Bu protokol, ol/gitme koku alma davranışı deneyleri için bir olfaktometrenin yapımını açıklar. Olfaktometrenin başarılı bir şekilde oluşturulmasını sağlamak için resimlerle birlikte adım adım talimatlar sağlanmıştır. İşlem sırasında karşılaşılan sorunların giderilmesine yönelik bilgiler de dahil edilmiştir.
Yöntem makalesi
Kemirgen Koku Alma Davranışı Çalışmaları için Bir Olfaktometre Oluşturma
Bu makalede
Özet
Özet
Koku alma görevleri sırasında kemirgen davranışını ve beyin aktivitesini incelemek için olfaktometrelerin kullanılması, beyin devrelerini anlamak için çok önemlidir. Bu sofistike cihazlar, araştırmacıların koku uyaranlarını hassas bir şekilde kontrol etmelerine ve iletmelerine olanak tanıyarak kemirgenlerde karmaşık koku alma süreçlerinin araştırılmasını sağlar. Ticari olarak temin edilebilen olfaktometreler kullanışlı olsa da, teknik sorunlar ortaya çıktığında zorluklar ortaya çıkarırlar, genellikle maliyetli yardım gerektirirler ve potansiyel olarak araştırma zaman çizelgelerini bozarlar. Bu makale, fare koku alma davranışı deneyleri için özel olarak tasarlanmış özel bir olfaktometrenin yapısını detaylandırarak kapsamlı bir parça listesi ve adım adım talimatlar sağlar. Olfaktometre, araştırmacılar için kullanıcı dostu bir arayüz sunan MATLAB aracılığıyla kontrol edilir. Daha da önemlisi, açık kaynak kodu, kullanıcıların sistemi değiştirmesine ve uyarlamasına olanak tanıyarak davranışsal görevleri belirli deneysel ihtiyaçları karşılayacak şekilde uyarlar. Özelleştirilmiş bir olfaktometre oluşturmak, kullanıcılara özel deneysel tasarım ve sorun gidermeyi bağımsız olarak gerçekleştirme bilgi ve yeteneği sağlayarak hem zamandan hem de kaynaklardan tasarruf sağlar. Bu yaklaşım yalnızca araştırma esnekliğini artırmakla kalmaz, aynı zamanda ekipmanın işlevselliğinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını teşvik eder ve sonuçta kemirgenlerde daha sağlam ve güvenilir koku alma çalışmalarına yol açar.
Giriş
Koku alma karar vermenin altında yatan karmaşık mekanizmalar, beynin duyusal işleme sisteminin olağanüstü karmaşıklığına dair büyüleyici bilgiler sunar 1,2,3. Farelerin koku soğancığı içinde, çok çeşitli koku alma duyusal nöronları, her biri aynı koku alma reseptörünü4 ifade eden nöronlar tarafından innerve edilen yaklaşık 2.200 glomerül üzerinde birleşir. Dikkat çekici bir şekilde, tek sentetik koku vericiler bile farelerdeyaklaşık 1.100 koku alma reseptörünün önemli bir bölümünü uyarabilir 5,6. Bununla birlikte, zorluk, ilk koku verici tespitinin ötesine uzanır. Ritmik koklama eyleminden etkilenen koku verici gelişinin zamansal dinamikleri, duyusal manzarayı daha da zenginleştirir ve beynin deşifre etmesi için bilgi katmanları ekler. Yüzlerce koku maddesi içeren türdeş idrar gibi doğal uyaranların karmaşıklığı ile birleştiğinde, koku alma sistemi, çeşitli kokuları ayırt etmek için karmaşık glomerüler aktivasyon modellerini çözmek gibi zorlu bir görevle karşı karşıyadır 7,8.
Bu zorluğun üstesinden gelmek için beyin, piriform korteks, lateral entorinal korteks, hipokampus, koku alma tüberkülü, prefrontal korteks ve hatta beyincik 9,10,11,12,13,14 dahil olmak üzere birçok bölgede sinirsel aktiviteyi düzenler. Bu devreler içinde, piriform korteksteki piramidal hücreler, mitral hücreler tarafından iletilen bilgileri bütünleştirir ve modüle ederken, diğer beyin alanları koku alma algısını şekillendirmede benzersiz rollere katkıda bulunur 15,16,17. Ayrıca, beynin koku alma uyaranlarını işlemesi, bağlamsal faktörlerden dinamik olarak etkilenir ve koku alma karar verme sürecinin uyarlanabilirliğini ve karmaşıklığını vurgular.
Bu makale, bir hareket/gitme görevinde bulunan serbestçe hareket eden farelerin davranışsal performansının bilgisayar kontrollü değerlendirmesini sağlayan özel bir olfaktometrenin yapısını açıklamaktadır. Bu ilişkisel öğrenme görevinde, sudan mahrum fare, kokulu bir burun konisi içinde bulunan bir su dağıtım musluğunu yalayarak bir deneme başlatır. İki koku maddesinden biri, hayvan denemeye başladıktan 1-1.5 saniye sonra verilir. Koku verici ödüllendirilen (S+) koku vericiyse, fare dört 0,5 saniyelik zaman penceresinin her birinde en az bir kez yalarsa (bir Hit) bir su ödülü alır. Aksi takdirde, fare ödül almaz (Bayan). Hayvan ödüllendirilmemiş koku maddesini (S-) alırsa, hiçbir ödül verilmez ve fare dört zaman penceresinin her birini yalarsa (Yanlış Alarm, FA), bir sonraki denemenin başlamasından önce bir zaman gecikmesi uygulanır. Hayvan zaman pencerelerinden birinde yalayamazsa, deneme doğru ret (CR) olarak sayılır ve herhangi bir zaman gecikmesi uygulanmaz. Doğru performans yüzdesi, farenin yirmi deneme penceresinde bir İsabet veya CR puanı aldığı denemelerin yüzdesi olarak hesaplanır:
Doğru yüzde = 100 ((İsabet + CR) / 20)
Olfaktometrelerin düzgün çalışmasını sağlamak için uygun/gitmeyin koku alma davranışını değerlendirmek için tasarlanmış iki temel konu vardır. İlk olarak, olfaktometre, buna göre koku ve su ödülleri vermek için farenin tepkilerini gerçek zamanlı olarak izlemelidir. Bu olfaktometre, ya su musluğu ile hazne tabanı arasındaki direnci ölçerek ya da kapasitans18'i algılayarak yalamaların izlenmesiyle elde edilir. Bir MATLAB programı daha sonra bu bilgileri koku verici dağıtımı ve su ödülü hakkında kararlar almak için kullanır. İkinci konu, güvenilir, tekrarlanabilir koku verici dağıtımına duyulan ihtiyaçtır. Bu olfaktometre, kokulu doymuş havayı taşıyıcı hava ile dengeleyen ve daha sonra bir burun konisine iletilen valflerin çalıştırılmasıyla elde edilir. Hava, mineral yağ ile seyreltilmiş bir koku çözeltisi ile köpürtülerek koku verici madde ile dengelenir. Koku maddesinin konsantrasyonu bir fotoiyonizasyon detektörü ile ölçülür ve Williams ve Dewan18,19 tarafından açıklanan prosedürler izlenerek buhar basıncı ve aktivite katsayısına dayalı olarak hesaplanabilir.
Protokol
Tüm deneyler, Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirildi. Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, tetrode implantasyonu sırasında iki aylık olan erkek CaMKIIα WT fareleriydi. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir.
1. Tek kutuplu, tek atışlı (SPST) anlık basma düğmelerinin tahta ve lehimlenmesi
- Koku valfleri, akış ölçerler, SSR48 kartı ve Şekil 1A'da gösterilen diğer bileşenler için rafları sabitlemek için delikli özel yapım beyaz süpürgeyi edinin.
NOT: Bu çalışmada kullanılan beyaz süpürgelik, CU Anschutz Tıp Kampüsü'ndeki Nöroteknoloji Merkezi'nin Makine Atölyesi tarafından üretilmiştir (Şekil 1A). Tasarım dosyalarına şu adresten ulaşabilirsiniz: - SSR1-RACK'i yerleştirmek için 3 inç vidalar ve 4/48 inç ara parçalar ekleyin. Vidalar, beyaz tahtanın arkasının sağ üst köşesinde bulunur (Şekil 1A).
- SSR48-RACK'i monte edin. SSR48-RACK, beyaz tahtanın arkasının sol üst tarafında yer alacaktır (Şekil 1C).
- Vidalı terminal şeridi bloklarını beyaz tahtanın arkasına yerleştirmek için delikler (0,4 cm) açın. Vidalı terminal şeridi blokları, beyaz tahtanın arkasının sağ ortasında yer alacaktır (Şekil 1D).
- Yukarıdan aşağıya: İlk 4 vidalı klemens şeridi bloğu, 24 V için kabloları bağlamak için kullanılacaktır. Bir sonraki vidalı terminal şeridi bloğu 5 V kablolar için kullanılacaktır. Bir vidalı terminal şeridi bloğunu boş bırakın ve son 4 vidalı terminal şeridi bloğu topraklama kablolarını bağlamak için kullanılacaktır.
- SPST anlık buton anahtarlarının yerleştirilmesi için kontrol kutusuna delikler (0.8 cm) açın. Kontrol kutusu, beyaz tahtanın ön alt kısmında yer alacaktır (Şekil 1E).
- SPST anlık basmalı düğme anahtarlarını ayarlayın. SPST anlık basmalı düğme anahtarına iki tel lehimleyin. Kırmızı ve siyah veya yeşil gibi iki farklı renk kullanılması tercih edilir (Şekil 1F).
- SPST anlık basmalı düğme anahtarını kontrol kutusuna takın. Basmalı düğmeler, kontrol kara kutusuna takmak için kullanılan bir somunla birlikte gelir (Şekil 1G).
- Telleri bir arada ve düzenli tutmak için bükerek veya bantla sabitleyerek sabitleyin.
NOT: 24 V güç, pinç valflerine ve koku valflerine güç sağlamak için kullanılır ve yalama devresi için 5 V güç kullanılır. - Koku valflerini beyaz tahtanın ortasında bulunan koku valfi rafının yuvalarına yerleştirin (Şekil 2A).
- Valflerden çıkan telleri soyun ve her valften bir tel lehimleyin daha kalın bir tele. Bir kabloyu beyaz tahtanın arkasındaki vidalı terminal şeridi bloklarındaki toprağa ve ikinci bir kabloyu SSR48-RACK'teki ilgili pime yerleştirin. Örneğin, koku valfi 1 pim 1'e gider, koku valfi 2 pim 2'ye gider, vb (Şekil 2B).
- SSR1-RACK'teki 8 ila 48 arasındaki pimleri her biri iki sıkıştırma valfine bağlayın (mineral yağ dengeleme şişeleri için giriş ve çıkış valfleri). Her valf için, bir basmalı düğmeden gelen bir kabloyu 24 V güce ve diğer kabloyu valfe bağlı SSR48-RACK'teki pime bağlayın. Diğer tel vanadan toprağa gider. Kabloları yerlerine yerleştirmek için Şekil 2B,C'ye bakın.
- Su vanasını ve son vanayı vana plakasındaki ilgili yuvalara yerleştirin. Yuva, beyaz tahtanın ortasında bulunur. Şekil 1'deki valf plakasına ve Şekil 3A'daki valflerin yerleşimine bakın.
- SSR17-RACK'teki su vanasını ve son vanayı şasiye ve sırasıyla 18 ve 48 numaralı pimlere bağlayın. Basmalı düğmeleri 24 V'a ve 17 ve 18 numaralı pimlere bağlayın (Şekil 2B).
2. Güç kaynağı
- Bir güç kaynağı ve uzatma kablosu satın alın. Belirli bir güç kaynağı türüyle ilgili bilgiler Malzeme Tablosunda bulunabilir. Güç kaynağı, olfaktometreye 24 V (V3) ve 5 V (V1) çıkış ve topraklama sağlayacaktır.
- Güç kaynağı için güç kablosunun fişini kesin. Özellikle, uzatma kablosunun dişi kısmı. Kesildikten sonra üç tel görülebilir. Yeşil kablo, güç kaynağındaki G'ye (toprak) bağlanır ve diğer iki kablo (beyaz ve siyah), güç kaynağına giden 120 V AC girişinin sırasıyla L ve N'sine bağlanır (Şekil 3B).
DİKKAT: 120 V güç kabloları açıkta kalır ve elektrik çarpması nedeniyle yaralanma riski vardır. Bir yalıtkan ile örtmek en iyisidir. - SSR48-RACK'e güç sağlayan kablonun bir ucunu kesin. Kablolardan birini güç kaynağındaki G vidasına ve ikincisini güç kaynağının V1'ine bağlayın (Şekil 3C).
- Güç kaynağında, G2'den gelen bir kabloyu vidalı terminal şeridi blokları üzerindeki toprağa bağlayın (Şekil 2C).
- Güç kaynağında, V1'den gelen bir kabloyu 5 V vidalı terminal şeridi bloklarına bağlayın (Şekil 2C).
- Güç kaynağında, V3'ten gelen bir kabloyu 24 V vidalı terminal şeridi bloklarına bağlayın (Şekil 2C).
3. Yalama Sensörü kartı
- 400 bağlantı noktalı bir devre tahtası edinin ve B7 bağlantı noktalarından B15'e bağlanan bir tel çalıştırın (Şekil 3D).
- Bir telin bir ucunu 6+ bağlantı noktasına ve diğer ucunu devre tahtasının C22 bağlantı noktasına bağlayın (Şekil 3D).
- Breadboard'un bir ucunu D16'ya ve ikinci ucunu G22'ye bağlayın (Şekil 3D).
- Bir kablonun bir ucunu I22 yuvasına ve ikinci ucunu devre tahtasının 29- yuvasına bağlayın (Şekil 3D).
- Bir kablonun bir ucunu devre tahtasının 20A yuvasına ve ikinci ucunu 29A'ya bağlayın (Şekil 3D).
- Bir kablonun bir ucunu devre tahtasının 21B'sine ve ikinci ucunu 28B'ye bağlayın (Şekil 3D).
- Bir kablonun bir ucunu devre tahtasının 1+ yuvasına ve ikinci ucunu vidalı terminal şeridi bloklarının 5 V'una bağlayın (Şekil 3D).
- Bir kablonun bir ucunu devre tahtasının 1- yuvasına ve ikinci ucunu vidalı terminal şeridi bloklarının topraklamasına bağlayın (Şekil 3D).
- Bir kablonun bir ucunu devre tahtasının C7 yuvasına ve ikinci ucunu SSR-27RACK üzerindeki 48 numaralı pime bağlayın (Şekil 3D).
- Bir kablonun bir ucunu devre tahtasının 28C yuvasına bağlayın ve ikinci ucuna, su musluğunun metal kısmına bağlanacak bir timsah klipsi takılı olacaktır (Şekil 3D).
- Bir kablonun bir ucunu devre tahtasının 20B yuvasına ve diğer ucunu potansiyometrenin orta terminaline bağlayın (Şekil 3D). Potansiyometrenin direnç elemanlarına bağlı iki terminal toprağa ve 5 V'a bağlanır. Orta terminal devre tahtasına bağlanır.
- 21 mΩ direnç elde edin. İlki için bir ucunu 19A'ya ve ikinci ucunu 20D'ye bağlayın. İkincisi için bir ucunu 22C'ye ve diğer ucunu 21D'ye bağlayın. Potansiyometreye bağlanın (Şekil 3D).
- Bir kΩ direnç elde edin. Bir ucunu 14C'ye ve ikinci ucunu 19C'ye bağlayın. Potansiyometreye bağlanın (Şekil 3D).
- Bir adet 120 Ω direnç edinin. Bir ucunu 7D'ye ve ikinci ucunu 7H'ye bağlayın (Şekil 3D).
- Bir LED ışık edinin. Renk önemli değil. Bir LED kablosunu 7J'ye ve ikinci kabloyu 6-'ya bağlayın (Şekil 3D).
- İki işlemsel yükselteç (op-amp) edinin. İlki için bağlantılar E10 ila E16, F10-F16'dır (Şekil 3D).
4. Hava ve su temini
- Akış ölçer tutucularına iki akış ölçer (2 L/dk ve 50 cc/dk) yerleştirin. Şekil 4A , genel hava akış sistemini gösterir ve Şekil 4B , akış ölçerlerin büyütülmüş görünümünü gösterir.
- 2 L/dk hava akışı sağlamak için bir akvaryum pompası edinin. Burada kullanılan akvaryum pompası modelinin iki çıkışı vardır (bkz. Malzeme Tablosu). Akvaryum pompasının iki çıkışının her birinden küçük bir boru parçasını bir T konektörünün iki girişine bağlayın (Şekil 4B).
- T konektörünün çıkışından bir boru parçasını aktif bir karbon filtrenin girişine bağlayın (Şekil 4B).
- Karbon filtrenin çıkışından gelen boruyu bir T konektörüne bağlayın ve hava akış hızını ayarlamak için konektörün iki çıkışını bir küresel vanaya bağlayın (Şekil 4C).
- Her bir küresel vananın çıkışını akış ölçerlerin girişine bağlayın (Şekil 4D).
- 50 cm/dk'lık akış ölçerin çıkışını üst manifolda bağlayın ve mineral yağda seyreltilmiş koku maddeleri ile 40 mL'lik koku dengeleme şişelerine hava sağlayın (Şekil 4E).
- Her bir koku şişesinden gelen çıkışı alt manifolddaki ilgili girişe bağlayın.
- Koku şişelerini manifoldlara bağlayan tüpler, iki ayrı pinç valf tarafından açılan pinç valf tüpleridir. Boruyu sıkıştırma valflerine yerleştirin.
- 2 L/dk debimetrenin çıkışını alt manifoldun yan girişinin girişine bağlayın.
- Alt manifoldun çıkışını son (yönlendirme) valfin girişine bağlayın (Şekil 4F).
- Son valfin varsayılan açık çıkışını, git/yok haznesindeki koku dağıtım borusuna bağlayın. Son valfin varsayılan kapalı çıkışını bir egzoz borusuna bağlayın (Şekil 4G). Bu, son valf kapalıyken 2 L/dk'lık sürekli kokusuz hava akışı ile sonuçlanır.
- Her deneme için, hayvan yaladığında, havayı egzoza götürdüğünde son valfin açıldığından ve aynı anda koku valfinin açıldığından emin olun. Bu, arka plan hava akışındaki kokunun dengelenmesine neden olur.
- 1-1,5 saniye sonra, havayı hazneye geri yönlendirerek son valfin kapandığından emin olun. Bu, koku konsantrasyonunda keskin bir artışa neden olur. 2,5 saniye sonra koku valfi kapanır ve koku konsantrasyonu 0'a döner.
- Su ödülünü vermek için kullanılacak 5 mL'lik şırınganın ucuna 18 G'lik bir iğne bağlayın (Şekil 4H).
- İğnenin ucuna bir tüp (2 mm çapında) bağlayın (Şekil 4H).
- Borunun diğer ucunu su vanasının girişine bağlayın. Su vanasının girişine uyması için farklı çapta bir borunun kesilmesi gerekebilir (Şekil 4I).
- Boruyu su vanasının çıkışından yalama musluğuna bağlayın (Şekil 5A).
5. Olfaktometrenin bilgisayara bağlanması ve yazılımın yüklenmesi
- SSR48-RACK'i 96 pinli dişi-dişi konektörle DIO50H/100'ye bağlayın. DIO96/H50'den gelen USB kablosunu bilgisayara bağlayın (Şekil 5B).
- mccdaq yazılımının ve sürücülerinin ve InstaCal'ın en son sürümünü indirin.
NOT: InstaCal, bilgisayar ile DIO96/H50 arasındaki iletişimi test eden programdır. En son yazılımı ve sürücüleri buradan indirin: https://www.mccdaq.com/software-downloads.aspx. - InstaCal'ı çalıştırın. "Evrensel Seri Veri Yolu"nun Anakart #'yi doğru numara olarak listelediğinden emin olun, genellikle #1 = Kart #1 USB-DIO96H/50.
- MATLAB'ı indirin.
- Olfaktometreyi https://github.com/restrepd/dropc'dan çalıştırmak için MATLAB programlarını indirin.
- MATLAB'ı Yönetici olarak açın ve yolu, MATLAB'ın programları tanıması için ayarlayın. MATLAB ortamındaki Ana Sayfa sekmesinde, Ortam bölümünde Yolu Ayarla'ya tıklayın. Bu, arama yoluna klasör ekleyebileceğiniz bir iletişim kutusu açar.
- daqregister('mcc') komutunu çalıştırın. dropcInitializePortsNow.m'deki kart numarasını değiştirin.
NOT: handles.dio = digitalio('mcc',1); %(bilgisayara bağlı olarak 1 veya 0). - Dripcspm.m'yi, yalama musluğu ile topraklanmış haznenin metal zemini arasındaki elektrik döngüsünü bağlayarak kullanıcının her denemeye "yanıt verdiği" kuru bir çalışma gerçekleştirerek test edin.
NOT: Olfaktometre artık kullanıma hazırdır. Farenin nasıl eğitileceğine dair bilgiler Nicole Arevalo ve ark.20'de bulunmaktadır.
6. Hayvan deneyleri
- Deney sürecine başlamak için hayvan denekleri dikkatlice hazırlayın. Kalibre edilmiş bir terazi kullanarak her fareyi ayrı ayrı tartın ve ağırlığı bir laboratuvar günlüğüne kaydedin. Hayvanların sağlığını takip etmek ve herhangi bir kilo değişikliğini derhal ele almak için bu önemli verileri çalışma boyunca izleyin.
- Tarttıktan sonra fareleri nazikçe özel olarak tasarlanmış fare haznesine yerleştirin. Koku alma ayırt etme görevi için sensörleri ve uyaran dağıtım sistemlerini etkinleştirin. Deney koşullarının hassas kontrolünü sağlarken haznenin hayvanlar üzerindeki stresi en aza indirdiğinden emin olun.
- Hayvanın haznede rahat olduğundan emin olun. Koku uyaranları iletme (2,5 s), su dağıtma ve tepkileri kaydetme gibi deneysel parametreleri kontrol etmek için MATLAB programını başlatın. Hayvanın performansı hakkında anında geri bildirim almak için verileri gerçek zamanlı olarak analiz edin.
- Hayvanın performansını sürekli olarak izleyin ve analiz edin. Doğru yanıtların yüzdesine dayalı olarak hesaplanan yeterlilik puanına bakın. Her hayvanın, görev yeterliliği eşiğini belirleyen 80 veya daha yüksek bir performans puanı elde etmesini hedefleyin.
- Deneyin yeni aşamasına, hayvan sürekli olarak 80 veya daha yüksek bir yeterlilik puanı elde ettiğinde başlayın, bu da ilk koku çifti ayrımında ustalığı gösterir. Koku çiftini tersine çevirin, daha önce ödüllendirilen kokuyu ödülsüz bırakın ve bunun tersi de geçerlidir.
- Hayvanın bilişsel esnekliğini ve çağrışımları unutma ve yeniden öğrenme yeteneğini test edin, böylece farelerde koku almanın plastisitesi hakkında değerli bilgiler edinin.
Sonuçlar
Burada açıklanan protokolü takiben, kokular arasında ayrım yapan farelerin gitme/gitmeme davranışını test etmek için bir olfaktometre ayarlanabilir. Şekil 6A , S+ koku verici olarak etil asetat ve S- olarak etil asetat ve propil asetat kombinasyonu kullanılarak, git/gitme görevinde eğitimin ilk günü boyunca bir farenin davranışını göstermektedir. Doğru yüzde, farenin isabet veya doğru ret puanı aldığı denemelerin yüzdesi olarak hesaplanır. Başlangıçta, fare her iki koku maddesine de tepki olarak yaladığı için P doğru şekilde başladı. Bununla birlikte, birkaç denemeden sonra, sadece S+ için yalamayı öğrendi ve S- için yalamayı bıraktı. Şekil 6B
Tartışma
Koku ilişkilendirme görevleri için tasarlanmış bir olfaktometre oluşturmak için kapsamlı bir adım adım kılavuz literatürde bulunabilir. Araştırmacılar, cihazın montajı ve çalıştırılması sırasında çeşitli zorluklarla karşılaşabilir, ancak neyse ki, bu sorunları ele almak için yerleşik sorun giderme yöntemleri vardır. Düzgün bir şekilde oluşturulduktan ve kalibre edildikten sonra, olfaktometre, koku alma ile ilgili deneyler yapan bilim adamları için paha biçilmez bir araç görevi görür ve koku uyaranlarının hassas kontrolünü ve iletilmesini sağlar.
Kritik adımlar
İndirilen MATLAB sürümü 2015 olmalıdır, çünkü yazılan kod bu sürümle uyumludur ve başka bir sürümün kullanılması sorunlara yol açabilir. Instacall'da doğru kartın seçildiğini doğrulamak önemlidir. mcc.dill kurulumu, bir MATLAB yöneticisi olarak oturum açmış durumdayken daqregister('mcc') yürütülerek gerçekleştirilebilir.
Sorun giderme
Her eğitim haftasının başında, PC ve olfaktometrenin doğru şekilde arayüzlendiğinden emin olmak için kalibrasyon yazılımını (InstaCal) çalıştırın. Bu programı açın , panoya tıklayın ve Dijital Kalibrasyon'a tıklayın. Hava akış hızının kontrol edilmesi gerekir. Arka plan hava akışı 2 L / dak olmalı ve koku dengeleme şişelerine akış 50 mL / dak olmalıdır. Olfaktometrenin çıkışındaki hava akış hızını rutin olarak kontrol etmek son derece önemlidir.
Bir fareyi yerleştirmeden önce, aşağıdaki parametrelerin test edildiğinden emin olmak önemlidir: (1) Koku valfleri: Kara kutu üzerindeki düğmeye basıldığında koku valflerine tıklanmalıdır. Hava hortumu, boru içinde sıkışmış mineral yağ olmadan mineral yağın içine kabarcık çıkarmalıdır. (2) Koku hortumu: Kokular kabarcık üretmezse, boru tipik olarak valfin yakınında sıkıştığı yerde tıkanabilir. Borunun değiştirilmesi gerekebilir. (3) Son vana ve su vanası: Son vana, borunun düzgün çalışıp çalışmadığı kontrol edilerek doğru şekilde açılmalıdır. Su vanası için, su akışını engelleyen herhangi bir hava temizlenmeli ve suyun lixit'e akmasına izin verilmelidir. (4) Hava akışı: Akış ölçerlerin kalibre edilmiş ve uygun şekilde konumlandırılmış görünmesi gerekir. (5) Röle ışıkları: Deney sırasında rölelerdeki "ışıkların" doğru şekilde yandığından emin olun. (6) Su ödülü rölesi: Bir su ödülü dağıtıldığında, suyun üzerindeki röle ödülü dağıtırken yanıp sönmelidir. (7) Koku ve su ödül rölesi: Bir koku bir su ödülü ile eşleştirildiğinde, ilgili valf numarasının üzerindeki kırmızı röle ödül sırasında kırmızı renkte yanıp sönmelidir.
Sınırlama
Git/gitme görevi, farenin 2 kokuyu test etme yeteneğini test eder. Görevi yürütmek için, hayvanın birkaç seanstan geçirilmesi gerekir. Bu, koku ayrımını test etmek için yüksek verimli bir teknik değildir. Olfaktometre, koku alma uyaranlarını test etmek için tasarlanmıştır. Çok duyulu bir test cihazı değildir. Bununla birlikte, diğer duyusal girdileri test etmek için değişiklikler yapılabilir.
Bu makale, mineral yağda 50 mL/dk hızında seyreltilmiş koku maddesinden köpüren havanın, 2 L/dk'da arka plan hava akışı ile önceden dengelendiği bir sıvı seyreltme olfaktometresini açıklar. Bu koku verici dağıtım tasarımı için, taşıyıcı hava akışındaki koku seyreltme kinetiği, arka plan hava akışındaki koku konsantrasyonundaki artışın hızını belirler. Şekil 7'de gösterildiği gibi, konsantrasyon 200 ms içinde nihai konsantrasyonun yarısına yükselirken, konsantrasyon değişim hızı yarım saniyeden fazla yavaşlar. Bu konfigürasyon koku konsantrasyonunda kare adımlı bir değişiklik üretmese de, koku ayrımı ve tespitini incelemek için başarıyla kullanılmıştır21. Deneysel protokol, koku konsantrasyonunda bir adım değişikliği gerektiriyorsa, koku verici verme tasarımı, koku maddelerinin sürekli olarak arka plan hava akış kanallarından ikisinin arka plan hava akışına verildiği üç sürekli 2 L/dk arka plan hava akışı kanalına değiştirilmelidir. Üçüncü dağıtım kanalı, mineral yağ ile dengelenmiş hava sağlayacaktır. Bu durumda, iki koku maddesinden birini veya kokusuz havayı koku portuna yönlendirmek için yönlendirme valfleri kullanılacaktır. Bu, koku portundaki koku konsantrasyonunda kademeli artışlara neden olacaktır (ayrıca önceki raporlar19,22). Ne olursa olsun, bir fotoiyonizasyon detektörü kullanarak koku konsantrasyonundaki değişimin zaman akışını belgelemek çok önemlidir.
Burada açıklanan olfaktometre, fare davranış deneyleri için tasarlanmıştır, ancak bu tasarım geçmişte fareler için kullanılmıştır. Temel fark, sıçanlar23 ile yapılan çalışmalar için odanın büyüklüğünün arttırılması gerektiğidir. Son olarak, bu olfaktometre tek bir farenin koku alma davranışını değerlendirir. Birden fazla fareyi test etmek için yüksek verimli otomatik bir olfaktometretanımlanmıştır 24.
Mana
Bu protokol, mevcut diğer yöntemlere kıyasla maliyetleri azaltan özel yapım bir olfaktometreyi tanımlar.
Gelecekteki uygulamalar
Olfaktometre, farelerle kullanım için özel olarak tasarlanmıştır ve sıçanlar gibi diğer hayvanlarla kullanım için modifikasyon gerektirir. Çok elektrotlu bir kayıt sistemi (örneğin, çok elektrotlu bir kayıt kartı), bir Arduino Uno kartı veya bir kamera gibi ek özellikler de dahil edilebilir.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yoktur ve rekabet eden hiçbir mali çıkar yoktur.
Teşekkürler
Bu araştırma, NIH hibeleri K01 NS127850-01, R25 NS080685, R01 NS081248 ve DC000566'den alınan hibelerle desteklenmiştir. Restrepo'nun ve Ramirez-Gordillo'nun laboratuvarının tüm üyelerine destekleri için teşekkür ederiz.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2 1/8' ’ Modüler IC Breadboard Soketi | Bulunduğu yer: amazon.com | ASIN : B004MCSOQY | Işıklara güç verir ve sansürü yalar |
| 500 parça çeşitli karbon film dirençleri 1/4 watt | amazon.com tarihinde bulundu Marka:bojack | Dirençler BreadBoard soketine takılacak | |
| 50k-ohm lineer konik potansiyometre | Marka:TWTADE Bulunduğu yer: Amazon.com | Olfaktometrenin bileşenlerine izin verir Güç kaynağı: Ac 220v-6A Kaydırma çapı: 6mm/0.2" Şaft uzunluğu: 15mm/0.59" Montaj dişi. Topuz boyutu 15/17mm/0.6 x 0.67" (d*H) güç ayarı | |
| 5 mm kırmızı LED | Bulunduğu yer: Amazon.com Marka: EDGELEC | Dahili Direnç ile önceden kablolu; 5mm yuvarlak üst ampul ve kablolu LED'ler-Kolay Bağlantı 3-6V DC ile Sürün, 7.9 inç uzunluğunda kablolar. Watt: 1 Watt | |
| 6 pozisyonlu çift sıralı brrier şeridi | Bulunduğu yer: Digikey.com | Temel Ürün Numarası 1546306 | Nasıl bağlandığına bağlı olarak güç ve toprak için kullanılır Gerilim derecesi:300v Akım derecesi (amper):20A Tel ölçüsü:12-22 AWG |
| 96 yüksek akım 50 pinli konnektör dişiden dişiye | Bulunduğu yer: Amazon.com Marka: IIVVERR | Parça Numarası: F5C953EE65A980D | Ağırlık: 109G Aralık:2,54 mm Toplam boyut: 50x6,4 cm/2x2,5 inç |
| Akvaryum pompası -AAPA7.8L 125 GPH, 2 ÇIKIŞ 3W | Bulunan on:Amazon.com Marka: Hydrofarm store | Bu, çift açık uçlu soğuk su muhafazasına bağlanacak ve makinedeki havaya güç sağlamak için kullanılacaktır | |
| Dikenli Tee konnektör polietilen 1/4" | Bulunduğu yer: Uplastic.com | Ürün numarası: 62200 | Farklı hava hortumlarını birbirine bağlar |
| Dikenli Tee konektörü polietilen 3/16" | Bulunduğu yer: Uplastic.com | Ürün numarası:62063 | Farklı hava hortumlarını birbirine bağlar |
| BD genel kullanım hassas kayma hipodermik iğne 18 G ½ | Bulunduğu yer: Medneedles.com | Ürün numarası: BD 305195 | Su sistemi için kullanılır |
| Kara kutu/manuel kontrol kutusu | Marka:Otdorpatio Bulunduğu yer: Amazon | Yok | Kontrol kutusu olarak kullanılır Boyutlar: 3.94x2.68x1.97 |
| Kablo, pc güç kaynağı dahili bağlantıları 10ft | Bulunduğu yer: Amazon.com | Güç kaynağına bağlanır 40 watt | |
| Cflex boru, beyaz ¼ ” Kimlik Kartı x 3/8" OD | on:uplastic.com bulundu | Ürün numarası:54033 | Hava sisteminde kullanılan borular |
| koku vanaları, akış ölçerler, SSR48 kartı için rafları sabitlemek için delikli özel yapım beyaz taban tahtası | CU Anschutz Tıp Kampüsü'ndeki Nöroteknoloji Merkezi'nin Makine Atölyesi | ||
| Diverter vana— Minyatür inert sıvı valfi, 3 | on:Radwell.com bulundu | Parça numarası:003-0258-900 | 1/8 BARB 24VDC 1500'E KADAR SCCM 4.2W |
| Mavi karterli çift açık uçlu soğuk su muhafazası | Bulunan on:GRAINGER.COM MarkaPENTAIR/PENTEK | Uyumlu Mfr. Model Numarası150295; 150578; 151117; 151118; 151120; 155003; 244043; 244686; 244687 | |
| Fisherbrand cam EPA şişeleri | Bulunduğu yer: fishersci.com | Katalog no. 02-912-379 | Kokular için kullanılır |
| Montaj redüktörü 1/4" x 1/8 inç | Bulunduğu yer: uplastic.com | Ürün numarası: 64370 | Hava sistemi hortumlarında kullanılan adaptör. |
| Sert Tüp, intramedikal polietilen, 0,045 (Kimlik) 1 x 100 | |||
| Yüksek kızılötesi LED | amazon.com 'da bulundu Marka: gikfun | Bellek saat hızı 1mhz | |
| Ic opamp gp 4 devre 14dip | Bulunduğu yer: Amazon.com Marka:BOJACK | Çalışma Gerilimi 50 Volt Maksimum Gerilim 50 Volt | |
| Jumper tel kiti | Bulunduğu yer: Amazon.com Marka:Elegoo | Ürün Boyutları UxGxY: 0.04 x 8.27 x 0.04 inç | |
| Mini spst anlık anahtar | Marka:Radioshack Bulunduğu yer: Amazon.com | B000TLWZM6 | Koku vanaları için kullanılır Çalışma hacmi: 250V Akım derecesi:1 Amper |
| Multimetre | Amazon.com tarihinde bulundu Marka:AstroAl | AC/DC Akımı, AC/DC Gerilimi, Kapasitans, Frekansı, Görev Döngüsünü, Direnci, Diyotu, Sürekliliği ve Sıcaklığı doğru bir şekilde ölçer | |
| İğne burunlu | Bulunan on:amazon.com Marka:WorkPro | Telleri bükmek için kullanılacak | |
| Koku valfleri | on:Radwell.com bulundu | Stok kodu: 192833415 Parça numarası:225T031 | Koku şişelerinden kokuları pompalar. 30 PSIG 12 VDC |
| Fototransistör | Bulunduğu yer: Amazon.com Marka: HILETGO | Voltaj: 1.3-1.5V Alma Aralığı: (NM) 400-1000 Kafa Boyutu: 5mm x 5mm / 0.2" x 0.2"(D*L) | |
| Fototransistör ve LED çift olarak | |||
| Boru adaptörü 3/4" x 1/4 inç | Bulunduğu yer: uplastic.com | Ürün numarası: 64807 | Hava sistemi hortumlarında kullanılan adaptör. |
| Su konut pompası için boru adaptörü- m ¾ x1/4" | Usplastic.com | Ürün numarası: 64807 | Sıcaklık aralığı -50f ila 275F Maksimum basınç: 150psi Weoght 0.0015 lbs |
| Güç kaynağı 12v 30A 360W | Bulunduğu yer: Amazon.com Marka: ALITOVE | makinenin ana güç kaynağı. Giriş Voltajı: 220 Volt Çıkış: DC 12V 30A maks. | |
| PTFE Boru | Amazon.com'da bulundu | ||
| DÜZ UÇLU RITEFLOW AKIŞ ÖLÇERLER (MONTE EDILMEMIŞ) | Bulunan on:Globalindustrial.com Model numarası:t9FB3075514 | Ürün numarası: H40407-0075 | Olfactometer'deki hava akışını izler 150mm Ölçek, Boyut 2 Üreticinin Parça Numarası:H40407-0075 |
| Tornavida | Bulunduğu yer: Amazon.com Marka:Sharden | Olfaktometredeki vidalar için kullanılır | |
| Shrimk sargı/boru (18-22 gauge tel köknar için çeşitli boyutlar | Bulunduğu yer: Amazon.com Marka: eventronic | Malzeme: Poliolefinden yapılmıştır, Büzülme Oranı: 2:1 (sağlanan çapının 1/2'sine kadar küçülür) | |
| Silikon Boru 0.030 x 0.065 | Bulunan on:Amazon.com Marka:Bilimsel ürünler | Koku şişeleri için boru | |
| Lehim - kurşunlu | on:Uline.com bulundu | S-25294 | Havya ile birlikte kullanılacaktır |
| Havya | on:Uline.com bulundu | model numarası.: H-10799 | Kontrol kutusu ve diğer bağlantılardaki Bottonları lehimlemek için kullanılacaktır |
| Solid State Röle Modülü Dört Çıkışlı – Kırmızı | Bulunduğu yer: https://www.sealevel.com/ | Parça: OB5Q Model: DC Çıkış QSSR Modülü | Kapasitans: 8 pF Boyutlar: 2.4" (L) x 1.1" (W) x 3.1" (H) # of I/O : 4 Çıkış Maksimum Hat Voltajı: 60 VDC Maksimum On-State Akımı: 3A Minimum Hat Voltajı: 3 VDC İşletme Sıcaklığı :-30° C'den 80&dereceye; C (-22&derece; F'den 176&dereceye; F) Çıkış İzolasyonu: 4000 Vrms Depolama Sıcaklığı: -40° C'den 100&dereceye; C (-40&derece; F'den 212°'ye; F) |
| SPST basmalı düğme anahtarı | Marka:Apiele Bulunduğu yer: Amazon.com | Yok | Kontrol kutusu kontrol suyu vanası ve son vananın içinde kullanılır. Çalışma voltajı 250v Akım derecesi: 1 Amper, 3 Amper |
| Ssr rafı 48 | on:Radwell.com bulundu | Ürün numarası: 83105002 | Olfaktometrenin tüm bağlantılarını işler ve dörtlü tip sooid durum röleleri ile çalışır. |
| Paslanmaz çelik besleme boruları | |||
| Uç kalaylayıcı ve temizleyici | Bulunduğu yer: Amazon.com Marka: Thermaltronics | Model numarası: FBA-TMT-TC-2 | |
| Vana Topu PVC 1/4" Barb Buna | Bulunduğu yer: uplastic.com | Ürün numarası:62281 | |
| Su vanası | Bulunduğu yer: Ph.parker.com | Parça #: 003-0257-900 | Hazneye su pompalar Maksimum Akış Hızı: 1500 sccm Gerilim (VDC): 24 Maksimum Çalışma Basıncı:50 psi, 3,44 bar |
| Tel 22awg | Marka:tuofeng Bulunduğu yer: Amazon.com | Yok | Olfaktometrenin farklı bileşenlerini kablolamak için kullanılır Malzeme: bakır Ölçer 30.0 |
| Tel makasları | Bulunan on:Amazon.com Marka:Billbotk | Telleri kesmek için kullanılacak | |
| Marka olarak: PTFE | Bölüm #036663601452 | Koku vericileri vermek için kullanın. | |
| https://medschool.cuanschutz.edu/neurotechnologycenter/Cores/machine-shop |
Kaynaklar
- Yeshurun, Y., Sobel, N. An odor is not worth a thousand words: from multidimensional odors to unidimensional odor objects. Annu Rev Psychol. 61, 219-241 (2010).
- Buck, L. B. Unraveling the sense of smell (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 44, 6128-6140 (2005).
- Spors, H., Wachowiak, M., Cohen, L. B., Friedrich, R. W. Temporal dynamics and latency patterns of receptor neuron input to the olfactory bulb. J Neurosci. 26 (4), 1247-1259 (2006).
- Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A., Mombaerts, P. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
- Soucy, E. R., Albeanu, D. F., Fantana, A. L., Murthy, V. N., Meister, M. Precision and diversity in an odor map on the olfactory bulb. Nat Neurosci. 12, 210-220 (2009).
- Spors, H., et al. Illuminating vertebrate olfactory processing. J Neurosci. 32, 14102-14108 (2012).
- Kwak, J., Willse, A., Preti, G., Yamazaki, K., Beauchamp, G. K. In search of the chemical basis for MHC odourtypes. Proc Biol Sci. 277 (1693), 2417-2425 (2010).
- Schaefer, M. L., Yamazaki, K., Osada, K., Restrepo, D., Beauchamp, G. K. Olfactory fingerprints for major histocompatibility complex-determined body odors II: relationship among odor maps, genetics, odor composition, and behavior. J Neurosci. 22 (21), 9513-9521 (2002).
- Li, Y., et al. A distinct entorhinal cortex to hippocampal CA1 direct circuit for olfactory associative learning. Nat Neurosci. 20 (4), 559-570 (2017).
- Gadziola, M. A., et al. A neural system that represents the association of odors with rewarded outcomes and promotes behavioral engagement. Cell Rep. 32 (3), 107919(2020).
- Carlson, K. S., Gadziola, M. A., Dauster, E. S., Wesson, D. W. Selective attention controls olfactory decisions and the neural encoding of odors. Curr Biol. 28 (14), 2195-2205.e4 (2018).
- Moberly, A. H., et al. Olfactory inputs modulate respiration-related rhythmic activity in the prefrontal cortex and freezing behavior. Nat Commun. 9, 1528(2018).
- Gire, D. H., et al. Information for decision-making and stimulus identification is multiplexed in sensory cortex. Nat Neurosci. 16 (8), 991-993 (2013).
- Ma, M., et al. Molecular layer interneurons in the cerebellum encode for valence in associative learning. Nat Commun. 11 (1), 4217(2020).
- Bolding, K. A., et al. Robust odor coding across states in piriform cortex requires recurrent circuitry: evidence for pattern completion in an associative network. bioRxiv. , 694331(2019).
- Bolding, K. A., Franks, K. M. Recurrent cortical circuits implement concentration-invariant odor coding. Science. 361 (6407), eaat6904(2018).
- Bolding, K. A., Franks, K. M. Complementary codes for odor identity and intensity in olfactory cortex. Elife. 6, e22630(2017).
- Bodyak, N., Slotnick, B. Performance of mice in an automated olfactometer: odor detection, discrimination and odor memory. Chem Senses. 24 (6), 637-645 (1999).
- Slotnick, B., Restrepo, D. Olfactometry with mice. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8.20), (2005).
- Williams, E., Dewan, A. Olfactory detection thresholds for primary aliphatic alcohols in mice. Chem Senses. 45 (7), 513-521 (2020).
- Villanueva, J. A., Restrepo, D., Ramirez-Gordillo, D. Closed-Loop Optogenetic Stimulation of the Olfactory Circuit at Different Phases of Theta Oscillations of the Local Field Potential. Methods Mol Biol. 2915, 179-187 (2025).
- Arevalo, N., et al. Open-source JL olfactometer for awake behaving recording of brain activity for mice engaged in olfactory tasks. Animal Models of Reproductive Behavior. Neuromethods. 200, (2023).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor discrimination and odor quality perception in rats with disruption of connections between the olfactory epithelium and olfactory bulbs. J Neurosci. 22 (10), 4205-4216 (2002).
- Burton, S. D., et al. A novel olfactometer for efficient and flexible odorant delivery. Chem Senses. 44 (3), 173-188 (2019).
- Slotnick, B., Cockerham, R., Pickett, E. Olfaction in olfactory bulbectomized rats. J Neurosci. 24 (41), 9195-9200 (2004).
- Reinert, J. K., Schaefer, A. T., Kuner, T. High-throughput automated olfactory phenotyping of group-housed mice. Front Behav Neurosci. 13, 267(2019).
Yeniden basım ve izinler
