Yöntem makalesi

Sağlam Drosophila Larvalarında Lazer Hücre Ablasyonu Sinaptik Rekabeti Ortaya Çıkardı

1.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67053

⸱

26 Temmuz 2024

 ,  , 
1Stiles-Nicholson Brain Institute, Florida Atlantic University, 2Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, sağlam Drosophila larvalarında bireysel nöronların lazer hücresi ablasyonunu gösterir. Yöntem, gelişmekte olan sinir sistemindeki nöronlar arasındaki rekabeti azaltmanın etkisinin incelenmesini sağlar.

Özet

Protokol, sağlam Drosophila melanogaster larvalarının merkezi sinir sisteminde (CNS) 2-foton lazer sistemi ile tek nöron ablasyonunu tanımlar. Bu non-invaziv yöntem kullanılarak, gelişmekte olan sinir sistemi hücreye özgü bir şekilde manipüle edilebilir. Bir ağdaki bireysel nöronların gelişimini bozmak, sinir sisteminin sinaptik girdi kaybını nasıl telafi edebileceğini incelemek için kullanılabilir. Bireysel nöronlar, Drosophila'nın dev lif sisteminde, iki nörona odaklanarak spesifik olarak kesildi: presinaptik dev lif (GF) ve postsinaptik tergotrokanteral motor nöron (TTMn). GF, kaçış tepkisi için çok önemli olan ipsilateral TTMn ile sinaps yapar. 3. instar beyindeki GF'lerden birinin, GF aksonal büyümeye başladıktan hemen sonra kesilmesi, CNS'nin gelişimi sırasında hücreyi kalıcı olarak uzaklaştırır. Kalan GF, eksik komşuya reaksiyona girer ve kontralateral TTMn'ye ektopik bir sinaptik terminal oluşturur. Bu atipik, iki taraflı simetrik terminal, boya eşleşmesi ile gösterildiği gibi her iki TTMN'yi de innerve eder ve elektrofizyolojik deneylerle gösterildiği gibi her iki motor nöronu da çalıştırır. Özetle, tek bir internöronun ablasyonu, bir nöronun kaybını telafi edebilen ve kaçış devresine normal tepkileri geri yükleyebilen iki taraflı bir nöron çifti arasındaki sinaptik rekabeti gösterir.

Giriş

Lazer ablasyon, çok çeşitli organizmalarda nöral devreleri diseksiyon etmek için tercih edilen bir araçtır. Solucanlar ve sinekler gibi model genetik sistemlerde geliştirilen, sinir sisteminin yapısını, işlevini ve gelişimini incelemek için hayvanlar aleminde uygulanmıştır 1,2,3. Burada, Drosophila'da devre montajı sırasında nöronların nasıl etkileşime girdiğini araştırmak için tek nöron ablasyonu kullanıldı. Sineğin kaçış sistemi, analiz için favori bir devredir, çünkü yetişkin sineğin en büyük nöronlarını ve en büyük sinapslarını içerir ve devre son yıllarda iyi karakterize edilmiştir4. Dev Fiber devresinin montajında nöron-nöron etkileşimlerinin oynadığı rol, bu araştırmanın odak noktasıdır.

Hubel ve Wiesel'in 1960'lardaki çalışmalarından bu yana sinirbilimde odak noktası olan bir etkileşim türü "sinaptik rekabet"tir5,6. Bu protokolde, fenomenin moleküler temellerinin keşfedilebileceği Drosophila'nın dev lif sisteminde (GFS) tek hücreli ablasyon yoluyla rekabetin rolünü yeniden gözden geçirmek için lazer ablasyon kullanıldı.

Gelişmekte olan sinekteki nöronların ablasyonu, hedef nöronların görselleştirilmesi, ablasyon yönteminin kesinliği ve numunenin hayatta kalması dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle zor olmuştur. GFS'deki bu problemlerin üstesinden gelmek için, ilgilenilen nöronları etiketlemek için UAS / Gal4 sistemi7 kullanıldı ve presinaptik dev lifi veya postsinaptik sıçrama motor nöronunu (TTMn) çıkarmak için iki fotonlu bir mikroskop kullanıldı.

Bu çalışmada, komşu bilateral nöronların GFS'deki sinaptik bağlantıyı ve sinaptik gücü ayarlamada oynadığı rolü belirlemek için, bilateral nöron çiftlerinden biri (presinaptik GF veya postsinaptik motor nöron) pupa gelişiminden hemen önce silindi. Bu gelişim aşamasında, GF aksonogenezi tamamlanmamıştır8. Yetişkindeki sinaptik devrenin GF yapısı ve işlevi daha sonra incelendi ve kalan GF'nin çıktısına özellikle dikkat edildi.

Protokol

Protokol için kullanılan tüm hayvanlar Drosophila melanogaster türündendi. Bu türün kullanımını çevreleyen herhangi bir etik sorun yoktur. Bu işi yürütmek için etik izin gerekli değildi. Çalışmada kullanılan Drosophila türlerinin, reaktiflerinin ve ekipmanlarının detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Drosophila'nın yetiştirilmesi ve doğru larva aşamasının seçilmesi

  1. Kesilecek hücrelerde ifadeyi yönlendiren bir Gal4 sürücü hattı seçin ve bunu bir UAS-GFP raportör hattıyla yeniden birleştirin veya çaprazlayın. 25 ° C'de standart sinek yemi üzerindeki sinekleri yükseltin.
    NOT: Dev fiber (GF) ablasyonu için R91H05-Gal4 veya A307-Gal4, UAS-GFP ile yeniden birleştirildi. TTMn ablasyonları için UAS-GFP ile yeniden birleştirilen ShakB(ölümcül)-GAL4 kullanıldı (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Yiyeceklerden çıkmaya başlayan ve yiyecek şişesinin yan tarafına doğru sürünen larvaları seçin. Bu larvalar, GF hücre ablasyonunu gerçekleştirmek için tercih edilen aşama olan gezinme aşamasındadır.
    NOT: Ablasyon herhangi bir larva aşamasında yapılabilir. Son larva aşaması, GFS'nin gelişiminin manipülasyonu için önemliydi, çünkü GF hücre gövdeleri beyinde kolayca tanımlanabilir, ancak GF aksonları bu aşamada hedefleriyle bağlantı kurmamıştır.

2. 3. instar larvasının hazırlanması

NOT: Larvalar Burra ve ark.9'a benzer bir yöntem kullanılarak uyuşturulmuştur. İşlem sürelerini kısa tutmak için, bir seferde sadece bir larva hazırlayın. Anesteziye kısa süre maruz kalma, deney hayvanlarının hayatta kalmasını artıracaktır10.

  1. Sıkıca oturan bir kapağı olan bir cam tabak hazırlayın. Tabağa bir pamuk top yerleştirin ve bir davlumbazın altına yaklaşık 3-5 ml etil eter (tehlikeli, yanıcı sıvı, laboratuvar önlüğü, eldiven, gözlük) ekleyin. Çanağı kapakla örtün.
  2. Sinek şişelerinden bireysel 3. instar larvalarını toplayın. 3. larva aşamasında, larvalar besin ortamını terk eder ve besin şişesinin11 kenarı boyunca sürünür.
    1. Larvaların hala hareket ettiğinden ve puparium oluşumuna başlamadığından emin olun. Durağan olan ve vücutta kısalma gösteren larvalar pupaya başlar ve ablasyon için uygun değildir. Larvaları küçük bir boya fırçası ile toplayın.
      NOT: 3. larva dönemi, gelişimin 72. saatinde (yumurtlamadan sonra) ikinci tüy dökümünden sonra başlar ve 25 °C'de yetiştirilen sinekler için 120 saatte puparium oluşumuna kadar sürer.
  3. Bir larvayı küçük, açık bir kaba aktarın. Kabı etil eterli cam tabağa yerleştirin ve tabağı sıkıca kapatın. Cam tabağı açarken, dumanların dışarı çıkmasını önlemek için bir şnorkelin altına veya çeker ocak içine yerleştirin.
    1. 30 sn aralıklarla, larva ile kapağı tabaktan çıkarın ve larvaların hareket kabiliyetini diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin. Larva genellikle 1 dakika içinde hareketsiz hale gelir. Ağız kancaları seğirmeyi bıraktığında larva montaja hazırdır. 3 dakika sonra tamamen hareketsiz hale getirilmemiş larvaları atın.
      NOT: Bir mikrosantrifüj tüpünün baş aşağı kapağının üst kısmı (tüpten çıkarılan kapak) bir kap olarak kullanılabilir.

3. Ablasyon için larvaların slaytlara monte edilmesi

  1. Anestezi uygulanmış larvaları bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Larvaları bir damla böcek tuzlu suya batırın; Bu, larvaya yapışabilecek yiyecek artıklarının bir kısmını temizleyecektir.
  2. Diseksiyon mikroskobu altında, salinin çoğunu bir kağıt mendille çıkarın. GF ablasyonu için larva dorsal tarafını yukarı veya TTMn ablasyonu için ventral tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın. Larvaların üzerine yavaşça bir cam lamel indirin. Cam slayt ile lamel arasındaki boşluğu doldurmak için lamel ile lamel arasındaki boşluğu doldurmak için lamel tarafına tuzlu su ekleyin.
  3. GF ablasyonu için, diseksiyon mikroskobunda yüksek büyütme altında beynin konumunu kontrol edin. Beynin düz bir şekilde yattığından ve kütikülden görülebildiğinden emin olun. Çoğu zaman, beyin yağ dokusu ile kaplanır, bu da görselleştirmeyi ve hücre ablasyonunu imkansız hale getirir.
    1. Beyni kaplayan herhangi bir yağ dokusunu yerinden çıkarmak için, lamel üzerine forseps ile hafif bir baskı uygulayın ve lamel bir yandan diğer yana hareket ettirin. Yağ dokusu bu şekilde beyinden uzaklaştırılamıyorsa, bunun yerine farklı bir larva kullanın.

4. Hedef hücrelerin bulunması

NOT: Bu çalışma için kullanılan çoklu foton sistemi dik bir mikroskop üzerine monte edilmiştir. Edinim ve lazer stimülasyon ayarlarını kontrol etmek için sisteme özel yazılım kullanıldı. Sistem, numuneleri bulmak için bir epifloresan ışık kaynağı ile donatıldı. Objektif lens, 25x büyütme, 2 mm uzun çalışma mesafesi ve 1.10 NA ile suya daldırma lensiydi.

  1. Numuneyi çoklu foton mikroskobunun tablasına yerleştirin ve numuneyi epifloresan modunda bulmak için GFP filtresini kullanın. GF ablasyonu için, Şekil 1A, C, D'de görüldüğü gibi hücre gövdeleri beyinde tanımlanabilir. TTMn ablasyonu için, Şekil 1A,B'de gösterildiği gibi, ventral sinir kordonunda (VNC) ventral taraftan dört hücreden oluşan bir küme tanımlanabilir. Odaklama bittiğinde, hücreleri görüş alanında ortalayın ve 2 foton moduna geçin.

5. Ablasyon parametrelerinin ayarlanması

  1. Galvano tarayıcı ile GFP ifade eden hücreleri görüntülemek için lazer ayarlarını ve dedektör kazancını ayarlayın. 870 nm'lik bir dalga boyu, GFP sinyalini görselleştirmek için en iyi sonucu verir. Hücreyi görüş alanında ortalayın.
  2. Ablasyon alanını tanımlamak için dairesel bir ilgi alanı (ROI) kullanın. ROI'nin hücre yüzeyinin çoğunu kapladığından emin olun (Şekil 1E,G).
  3. Yazılımda ablasyon protokolünü ayarlayın. Bir edinme çerçevesi, ardından stimülasyon ve ardından başka bir edinme çerçevesi ayarlayın.
  4. Stimülasyon lazer gücü ayarını daha düşük bir değerde (- ) başlatın ve stimülasyon protokolünü çalıştırın. Başarılı bir ablasyon, ROI'nin bulunduğu yerde hücre soma'sının merkezinde net bir daire ve ROI'yi çevreleyen floresanda bir artış ile tanınabilir (Şekil 1F).
    1. Ablasyon başarılı olmadıysa ve sadece hücreyi ağarttıysa (Şekil 1H), lazer gücünü% 5'lik artışlarla veya ilmek sayısını birer birer artırın ve protokolü tekrar çalıştırın. Protokolde kullanılan sistem için uygulanan lazer gücü ile @ arasında bulunmuştur.
      NOT: Ablasyon için lazer güç ayarları, hücrelerin dokuda ne kadar derin bulunduğuna ve kütikül katlanması gibi diğer faktörlere büyük ölçüde bağlıdır. Hücreler parlak ve net bir şekilde görülebiliyorsa, lazer gücü aralığın alt ucunda olacaktır. Lazer gücü, lazer modeline ve lazerin yaşına bağlı olarak her sistem için farklı olacaktır.

figure-protocol-1
Şekil 1: Sağlam Drosophila L3 larvalarında lazer ablasyonu için nöronların tanımlanması. (A) Beyindeki dev lif (GF) soma'nın ve ventral sinir kordonundaki (VNC) tergotrokanteral motornöronu (TTMn) içeren motor nöron kümesinin konumunun şeması. (B) Larva VNC'de GFP'nin shakB (ölümcül) -Gal4 sürüş ekspresyonunun maksimum yoğunluk projeksiyonu. Orta çizgi noktalı çizgi ile gösterilir. Daire, lazer ablasyonu için hedeflenen TTMn'yi içeren nöron kümesini gösterir. Ölçek çubuğu: 50 μm. (C) A307-Gal4'ün kontrolü altında GFP'yi ifade eden larva beyninin kısmi projeksiyon görünümü. Daire, lazer ablasyon için hedeflenen GF soma'yı gösterir. Ölçek çubuğu: 50 μm. (D) R91H05-Gal4 sürüş UAS-GFP ile beynin maksimum yoğunluk projeksiyonu. Her iki GF (daire) konum, şekil ve boyuta göre tanımlanabilir. Ölçek çubuğu: 50 μm. (E) GF soma lazer ablasyondan önce büyütülmüş görünüm. Eflatun daire, lazer ablasyon için hedef bölgeyi gösterir. Ölçek çubuğu: 10 μm. (F) GF soma, lokalize lazer gücü ve başarılı ablasyon sonrası büyütülmüş görünüm. Ölçek çubuğu: 10 μm. (G) GF soma lazer ablasyondan önce büyütülmüş görünüm. Eflatun daire, lazer ablasyon için hedef bölgeyi gösterir. Ölçek çubuğu: 10 μm. (H) GF soma, lokalize lazer gücü ve başarısız ablasyon (ağartma) sonrası büyütülmüş görünüm. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Larvaların geri kazanılması

  1. Hücreyi başarılı bir şekilde kestikten sonra, lameli çıkarın ve larvaları bir boya fırçası ile slayttan yavaşça alın. Larvaları bir yiyecek şişesine yerleştirin. Larvalar 30 dakika içinde tekrar sürünmeye başlayacaktır.
    NOT: İşlem süresini kısa tutmak, hayvanların hayatta kalma oranlarını artırır. Tecrübe ile, deney 10 dakikadan kısa bir sürede gerçekleştirilebilir.
  2. Pupa kılıfından kapanana kadar larvaları standart koşullarda yetiştirmeye devam edin.

7. Yetişkin sineklerde GFS'nin işlevselliğinin test edilmesi

NOT: Aşağıdaki adımlar Allan ve Godenschwege12 ve Augustin ve ark.13'te ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

  1. Test yetişkin uçarları eklosiyondan 2-5 gün sonra. CO2 ile sinekleri uyuşturun ve bacakları mumun içine iterek diş mumunun üzerine monte edin. Kanatları 90° açıyla açın ve balmumu ile yerlerine sabitleyin. Hortumu balmumunun içine iterek kafayı sabitleyin.
  2. Her iki göze stimülasyon kabloları, karın içine bir topraklama kablosu ve her iki taraftaki atlama kaslarına (TTM'ler) cam kayıt elektrotları yerleştirin.
  3. Her iki kas için yanıt gecikmesini ölçmek için GF devresini tek uyaranlarla uyarın. Her iki kas için aşağıdaki frekansı ölçmek için devreyi sırasıyla 100 Hz ve 200 Hz uyaran dizileri ile uyarın.

8. Konfokal görüntüleme için dev fiber sisteminin diseksiyonu ve etiketlenmesi

NOT: Fly CNS diseksiyonu ve boya enjeksiyonu Boerner ve Godenschwege14'te detaylandırılmıştır.

  1. Sineği diş mumundan forseps ile nazikçe çıkarın ve bir diseksiyon kapsamı altında silikon elastomer kaplı bir Petri kabına aktarın.
  2. Bacakları, kanatları ve hortumu makasla çıkarın ve sinek sırt tarafını elastomer kaplamaya sabitlemek için böcek pimleri kullanın.
  3. Orta karın bölgesinden orta hat boyunca, tüm göğüs kafesi boyunca ve boynu yukarı doğru göğsü başa bağlayarak yanal bir kesi yapın. Sineği böcek pimleri ile açın. Sinir sistemine zarar vermeden organları ve bezleri sinekten çıkarın.
    NOT: Bu noktada, GF'leri ve elektriksel olarak bağlanmış nöronları13 etiketlemek için GF aksonlarına boyalar enjekte edilebilir.
  4. Beyni açığa çıkarmak için kafa kapsülünü kafadan çıkarın.

9. Sinir sisteminin immünohistokimyası

  1. CNS diseksiyonundan sonra, sineği oda sıcaklığında (RT) 45 dakika boyunca PBS'de% 4 PFA'da sabitleyin. PBS'de RT'de (3 kez) 20 dakika yıkayın.
  2. Numuneyi% 0.5 deterjan çözeltisi ile PBS'de% 3 BSA'da RT'de 1 saat bloke edin.
  3. PBS'de% 0.3 deterjan çözeltisi ve tavşan anti-GFP (1:500) ile% 3 BSA'da 4 ° C'de 2-3 gece inkübe edin. PBS'de RT'de (6 kez) 20 dakika yıkayın.
  4. Anti-tavşan Alexa 488 ile PBS'de gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. PBS'de RT'de (6 kez) 20 dakika yıkayın.

Sonuçlar

Bu yöntem, Drosophila'nın sinir sistemindeki belirli nöronal ağların gelişimini manipüle etmek için kullanılabilir. Buradaki birincil araştırma sorusu sinaptik bağlantıların oluşumuydu. Presinaptik GF veya postsinaptik TTMn'nin çıkarılması, bu merkezi sinapsta reaktif sinaptogenezin ve sinaptik fonksiyon ve gelişim için çok önemli olan moleküler mekanizmaların araştırılmasını sağladı. Protokolde tarif edildiği gibi, GF'lerden birinin veya TTMN'lerden birinin lazer hücre ablasyonu gerçekleştirildi ve yetişkin sinekte pupa gelişimi sonrası sinaps üzerindeki etkileri analiz edildi.

Prosedürün hayvan sağkalımı üzerinde olumsuz bir etkisi olmadığından emin olmak için, paralel olarak sahte ablasyonlar yapıldı. Sahte ablasyonlar için, hayvanlara deney hayvanlarıyla aynı şekilde davranıldı, ancak lazer darbeleri% 0'lık bir lazer gücü ile verildi. Vakaların% 82.4'ünde, sahte ablasyonlardan elde edilen hayvanlar yetişkin sineklere dönüşmüştür. Sahte ablasyonlu sineklerin GF'leri, 1 ms'nin altında bir gecikme ile yanıt verebildi ve uyaranların y.3'ü için 100 Hz'lik bir stimülasyonu takip edebildi. GF anatomisi tedavi edilmemiş sineklerden ayırt edilemezdi.

Her deney hayvanı için ablasyon anatomik olarak doğrulandı. GF ile ablasyonlu hayvanlarda, ablasyonsuz GF boya enjekte edildi ve görüntülendi (aşağıya bakınız). Servikal bağda (CvC) sadece bir GF akson görünüyorsa, diğer GF'nin ablasyonu varsayılmıştır. Ablasyon, beynin ablasyonlu tarafında GFP işaretli bir soma bulunmaması yoluyla da doğrulanabilir (Şekil 2A, daire). TTMn ablasyonunu değerlendirmek için, yetişkin VNC'deki GFP sinyali, TTMn soma ve dendritin kolayca tanımlanabildiği yerlerde analiz edildi. Bir tarafta TTMn'nin yokluğu, eksik soma ve dendritler nedeniyle kolayca fark edildi (Şekil 2B, daire).

Tedavi edilen sineklerde GFS'nin işlevini test etmek için, TTMn tarafından innerve edilen atlama kaslarından12,13 sinaptik potansiyeller kaydedildi (Şekil 3A). GF'ler, TTMn medial dendrit15 ile karışık bir elektriksel-kimyasal sinaps oluşturur. GF terminali dallanmamıştır ve sinaptik bölgedeki TTMn dendritine zıt tipik bir yanal bükülme gösterir (Şekil 3D, Şekil 4A ok ucu). Kontrol sineklerinde, her GF yalnızca ipsilateral motonöronunu innerve eder. TTM liflerinden elde edilen kayıtlarda, bağlantının gücü, 1 Hz stimülasyonda yanıt gecikmesi ve 100 Hz stimülasyonda takip eden frekans analiz edilerek değerlendirildi (Şekil 3B,C). Kontrol sinekleri, 1 ms'den daha az bir ortalama yanıt gecikmesi gösterdi ve uyaranların x.1'i için 100 Hz'lik bir stimülasyonu takip edebildi (Şekil 3B). Fizyolojik kayıtlar yapıldıktan sonra, numune, TRITC-Dekstran ve Nörobiotin karışımı ile boya enjekte edilen CNS ve GF'leri ortaya çıkarmak için diseke edildi. Büyük Dekstran molekülü, GF aksonunu ve terminali etiketler, ancak boşluk bağlantılarından geçmez. Nörobiotin, GF ve TTMn arasındaki boşluk bağlantılarını geçebilir ve postsinaptik dendritte Nörobiyotin sinyali tespit edildi (Şekil 3E, F, ok uçları). Bu Neurobiotin boya eşleşmesi, iki nöron arasındaki elektriksel eşleşmeyi doğruladı. Nörobiotin, VNC'deki boşluk bağlantıları yoluyla GF16'ya bağlanan diğer birçok nöronda da tespit edilebilir (Şekil 3E, F).

Aynı fizyolojik ve anatomik testler, L3'te bir GF ablasyon yapıldıktan sonra yapıldı. Ablasyon sineklerinde kalan GF'lerin çoğunun (13/15) aksonu, terminalin iki dala bölünmesini sergiler: biri olağan ipsilateral konumda ve diğeri orta çizgiyi sağlam GF'ye karşı homolog bir pozisyona geçer (Şekil 3G, ok). Her dal, TTMn dendritlerinden birine boya ile bağlandı (Şekil 3H,I, ok uçları). TTM'lerden elde edilen fizyolojik kayıtlar, normalden daha zayıf olmasına rağmen, bir GF'nin her iki TTM'ye olan bu sinaptik bağlantısını doğruladı. TTM yanıt latansları her iki taraf için 1 ms'den büyüktü ve 100 Hz'de aşağıdaki frekanslar, sağlam GF'ye bağlı TTMn için 7.1 ve kontralateral TTM için ( idi (Şekil 3C).

Bir GF'nin ablasyonu, kalan GF'nin her iki hedef nöronu da innerve etmesine neden olduğundan, bir sonraki deney, normal bir ipsilateral hedef motor nöron olmadığında komşu GF'lerin tepkisini gözlemlemeyi amaçladı. Bu deney için, postsinaptik nöronlardan biri silindi ve kalan TTMn'nin anatomisi ve işlevi ile GF terminallerinin morfolojisi değerlendirildi. Yetişkin kontrol hayvanlarında hem TTM'leri hem de GF'leri görselleştirirken, varsayılan sinaptik temas bölgesi açıkça görülebiliyordu (Şekil 4A, ok uçları). Her TTMn medial dendrit ipsilateral GF presinaptik terminale uygulandı. Her iki taraftan gelen TTMn dendritlerinin küçük çıkıntıları orta hatta temas ediyordu (Şekil 4C; iç). Nörobiyotin ile boya eşleşmesi her iki TTMn'de de belirgin şekilde görüldü (Şekil 4D, ok uçları).

Bir TTMn ablasyon yapıldığında, kalan TTMn medial dendritinin morfolojisi değiştirildi. Bu örneklerdeki medial dendrit, orta hat boyunca uzun, kalın bir dal uzatıyordu (Şekil 4I,K; sarı oklar). Ek olarak, her iki GF terminaline doğru daha ince çıkıntılar öne doğru genişledi (Şekil 4E,G; sarı ok uçları). TTMn'ye ipsilateral olan GF, TTMn dendrit boyunca çıkıntı yapan bir terminal ile olağan anatomisini gösterdi.

Hedef motor nöronu olmayan "öksüz" GF'nin tepkisi birincil ilgi alanıydı. Çoğu durumda (hayvanların% 61.5'i), yetim GF, bir terminali ipsilateral tarafta ve diğer terminali orta hattı geçen ve kontralateral TTMn dendrite doğru çıkıntı yapan bölünmüş bir terminal sergiledi (Şekil 4J, oklar). GF'nin bu çapraz dalları, komşu GF ablasyon yapıldığında ücretsiz deneyde görülenlerden her zaman daha küçüktü (Şekil 3F). İpsilateral terminal, orta hat boyunca uzanan TTMn dalına temas etti (Şekil 4I, sarı ok). Örneklerin #'ünde, öksüz GF orta çizgiyi geçti (Şekil 4F, ok) ve TTMn ön dallarından biri boyunca çıkıntı yaptı (Şekil 4E, sarı ok uçları) ve kalan TTMn'ye boya ile bağlandı (Şekil 4H, ok ucu).

TTMn ablasyon sineklerinde iki fenotip daha gözlendi (Şekil 4M). 13 sinekten birinde, her iki GF de normal bükülmeyi yaptı ve sinir sisteminin kendi taraflarında kaldı. Başka bir durumda, öksüz GF, öksüz GF'nin bir terminal yapmadığı ve genellikle büküldüğü alandan önce durduğu sonsuz fenotipi sergiledi. Dört fenotipin tümü için, sağlam TTMn tarafındaki TTM kayıtları, yanıt gecikmesi 1 ms'nin altında ve 100 Hz'de 0 veya 0'e yakın takip frekansı ile vahşi tip (WT) fizyolojisi ile karşılaştırılabilirdi. Bir hedefi kaldırmak, her iki GF'nin de kalan hedef TTMn'yi paylaşmasına izin verebilir. Çoğu durumda, her iki GF de kalan TTMn ile bağlantı kuracaktır. Genel olarak, yetim GF iki taraflı bir terminal sergileyecektir. Kontrol sineklerinde, GF'ler asla orta çizgiyi geçemez; bununla birlikte, TTMn ablasyon sineklerinin yaklaşık% 85'inde, bir GF kontralateral TTMn ile temas etmek için orta hattı geçti. Bir TTMn'nin iki GF tarafından innervasyonu sinaptik fonksiyonu olumsuz yönde etkilemedi.

Komşu GF'nin yokluğunun, hedef motor nöronun yokluğundan daha büyük bir etkiye sahip olması dikkat çekicidir. Kontralateral GF'nin yokluğunda oluşan bilateral terminal, hedef çıkarıldığında meydana gelen değişikliklerden çok daha büyük ve daha belirgin bir şekilde işlevseldir.

figure-results-1
Şekil 2: Yetişkin CNS'de başarılı ablasyon örnekleri. (A) Larva GF ablasyonundan sonra yetişkin bir sinek beyninin maksimum yoğunluk projeksiyonu. GFP (yeşil), A307-GAL4 tarafından tahrik edilir. Daire, ablasyonlu GF'nin eksik olduğu alanı gösterir. Ok ucu, beynin diğer tarafında GFP'yi ifade eden kalan GF'yi gösterir. GF, TRITC-Dextran (kırmızı) ile dolduruldu. Akson, VNC'ye doğru arkaya doğru çıkıntı yapıyor. Ölçek çubuğu: 20 μm. (B) L3'te bir TTMn'nin ablasyon edildiği yetişkin bir VNC'nin maksimum yoğunluk projeksiyonu. Kalan TTMn (ok ucu), shakB (ölümcül) sürücü altında GFP'yi ifade ediyor. Eksik TTMn'nin alanı daire ile gösterilir. Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 3: Bir dev lifin (GF) larva ablasyonu, kalan GF'nin presinaptik terminalinin iki taraflı dallanmasına neden olur. (A) Yetişkin dev lif sistemi (GFS) yapısını ve işlevini test etmek için deney düzeneğinin şeması. Kayıt elektrodu, sağlam hayvanda beynin uyarılması üzerine tergotrokanteral kaslarda (TTM) gecikmeyi ve aşağıdaki tergotrokanteral motornöron (TTMn) çıkış frekansını ölçer. Sinir sistemi diseksiyonunu takiben, boya servikal bağdaki (CvC) GF aksonlara enjekte edildi. (B,C) 100 Hz'de TTM yanıt gecikmesi ve takip frekansı için örnek izlemeler (n, gösterilen ortalama gecikme süresi ve takip frekansı ile her durumdan kaydedilen TTM sayısını temsil eder). (B) İki sağlam GF'ye sahip kontrol hayvanları, 1 ms'nin altında TTM gecikmeleri ve 100 Hz'de 0'e yakın frekansları takip eder. (C) Ablasyonlu hayvanlarda kalan tek GF, her iki TTM'yi de innerve eder. Her iki TTM için gecikmeler kontrollerden daha uzundur ve 100 Hz'den sonra frekans önemli ölçüde azalır. (D-I) Boya dolgulu GF'ler için konfokal görüntü yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyonu. TRITC-Dekstran (kırmızıda D, G, F, I) ve Nörobiotin (gri renkte E, H, F, I) birlikte enjekte edildi. Nörobiotin, postsinaptik nöronları etiketleyerek GF ve TTMn arasındaki boşluk bağlantılarını geçebilir. Noktalı çizgiler orta çizgiyi gösterir. (D) Terminal bükümü ile kontrol hayvanlarının tipik GF anatomisi. (E,F) Nörobiotin, GF'lere elektriksel olarak bağlanmış birçok postsinaptik nöronu etiketler. Trans sinaptik olarak etiketlenmiş TTMn dendritleri ok uçları ile gösterilir. (G) Ablasyondan sonra, kalan GF, kontralateral TTMn'yi innerve etmek için orta çizgiyi geçen ekstra bir terminal (ok) oluşturur. (H,I) Her iki TTMn (ok ucu) aynı GF'ye boya ile bağlanmıştır. Ölçek çubukları: 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 4. Bir tergotrokanteral motor nöronun (TTMn) larva ablasyonu, kalan TTMn'nin her iki dev lif (GF) tarafından innervasyonuna neden olur. (A-L) ShakB(lethal)-Gal4 kontrolü altında GFP (yeşil) ile etiketlenmiş TTM'lerin konfokal görüntü yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyonları ve GF'ler TRITC-Dekstran (macenta) ve Nörobiyotin (kırmızı) ile boya ile dolduruldu. Noktalı çizgi, sinir sisteminin orta çizgisini gösterir. (M.S.) Her iki TTM de sağlam olan numuneleri kontrol edin. GF'ler, TTMn (A,B) ile temas etmek için tipik terminallerini orta hattan uzağa doğru büker ve her GF bir TTMn ile temas eder. TTMn dendritleri orta hatta (C) buluşur. Her GF, TTMn'sine (D, beyaz ok uçları) bağlı boyadır. (E-H) Sol TTMn ablasyon yapıldı. Kalan TTMn'nin medial dendriti orta hat boyunca çıkıntı yapar (G, sarı ok). Yetim GF, sinaptik bölgede orta çizgiyi (beyaz ok) geçer ve kontralateral TTMn dendrit (E,F) ile temas eder. GF'ler, kalan TTMn'ye (H, ok ucu) boya ile birleştirilir. (I-L) Sol TTMn'nin ablasyon edildiği başka bir GF fenotipi örneği. Kalan TTMn'nin medial dendriti orta hat boyunca çıkıntı yapar (I ve K, sarı ok). Sol yetim GF iki taraflı bir terminal yapar; bir dal kontralateral olarak çıkıntı yapar ve diğeri TTMn'ye bağlanmak için ipsilateral kalır (J, oklar). Ölçek çubukları: 20 μm. (M) TTMn ablasyon hayvanlarında gözlenen dört farklı GF fenotipinin şeması. n, her sınıftaki hayvan sayısını gösterir. Sağlam TTMn tarafı için TTM yanıt gecikmesi ve 100 Hz'de takip eden frekans (FF) için standart hataya sahip ortalamalar verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

2 fotonlu bir mikroskop ile hücre ablasyonunun, Drosophila'da nöronal devre gelişimini manipüle etmek için oldukça başarılı bir yöntem olduğu kanıtlandı. Bu yöntem non-invaziv olduğu için hayvana minimum zarar verir. Veriler, bilinen devrelerin bu hücreye özgü manipülasyonunun kullanışlılığını desteklemektedir.

Ablasyonun başarısı için en uygun Gal4 sürücüsünü seçmek çok önemliydi. GFS iyi çalışıldığından, birçok özel Gal4 sürücü hattı tanımlanmıştır7. Çoğu Gal4 sürücüsü çok sınırlıdır, ancak yine de diğer birçok nöronda ifade edilir. Zorluklardan biri, bozulmamış hayvandaki hedef hücreleri güvenilir bir şekilde tanımlamaktı. Açıkça görülebilen bir GFP etiketine sahip hayvanlar için, ablasyon düşük lazer gücünde gerçekleştirilebilir ve genellikle sadece bir deneme gerektirir. Yağ dokusunun beyni kapladığı veya GFP ekspresyonunun zayıf olduğu hayvanlarda, hedef hücrelerin silinmesi daha yüksek lazer gücü ve çoklu lazer maruziyeti döngüleri gerektiriyordu. GF hücre gövdeleri, beynin dorsal tarafından yaklaşık 100 μm derinliğe yerleştirildi. Hedef hücrelerin daha derin bir derinlikte bulunduğu deneyler için, sinir sisteminin daha küçük olduğu daha erken larva aşamalarında ablasyon yapmak faydalı olabilir.

Laboratuvarda daha önce yapılan deneylerde, hücre ablasyonu için farklı yöntemler araştırılmıştı. Toksinlerin ekspresyonunu yönlendirmek için UAS / Gal4 sisteminin kullanılması da belirli nöronların silinmesine yol açtı. Bununla birlikte, tek hücrelerin silinmesini kontrol etmek ve hedef dışı etkilerden kaçınmak çok daha zordur. Diğer zorluk, hücre silme olayının tam zamanlamasını kontrol etmektir. Lazer hücre ablasyonu, hedef konum ve delesyon zamanlaması üzerinde hassas kontrol sağladı, ancak yöntem mükemmelleştirilmeden ve %80'in üzerinde başarı oranlarına (hayvan sağkalımı ve başarılı hücre ablasyonu) ulaşılmadan önce hala üstesinden gelinmesi gereken bazı zorluklar vardı. Hayvanların hayatta kalma oranı, etil etere uzun süre maruz kalma ve uzun işlem sürelerinden olumsuz etkilenmiştir. Çalışmalar, L3 Drosophila larvalarının Etil Eter10'a 3,5 dakika maruz kalması için pupa (%78) ve yetişkinlere (%67) yüksek sağkalım oranlarının elde edilebileceğini göstermiştir. 3,5 dakika maruz kalma, hayvanın 8 saate kadar hareketsiz kalmasını sağlayacaktır. Lazer hücre ablasyonu için hayvanların 30 dakika veya daha kısa bir süre hareketsiz kalması gerekir. Bu nedenle, etil etere maruz kalma süresi 3,5 dakikanın çok altında tutulabilir. Çoğu durumda, larvalar 1 dakika içinde tamamen hareketsiz kaldı.

Lazer ablasyon sonuçları, GF'nin temiz bir şekilde ablasyon edilebileceğini ve kontralateral komşu GF üzerindeki etkinin kolayca değerlendirilebileceğini göstermektedir. Ablasyon sonucu net ve tutarlıydı. 15 tek hücreli ablasyonun 13'ünde, kalan GF ortakları, kontrol hayvanlarında hiç görülmeyen iki taraflı bir terminal sergiler. Bu iki taraflı simetrik terminal kolayca tanınır ve olağandışı kontralateral dal, normal bir terminale benzer boyuttadır ve kontralateral hedef motor nörona boya ile bağlanmıştır. Bilateral terminal, her iki hedef motor nörona boya ile bağlanmıştır ve çoğu örnekte neredeyse vahşi tipte işlev görür, hem normal ipsilateral hedefi hem de kontralateral hedef motor nöronu gecikmelerle ve kontrol değerlerine yakın frekansları takip ederek çalıştırır.

Tamamlayıcı deney, bir hedef motor nöronun tek taraflı ablasyonu, ilginç bir karşılaştırma sağlar. Kalan motor nöron genellikle reaktif bir dendritik büyüme sergiler ve orta hat boyunca normalde silinen komşu tarafından işgal edilen boşluğa bir süreç uzatır. Bu dendrit, silinen kadar büyük olmasa da, GF'lerin ikili eşlerini kaçırmalarına benzer bir reaksiyon gösterir. Buna karşılık, artık hedefsiz GF, eksik hedefe yalnızca mütevazı bir şekilde yanıt verir, küçük süreçleri orta hat boyunca ve kalan motor nöron dendritleri boyunca uzatır. Bu mütevazı yanıt, GF'nin, normal terminali tamamlamak ve iki taraflı bir terminal oluşturmak için büyük bir kontralateral terminalin oluşturulduğu eksik bir bilateral homolog GF'ye verdiği dramatik tepkiyle keskin bir tezat oluşturur.

Son zamanlarda beyindeki GF'ye presinaptik girdiler üzerinde paralel bir ablasyon deneyi yapıldı ve burada sinaptik boşluk için benzer bir "rekabet" ortaya çıktı17. GF'ye görsel girişler, görsel projeksiyon nöronlarının (VPN) GF dendritlerine ulaştığı glomerulusu kaplar. Bir grup VPN'yi silmek (bu durumda genetik olarak), kalan VPN'lerin eksik komşunun sinaptik alanının bir kısmını ele geçirdiğini ve innerve ettiğini ve baş gösteren uyaranlara görsel tepkinin telafi edici bir fizyolojik iyileşmesini sağladığını gösterir. İlk gelen afferentler silindiğinde, daha sonraki gelenler yer kaplar ve artık işgal edilmez. Bu çalışmayla en büyük fenomenolojik benzerlik, fiziksel doluluğun çeşitli girdiler arasındaki dengeyi belirlemede oynadığı belirgin roldür. İki GF'nin çıkış terminalleri, fiziksel sinaptik alan için birbirleriyle rekabet ediyor gibi görünüyor.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

2 foton mikroskobu üzerinde deneyler FAU Stiles-Nicholson Beyin Enstitüsü İleri Hücre Görüntüleme Çekirdeği'nde gerçekleştirildi. Jüpiter Yaşam Bilimleri Girişimi'ne finansal destek için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Tavşan IgG (H + L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Anti-yeşil floresan protein, tavşanFisher ScientificA111221:500 konsantrasyon
Apo LWD 25x/1.10W ObjektifNikonMRD77220suya daldırma uzun çalışma mesafesi
Sığır Serumu Albümin (BSA)SigmaB4287-25G
Bukalemun Ti: Safir Vision II LazerTutarlı
PamukTopu Genesee Scientific51-101
Dekstra, Tetrametilrodamin, 10.000 MW, Lizin Sabitlenebilir (floro-Yakut)Fisher ScientificD1817
Gu ve O'Dowd'danDrosophila salin
Etil EterFisher ScientificE134-1Tehlike, Yanıcı sıvı
Sinek yemeği B (Bloomington tarifi)LabExpress7001-NV
Metil salisilatFisher ScientificO3695-500
Mikrosantrifüj tüpü 1.5 mLEppendorf22363204
Mikroskop kapak kayması 18x18 #1.5Fisher Scientific12-541A
Nörobiotin İzleyiciVektör LaboratuvarlarSP-1120
Nikon A1R çoklu foton mikroskobudik bir FN1 mikrosopa standı üzerindeNIS
Elemanları İleri AraştırmaNikonEdinimi ve veri analizi yazılımı
Paraformaldehit (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (Fosfat Tamponlu Salin)Fisher BioReagentsBP2944-100Tabletler
R91H05-Gal4Bloomington Drosophila Stok Merkezi40594
shakB(ölümcül)-GAl4Bloomington Drosophila Stok Merkezi51633
Superfrost mikroskobu cam slaytFisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000deterjan çözeltisi
UAS-10xGFPBloomington Drosophila Stok Merkezi32185
tarifi, 2006 Nikon

Kaynaklar

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
  2. Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92(2014).
  3. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  4. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
  5. Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
  6. Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
  7. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  8. Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
  9. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  10. Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
  11. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  12. Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).
  13. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. (47), e2412(2011).
  14. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), e3080(2011).
  15. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
  16. Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), 0346(2018).
  17. Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ki Foton MikroskobisiN ral Devre KurulumuDev Lif SistemiOptogenetikTekil N ron AblasyonuKa DavranGFP Eksprese Eden H creler
Sağlam Drosophila Larvalarında Lazer Hücre Ablasyonu Sinaptik Rekabeti Ortaya Çıkardı
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.