Bu protokol, pankreas kanalının görselleştirilmesini ve pankreas kanalı tıkanıklığına neden olmak için pankreas kanalının elektrokoagülasyonunu içeren kronik obstrüktif pankreatitin modellenmesine yönelik yeni bir yaklaşımı açıklamaktadır.
Yöntem makalesi
* These authors contributed equally
Bu protokol, pankreas kanalının görselleştirilmesini ve pankreas kanalı tıkanıklığına neden olmak için pankreas kanalının elektrokoagülasyonunu içeren kronik obstrüktif pankreatitin modellenmesine yönelik yeni bir yaklaşımı açıklamaktadır.
Kronik pankreatit (SP), pankreası tahrip edebilen, diyabete yol açabilen ve pankreas kanseri riskini artırabilen, hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde etkileyebilen ciddi bir inflamatuar durumdur. SP'nin ele alınması gastroenterolojide kritik bir araştırma odağıdır. 8 haftalık C57BL/6 erkek fareleri kullanarak mevcut olanların sınırlamalarının üstesinden gelmek için yeni bir hayvan modeli geliştirdik.
Anestezi uygulanmış farelerde karın ameliyatı ile pankreası açığa çıkardıktan sonra, metilen mavisinin girmesini önlemek için karaciğerin yakınındaki ana safra kanalını klempledik. Boyayı enjekte etmek için safra kanalına bir kılcal damar yerleştirildi ve pankreas kanalı boyandıktan sonra. Pankreas kanalı görüntülendikten sonra, ana safra kanalı ile superior pankreatikoduodenal arter arasındaki pozisyonun orta ve alt 2/3'ünde elektrokoagülasyon için pankreas seçildi. Mavi boyama solüsyonu tanınamayınca elektrokoagülasyon sonlandırıldı. Daha sonra karın kapatıldı ve fareler normal şekilde büyütüldü. Ameliyattan 7, 14, 21 ve 28 gün sonra pankreas HE boyama, Masson boyama ve immünohistokimya kullanılarak incelendi ve kan serumu biyokimyasal parametreler açısından analiz edildi. 14 gün sonra patoloji, serum biyokimyasal parametreleri gibi kronik pankreatitin özellikleriyle yakından eşleşti.
Kronik pankreatit (SP), pankreasın tahrip olmasına yol açan, karın ağrısı ve sindirim bozuklukları olarak kendini gösteren ciddi, ilerleyici inflamatuar bir hastalıktır. Zamanla şeker hastalığına neden olabilir ve pankreas kanseri riskini artırabilir. SP'nin hayvan modelinin oluşturulması ve etkili terapötik stratejilerin geliştirilmesi bu nedenle çok önemlidir.
Pankreas ekzokrin asiner hücreleri çok sayıda sindirim enzimi üretir ve salgılar. Organeller ve protein homeostazı regülasyonu bozulduğunda, hücre içi tripsinojenin uygun olmayan aktivasyonuna yol açarak sonuçta asiner hücre hasarına ve pankreatit1 gelişimine yol açabilir.
Önceki çalışmalar, fare modellerinin, özellikle tekrarlayan serulein enjeksiyonları2 ve pankreas kanallarının cerrahi ligasyonu 3,4 ile indüklenenlerin, SP'nin incelenmesinde etkili olduğunu göstermiştir. Serulein, kronik bir duruma geçebilen akut pankreatiti indükleyebilir, ancak spesifik pankreas kanalı tıkanıklığının olmaması, obstrüktif pankreatitin simülasyonundaki klinik önemini sınırlar. Cerrahi ligasyon, insan SP'sinin obstrüktif doğasını daha iyi taklit etse de, oldukça invazivdir, gerçekleştirilmesi zordur ve sıklıkla ciddi sistemik etkilere yol açarak lokalize duktal patolojilerin incelenmesini engeller.
Bu sınırlamaları ele alarak, elektrokoagülasyon yoluyla yeni bir obstrüktif SP modeli önerilmiştir. Pankreas kanalı ligasyonu prensibine benzer şekilde, pankreas kanalını tıkar ancak gerçekleştirilmesi daha kolaydır ve başarı oranı daha yüksektir. Araştırmacılar, domuzların ana pankreas kanalındaki radyofrekans ablasyonunun pankreas atrofisini5 indüklemek için güvenli ve etkili bir yöntem olduğunu öne sürmüşlerdir, bu da ana pankreas kanalının yüksek frekanslı elektrokoagülasyonla kesilmesinin benzer etkiler yaratabileceğini düşündürmektedir. Bu teknik, retrograd pankreas kanalı ponksiyonu ve duktal boyama için metilen mavisi solüsyonu enjeksiyonunu ve ardından lokalize duktal obstrüksiyonu indüklemek için elektrokoagülasyon içerir (Şekil 1). Bu yaklaşım, yaygın inflamatuar yanıt ve sistemik komplikasyonlardan kaçınırken, insan obstrüktif SP'sini taklit eden inflamasyon ve fibrozu hızlandırır. Geleneksel modellerle karşılaştırıldığında, elektrokoagülasyon modeli çeşitli avantajlar sunar: özellikle pankreas kanalını hedef alır, değişkenliği azaltır ve sistemik komplikasyonları hafifletir. SP'de duktal tıkanıklığın altında yatan mekanizmaları ve hastalığın ilerlemesindeki rolünü anlamak için hastalığa daha özgü, tekrarlanabilir ve çok yönlü bir yaklaşım sağlar.
Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Deniz Tıp Üniversitesi'nin Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylandı. Tüm cerrahi malzemelerin steril olduğundan emin olun.
1. Laparotomi
2. Pankreasın yerini tespit etmek ve açığa çıkarmak
3. Ameliyat bölgesinin izlenmesi
4. Elektrokoagülasyon prosedürünün indüksiyonu
5. Hayvanları hayatta tutmak
6. Analiz yöntemleri
Hayvanlar, her grupta toplam 20 fare olmak üzere bir kontrol grubuna (sadece elektrikli pıhtılaşma için metilen mavisi enjeksiyonu) ve elektrikli pıhtılaşma grubuna ayrıldı. Mortalite oranı kontrol grubunda %0 ve elektrik pıhtılaşma grubunda ; Modeli oluşturmanın başarı oranı (canlı model fare sayısı) q idi. Her grupta patolojik değerlendirme için bir düzine hayvan seçildi. Her gruptaki üç fare,HE, Masson ve immünohistokimyasal boyama için 7., 14., 21. ve 28. günlerde rastgele seçildi. Modelleme süreci Şekil 1'de gösterilmektedir. Metilen mavisi ile izledikten sonra, farelerin pankreasında koledok kanalı ile anterior superior pankreatikoduodenal arter arasındaki yeri elektrokoagüle ettik. Elektrokoagülasyon alanı, pozisyonun orta ve alt kısmında üçte birden daha az bir alana sahip olarak seçilirse, etkinin beklentileri karşılamaması muhtemeldir. Bununla birlikte, 2/3'ü aşarsa, farelerin elektrokoagülasyondan sonraki 72 saat içinde ölmesi muhtemeldir, bu da muhtemelen pankreas kanalı tamamen tıkandıktan sonra ortaya çıkan şiddetli akut pankreatit nedeniyledir.
Bundan, elektrokoagülasyondan sonraki 14. günde, farelerin pankreasında ( Şekil 1'de gösterildiği gibi) kronik pankreatitin histolojik bir görüntüsünün gözlemlenebileceği sonucuna vardık, bu tamamen bloke olmamış, ancak pankreas kanalının kısmi tıkanmasından sonra oluşmuştur. 7. günde dokuda hafif doku ödemi görüldü ve dokuda kronik pankreatit belirtisi görülmedi. 14. günde, pankreas dokusunun HE boyaması, pankreas asiner hücrelerinin dağıldığını gösterdi. 21. günde pankreas dokusundaki asiner hücrelerin iltihaplanma derecesi yavaş yavaş düzeldi. 28. günde dokudaki patolojik değişikliklerin tersine döndüğüne dair belirtiler vardı (Şekil 2). Bunun nedeni, elektrokoagülasyon işlemi sırasında yetersiz pankreas kanalı elektrokoagülasyonunun yanı sıra kısmi pankreas kanalı tıkanıklığından sonra kalan pankreas kanalının telafi edici etkisi olabilir.
Masson boyama, operasyon grubundaki fibrozis derecesinin sahte operasyon grubuna göre önemli ölçüde daha şiddetli olduğunu gösterdi. Kol-1 ve (alfa-düz kas aktini) SMA'nın boyanması için immünohistokimyasal skorlar daha yüksekti (Şekil 3). Pankreas dokusunda kronik pankreatit varlığı 14. günde patolojik analiz ile gözlendi ve öncesi ve sonrası değişiklikler sadece daha sonraki patolojik analizde HE boyama ile karşılaştırıldı. Serum biyokimyasal göstergelerinin analizi sonucunda, serum amilaz, bilirubin ve hyaluronik asit konsantrasyonlarının elektrik pıhtılaşma grubunda kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu ve kronik pankreatitin başladığını gösterdiği bulundu (Şekil 4).

Şekil 1: Farelerde elektrokoagülasyon yoluyla indüklenen obstrüktif kronik pankreatitin şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Pankreas dokularının zaman içinde hematoksilen-eozin boyaması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Hematoksilin-eozin ve Masson boyaması ve pankreasın immünohistokimyası. Kısaltmalar: Col-1 = alfa-1 tip 1 kolajen; SMA = alfa-düz kas aktini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Farklı periyotlarda farelerin serum biyokimyasal indekslerinin temsili sonuçları. (A) Serum hyaluronik asit konsantrasyonu (μg/L). (B) Serum bilirubin konsantrasyonu (mmol/L). (C) Serum amilaz konsantrasyonu (U/dL). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Pankreatit riski ve şiddeti hem genetik hem de çevresel faktörler tarafından belirlenir6. Klinik pankreatitin tamamen iyileşmesi gastroenterolojide bir hedeftir ve hayvan modellerinin oluşturulması ilk adımdır. Bu modelleri oluşturmak için her birinin avantajları ve dezavantajları olan çeşitli yöntemler mevcuttur 7,8,9,10,11.
Cerrahlar, pankreas ekzokrin sekresyonunu azaltmak için ana pankreas kanalında endoluminal termal ablasyon (ETHA) yapmak için yüksek frekanslı elektrokoagülasyon kullanmış, böylece pankreatikoduodenektomi (PD) sonrası postoperatif pankreas fistül (POPF) insidansını azaltmıştır12. Bu, pankreas atrofisine neden olan termal ablasyon yönteminin klinik uygulamada uygulandığını göstermektedir. Pankreas kanalını görselleştirmek ve hassas bir şekilde elektrokoagüle etmek için metilen mavisi kullanarak yeni bir obstrüktif pankreatit modeli geliştirdik.
Bu deney için C57BL/6 8 haftalık erkek fareler seçildi. Dişi farelerin bir üreme döngüsü vardır ve vücuttaki hormon seviyeleri deneysel veriler üzerinde etkili olabilir. 8 haftalıkken, fareler olgun vücut organları ve iyi yaşam sağlığı indeksi ile yaşamlarının baharındaydı ve aynı yaştaki erkek fareler boyut olarak daha güçlüydü. Postoperatif 1 aylık gözlemde 7, 14, 21 ve 28. günlerde fare pankreasından örnek aldık; 14 günde elde edilen sonuçlar en çok pankreatitin patolojik özelliklerine uygundur.
Bu yaklaşımın birkaç uyarısı vardır. İlk olarak, boyanın pankreas kanalına enjeksiyonunu kolaylaştırmak için ana safra kanalı hepatik hilusa mümkün olduğunca yakın klemplenmelidir. İkinci olarak, metilen mavisi boyanın pankreas kanalına enjeksiyon hızına ve süresine dikkat edilmelidir. Pankreas kanalı çok az boya solüsyonu ile görülemez ve çok fazla boya solüsyonu cerrahi alanda ana pankreas kanalının yerinin belirlenmesini engelleyecektir. Üçüncüsü, mavi boyama solüsyonu görülemediğinde elektrokoagülasyon sonlandırıldı. Bu deneylerde, metilen mavisi lekesi ile gösterilen bölgede ameliyat yapılır, çünkü fare pankreasının elektrokoagüle edilen alanı farklı olacaktır, bu nedenle metilen mavisi lekesi pankreas kanalını izlemek için kullanılır. Dördüncüsü, ameliyat sırasında pankreasta meydana gelen herhangi bir kanama derhal durdurulmalıdır. Aynı zamanda pankreası kesmek için elektrokoagülasyon bıçağı kullanılmalıdır. Elektrokoagülasyon bıçağı herhangi bir nedenle pankreasa yapışırsa elektrokoagülasyon süresi uzatılmalıdır. Bu, pankreas kaçağının neden olduğu ciddi postoperatif komplikasyonların ortaya çıkmasını önlemenin en yaygın yoludur.
Ancak, bu yöntemin dezavantajları vardır. Operatörün yeterliliği deneyin sonucunu doğrudan etkiler ve ameliyatın farklı fareler arasındaki tekdüzeliği modelin başarı oranını etkiler. Bu model, safra kesesi taşlarının veya pankreas kanalı tıkanıklığının etkilerini simüle ederek, sonunda kronik pankreatite neden olan tekrarlayan akut pankreatit nöbetlerine yol açar. Bu, yüksek bilirubin seviyelerini açıklayabilir. Bu nedenle, bu model elektrokoagülasyon derecesine dayalı bir akut pankreatit modeli olarak da geliştirilebilir. Elektrokoagülasyondan 3 gün sonra farelerin pankreası üzerinde yapılan ilk deneyler, akut pankreatitin özelliklerini gösterdi, ancak postoperatif komplikasyonlar, modelin akut pankreatit için başarı oranını düşürdü. Bununla birlikte, elektrokoagülasyon işlemi sırasında elektrokoter tarafından üretilen ısının ana safra kanalına yayılmış olabileceği göz ardı edilemez. Elektrokoagülasyon yoluyla akut pankreatitin nasıl stabil bir şekilde indükleneceği sorusu araştırmaya değer.
Birkaç hafta boyunca tekrarlanan enjeksiyonlar gerektiren geleneksel serulein enjeksiyon yöntemiyle karşılaştırıldığında, elektrokoagülasyon yöntemi zamandan tasarruf sağlar ve daha uygundur. Serulein enjeksiyonu mükemmel stabilite ve kullanım kolaylığı gösterirken, elektrokoagülasyon ~20 dakika sürer ve sonraki deney süresinden tasarruf sağlar.
Yeni modellerin geliştirilmesi, hastalığın doğal seyrini incelemeyi ve hedefe yönelik tedaviler geliştirmeyi amaçlamaktadır. Yeni hayvan modelimiz, endoskopik retrograd kolanjiyopankreatografi pankreatit (ERCP)13 dahil olmak üzere farelerde pankreas kanalı tıkanıklığının neden olduğu kronik pankreatitin simüle edilmesine yardımcı olur.
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın Genel programı (Hibe No. 81770642), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın Genel programı (Hibe No. 82170657), Şanghay Pudong Sağlık Komitesi Projesi (Hibe No. PWYgf2021-08) ve Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LGF22H030014). Renkler BioRender.com yardımıyla dolduruldu.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 16 mm mikrovasküler klips | Stronger, Ningbo, Çin | ||
| Emilebilir Dikiş | Yangzhou Jinhuan Tıbbi Cihaz Fabrikası | 4-0 | - |
| Karprofen | Shanghai Macklin Biyokimyasal Şirketi, Ltd. | C830557-5g | - |
| Kapiler tüp | Tygon, ABD | AAQ(AAD)04091 | 0,25 x 0,3 mm |
| Elektrokoagülasyon bıçağı | Shun Ye TIBBI Ekipman Şirketi, Ltd, Ningbo, Çin | Shun Ye BDD-YE-DF-1 | |
| Göz makası | |||
| Ketamin Hidroklorür İjekte (Ketaset CIII) | Zoetis Inc. | S5564 | - |
| Metilen mavisi boyama çözeltisi | Solarbio, Şanghay, Çin | G1303 | |
| Emici olmayan 4-0 monofilament polipropilen dikiş | Jinhuan, Şanghay, Çin | ||
| Çalışma mikroskobu | Murzider, Guangdong, Çin | MSD203 | |
| Oftalmik forseps | |||
| Yuvarlak başlı sörbün | Olga Sherer, Huaximedical, Çin | ||
| Şırınga iğnesi | Minank, Zhejiang, Çin | 0,25 mm | |
| Doku forsepsi | |||
| Doku makası | Şanghay Puxin Enstrüman Teknolojisi Şirketi | ||
| Ksilazin Hidroklorür Enjeksiyonu | Bayer Hayvan Sağlığı | XYL-50-20 | - |
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste