, her bir kuyucuğun neredeyse aynı hücre numaralarını9 içerdiği anlamına gelir, böylece çoğu deney için OCR'yi hücre numarasına normalleştirme ihtiyacını ortadan kaldırır. Hücre sayısına normalleştirme gerektiğinde bile, ağır RPE pigmentasyonu ve iyi sınırlandırılmış hücre sınırları, normalizasyonun, parlak alan görüntülemeye dayalı invaziv olmayan basit bir hücre sayımı ile gerçekleşmesine izin verir. Şekil 5'teki EMT deneyleri gibi farklılaşmamış RPE ve RPE proliferasyonunu içeren deneyler için, "hücre başına" OCR'nin ne olduğunu bilmek için kuyu başına OCR'yi hücre sayısına normalleştirmek gerekli hale gelir.

Retina alanının dışında, sistem, pankreas adacık hücreleri25, iskelet kası26, yumurtalık kanseri27, kardiyomiyositler28 ve hatta C. elegans29 gibi tüm organizmalar dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde hücresel solunum ve metabolik aktiviteyi incelemek için kullanılmıştır. Burada açıklanan OCR sistemini kullanarak OCR'nin gerçek zamanlı, uzun vadeli izlenmesi, bu çeşitli hastalık modellerinde biyoenerjetik kaymalar ve mitokondriyal işlev bozukluğu hakkında önemli bilgiler ortaya çıkardı.

Resipher sistemi sınırlamalar taşır. OCR'yi belirleme yöntemi, Denizatı Analizörü, BaroFuse veya Oxygraph'tan temel olarak farklıdır. OCR'yi hesaplamak için bir O2 gradyanının oluşturulmasını gerektirir ve gradyanın oluşturulması saatler alabilir. Bu nedenle, diğer sistemlerde mümkün olan hızlı kinetik deneyler bu sistemle mümkün değildir. Ayrıca, diğer sistemlerden farklı olarak, Resipher, küçük moleküllerin hızlı bir şekilde iletilmesi veya metabolitlerin toplanması için herhangi bir enjeksiyon portuna sahip değildir. Bunun yerine, algılama kapağı bir hücre kültürü başlığında çıkarılmalı, ilaçlar çivilenmeli veya ortam değiştirilmeli ve analiz edilecek metabolitlerin manuel olarak toplanması gerekir.

Bu belgede açıklanan OCR sistemini kullanarak bir deney oluşturmak ve sorun gidermek için aşağıdakiler önerilir. İlk olarak, buharlaşmayı en aza indirin. RPE tek katmanının üzerindeki ortam sütunundaki O2 gradyanının, sütun9'un yüksekliğine büyük ölçüde bağlı olduğunu ve sistemin OCR'yi O2 gradyanına göre hesapladığını hatırlayın. Bu nedenle, deney sırasında buharlaşma nedeniyle ortam sütununda belirgin bir alçaltma varsa, O2 gradyanı değişecek ve OCR okumalarını etkileyecektir. Kuluçka makinesinin su tepsisini dolu tutmak çok önemlidir, ancak 96 oyuklu plakanın kullanılmayan tüm kuyularına su yerleştirilmesi de önerilmektedir. Ayrıca, plakanın kenarındaki kuyular daha yüksek buharlaşma oranlarına sahiptir, bu nedenle bu kuyucuklar yukarıda sunulan tipik deneylerde hücrelerden boş bırakılır. OCR sistemindeki nem sensörü, kuluçka makinesinin neminin izlenmesine yardımcı olabilir. Şekil 8A'da, deney sırasında nemdeki düşüş, inkübatörün su tepsisinin boş olduğunu göstermektedir. Kuyuda buharlaşma hızlandıkça, kuyu için O2 konsantrasyonu okumaları daha yükseğe tırmanacak ve sonunda atmosferik O2 konsantrasyonunda (~ 200 μM) "düz çizgi" olacaktır (Şekil 8A).

İkinci olarak, OCR sisteminin "sandviçinin" uygun şekilde monte edildiğini onaylayın. Cihazın altındaki ve algılama kapağının üstündeki metal temas noktaları temiz olmalı ve tam teması engelleyecek kalıntılar olmamalıdır. Cihaz ve algılama kapağı, herhangi bir eğim olmaksızın 96 oyuklu plaka üzerine tam olarak aynı hizada ve eşit şekilde hizalanmalıdır. Cihazı Hub'a bağlayan USB kablosu gergin olmamalıdır, bu da "sandviçin" torkuna ve Cihazın düzgün hareketinin kısıtlanmasına neden olabilir.

Üçüncüsü, Cihazın ve algılama kapağı sensörlerinin kalibre edildiğinden emin olun. Şekil 2B , her deneyin başında uygun sensör işlevinin nasıl hızlı bir şekilde kontrol edileceğini detaylandırır. Dördüncüsü, deneysel manipülasyondan önce belirli bir kuyunun aykırı bir OCR göstermediğinden emin olun. Sensörlerin çalıştığından emin olduktan sonra, hücreli tüm oyuklar için temel OCR değerlerinin belirlenmesi, belirli kuyucukların sağlıksız hücreler içerip içermediğini belirlemeye yardımcı olabilir. Şekil 8B , mavi renkli kuyunun açıkça daha düşük bir OCR (ve dolayısıyla yüksekO2 konsantrasyonu) gösterdiği temel OCR değerlendirmesine tabi tutulan birkaç kuyuyu göstermektedir. Bu kuyu bir aykırıdır ve deneysel manipülasyonun dışında tutulmalıdır.

Beşincisi, aktif OCR okumaları sırasında çevresel manipülasyonları en aza indirin. O2 gradyanı, sıcaklık, nem, inkübatör CO2 seviyeleri ve atmosferik basınçtaki değişikliklere karşı oldukça hassastır. İnkübatör kapısının açılması bu faktörleri önemli ölçüde etkiler ve medya kolonunun O2 gradyanı dengeye dönene kadar OCR okumalarında geçici kesintilere neden olur (Şekil 8C). OCR'yi etkileyen parametreler, sistemin çevrimiçi arayüzünde "Ortam" sekmesi altında izlenebilir (Şekil 8A).

Altıncı olarak, deney için en uygun ortam hacmini belirleyin. Yetersiz ortam hacmi, aşırı buharlaşmadan (yukarıdaki ilk sorun giderme önlemine bakın) veya ortamdaki besin maddelerinin erken tükenmesinden kaynaklanan artefaktlar oluşturabilirken, aşırı ortam hacmi, RPE tek katmanına O2 kullanılabilirliğini sınırlar ve hipoksi9'u tetikler. Şekil 7 , ortam hacminin RPE tek katmanındaki O2 konsantrasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için mevcut olan çevrimiçi hesap makinesinin bir ekran görüntüsüdür. Belirli bir ortam hacmi için mümkün olan maksimum OCR, Şekil 9A'da görüntülenir. Belirli bir hacim kullanılarak yapılan belirli bir deney için OCR oranı, Şekil 9A'da gösterilen hıza yaklaşırsa, RPE tek tabakasındakiO2 konsantrasyonu anoksiye (%0) yaklaşır ve daha düşük bir ortam hacmi gerekir. Genel olarak, RPE kültüründe mitokondriyal olarak yoğun süreçleri içeren deneyler, 96 oyuklu başına 75 μL'den büyük olmayan ortam hacimlerine sahip olmalıdır.

Yedincisi, deneysel bir müdahalenin OCR üzerindeki etkilerini izole etmek için uygun normalleştirme yapın. Farklı kuyular farklı temel OCR'ye sahip olabileceğinden, deneysel bir müdahaleden önce her kuyu için temel OCR okumaları elde etmek çok önemlidir. Deneysel müdahalenin OCR üzerindeki etkisini gösteren "Delta OCR"yi elde etmek için deneysel müdahaleden sonra temel OCR'yi OCR'den çıkarın. "Delta OCR" elde etme yöntemi Şekil 3 ve Şekil 9B'de gösterilmiştir. Bir deneysel müdahalenin başka bir deneysel müdahalenin OCR'yi indükleme yeteneği üzerindeki etkileriyle ilgileniyorsa, ek bir normalleştirme adımı olan "Delta-Delta OCR" gereklidir. Böyle bir örnek, palmitatın (bir deneysel müdahale) artan OCR'yi (β-oksidasyonun indüksiyonu yoluyla) indükleme yeteneğinin, RPE kültürü için ortam tipine (ikinci bir deneysel müdahale) bağlı olduğu Şekil 9B'de gösterilmiştir.

Son olarak, kontaminasyon riskini en aza indirin. Sistem, hücrelerin üzerindeki ortama bir oksijen sensörü yerleştirerek OCR'yi izler. Bu da enfeksiyon riskini artırır. Deney sırasında OCR'de beklenmeyen düşüşler veya deneyin başlangıcında beklenmedik şekilde düşük OCR, bir enfeksiyonun belirtisi olabilir. Plakaların hücre kültürü mikroskobu altında enfeksiyon açısından aktif olarak izlenmesi gerekir. Bir algılama kapağı yeniden kullanılırsa 96 oyuklu plakalar arasında çapraz kontaminasyon meydana gelebilir. Bu tür çapraz kontaminasyonu en aza indirmek için, bir deney yapıldıktan sonra, algılama kapağının yeni bir deneyde yeniden kullanılmasından önce, dekontaminasyon için tüm kapak 20 dakika boyunca %70 etanole daldırılmalıdır (bkz. protokol bölüm 1.2.15).

Sonuç olarak, Resipher adı verilen yeni bir sistem kullanılarak OCR'nin değerlendirilmesi yoluyla yüksek kaliteli RPE kültürlerinde mitokondriyal metabolizmanın gerçek zamanlı, uzun süreli izlenmesi için bir protokol sunulmuştur. Yüksek derecede polarize ve farklılaşmış RPE kültürleri üzerinde, özellikle izole RPE'nin fizyolojik metabolik özelliklerinin yanı sıra AMD ve PVR dahil retina hastalığının in vitro modellerinde değişmiş RPE metabolizmasının araştırılması üzerinde çok sayıda uygulama için kullanılabilir.

Açıklamalar

Richard A. Bryan ve Kin Lo, Resipher sistemini üreten Lucid Scientific'in çalışanlarıdır.

Teşekkürler

Dr. Daniel Hass ve Jim Hurley'e, O2 çözünürlüğünü yeni ve koşullu ortamlarda bir kontrol olarak test etme fikri için teşekkür ederiz. Dr. Magali Saint-Geniez'e el yazması üzerindeki editoryal katkıları için teşekkür ederiz. Kellogg Göz Merkezi, Instrument and Electronic Services Core'dan Scott Szalay'a, hipoksi odasını Resipher USB kablosuyla güçlendirdiği için teşekkür ederiz. HFT araştırması için hiçbir federal fon kullanılmadı. Elektronik Hizmetler Çekirdeği, Ulusal Göz Enstitüsü'nden P30 EY007003 tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, Körlüğü Önleme Araştırmaları'ndan (RPB) sınırsız bir bölüm hibesi ile desteklenmektedir. J.M.L.M., James Grosfeld Kuru Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonu Girişimi, E. Matilda Ziegler Körler Vakfı, Eversight göz bankası hibesi, Ulusal Göz Enstitüsü'nden K08EY033420 hibesi ve Dee ve Dickson Brown'ın yanı sıra David ve Lisa Drews Umudu Keşfetme Vakfı tarafından desteklenmektedir. D.Y.S., UNSW Scientia Programı tarafından desteklenmektedir. L.A.K., Iraty Ödülü, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, Ulusal Göz Enstitüsü'nden bir R01EY027739 hibe ve Savunma Bakanlığı Ordusu Tıbbi Araştırma Satın Alma Faaliyeti VR220059 tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 Tripsin-EDTAGibco# 25-200-056
3,3 ', 5-triiyodo-L-tironin sodyum tuzuSigmaT5516
32 kanallı Resipher kapağıLucid ScientificNS32-101A Falcon
Antimisin A için streptomyces sp.SigmaA8674-25MGElektron taşıma zincirinin Kompleks III'ünün inhibitörü
BAM15SigmaSML1760-5MGMitokondriyal solunumu artırmak için ayırma maddesi
DMSO, hücre kültürü sınıfıSigma-aldrichD4540-100MLMitokondriyal ilaçların sulandırılması için araç
Hücre dışı matris kaplama yüzeyleri:
Synthemax II-SC		Corning# 3535hfRPE için hücre dışı matris
Hücre dışı matris kaplama substratları: VitronectinGibcoA14700iPSC-RPE
FCCPSigmaC2920-10MGMitokondriyal solunumu artırmak için ayırma maddesi
Fetal Sığır Serumu (Bio-Techne S11550H)Bio-TechneS11550H
Hidrokortizon-SiklodekstrinSigmaH0396
Hipoksi odasıEmbrient Inc.MIC-101
N1 Medya TakviyesiSigmaN6530
Esansiyel Olmayan Amino Asit ÇözeltisiGibco11140050
O2 sensörüSensit teknolojisi veya Adli Bilişim DedektörleriP100 veya FD-90A-O2
Penisilin-StreptomisinGibco15140-122
Rekombinant insan TGF ve beta; 2Peprotech100-35BEpitelyal-mezenkimal geçişi indüklemek için büyüme faktörü beta-2'nin dönüştürülmesi
RotenoneSigmaR8875-1GElektron taşıma zincirinin Kompleks I'inin inhibitörü
Sistem uyumlu plakaCorning#353072
TaurinSigmaT8691
α MEM (Eagle's Media'nın Alfa Modifikasyonu)Corning15-012-CV
için hücre dışı matris

Kaynaklar

  1. Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration. Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).
  2. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis. Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).
  3. Hurley, J. B. Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection. Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).
  4. Wu, W., et al. Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).
  5. Hansman, D. S., et al. Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration. Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).
  6. Li, K. X., et al. Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).
  7. Gupta, S., et al. Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery. Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).
  8. Wilson, D. F., et al. Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging. Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).
  9. Hass, D. T., et al. Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).
  10. Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).
  11. Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).
  12. Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition. Metabolites. 13 (2), 213(2023).
  13. Kar, D., et al. Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).
  14. Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).
  15. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  16. Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).
  17. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).
  18. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).
  19. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  20. Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration. Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).
  21. Fitch, T. C., et al. Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry. J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).
  22. Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Mol Vis. 24, 425-433 (2018).
  23. Grumbine, M. K., et al. Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system. J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).
  24. Mu, C., Shearer, J. Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats. STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).
  25. Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets. Mol Metab. 83, 101922(2024).
  26. Kanaan, M. N., et al. Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation. Redox Biol. 73, 103213(2024).
  27. da Veiga Moreira, J., et al. Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth. Cancers. 16 (2), 355(2024).
  28. McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology. J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).
  29. Misare, K. R., et al. The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics. Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Retinal Pigment EpiteliMitokondriyal FonksiyonRPE KültürleriHücre Kültürü İnkübatörüHipoksi OdasıBioenerjetik ProfillemeRPE PolarizasyonuOksijen Gradyanı Ölçümü
Yüksek Derecede Diferansiye ve Polarize Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Oksijen Tüketim Oranlarının Uzun Süreli İzlenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.