Yöntem makalesi

İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu

1.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67042

⸱

29 Kasım 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

Bu makalede

Özet

Prokoagülan trombosit oluşumu, artmış tromboz riski ile ilişkilendirilmiştir. Burada, prokoagülan trombositlerin ayırt edici özellikleri olan fosfatidilserin ve mikrovezikül salınımının maruziyetini ölçmeyi amaçlayan, yıkanmış trombositleri insan kanından izole etmek için kesin bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Aktive edilmiş trombositler, esas olarak dış zar yüzeylerinde prokoagülan fosfolipid fosfatidilserini (PS) açığa çıkararak ve kaynak hücrelerinin orijinal zar mimarisini ve sitoplazmik bileşenlerini koruyan PS eksprese eden mikro-parçacıkları serbest bırakarak pıhtılaşmayı teşvik eder. Fosfatidilserinin erişilebilirliği, ana pıhtılaşma faktörlerinin bağlanmasını kolaylaştırır, pıhtılaşma enzimlerinin katalitik verimliliğini önemli ölçüde artırırken, mikro-parçacık salınımı, hücreler arası sinyalleşmenin önemli bir aracısı olarak işlev görür. Prokoagülan trombositler, hemostaz sırasında pıhtı stabilizasyonunda çok önemli bir rol oynar ve kan dolaşımındaki artan oranları, tromboz riskinin artmasıyla ilişkilidir. Trombosit mikro-parçacıklarının yara iyileşmesini ve inflamatuar modülasyonu destekleyen büyüme faktörleri açısından zengin olduğu da gösterilmiştir. Akış sitometrisi kullanılarak fosfatidilserin maruziyetini ve mikrovezikül salınımını analiz etmek, küçük boyutları ve ilgilenilen belirteçler için sınırlı sayıda pozitif olay nedeniyle önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Son on yıldaki önemli ilerlemelere rağmen, fosfatidilserin maruziyetini ve mikrovezikül salınımını değerlendirme yöntemleri devam eden bir çalışma olmaya devam etmektedir. Ne yazık ki, evrensel olarak uygulanabilir tek bir protokol yoktur ve her bir özel uygulama için en uygun metodolojiyi belirlemek için çeşitli faktörlerin değerlendirilmesi gerekir. Burada, prokoagülan trombositleri karakterize eden fosfatidilserin ve mikro-vezikül salınımının maruziyetini ölçmek için yıkanmış trombositleri insan kanından izole etmek ve ardından kollajen ve/veya trombin aktivasyonu için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, trombositten zengin plazmanın ilk hazırlanmasını ve yıkanmış trombositlerin izolasyonunu kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Son olarak, fosfatidilserin maruziyeti ve mikro-parçacık salınımı, prokoagülan trombositlerin tanımlanmasını sağlayan akış sitometrisi ile ölçülür.

Giriş

Trombosit prokoagülan oluşumu, hemostazı sürdürmek için çok önemlidir 1,2,3. Bu işlem, tenaz ve protrombinaz komplekslerinin 1,3,4 montajı için gerekli olan trombosit zarı üzerinde agonist kaynaklı fosfolipid ekspresyonunu içerir. Trombosit aktivasyonundan sonra, trombosit mikro-parçacıkları da sürekli olarak salınır 5,6. Mikro-parçacıklar (çapı 50 nm ila 1 μm'den fazla), kaynak hücrelerin 7,8 hem zar yapısını hem de sitoplazmik bileşenlerini kapsar. Mikro-parçacıklar, hücreler arası sinyalleşmenin 9,10 önemli aracılarıdır ve ayrıca yara iyileşmesini ve inflamatuar modülasyonu destekleyen büyüme faktörlerinindepolarıdır 11,12. Mikro-parçacıkların ayrıca aktive edilmiş trombositlerden 50 ila 100 kat daha fazla prokoagülan olduğu öne sürülmüştür13. Özellikle, son kanıtlar, depolanan trombositlerin aktive olduğunu ve mikro-parçacıkların üretimine yol açtığını göstermektedir - bunun trombosit transfüzyon tedavisi uygulaması için potansiyel sonuçları vardır. Mikroveziküllerin uzun saklama süresi ve artan prokoagülan aktivitesi, onları transfüzyon uygulamalarında trombositler için umut verici bir ikame haline getirir14.

Hem sağlık hem de hastalık koşullarında trombosit prokoagülan oluşumunu doğrudan ve dolaylı olarak değerlendirmek için metodolojik yenilikler yapılmıştır 4,14,15. Saflaştırılmış trombositler kullanılarak fosfatidilserin maruziyeti ve mikrovezikül salınımının değerlendirilmesi, çeşitli insan hastalıklarında trombosit prokoagülan yanıtlarının nasıl bozulduğuna dair yeni veriler sağlamıştır 1,4. Bu büyüyen araştırma alanı aynı zamanda terapötik müdahaleler için yollar açmaktadır 1,4. Bununla birlikte, saflaştırılmış trombositlerin kandan izolasyonu ve analizi zaman alıcıdır, özel laboratuvar ekipmanı gerektirir ve bu nedenle şu anda rutin klinik teşhis için uyarlanamamaktadır16,17. Fosfatidilserin maruziyetini ve mikrovezikül salınımını analiz etmek, küçük boyutları ve ilgilenilen belirteçler için pozitif olayların sayısı18,19 nedeniyle de zordur.

Floresan Annexin-V bağlanmasından yararlanan akış sitometrisi, yirmi yıl önceki başlangıcından bu yana trombositler ve mikro-parçacıklar üzerindeki PS ekspresyonunun değerlendirilmesinde bir mihenk taşı olmuştur20. Prokoagülan trombositler ve mikro-parçacıkların incelenmesinde yaygın kabul görmüştür21,22. Bu nedenle, burada, Cazenave'nin grubu23 tarafından geliştirilen teknik kullanılarak kan örneklerinden saflaştırılmış trombositlerin izolasyonu ve ardından trombosit aktivasyonundan sonra akış sitometrisi ile fosfatidilserin maruziyetinin ve mikrovezikül salınımının karakterizasyonu için kullanılabilecek optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır24. Bu protokol, ilgilenilen klinik popülasyonlarda prokoagülan trombositlerin daha fazla çalışılmasını ve derinlemesine karakterizasyonunu kolaylaştıracaktır.

Protokol

Protokol yönergeleri takip eder ve Bordeaux Üniversite Hastanesi İnsan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bilgilendirilmiş onam veren sağlıklı gönüllülerden kan örnekleri alındı ve bu örnekler kurum protokollerine göre işlendi. Trombosit fonksiyonunu etkileyebilecek herhangi bir madde almış olan donörler, bu tür maddeler deneylerden önceki 10 gün içinde alınmışsa hariç tutulmuştur. Sağlıklı gönüllülerden kanlarını almak ve verilerini yayınlamak için bilgilendirilmiş onam alındı. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Kan alınması ve yıkanmış trombositlerin hazırlanması

  1. İlk 3 mL'yi attıktan sonra Sitrik Asit ve Dekstroz (ACD) ile aktif antikoagülan Tri-sodyum Sitrat içeren toplama tüplerinde periferik venöz kanı toplayın.
  2. Toplandıktan sonra, kanı ACD ile karıştırmak için tüpü hafifçe ters çevirin ve karışımın santrifüjlemeden önce 15 dakika oda sıcaklığında dinlenmesine izin verin.
  3. Santrifüjleme için doğru hızı belirlemek için santrifüjlemeden önce otomatik bir hücre sayacı kullanarak trombositleri sayın (Tablo 1). Trombosit geri kazanımını optimize etmek için fren uygulamadan oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleme ile trombositten zengin plazma (PRP) hazırlayın.
    NOT: Bu adım, numunede üç katman üretecektir: plazma, trombositler ve beyaz kan hücrelerinin küçük bir kısmını içeren üst katman; beyaz kan hücreleri ile zenginleştirilmiş bir orta tabaka; ve kırmızı kan hücrelerinden oluşan bir alt tabaka. Kırmızı ve beyaz kan hücreleri ile kontaminasyonu önlemek için PRP'yi üst tabakadan dikkatlice 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
  4. PRP'ye 1 mL ACD-A (bakınız Tablo 2) ve 9 mL'ye 6.25 μL apyraz ekleyin.
    NOT: Apiraz, 0.02 U / mL'lik bir konsantrasyonda, trombositler tarafından salgılanan ATP veya ADP izlerini bozar, böylece trombosit ADP reseptörlerinin duyarsızlaşmasını önler ve trombosit şeklinikorur 25. Trombosit aktivasyonunu önlemek için bir prostasiklin PGI2 inhibitörü (0.5 μM) de apiraz ile birlikte dahil edilebilir.
  5. Trombosit peletini 10 dakika boyunca 1100 x g'da RT'de santrifüjleme ile hazırlayın. Pasteur pipeti gibi nazik bir yöntem kullanarak Trombosit Zayıf Plazma (PPP) içeren süpernatanı aspire edin ve peleti 1 mL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin (bkz. Tablo 3 ve Tablo 4). Bir pipetle nazikçe homojen hale getirin, ardından 3-4 mL daha yıkama tamponu ekleyin.
    NOT: Plazmada bulunan pıhtı faktörleri ile pıhtılaşmayı önlemek için kalsiyum seviyesi düşürülür. Bu aşamada, trombositten fakir plazma tamamen çıkarılarak pıhtı oluşumu ve trombin üretimi ile trombosit aktivasyonu önlenmiştir.
  6. RT'de 1100 x g'da 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 mL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayımı için 150 μL trombosit süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın. Ardından, peleti 3-4 mL yıkama tamponu ile yeniden süspanse edin.
  7. 10 dakika boyunca (RT'de) 1100 x g'da son bir santrifüjleme gerçekleştirin. Süpernatanı aspire edin ve 5 x 1011 trombosit / L'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için trombosit peletini bir hacim reaksiyon tamponunda (bkz. Tablo 5 ve Tablo 6) yeniden süspanse edin.
  8. Artık inhibitörlerin yıpranmasına ve trombositlerin tampona alışmasına izin vermek için deneylerden önce yıkanmış trombositlerin en az 30 dakika dinlenmesine izin verin.

2. Tahlil hazırlığı

  1. Reaksiyon tamponundaki tüm agonistleri ve florokromları hazırlayın. 45 μL tampona 5 μL trombin (seyreltme 1:10) ve 495 μL tampona 5 μL iyonofor ekleyin (seyreltme 1:500).
    1. Dahili tahliller için, aktive edilmemiş trombositleri tek ve çift agonistlerle tedavi edilenlerle kıyaslayın. Farklı alikotlarda, 50 x 109 trombosit/L'de 100 μL yıkanmış trombosit ekleyin: (i) 10 μL reaksiyon tamponu, (ii) 3 μL seyreltilmemiş kollajen (nihai konsantrasyon 30 μg/mL), (iii) 10 μL önceden seyreltilmiş trombin (0.5 IU/mL), (iv) 3 μL seyreltilmemiş kollajen + 10 μL önceden seyreltilmiş trombin ve (v) 10 μL önceden seyreltilmiş iyonofor (nihai konsantrasyon 2 μM), daha önce belirtildiği gibi hücre içi kalsiyum seviyelerini doğrudan arttırdığı bilinmektedir26.
      NOT: A23187 veya iyonomisin gibi bir kalsiyum iyonoforla tedavi, geniş fosfolipid membran karışmasına ve gelişmiş PS dışsallaşmasına neden olduğu için kritiktir.
    2. Her bir alikotu elinizle hafifçe çalkalayın ve 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
      NOT: Daha uzun agonist inkübasyonu (30 dakika), akış sitometrisi analiz işlemi sırasında trombosit popülasyonları arasında daha iyi farklılaşmaya izin verebilir.
  2. Her mikrotüpe 5 μL seyreltilmemiş Annexin-V FITC ekleyin ve karanlıkta 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    NOT: Trombosit hücrelerini daha iyi tanımlamak için trombosit spesifik reseptörlerden birine, GPIX (CD42b) veya αIIb integrine (CD41, GPIIb) karşı bir monoklonal antikor da dahil edilebilir.
  3. İşlemi durdurmak için 500 μL reaksiyon tamponu ekleyin ve bir akış sitometresi kullanarak numunenin analizine devam edin.

3. Prokoagülan trombositlerin ve mikro-parçacıkların Flow Sitometri (FC) ile karakterizasyonu

NOT: Güvenilir trombosit fonksiyon analizi için, belirlenmiş standartlara27 göre yapılandırılmış bir akış sitometrisi (FC) cihazı kullanın. Cihaz, ileri saçılma (FSC) ve en az bir floresan sinyalini algılayabilmelidir. Işık saçılımı ve floresan dedektörlerini logaritmik kazanca ayarlayın. Düşük veri toplama hızında yalnızca tek tek trombositlerin sayılmasını sağlamak için numuneleri FC'ye uygun şekilde seyreltin.

  1. Akış sitometresini en az 10.000 trombosit olayı eşiği ile 'yavaş' bir akış hızına ayarlayın. FITC için bir geçiş filtresi kullanarak floresan emisyonunu izleyin.
  2. İleri saçılma (FSC) kullanarak trombosit popülasyonunu kapatın. Trombositleri ve salınan mikro-parçacıkları boyutlarına göre inceleyin. Hem dinlenme hem de uyarılmış trombositler için trombositleri ve salınan mikro-parçacıkları tanımlamak için yoğunluk grafiklerini kullanın; Her kapılı popülasyonu bağımsız olarak analiz edin.
  3. Prokoagülan trombositleri FL1 eksenine göre ayırt edin. Negatif kesmeyi, dinlenme durumunda (yani reaksiyon tamponu varlığında) trombosit popülasyonunun en sağına yerleştirin. Trombosit aktivasyonundan sonra, bu kesimin sağında lokalize olan tüm olayları fosfatidilserin açığa çıkaran trombositler olarak sınıflandırın.
  4. Trombositlerden daha küçük olan mikro-parçacıkları, benzersiz ışık saçılma özellikleri ile ayırt edin. Kesmeyi, dinlenme trombosit popülasyonunda gözlenen en düşük FSC değerine ayarlayın. Aktivasyondan sonra, bu eşiğin altına düşen fosfatidilserin pozitif olayları mikro-parçacıklar olarak sınıflandırın.
    NOT: Gerekirse kesmeyi ayarlayarak trombosit boyutundaki bireysel varyasyonu hesaba katın. Dinlenme durumunda mikro-parçacıkların% 1'inden daha azının bulunduğundan emin olun.

Sonuçlar

Prokoagülan trombositlerin ve mikro-parçacıkların miktar tayini, numune başına en az 50.000 olay kaydedilen Annexin-V boyama kullanılarak elde edilir. Adım 2.2'de belirtildiği gibi, Şekil 1A'da gösterildiği gibi, reaksiyon tamponu ile inkübe edilen numunelerden temel trombosit ölçümleri alınmıştır. Trombosit boyutları medyan öne doğru saçılma (FSC) değeri kullanılarak ölçüldü. FSC çeşitli faktörlerden etkilenirken, trombositler de dahil olmak üzere hücre boyutu tahmini için ortak bir vekil olmaya devam etmektedir. Alanın yoğunluk grafikleri (Şekil 1A), dinlenme trombositlerini ve salınan mikro-parçacıkları tanımlamak ve kapılamak için kullanıldı.

Aktive edilmemiş trombositler söz konusu olduğunda,% 2.9'dan azı Annexin-V boyama ile belirlendiği gibi fosfatidilserin (PS) gösterdi. Yıkanmış trombositlerin tek başına kollajen ile veya trombin veya kalsiyum iyonofor ile birlikte aktivasyonu üzerine, PS maruziyetinde gözlenebilir bir artış olmuştur. Tek başına kollajen, PS pozitif trombositlerde% 26.7'lik bir artışa neden oldu. Trombin, PS maruziyeti üzerinde minimal etkilere sahipti (% 9.1), ancak kollajen ile ilişkili olduğunda, PS'ye maruz kalan trombositlerin yüzdesini% 36.2'ye çıkardı. Referans olarak, 2 μM iyonofor ile tedavi, trombositlerin% 49.6'sının prokoagülan hale gelmesine neden oldu.

Şekil 1 , sağlıklı bir bireyde yıkanmış trombositlerden elde edilen mikro-parçacıkların başlangıç oranının minimum olduğunu göstermektedir (% 0.3). Trombin ve kollajen mikrovezikül oluşumunu minimal düzeyde artırırken, sadece kollajen ve trombin kombinasyonu ile mikrovezikül oluşumu anlamlı olarak artmıştır (Şekil 1D; .4). 2 μM iyonofor eklenmesi, kontrol trombositleri tarafından oluşturulan mikro-parçacıkların% 44.0'ının PS'ye maruz kalmasına neden oldu.

Şekil 2 , bu süreçten beklenebilecek varyasyon, tekrarlanabilirlik ve tekrarlanabilirlik ile ilgili bilgiler sağlar.

figure-results-1
Şekil 1: İstirahat ve aktif kontrol trombositlerinde PS maruziyeti ve mikrovezikül oluşumu. Trombositler ya aktive edildi ya da aktive edilmedi (İstirahat) (A), 30 μg/mL kollajen (B), 0.5 U/mL trombin (C), kollajen ve trombin (D) ile 2 μM iyonofor kombinasyonları ile. Temsili nokta grafikleri, Annexin-V bağlamasına karşı trombosit boyutunu (ileri dağılım (FSC log)) gösterir. Yatay ve dikey çizgiler (E) trombosit negatif popülasyonu tanımlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: İyonofor ile inkübasyondan sonra PS maruziyetinin ve mikrovezikül oluşumunun tekrarlanabilirliği ve tekrarlanabilirliği. Sitrat (bir kalsiyum şelatörü) ile tedavi edilmiş veya tedavi edilmemiş yıkanmış trombositlerde 2 μM veya 5 μM iyonofor ile inkübasyondan sonra PS maruziyeti ve mikrovezikül oluşumunun analizi: (A) 4 farklı sağlıklı kontrolden; (B) 5 kez tekrarlanan bir sağlıklı kontrolden; ve (C) iki farklı teknisyen tarafından hazırlanan iki sağlıklı kontrolden. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tam kandaki trombosit sayısı (mL başına10-9 )Bağıl merkezkaç kuvvetleri (g)
<3070
30-50100
51-100130
101-150200
151-300250
301-600290
>600340

Tablo 1: Tam kandaki trombosit sayısına göre trombositten zengin plazma hazırlığı için bağıl merkezkaç kuvvetleri.

ReaktifMiktar
Sitrik asit monohidrat (C6H8O7. H2O, 38 mM)8 gr
Trisodyum sitrat dihidrat (Na3C6H5O,7.2H2O, 61 mM)180 gr
Glikoz (C6H12O6, 136 mM)24,6 gr
Çözeltinin pH'ı ayarlanmamalıdır. Çözeltiyi 4 °C'de tutun.

Tablo 2: 1 L sulu asit-sitrat-dekstroz (ACD) çözeltisinin hazırlanması.

ReaktifMiktar
Sitrik asit monohidrat (C6, H, 8, O, 7. H2O, 36 mM)7.56 gr
NaCl (103 mM)6 gr
NaOH (NanoOH)4 gr
MgCl2.6H 2O (1 mM)0.203 gr
PH'ı 6.5'e ayarlayın. Çözeltiyi 4 °C'de tutun.

Tablo 3: Yıkama Tamponu stok çözeltisinin hazırlanması.

ReaktifMiktar
% 30 Sığır Serum Albümini (BSA)583 μL
CaCl2, 0.25 m400 μL
Glikoz40 mg
Apiraz31,5 μL

Tablo 4: Stok çözeltisinden 50 mL'lik doğaçlama bir Yıkama Tamponu çözeltisinin hazırlanması.

ReaktifMiktar
NaCl (137 mM)8 gr
KCl (2,7 mM)0.2 gr
MgCl2.6H 2O (1 mM)0.203 gr
HEPES (5 mM)1.19 gr
NaHCO3 (12 mM)1 gr
NaH2PO4.2H 2O; 0,3 milyon0.05 gr
PH'ı 7.4'e ayarlayın. Çözeltiyi 4 °C'de tutun.

Tablo 5: Reaksiyon Tamponunun bir stok çözeltisinin hazırlanması.

ReaktifMiktar
% 30 Sığır Serum Albümini (BSA)167 μL
CaCl2, 0.25 m400 μL
Glikoz50 mg

Tablo 6: Stok çözeltisinden 50 mL'lik doğaçlama bir Reaksiyon Tamponu çözeltisinin hazırlanması.

Tartışma

Prokoagülan trombositler üzerine yapılan son çalışmalar,çeşitli hastalıklar 1,28,29 sırasındaki değişikliklerini vurgulamış, ayrıntılı analizlerinin ve karakterizasyonlarının önemini vurgulamıştır 30,31,32. Trombosit prokoagülan oluşumunu değerlendirmek için mevcut klinik testler sınırlı olsa da, son yirmi yılda klinik ilgide önemli bir artış olmuştur. Örneğin, kalsiyuma bağımlı scramblase TMEM16F (ANO6), prokoagülan fosfatidilserin (PS) maruziyetinderol oynar 33. TMEM16F varyantları, bozulmuş fosfolipid karıştırmaya ve aktive trombositlerde azalmış trombin oluşumuna neden olan nadir bir kanama bozukluğu olan Scott sendromu33,34,35 ile ilişkilidir 36. Ayrıca, yüksek prokoagülan trombosit seviyeleri trombotik inmeler ve koroner arter hastalığı ile bağlantılıdır ve trombosit prokoagülan aktivitesini engellemeye yönelik tedavilere ilgi uyandırır37. Prokoagülan trombosit oluşumunu değerlendirmek için şu anda mevcut olan yöntemlerden, Annexin-V bağlanması ve mikrovezikül salınımı ile PS maruziyetinin değerlendirilmesi en sık kullanılanlardan biridir38,39.

Burada özetlenen protokol, akış sitometrisi kullanılarak PS maruziyetini ve mikro-parçacık salınımını ölçerek insan saflaştırılmış trombositlerin izolasyonunu ve prokoagülan trombositlerin karakterizasyonunu sağlar. Sağlıklı gönüllülere, kan örneklemesinden en az 10 gün önce trombosit fonksiyonunu etkileyebilecek ilaçlardan kaçınmalarını tavsiye etmek çok önemlidir. Kan alma, trombin oluşumunu ve trombosit aktivasyonunu indükleyebileceğinden, damar travmasını veya aşırı yavaş akışı önlemek için özen gerektirir. Sodyum sitrat-antikoagüle kan, yıkanmış trombositlerin hazırlanması için önerilmez, çünkü artık kalsiyum santrifüjleme sırasında trombin oluşumunu ve trombosit aktivasyonunu sağlayabilir17. ACD-antikoagüle kan, sitrat antikoagüle kanın pH'ı 7.5 ve 13 mmol/L sitrat konsantrasyonu17 ile karşılaştırıldığında, pH 6.5 ve 22 mmol/L'lik daha yüksek bir sitrat konsantrasyonuna sahiptir. ACD antikoagüle kandaki asidik pH ve düşük hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu trombosit agregasyonunu önler24. Toplama işlemi sırasında trombin oluşumunu en aza indirmek çok önemlidir. Venöz stazı veya aşırı basıncı önlemek için en az 21 G iğne kullanılarak travmatik olmayan bir damar delinmesi önerilir. Ek olarak, doku faktörleri ve eser miktarda trombin17 ile kontaminasyonu önlemek için ilk birkaç mililitre kan atılmalıdır. Damar delinmesi ve numune işleme arasındaki sürenin en aza indirilmesi de önemlidir, çünkü uzun süreli kan depolaması trombosit aktivasyonuna yol açabilir, böylece PS maruziyetini ve mikrovezikül salınımınıartırabilir 40. Hazırlama işleminin kendisi sırasında meydana gelebilecek spontan trombosit ön aktivasyonunu önlemek için tüm trombosit hazırlama prosedürü sırasında özel dikkat gösterilmelidir41,17. Ayrıca, saflaştırılmış trombositlerin izole edilmesi, diğer kan hücreleri tarafından kontaminasyondan dikkatli bir şekilde kaçınılmasını gerektirir17. Bu, temiz bir hazırlık sağlamak için trombositleri santrifüjledikten sonra süpernatantın iyice aspire edilmesini içerir. Pelet tipik olarak görünür olduğundan ve tüp duvarına sıkıca yapıştığından, süpernatant bir pipet ucu kullanılarak kolayca aspire edilebilir.

Santrifüjleme yıkama adımları sırasında, trombositler fizyolojik koşulları simüle eden bir tampon içinde yeniden süspanse edilir. Yıkanmış trombositlerin fizyolojik bir tamponda kullanılması, onları antikoagülanlardan ve plazmadan izole eder, böylece trombin aracılı artefaktları önler. Trombositten zengin plazma (PRP), yüksek trombosit konsantrasyonları elde etmek için hızlı bir yöntem olsa da, fonksiyonel çalışmalar için kullanımı, antikoagülanın neden olduğu pH değişiklikleri ve plazmanın trombosit aktivasyonunu etkileyebilecek hücre dışı kalsiyum ve protein içeriği ile sınırlıdır17. Ayrıca, trombosit aktivasyonu sırasında üretilen yüksek PS seviyeleri, plazma pıhtılaşma komplekslerinin montajını, müteakip trombin patlamasını ve PRP'de pıhtı oluşumunu teşvik etmek için yeterli olacak ve deneysel sonuçları yorumlanamaz hale getirecektir. Buna karşılık, ATP ve ADP42,43'ün bozunması yoluyla purinerjik reseptörlerin duyarsızlaşmasını önleyerek trombosit işlevselliğini korumak için apiraz içeren bir tamponda yeniden süspansiyon önerilir. Tekrarlanan santrifüjleme ve yıkama adımları daha fazla zaman gerektirse de, bu yöntemle hazırlanan yıkanmış trombositlerin süspansiyonları, 1-3 saatten fazla stabil olmayan sitratlı PRP preparatlarına kıyasla daha fazla stabilite (5-8 saat) avantajı sunar23.

Bu çalışma, akış sitometrisi ile mikro-parçacıkların miktarının belirlenmesinin fizibilitesini ve basitliğini göstermektedir. Bununla birlikte, mikro-parçacık üretimi, makinenin döküntüsü ve gürültüsü arasında kaybolabilir. Bu nedenle, akış sitometresinin kapsamlı bir temizliğe tabi tutulduğundan ve kullanılan tamponların, akış sitometrisi analizi sırasında yüksek bir arka plana yol açabilecek herhangi bir kirletici parçacık içermediğinden emin olmak çok önemlidir. Alternatif olarak, mikro-parçacık oluşumunu tanımlamak için küçük partikül algılama özelliklerine sahip özel akış sitometreleri kullanılabilir. Floresein etiketli Annexin-V'nin membran PS içeriğinin bir fonksiyonu olarak bağlanması da incelenmiş ve Annexin-V bağlanması ve prokoagülan trombosit yanıtı44 için tampondaki yeterli kalsiyum konsantrasyonlarının kritik rolü vurgulanmıştır.

Trombosit örneklerinin zaman içindeki stabilitesini destekleyen veriler şu anda azdır. Birkaç laboratuvar, formaldehit içeren bir tampon gibi fiksatif bir çözelti ekleyerek numuneleri stabilize ederek bu sorunu çözmüştür. Yeni toplanan trombosit örneklerine bir fiksatif eklemek, numuneleri daha sonraki analizler için koruma avantajına sahiptir. Bununla birlikte, formaldehit fiksasyonu yapay olarak artmış Annexin-V bağlanmasına neden olabilir. Rochat ve ark. düşük konsantrasyonlu, kalsiyum içermeyen formaldehit çözeltisi ile trombosit fiksasyonunun Annexin-V pozitif trombositlerin45 oranını değiştirmediğini göstermiştir. Bununla birlikte, fiksasyona ihtiyaç duyan araştırmacılar, yapay olarak değiştirilmiş sonuçlara neden olmadığından emin olmak için özel protokollerini optimize etmelidir. Aksi takdirde, numuneler hemen işlenmelidir.

PS maruziyetine de yol açabilecek başka bir yol, dolaşımdaki trombosit ömrünü düzenlediği bilinen bir süreç olan intrinsik apoptozu içerir46. Pro-apoptotik BAK ve BAX proteinlerinin aktive edilmesi, PS'nin dışsallaştırılmasını teşvik eden kaspaz aktivasyonu ile sonuçlanır ve bu da trombositlerin in vivo klerensine yol açar. Son zamanlarda, prokoagülanları apoptotik trombositlerden ayırt etmek için Annexin-V'ye ek olarak başka bir trombosit yüzey markörü olan P-selectin/CD62P'nin kullanılması önerilmiştir47. Prokoagülan trombositlerin hem PS hem de P-selektin belirteçleri için pozitif olması beklenirken, apoptotik trombositlerin Annexin-V için pozitif, P-selektin için negatif olması beklenir. Bununla birlikte, zaman aynı zamanda prokoagülan ve apoptotik trombositler arasında ayırt edici bir faktördür47. Prokoagülan trombositlerin in vitro olarak üretilmesi hızlı bir süreçtir, oysa intrinsik apoptoz daha yavaş bir süreçtirve saatler sürer 48. Bu bağlamda, prokoagülan trombositleri değerlendirmek için ek belirteçlerin kullanılması gerekli değildir, bu da yöntemi basitleştirir. Hücre içi Ca2 + ve prokoagülan trombosit oluşumunda sürekli artışlar, iyonofor veya kollajen ve trombin ile kombine aktivasyon gibi çok güçlü agonistlerle birkaç dakika içinde meydana gelirken, bir BCL-XL inhibitörü (veya BH3 taklitçisi) pro-apoptotik BAK ve BAX'ı aktive ederek apoptotik trombosit oluşumunu tetikler, mitokondriyal dış membran geçirgenliğine, sitokrom C salınımına neden olur, ve kaspaz aktivasyonu49.

Sonuç olarak, burada açıklanan protokol, saflaştırılmış trombositlerin izolasyonunu ve standart laboratuvar ekipmanı ve akış sitometrisi kullanılarak prokoagülan aktivite için müteakip karakterizasyonunu kolaylaştırır. Bu prosedür, nadir görülen Scott sendromunun50 teşhisi gibi klinik uygulamada potansiyel uygulamalarla birlikte, hasta kan örneklerinde prokoagülan trombositler üzerine gelecekteki araştırmaların önünü açmaktadır.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A kan alma tüpleriBD Vacutainer 366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Sığır Serum Albümini% 30Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Sitrik asit monohidratMerck5949-29-1
Kollajen ve nbsp;Stago86924
Glikoz Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
İyonofor Calbiochem/VWR 100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Sodyum hidrojen karbonatMerck6329NaHCO3
>Trombin Hyphen BiomedEZ 006 A Trisodyum
sitrat dihidrat Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
&alfa; IIb entegratörü (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Kaynaklar

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Prokoag lan TrombositlerTrombosit AktivasyonuAk SitometrisiY kanm TrombositlerTrombosit Zengin PlazmaTrombosit zolasyonuKollajen AktivasyonuTrombin Aktivasyonu

İlgili makaleler