Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67042

⸱

29 Kasım 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

Bu makalede

Özet

Prokoagülan trombosit oluşumu, artmış tromboz riski ile ilişkilendirilmiştir. Burada, prokoagülan trombositlerin ayırt edici özellikleri olan fosfatidilserin ve mikrovezikül salınımının maruziyetini ölçmeyi amaçlayan, yıkanmış trombositleri insan kanından izole etmek için kesin bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Aktive edilmiş trombositler, esas olarak dış zar yüzeylerinde prokoagülan fosfolipid fosfatidilserini (PS) açığa çıkararak ve kaynak hücrelerinin orijinal zar mimarisini ve sitoplazmik bileşenlerini koruyan PS eksprese eden mikro-parçacıkları serbest bırakarak pıhtılaşmayı teşvik eder. Fosfatidilserinin erişilebilirliği, ana pıhtılaşma faktörlerinin bağlanmasını kolaylaştırır, pıhtılaşma enzimlerinin katalitik verimliliğini önemli ölçüde artırırken, mikro-parçacık salınımı, hücreler arası sinyalleşmenin önemli bir aracısı olarak işlev görür. Prokoagülan trombositler, hemostaz sırasında pıhtı stabilizasyonunda çok önemli bir rol oynar ve kan dolaşımındaki artan oranları, tromboz riskinin artmasıyla ilişkilidir. Trombosit mikro-parçacıklarının yara iyileşmesini ve inflamatuar modülasyonu destekleyen büyüme faktörleri açısından zengin olduğu da gösterilmiştir. Akış sitometrisi kullanılarak fosfatidilserin maruziyetini ve mikrovezikül salınımını analiz etmek, küçük boyutları ve ilgilenilen belirteçler için sınırlı sayıda pozitif olay nedeniyle önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Son on yıldaki önemli ilerlemelere rağmen, fosfatidilserin maruziyetini ve mikrovezikül salınımını değerlendirme yöntemleri devam eden bir çalışma olmaya devam etmektedir. Ne yazık ki, evrensel olarak uygulanabilir tek bir protokol yoktur ve her bir özel uygulama için en uygun metodolojiyi belirlemek için çeşitli faktörlerin değerlendirilmesi gerekir. Burada, prokoagülan trombositleri karakterize eden fosfatidilserin ve mikro-vezikül salınımının maruziyetini ölçmek için yıkanmış trombositleri insan kanından izole etmek ve ardından kollajen ve/veya trombin aktivasyonu için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, trombositten zengin plazmanın ilk hazırlanmasını ve yıkanmış trombositlerin izolasyonunu kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Son olarak, fosfatidilserin maruziyeti ve mikro-parçacık salınımı, prokoagülan trombositlerin tanımlanmasını sağlayan akış sitometrisi ile ölçülür.

Giriş

Trombosit prokoagülan oluşumu, hemostazı sürdürmek için çok önemlidir 1,2,3. Bu işlem, tenaz ve protrombinaz komplekslerinin 1,3,4 montajı için gerekli olan trombosit zarı üzerinde agonist kaynaklı fosfolipid ekspresyonunu içerir. Trombosit aktivasyonundan sonra, trombosit mikro-parçacıkları da sürekli olarak salınır 5,6. Mikro-parçacıklar (çapı 50 nm ila 1 μm'den fazla), kaynak hücrelerin 7,8 hem zar yapısını hem de sitoplazmik bileşenlerini kapsar. Mikro-parçacıklar, hücreler arası sinyalleşmenin 9,10 önemli aracılarıdır ve ayrıca yara iyileşmesini ve inflamatuar modülasyonu destekleyen büyüme faktörlerinindepolarıdır 11,12. Mikro-parçacıkların ayrıca aktive edilmiş trombositlerden 50 ila 100 kat daha fazla prokoagülan olduğu öne sürülmüştür13. Özellikle, son kanıtlar, depolanan trombositlerin aktive olduğunu ve mikro-parçacıkların üretimine yol açtığını göstermektedir - bunun trombosit transfüzyon tedavisi uygulaması için potansiyel sonuçları vardır. Mikroveziküllerin uzun saklama süresi ve artan prokoagülan aktivitesi, onları transfüzyon uygulamalarında trombositler için umut verici bir ikame haline getirir14.

Hem sağlık hem de hastalık koşullarında trombosit prokoagülan oluşumunu doğrudan ve dolaylı olarak değerlendirmek için metodolojik yenilikler yapılmıştır 4,14,15. Saflaştırılmış trombositler kullanılarak fosfatidilserin maruziyeti ve mikrovezikül salınımının değerlendirilmesi, çeşitli insan hastalıklarında trombosit prokoagülan yanıtlarının nasıl bozulduğuna dair yeni veriler sağlamıştır 1,4. Bu büyüyen araştırma alanı aynı zamanda terapötik müdahaleler için yollar açmaktadır 1,4. Bununla birlikte, saflaştırılmış trombositlerin kandan izolasyonu ve analizi zaman alıcıdır, özel laboratuvar ekipmanı gerektirir ve bu nedenle şu anda rutin klinik teşhis için uyarlanamamaktadır16,17. Fosfatidilserin maruziyetini ve mikrovezikül salınımını analiz etmek, küçük boyutları ve ilgilenilen belirteçler için pozitif olayların sayısı18,19 nedeniyle de zordur.

Floresan Annexin-V bağlanmasından yararlanan akış sitometrisi, yirmi yıl önceki başlangıcından bu yana trombositler ve mikro-parçacıklar üzerindeki PS ekspresyonunun değerlendirilmesinde bir mihenk taşı olmuştur20. Prokoagülan trombositler ve mikro-parçacıkların incelenmesinde yaygın kabul görmüştür21,22. Bu nedenle, burada, Cazenave'nin grubu23 tarafından geliştirilen teknik kullanılarak kan örneklerinden saflaştırılmış trombositlerin izolasyonu ve ardından trombosit aktivasyonundan sonra akış sitometrisi ile fosfatidilserin maruziyetinin ve mikrovezikül salınımının karakterizasyonu için kullanılabilecek optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır24. Bu protokol, ilgilenilen klinik popülasyonlarda prokoagülan trombositlerin daha fazla çalışılmasını ve derinlemesine karakterizasyonunu kolaylaştıracaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Protokol yönergeleri takip eder ve Bordeaux Üniversite Hastanesi İnsan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bilgilendirilmiş onam veren sağlıklı gönüllülerden kan örnekleri alındı ve bu örnekler kurum protokollerine göre işlendi. Trombosit fonksiyonunu etkileyebilecek herhangi bir madde almış olan donörler, bu tür maddeler deneylerden önceki 10 gün içinde alınmışsa hariç tutulmuştur. Sağlıklı gönüllülerden kanlarını almak ve verilerini yayınlamak için bilgilendirilmiş onam alındı. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Kan alınması ve yıkanmış trombositlerin hazırlanması

  1. İlk 3 mL'yi attıktan sonra Sitrik Asit ve Dekstroz (ACD) ile aktif antikoagülan Tri-sodyum Sitrat içeren toplama tüplerinde periferik venöz kanı toplayın.
  2. Toplandıktan sonra, kanı ACD ile karıştırmak için tüpü hafifçe ters çevirin ve karışımın santrifüjlemeden önce 15 dakika oda sıcaklığında dinlenmesine izin verin.
  3. Santrifüjleme için doğru hızı belirlemek için santrifüjlemeden önce otomatik bir hücre sayacı kullanarak trombositleri sayın (Tablo 1). Trombosit geri kazanımını optimize etmek için fren uygulamadan oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleme ile trombositten zengin plazma (PRP) hazırlayın.
    NOT: Bu adım, numunede üç katman üretecektir: plazma, trombositler ve beyaz kan hücrelerinin küçük bir kısmını içeren üst katman; beyaz kan hücreleri ile zenginleştirilmiş bir orta tabaka; ve kırmızı kan hücrelerinden oluşan bir alt tabaka. Kırmızı ve beyaz kan hücreleri ile kontaminasyonu önlemek için PRP'yi üst tabakadan dikkatlice 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
  4. PRP'ye 1 mL ACD-A (bakınız Tablo 2) ve 9 mL'ye 6.25 μL apyraz ekleyin.
    NOT: Apiraz, 0.02 U / mL'lik bir konsantrasyonda, trombositler tarafından salgılanan ATP veya ADP izlerini bozar, böylece trombosit ADP reseptörlerinin duyarsızlaşmasını önler ve trombosit şeklinikorur 25. Trombosit aktivasyonunu önlemek için bir prostasiklin PGI2 inhibitörü (0.5 μM) de apiraz ile birlikte dahil edilebilir.
  5. Trombosit peletini 10 dakika boyunca 1100 x g'da RT'de santrifüjleme ile hazırlayın. Pasteur pipeti gibi nazik bir yöntem kullanarak Trombosit Zayıf Plazma (PPP) içeren süpernatanı aspire edin ve peleti 1 mL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin (bkz. Tablo 3 ve Tablo 4). Bir pipetle nazikçe homojen hale getirin, ardından 3-4 mL daha yıkama tamponu ekleyin.
    NOT: Plazmada bulunan pıhtı faktörleri ile pıhtılaşmayı önlemek için kalsiyum seviyesi düşürülür. Bu aşamada, trombositten fakir plazma tamamen çıkarılarak pıhtı oluşumu ve trombin üretimi ile trombosit aktivasyonu önlenmiştir.
  6. RT'de 1100 x g'da 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 mL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayımı için 150 μL trombosit süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın. Ardından, peleti 3-4 mL yıkama tamponu ile yeniden süspanse edin.
  7. 10 dakika boyunca (RT'de) 1100 x g'da son bir santrifüjleme gerçekleştirin. Süpernatanı aspire edin ve 5 x 1011 trombosit / L'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için trombosit peletini bir hacim reaksiyon tamponunda (bkz. Tablo 5 ve Tablo 6) yeniden süspanse edin.
  8. Artık inhibitörlerin yıpranmasına ve trombositlerin tampona alışmasına izin vermek için deneylerden önce yıkanmış trombositlerin en az 30 dakika dinlenmesine izin verin.

2. Tahlil hazırlığı

  1. Reaksiyon tamponundaki tüm agonistleri ve florokromları hazırlayın. 45 μL tampona 5 μL trombin (seyreltme 1:10) ve 495 μL tampona 5 μL iyonofor ekleyin (seyreltme 1:500).
    1. Dahili tahliller için, aktive edilmemiş trombositleri tek ve çift agonistlerle tedavi edilenlerle kıyaslayın. Farklı alikotlarda, 50 x 109 trombosit/L'de 100 μL yıkanmış trombosit ekleyin: (i) 10 μL reaksiyon tamponu, (ii) 3 μL seyreltilmemiş kollajen (nihai konsantrasyon 30 μg/mL), (iii) 10 μL önceden seyreltilmiş trombin (0.5 IU/mL), (iv) 3 μL seyreltilmemiş kollajen + 10 μL önceden seyreltilmiş trombin ve (v) 10 μL önceden seyreltilmiş iyonofor (nihai konsantrasyon 2 μM), daha önce belirtildiği gibi hücre içi kalsiyum seviyelerini doğrudan arttırdığı bilinmektedir26.
      NOT: A23187 veya iyonomisin gibi bir kalsiyum iyonoforla tedavi, geniş fosfolipid membran karışmasına ve gelişmiş PS dışsallaşmasına neden olduğu için kritiktir.
    2. Her bir alikotu elinizle hafifçe çalkalayın ve 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
      NOT: Daha uzun agonist inkübasyonu (30 dakika), akış sitometrisi analiz işlemi sırasında trombosit popülasyonları arasında daha iyi farklılaşmaya izin verebilir.
  2. Her mikrotüpe 5 μL seyreltilmemiş Annexin-V FITC ekleyin ve karanlıkta 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    NOT: Trombosit hücrelerini daha iyi tanımlamak için trombosit spesifik reseptörlerden birine, GPIX (CD42b) veya αIIb integrine (CD41, GPIIb) karşı bir monoklonal antikor da dahil edilebilir.
  3. İşlemi durdurmak için 500 μL reaksiyon tamponu ekleyin ve bir akış sitometresi kullanarak numunenin analizine devam edin.

3. Prokoagülan trombositlerin ve mikro-parçacıkların Flow Sitometri (FC) ile karakterizasyonu

NOT: Güvenilir trombosit fonksiyon analizi için, belirlenmiş standartlara27 göre yapılandırılmış bir akış sitometrisi (FC) cihazı kullanın. Cihaz, ileri saçılma (FSC) ve en az bir floresan sinyalini algılayabilmelidir. Işık saçılımı ve floresan dedektörlerini logaritmik kazanca ayarlayın. Düşük veri toplama hızında yalnızca tek tek trombositlerin sayılmasını sağlamak için numuneleri FC'ye uygun şekilde seyreltin.

  1. Akış sitometresini en az 10.000 trombosit olayı eşiği ile 'yavaş' bir akış hızına ayarlayın. FITC için bir geçiş filtresi kullanarak floresan emisyonunu izleyin.
  2. İleri saçılma (FSC) kullanarak trombosit popülasyonunu kapatın. Trombositleri ve salınan mikro-parçacıkları boyutlarına göre inceleyin. Hem dinlenme hem de uyarılmış trombositler için trombositleri ve salınan mikro-parçacıkları tanımlamak için yoğunluk grafiklerini kullanın; Her kapılı popülasyonu bağımsız olarak analiz edin.
  3. Prokoagülan trombositleri FL1 eksenine göre ayırt edin. Negatif kesmeyi, dinlenme durumunda (yani reaksiyon tamponu varlığında) trombosit popülasyonunun en sağına yerleştirin. Trombosit aktivasyonundan sonra, bu kesimin sağında lokalize olan tüm olayları fosfatidilserin açığa çıkaran trombositler olarak sınıflandırın.
  4. Trombositlerden daha küçük olan mikro-parçacıkları, benzersiz ışık saçılma özellikleri ile ayırt edin. Kesmeyi, dinlenme trombosit popülasyonunda gözlenen en düşük FSC değerine ayarlayın. Aktivasyondan sonra, bu eşiğin altına düşen fosfatidilserin pozitif olayları mikro-parçacıklar olarak sınıflandırın.
    NOT: Gerekirse kesmeyi ayarlayarak trombosit boyutundaki bireysel varyasyonu hesaba katın. Dinlenme durumunda mikro-parçacıkların% 1'inden daha azının bulunduğundan emin olun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Prokoagülan trombositlerin ve mikro-parçacıkların miktar tayini, numune başına en az 50.000 olay kaydedilen Annexin-V boyama kullanılarak elde edilir. Adım 2.2'de belirtildiği gibi, Şekil 1A'da gösterildiği gibi, reaksiyon tamponu ile inkübe edilen numunelerden temel trombosit ölçümleri alınmıştır. Trombosit boyutları medyan öne doğru saçılma (FSC) değeri kullanılarak ölçüldü. FSC çeşitli faktörlerden etkilenirken, trombositler de dahil olmak üzere hücre boyutu tahmini için ortak bir vekil o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Prokoagülan trombositler üzerine yapılan son çalışmalar,çeşitli hastalıklar 1,28,29 sırasındaki değişikliklerini vurgulamış, ayrıntılı analizlerinin ve karakterizasyonlarının önemini vurgulamıştır 30,31,32. Trombosit prokoagülan oluşumunu değerlendirmek için mevcut klinik testler sınırlı olsa da, son y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A kan alma tüpleriBD Vacutainer 366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Sığır Serum Albümini% 30Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Sitrik asit monohidratMerck5949-29-1
Kollajen ve nbsp;Stago86924
Glikoz Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
İyonofor Calbiochem/VWR 100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Sodyum hidrojen karbonatMerck6329NaHCO3
>Trombin Hyphen BiomedEZ 006 A Trisodyum
sitrat dihidrat Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
&alfa; IIb entegratörü (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Kaynaklar

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Prokoagülan TrombositlerTrombosit AktivasyonuAkış SitometrisiYıkanmış TrombositlerTrombosit Zengin PlazmaTrombosit İzolasyonuKollajen AktivasyonuTrombin Aktivasyonu
İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.