Method Article

Sigara Dumanı Ekstraktı ile Uyarılan Murin Hava Yolu Epitel Hücrelerinde Multi-Omiklerin Farklılaşması ve Değişikliklerinin İncelenmesi için İn Vitro Model

DOI:

10.3791/67057

⸱

July 12th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, murin hava yolu epitel hücrelerini izole etmek ve farklılaştırmak için, kronik sigara dumanı ekstraktına (CSE) alışmalarına odaklanan bir in vitro model açıklıyoruz. Model, CSE'nin multi-omik etkisini kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kullanılabilir, bu da muhtemelen kronik duman maruziyeti altındaki hücresel tepkiler hakkında bilgi sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) büyük ölçüde tütün dumanı maruziyetine bağlıdır. Hava yolu epitel hücrelerinin tütün dumanına fonksiyonel olarak nasıl adapte olduğunu araştırmak KOAH patogenezini anlamak için çok önemlidir. Bu çalışma, tütün dumanının gerçek yaşam etkisini taklit etmek için primer murin hava yolu epitel hücrelerini kullanarak bir in vitro model oluşturmaktı. Yerleşik hücre dizilerinin aksine, birincil hücreler, büyüme modelleri, yaşlanma ve farklılaşma dahil olmak üzere daha fazla in vivo benzeri özellikleri korur. Bu hücreler hassas bir enflamatuar yanıt ve verimli farklılaşma sergiler, böylece fizyolojik koşulları yakından temsil eder. Bu modelde, primer murin hava yolu epitel hücreleri, optimal bir sigara dumanı ekstraktı (CSE) konsantrasyonuna sahip bir hava-sıvı arayüzü altında 28 gün boyunca kültürlendi, bu da farklılaşmamış hücrelerin tek tabakasının CSE iklimlendirmesinin göstergesi olan psödostratifiye bir kolumnar epitele dönüşmesine yol açtı. Daha sonra CSE'nin bazal hava yolu hücrelerinin farklılaşmasını etkilediği mekanizmaları aydınlatmak için kapsamlı multi-omik analizler uygulandı. Bu içgörüler, tütün dumanı maruziyetine yanıt olarak KOAH ilerlemesini destekleyen hücresel süreçlerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), karmaşık özelliklere sahip heterojen bir akciğer rahatsızlığı iken, KOAH'lı hastalar yavaş yavaş daha genç olma eğilimindedir1. KOAH2 için birincil risk faktörü olan sigara, tütün dumanına karşı ilk bariyer görevi gören hava yolu epitel hücreleri üzerinde derin bir etkiye sahiptir. Bilinen bu ilişkiye rağmen, tütün dumanının hava yolu epitel hücrelerinde değişikliklere neden olduğu ayrıntılı mekanizmalar yeterince araştırılmamıştır. Bu moleküler değişikliklerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, KOAH için erken tanı belirteçlerinin ve terapötik hedeflerin belirlenmesi için gereklidir.

Bu boşluğu gidermek için, murin hava yolu epitel hücrelerini kullanarak yeni bir in vitro model geliştirdik. Bu hücreler, sigara dumanı ekstraktı (CSE) ile uzun süreli stimülasyona tabi tutuldu, bu da dinamik hücresel değişiklikleri izlememizi ve uzun süreli tütün stimülasyonu altında hava yolu epitel hücrelerindeki değişiklikleri ve altta yatan mekanizmayı keşfetmemizi sağladı. Bu modelde, hava yolu epitel hücrelerinin hava-sıvı arayüzünü sağlamak için transwell kullanıldı ve sigara dumanı ekstraktı, epitel hücresi farklılaşmasının erken evresinde, 28 günde farklılaşmanın sonuna kadar uyarıldı. Önceki çalışmalarda sadece hava yolu epitel hücrelerinin farklılaşması ve kısa süreli uyarılması (hücre hattı baskınlığı) araştırılmıştır. Tek bir düzenleyici yol 3,4,5,6 ile sınırlıydılar. Bununla birlikte, burada sunulan protokol, birincil fare hava yolu epitel hücrelerini kullanır ve önceki hava yolu epitel hücre kültürü yöntemlerinden daha iyi hücre aktivitesi için hücre ekstraksiyon sürecini optimize eder. Bu model, kapsamlı transkriptomik, proteomik, metabolomik ve epigenomik analizlerin yanı sıra hücresel farklılaşmadaki değişikliklere odaklanmaktadır. İmmünofloresan ve ileri multi-omik teknikler kullanarak, hava yolu epitel hücrelerinin kronik tütün dumanı maruziyetine hücresel yanıtlarını aydınlatmayı ve böylece KOAH patogenezinin daha derin bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunmayı amaçladık. Bu model, hava yolu epitel hücresi farklılaşma paternindeki değişiklikleri ve çeşitli kirleticilerin uzun süreli uyarılmasının neden olduğu mekanizmasını araştırmak için kullanılabilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel protokol, murin trakealarından izole edilen hava yolu epitel hücrelerinin hazırlanması için 1 gün, hücre proliferasyonu için 15 gün ve hava-sıvı arayüzünde CSE stimülasyonu için 28 gün dahil olmak üzere 44 gün gerektirir. Tüm deney hayvanları, Capital Medical Üniversitesi Hayvan Deney Merkezi'nin SPF Bariyerli Hayvan Odası'nda barındırılmaktadır ve Capital Medical Üniversitesi Hayvan Deneyi ve Laboratuvar Hayvanları Etik Kurulu (AEEI-2020-100) tarafından ARRIVE yönergelerinin gerekliliklerini karşılamak için gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır7.

1. Primer murin hava yolu epitel hücrelerinin murin trakealarından izolasyonu

  1. Hazırlık
    1. 1 mL 50x takviyesi ve 0.05 mL hidrokortizon stoğunu 48.95 mL genleşme bazal ortamı ile birleştirerek tam genleşme ortamı hazırlayın. 4 °C'de saklayın ve 4 hafta içinde kullanın.
    2. Bir proteinaz çözeltisi hazırlamak için 7.5 mg proteinaz ve 5 mg deoksiribonükleaz I'i 5 mL Ham'ın F-12'sinde çözün. Sterilize etmek ve 4 ° C'de saklamak için filtreleyin ve 4 hafta içinde kullanın.
    3. 5 mL tam genleşme ortamına, PBS'ye ve proteinaz çözeltisine (100 U / mL Penisilin, 100 U / mL Streptomisin, 10 μg / mL gentamisin ve 0.25 μg / mL amfoterisin B) 0.05 mL 100x penisilin / streptomisin ve 0.01 mL 500x gentamisin / amfoterisin ekleyerek antibiyotik çözeltileri hazırlayın. 4 °C'de saklayın ve 4 hafta içinde kullanın.
    4. Cerrahi aletleri sterilize edin ve biyolojik güvenlik kabinini hücre izolasyonu için hazırlayın. Aynı zamanda, standart hücre kültürü ekipmanının kullanıma hazır olduğundan emin olun.
    5. 100 mm kültür kaplarına ve 24 mm transwelllere (0,05 mL/cm2) sıçan kuyruğu kollajeni (0,02 N asetik asit içinde 100 μg/mL) ekleyerek sıçan kuyruğu kollajen kaplı tabaklar hazırlayın. Sterilizasyon için UV ışığı altında gece boyunca açık bırakın.
  2. Primer murin hava yolu epitel hücrelerinin izolasyonu
    1. Trakeal epitel hücre izolasyonu için C57BL / 6 fareleri (6-8 haftalık, erkek, SPF'li) kullanın. % 1 pentobarbital sodyum çözeltisi doz aşımı (yaklaşık 200 mg / kg) ile ötenazi yapın. Yeterli hücre verimi için beş fare kullanın.
    2. Alkolün trakeaya akmasını önlemek için fareyi% 75 etanol çözeltisine batırarak% 75 etanol çözeltisine batırarak sterilize edin.
    3. Fareyi inceleyin.
      1. Epidermisi alt çeneden farenin karın boşluğuna kesmek ve açmak için bir cihaz seti olan cerrahi bıçaklar ve forseps kullanın.
      2. Her iki taraftaki tiroid bezlerini koparmak ve trakea, çevredeki kas dokusu ve yemek borusu arasındaki bağlantıları çıkarmak için başka bir cerrahi alet seti kullanın.
      3. Bundan sonra, göğsü dikkatlice kesin, göğüs boşluğuna daha derine inmek için forseps kullanın, tüm akciğeri çıkarın ve trakeanın ucunu bulun.
    4. Trakeayı işleyin.
      1. Trakeayı tiroid kıkırdağından trakeo-bronşiyal dala kadar kesin ve dört antibiyotik içeren soğuk genleşme öncesi bir ortama koyun.
      2. Trakea yüzeyinden mümkün olduğunca fazla kanı durulamak için tüpü sallayın, buz üzerinde tutun ve ardından bir sonraki fare için ameliyata başlayın.
    5. Toplanan tüm trakeaları, sindirim öncesi ön tedavi için dört antibiyotik (200 U/mL Penisilin, 200 U/mL Streptomisin, 20 μg/mL gentamisin ve 0.5 μg/mL amfoterisin B) içeren soğuk öncesi PBS tamponuna aktarın.
    6. Trakea yüzeylerinden pıhtıları ve diğer dokuları çıkarmak için bir dizi cerrahi alet kullanın ve ardından bunları 1 cm2 boyutunda kesin.
    7. Trakeal dokuyu proteinaz çözeltisi içinde 37 ° C'de 40 dakika inkübe edin.
    8. 40 dakika sonra, tüpü birkaç kez sallayın ve kalan dokuları çıkarmak için 40 μm'lik bir hücre süzgeci kullanın. Doğranmış trakeaları 5 mL genleşme ortamı olan bir süzgeç üzerinde durulayın, hücre süspansiyonunu 400 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    9. Elde edilen hücreleri 8 mL genleşme ortamında yeniden süspanse edin.
    10. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.
    11. Sıçan kuyruğu kollajeni ile önceden kaplanmış 100 mm'lik tabaklar (1 x 104 canlı hücre /cm2) üzerinde P0 hücre süspansiyonunu plakalayın ve hücreleri 37 ° C,% 5 CO2'de bir inkübatörde kültürleyin.

2. Primer murin hava yolu epitel hücrelerinin genişleme kültürü ve geçişi

  1. P0 hücre kültürü için ortamı, hücreler genellikle 6 gün içinde% 70 -% 80 birleşmeye ulaşana kadar her 3 günde bir değiştirin. Bu noktada, murin trakeal epitel hücreleri, parke taşı görünümünde sağlam bir tek tabaka oluşturabilir (Şekil 1A-D).
  2. Yeterli hacimlerde PBS, tam genleşme ortamı ve hayvan bileşeni içermeyen (ACF) hücre ayrışma kitini 37 °C'ye önceden ısıtın.
  3. Hücreleri 3 mL PBS ile nazikçe durulayın.
  4. Enzimatik ayrışma gerçekleştirin.
    1. Tabağa 3 mL ACF enzimatik ayrışma çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Pipetlemeden sonra, hücreleri nazikçe yerinden çıkarın ve hücre süspansiyonunu 3 mL ACF enzim inhibisyon çözeltisine aktarın.
    2. 3 mL ACF enzimatik ayrışma çözeltisi ilavesini tekrarlayın ve maksimum hücre ayrılmasını sağlamak için tekrar 5 dakika inkübe edin.
  5. Hücre süspansiyonunu 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da döndürün. Süpernatanı atın.
  6. Hücreleri 1 mL genleşme ortamında yeniden süspanse edin.
  7. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.
  8. Sıçan kuyruğu kollajeni ile önceden kaplanmış birkaç 100 mm'lik tabak (5 x 104 canlı hücre /cm2) üzerinde P1 hücre süspansiyonunu plakalayın ve hücreleri 37 ° C,% 5 CO2'de bir inkübatörde kültürleyin.

3. Hava-sıvı arayüzünde primer murin hava yolu epitel hücrelerinin farklılaşması ve CSE stimülasyonu

  1. Hücre türünü onaylayın.
    1. Sitokeratinlere karşı antikorlar içeren bir immünofloresan testi (IFA) kullanarak izole edilmiş hücrelerin epitel kökenini doğrulayın. Sıçan kuyruğu kollajeni ile kaplanmış cam slaytlar üzerindeki tohum hücreleri ve hücreler% 80 birleşmeye ulaştıktan sonra en az 12 saat boyunca sabitlemek için paraformaldehit kullanın.
    2. Slaytları PBS solüsyonu ile 3 kez 5 dakika yıkayın ve PBS solüsyonunda %3 BSA ve %0.1 triton X-100 ile oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
    3. Slaytları gece boyunca 4 ° C'de 1:500 seyreltmede ticari anti-pan sitokeratin antikoru ile inkübe edin.
    4. Ertesi gün, slaytları 5 dakika boyunca PBS çözeltisi ile 3 kez yıkayın ve karanlıkta 2 saat boyunca RT'de 1:1000 seyreltmede ikincil antikor tamponu ile inkübe edin.
    5. İnkübasyondan sonra, slaytları PBS ile 3 kez yıkayın (yıkama başına 5 dakika) ve bunlara 1:1000 oranında seyrelterek DAPI ekleyin. RT'de 15 dakika inkübe ettikten sonra, slaytları PBS ile bir kez 5 dakika yıkayın.
    6. Slaytları bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin ve ifade modellerini pozitif bir kontrol (A549 hücre hattı) ve bir negatif kontrol (Raw264.7 hücre hattı) ile karşılaştırın (Şekil 2).
  2. Farklılaşma için hücreleri tohumlayın.
    1. P2 hücrelerini daha önce tarif edildiği gibi ayırın ve santrifüjleyin ve 1 x 104 canlı hücre /cm2'nin kaplanmasını kolaylaştırmak için hücre peletini uygun bir hacimde genleşme ortamında yeniden süspanse edin.
    2. Transwell polikarbonat membran ekinin apikal haznesine 1 mL hücre süspansiyonu pipetleyin. Transwell'in bazal bölmesine 1.5 mL proliferasyon ortamı ekleyin.
  3. Hücreleri 37 ° C'de inkübe edin ve birleşme noktasına ulaşılana kadar genleşme ortamı kullanarak her 3 günde bir bazal ve apikal odalardaki tüm ortamı tamamen değiştirin. Bu genellikle 3-6 gün sürer.
  4. 44.15 mL ALI Bazal Besiyerine 5 mL ALI 10x Eki, 500 μL ALI Bakım Eki, 100 μL heparin çözeltisi ve 250 μL hidrokortizon stok çözeltisi ekleyerek 50 mL tam farklılaşma ortamı hazırlayın.
  5. ÖAM'yi hazırlayın.
    1. Bir sigarayı 12,5 mL farklılaştırma ortamından geçirin ve ardından CSE'yi hazırlamak için 0,22 μm'lik bir gözenek filtresinden süzün. Deneyler ve CSE grupları arasında standardizasyonu sağlamak için, bir spektrofotometrede 320 nm'de absorbansı ölçün ve 1'in optik yoğunluğunu (OD) %100 olarak tanımlayın8.
  6. Hücrelerin farklılaşması üzerindeki etkileri tespit etmek için primer murin hava yolu epitel hücrelerini uyarmak için uygun bir CSE konsantrasyonu içeren farklılaşma ortamını kullanın.
  7. Hücrelerin 28 gün boyunca farklılaşmasına izin verin, bu süre zarfında bazal oda ortamı değiştirilir ve apikal taraf, apikal oda ortamını çıkararak ve bazal oda ortamını uygun CSE konsantrasyonunu içeren farklılaşma ortamı ile değiştirerek haftada iki kez yıkanır.
  8. Maruz kalma sonrası hücreleri analiz edin.
    1. CSE içeren farklılaşma ortamına maruz kaldıktan sonra, hücreleri ve kültür süpernatantlarını herhangi bir zaman noktasında hasat edin (ör., 0-28 gün) morfolojik değişiklikleri tespit etmek için (ör., immünofloresan testi (IFA) veya hematoksilen-eozin boyama (HE) veya biyoinformatik analitik prosedürler (ör., transkriptomik, proteomik, metabolomik, vb.).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklılaştırma
Murin hava yolu epitel hücreleri, 28 gün boyunca bir farklılaşma ortamı ile bir hava-sıvı arayüzünde kültürlendikten sonra başarılı bir şekilde farklılaştı. Kirpikli ve goblet hücrelerinin varlığı, silia marker asetillenmiş α-Tubulin'in (yeşil; Şekil 3A) ve kadeh hücre markörü Mucin5AC, sırasıyla6 (kırmızı; Şekil 3B).

Hücre farklılaşması için CSE konsantrasyonunun belirlenmesi
İzole edilmiş epitel hücrelerini 24 saat boyunca farklı CSE konsantrasyonları ile uyarın. Sonuçlar, CSE konsantrasyonu% 6'dan yüksek olduğunda epitel hücrelerinin hücre canlılığında azaldığını gösterdi (p <0.05, Şekil 4A). Uzun süreli stimülasyon altında hücre aktivitesini sürdürmek için, 28 gün boyunca epitel hücrelerinin farklılaşmasını uyarmak için %2, %4 ve %6 CSE içeren kültür ortamları kullanıldı. Ayrıca, sonuçlar, CSE konsantrasyonundaki artışla birlikte epitel hücrelerinde önemli bir hücre ölümü olmadığını (Şekil 4B), ancak hücreler arası transmembran direncinin (TEER) (Şekil 4C) ve pul pul dökülmüş hücrelerin sayısında kademeli bir değişiklik olduğunu göstermiştir (Şekil 4D). Ek olarak, murin hava yolu epitel hücre kültürleri kronik olarak CSE'ye maruz kaldığında farklılaşmış hücrelerde ve siliyer hücrelerde genel bir azalma kaydedilmiştir (Şekil 4E-H). Bu nedenle, epitel hücrelerini 28 gün boyunca farklılaştırırken hücre canlılığında bir azalma olmadan epitel bariyer fonksiyonunu düzensizleştirmek ve siliyer hücre sayılarını azaltmak için %6 CSE içeren farklılaşma ortamı seçildi.

Çoklu omik analizi
28 gün boyunca %0 veya %6 CSE içeren diferansiyel ortamla uyarılan iki hücre grubu hasat edildi. Transkriptomik analiz için total mRNA ekstrakte edildi. Kütüphane hazırlığı, dizileme, kalite kontrol, referans genoma okuma eşlemesi ve gen ekspresyonunun nicelleştirilmesinden sonra, iki grup arasındaki genlerin diferansiyel ekspresyonu analiz edildi. clusterProfiler R paketi, gen uzunluğu farklılıklarını hesaba katmak için ayarlamalar yapılarak, diferansiyel ekspresyon sergileyen genler için Gen Ontolojisi'nin (GO) zenginleştirme analizini yapmak için kullanıldı (Şekil 5A). Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG), genomik dizileme ve yüksek verimli deneysel metodolojiler gibi kapsamlı veri kümelerinden türetilen moleküler düzeydeki verileri entegre ederek, hücresel, organizmasal ve ekolojik dahil olmak üzere çeşitli düzeylerde karmaşık biyolojik sistem işlevlerinin ve rollerinin anlaşılmasını kolaylaştıran kapsamlı bir veritabanı görevi görür (Şekil 5B). Proteomik için, toplam proteinler, %0 veya %6 CSE içeren diferansiyel ortamlara sahip kültürlerden 28 gün sonra iki hücre grubundan ekstrakte edildi. Protein kalite testi, tuz giderimi, protein enzimatik hidrolizi, peptitlerin Tandem Kütle Etiketleri (TMT) etiketlemesi, fraksiyonların ayrılması, LC-MS analizi, protein tanımlaması ve protein kantitasyonundan sonra, iki grup arasında diferansiyel olarak ifade edilen proteinler tanımlanabilir. GO analizi, yedekli olmayan protein veri tabanına karşı interproscan programı kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 6A) ve yolu analiz etmek için KEGG kullanıldı (Şekil 6B). Metabolomikler için, kültür süpernatantları, %0 veya %6 CSE içeren farklılaşma ortamı olan kültürlerden 28 gün sonra iki grup hava yolu epitel hücresinden toplandı. Metabolitlerin HPLC-MS/MS analizi, tanımlanması ve miktar tayininden sonra, iki grup arasındaki diferansiyel metabolitler tanımlanabilir. Tüm metabolitleri açıklamak için KEGG Veritabanı (Şekil 7A), İnsan Metabolom Veritabanı (Şekil 7B) ve Lipidmaps Veritabanı (Şekil 7C) kullanıldı. Bu diferansiyel metabolitlerin ve metabolik yolların fonksiyonlarını analiz etmek için KEGG veri tabanı kullanıldı (Şekil 7D). Epigenomik için, ATAC-seq daha önce bildirildiği gibi gerçekleştirildi9. Çekirdekler, %0 veya %6 CSE içeren diferansiyel ortam ile kültürden 28 gün sonra iki hücre grubundan ekstrakte edildi ve çekirdek peleti, Tn5 transpozaz reaksiyon karışımında yeniden süspanse edildi. Transpozisyon reaksiyonu 37 ° C'de 30 dakika inkübe edildi. Bir adaptör ekledikten sonra, kütüphane hazırlama, kalite değerlendirme, kümeleme ve dizileme sonrasında, iki grup arasındaki diferansiyel epigenomik tanımlanabilir. Diferansiyel olarak tepe ile ilişkili genlerin GO zenginleştirme analizi, biyolojik süreçler, hücresel bileşenler ve moleküler fonksiyon açısından zenginleştirilmiş GO öğelerindeki diferansiyel tepe ile ilişkili genlerin sayı dağılımını doğrudan yansıtır (Şekil 8A). Bu diferansiyel genlerin ve yolakların işlevlerini analiz etmek için KEGG veri tabanı kullanıldı (Şekil 8B).

Sıkı bağlantı proteinlerini kodlayan genler
Transkriptomik veriler, CSE'nin uzun süreli stimülasyonundan sonra, Cgn, Cldn2, Cldn3, Cldn8, Cldn10, Cldn20, Cldn23, Jam2 ve Ocln dahil olmak üzere sıkı bağlantı proteinlerini kodlayan çok sayıda genin ekspresyonunun azaldığını gösterdi (Şekil 9A), burada Cldn3 ve Ocln'nin azalmış ekspresyonu Western-Blot ve immünohistokimya (IHC) ile daha da doğrulandı (Şekil 9B-E). Bu veriler, CSE'ye maruz kalmanın, hava yolu epitel hücrelerinin sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunu önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.

Sitokin ve kemokin ekspresyonu
Sıkı bağlantıların bozulmasına ek olarak, transkriptomik ayrıca CSE'nin uzun süreli stimülasyonundan sonra, Cxcl5, Csf3, Il1a, Il34, Ccl20 ve Il33 dahil olmak üzere bazı sitokinlerin ve kemokinlerin ekspresyonunun arttığını, ancak Ccl5 ekspresyonunun azaldığını göstermiştir (Şekil 10A). Luminex testi ayrıca CXCL-5, CSF-3 ve IL-1α konsantrasyonlarının arttığını (Şekil 10B-D), ancak murin hava yolu epitel hücrelerinin süpernatanında CCL-5'in (Şekil 10E) azaldığını doğruladı. Bu sonuçlar, CSE'ye maruz kalmanın seçici olarak sitokinlerin ve kemokinlerin ekspresyonu üzerinde etkili olduğunu göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Primer murin hava yolu epitel hücrelerinin büyümesi. (A) Yeni izole edilen hücreler yuvarlak ve şeffaf görünür. (B) İzolasyondan sonraki 2. günde, genişlemiş hücreler küçük hücre adalarına dönüştü. (C

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

figure-results-6

figure-results-7

figure-results-8

figure-results-9

figure-results-10

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KOAH, sık görülen kronik hava yolu inflamatuar bir hastalıktır. Tütün dumanına maruz kalmak, çeşitli yapısal hücrelerin ve bağışıklık hücrelerinin etkileşiminin bir sonucu olan kronik hava yolu iltihabına, hava yolunun yeniden şekillenmesine ve akciğer yapısal tahribatına yol açar10. Akciğerde doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ön cephesi olan hava yolu epitel hücreleri, hastalığın gelişimi sırasında çok önemli bir rol oynar11. Bu bakış açısına göre, epitel hücrelerinin, zararlı maddelerin uyarımı altında alt hücreleri nasıl değiştirdiğini ve düzenlediğini açıklığa kavuşturmak, acilen çözülmesi gereken bilimsel bir sorundur.

Son zamanlarda, bazı sınırlamaların üstesinden gelen KOAH'ın birkaç hayvan modeli bildirilmiştir12. Bu modellerde orta düzeyde nötrofilik hava yolu iltihabı, bir Th1 / Th17 inflamatuar imzası, belirgin mukus hiperüretimi, artmış hava yolu yeniden şekillenmesi, azalmış akciğer fonksiyonu ve genişlemiş hava boşlukları gözlenebilir. Bu modellerin KOAH benzeri değişiklikler oluşturması için sadece 1 ay gerekmesine rağmen, 1 ay içinde sigara dumanına maruz kalan farelerde ne olduğu hala belirsizdir. Uzun süreli CSE stimülasyonunun kullanılması, daha kolay kalibre edilme avantajına sahiptir, bu da hava yolu epitel hücrelerinin, tıpkı sigara içenlerdeki hava yolu epitel hücreleri gibi, ölüm olmaksızın mümkün olduğunca şiddetli sigara uyaranına maruz kalabileceği anlamına gelir. Bu durumda, hava yolu inflamasyonuna ve amfizem oluşumuna yol açan dinamik patolojik değişikliklerin izlenmesi, sigaraya bağlı KOAH patogenezinin daha iyi anlaşılması için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, duman durumunu taklit etmek için bir in vitro model oluşturduk ve CSE'nin hava yolu epitel hücrelerine maruziyeti sırasındaki dinamik değişiklikleri izlemeye çalıştık. Ayrıca, nispeten saflaştırılmış hava yolu epitel hücreleri, multi-omik çalışmayı tüm dokularınkinden daha kolay hale getirir, bu da CSE'ye maruz kalan hava yolu epitel hücrelerindeki moleküler ve hücresel yanıtları bulmamıza ve KOAH'ın anahtar yollarını ve terapötik hedeflerini belirlememize yardımcı olabilir.

Burada, murin trakeal epitel hücrelerinin izolasyonunu tanımlayan protokol, Hilaire ve ark.13 ve You ve ark.14'ün protokollerinden bazı modifikasyonlarla uyarlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan protokolde, murin hava yolu epitel hücreleri, bir hava-sıvı arayüzü ve CSE içeren bir ortam kullanılarak kirpikli ve goblet hücreleri içeren psödostratifiye bir yapıya çoğaltıldı ve farklılaştırıldı, böylece kronik bir CSE iklimlendirme modeli oluşturuldu. Aşağıdaki olaylar mevcut modelin kilit noktalarıdır.

Servikal çıkıkın boynu mekanik olarak zorlayabileceği ve epitel hücrelerine fiziksel olarak zarar verebileceği ve kloral hidrat anestezisinin de hava yollarını etkileyebileceği göz önüne alındığında, ötenazi için pentobarbital sodyum kullanıldı15. Fareler üzerindeki cerrahi prosedürler sırasında, alkolün nazal alana girmesini önlemek için sadece boyun ve alt bölgelere daldırmak, hava yolu epitel hücrelerinin canlılığını artırabilir16. Bu çalışmadan elde edilen ön veriler, trakeal entübasyona veya alkole daldırmaya maruz kalan hava yolu epitel hücrelerinin canlılığının düşük olduğunu ve genişleyemediğini göstermiştir. Ek olarak, eritrositsiz hava yolu epitel hücrelerini elde etmek için, ana hava yollarını izole ederken kan kontaminasyonunu önlemek için cerrahi prosedürlerde dikkatli olunmalıdır.

Spesifik patojen içermeyen farelerde bile, hava yolları önemli mikropları kolonize etti. P0 primer murin hava yolu epitel hücrelerinin genişleme ortamına uygun antibiyotiklerin eklenmesi, bakteriyel veya fungal patojenlerden kontaminasyonu önlemek için gereklidir. Penisilin, streptomisin, amfoterisin B ve gentamisin17'den oluşan bir kokteyl çözeltisi, steril bir in vitro ortamda P0 murin hava yolu epitel hücrelerinin genişlemesini etkili bir şekilde sağlar. Ön deneyler, bakteriyel kontaminasyonun etkili bir şekilde inhibisyonu yoksa, P0 murin hava yolu epitel hücrelerinin ilk geçişten önce öleceğini göstermiştir.

Sindirim yöntemlerinde hem 4 °C hem de 37 °C test edilmiştir. Ön deneylerden elde edilen sonuçlar, 37 ° C'de sindirimin zaman verimliliği, hücre canlılığı ve hücre verimi açısından 4 ° C'den daha iyi performans gösterdiğini gösterdi.

Epitel hücrelerinin tohumlanmasından önce, sıçan kuyruğu kollajeni asetik asit içinde çözüldü ve epitel hücresi yapışmasını iyileştirmek için kültür kabı kaplaması için kullanıldı18. Bununla birlikte, kollajen kaplamanın yoğunluğu çok yüksek veya çok düşük olmamalıdır; Yetersiz bir yoğunluk, yeterli yapışma koşullarını sağlayamazken, aşırı bir yoğunluk, kültür yüzeyinde kristal kalıntısına neden olur.

Kritik bir adım, daha fazla epitel hücresini canlı tutmak ve fibroblast kontaminasyonunu önlemektir. Bunları başarmak için, 1) hayvan bileşeni içermeyen hücre ayrışma kitinin kullanılmasının epitel hücrelerini nazikçe izole edebileceğini ve gereksiz hücresel hasarı azaltabileceğini ve 2) hidrokortizon içeren diferansiyel ortamın kullanılmasının fibroblastların büyümesini engelleyebileceğini ve epitel hücrelerinin çoğalmasını teşvik edebileceğini öneriyoruz.

Hava yolu epitel hücrelerinin geleneksel batık tek tabakalı kültürleri, solunum araştırmaları ve toksikolojik çalışmalarda temel bir unsur olmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemler, in vivo olarak bulunan hava yolu epitel dokularının farklılaşmış özelliklerini doğru bir şekilde kopyalamakta yetersiz kalmaktadır. Bu sınırlamayı ele almak için alternatif bir hava yolu epitel modeli seçtik. Bu model, birincil hava yolu hücrelerinin, transwell sistemleri tarafından sağlananlar gibi mikro gözenekli membran iskeleleri üzerinde, bir hava-sıvı arayüzünde19 yetiştirilmesine dayanmaktadır. Bu ALI kültürü kurulumunda apikal yüzeyin ortam havasına maruz kalması, hücresel farklılaşmayı teşvik etmede etkilidir, böylece in vivo koşulları daha yakından taklit eder20.

Farklılaşma etkili değilse, olası nedenleri değerlendirmek çok önemlidir. Bu, hava yolu epitel hücrelerinin, farklılaşma kapasitelerini tehlikeye atabilecek aşırı geçişe maruz kalmış olma olasılığını içerir. Ek olarak, kalıntı içerik farklılaşma sürecini engelleyebileceğinden, iki haftalık medya değişim işlemi sırasında apikal oda içindeki mukus ve sıvı birikiminin tamamen ortadan kaldırılmasını sağlamak zorunludur.

Bu model belirli sınırlamalar sunsa da, araştırma için değerli bir araç olmaya devam etmektedir. Bir sınırlama, hava yolu epitel hücrelerini uyarmak için CSE içeren bir ortamın kullanılmasının, sigara içenlerde hava yolu epitel hücrelerinin yaşadığı in vivo koşulları tam olarak kopyalayamamasıdır. Ek olarak, farklılaşmış siliyer epitel hücrelerinin in vitro canlılığı tipik olarak bir ay ile sınırlıdır. Bu kısıtlamalara rağmen, model birkaç temel yönü etkili bir şekilde bütünleştirir: hava-sıvı arayüzünde hava yolu epitel hücresi farklılaşmasının incelenmesini, CSE'ye uzun süreli alışmayı ve belirli bir zaman dilimi boyunca çoklu omik analizin uygulanmasını kolaylaştırır. Bu kapsamlı yaklaşım, hava yolu epitel hücrelerinin fizyolojik ve patolojik mekanizmalarına ilişkin gelecekteki araştırmalar için sofistike ve bütünsel bir çerçeve sunar. Ayrıca, hava yolu hastalıkları için potansiyel biyobelirteçlerin ve terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olur. Deneyimlerimizin, bu modeli ilgili çalışmalar için kullanmak isteyenler için faydalı bilgiler sağlayacağını umuyoruz.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82090013) tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x Penisilin / Streptomisin çözeltisiGibco15140122
24 mm Transwell 0.4 & mikro; m Gözenekli Polyester Membran Ek Parça, SterilBIOFILTCS016012
40 & mikro; m Hücre SüzgeciFalcon352340
500x Gentamisin/Amfoterisin ÇözeltisiGibcoR01510
asetillenmiş &alfa;-TubulinCST#5335
Asetil-&alfa;-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Tavşan mAb cellsignal# 5335
Hayvan Bileşeni Serbest Hücre Ayrışma KitiKök Hücre05426
Anti-pan Sitokeratin antikoruabcamab7753
SigaraMarlboro
Claudin3immünowayYT0949
Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz ISigma-AldrichDN25
Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz ISigmaDN25
Jambon' s F-12Sigma-AldrichN6658
Heparin Çözeltisi Kök Hücre07980
Hidrokortizon Stok ÇözeltisiKök Hücre07925
Müsin 5ACabcamab212636
Oklüdinproteintech27260-1-AP
PBS CytosciCBS004S-BR500
Penisilin-Streptomisin ÇözeltisiGibco15140122
PneumaCult-ALI
Bazal Orta Kök		Hücre05002 
PneumaCult-ALI 10x Takviye Edici GıdaKök Hücre05003 
PneumaCult-ALI Bakım TakviyesiKök Hücre05006
PneumaCult-Ex Plus 50x TakviyesiKök Hücre05042
PneumaCult-Ex Plus Bazal OrtaKök Hücre05041
PronaseE Sigma-AldrichP5147
Sıçan kuyruğu kollajenCorning354236
Tripan MavisiKök Hücre07050 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ritchie, A. I., Martinez, F. J. The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population. Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).
  2. Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD. Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).
  3. Leino, M. S., et al. Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors. PLoS One. 8 (8), e71278(2013).
  4. Benediktsdóttir, B. E., Arason, A. J., Halldórsson, S., Gudjónsson, T., Másson, M., Baldursson, Ó Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10. Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).
  5. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respir Res. 14 (1), 135(2013).
  6. Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., BéruBé, K. Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model. Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).
  7. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
  8. Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).
  9. Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq. Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).
  10. Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells. Ann Am Thorac Soc. 11, Suppl 5 (Suppl 5) S252-S258 (2014).
  11. Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD. Front Immunol. 14, 1201658(2023).
  12. Zhou, J. -S., et al. Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice. Eur Respir J. 56 (3), 2000404(2020).
  13. Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface. J Vis Exp. (48), e2513(2011).
  14. You, Y., Brody, S. L. Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).
  15. Wandalsen, G. F., Lanza, F. deC., Nogueira, M. C. P., Solé, D. Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests. Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).
  16. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  17. Takagi, R., et al. How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets. Regen Ther. 1, 1-4 (2015).
  18. Culp, D. J., Latchney, L. R. Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture. Am J Physiol. 265 (3), Pt 1 L260-L269 (1993).
  19. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).
  20. Bebök, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Airway Epithelial CellsCigarette Smoke ExtractIn Vitro ModelMurine Airway CellsAir Liquid InterfaceCell DifferentiationMulti Omics AnalysisChronic Smoke ExposureImmunofluorescence AssayCOPD Pathogenesis

Related Articles