Method Article

Çok Bölgeli İn Vivo Kayıt için Esnek ve Kullanışlı Elektrofizyolojik Seçenekler Hazırlamak için Entegre Bir Yöntem

DOI:

10.3791/67071

⸱

November 21st, 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medical Neurobiology and MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrot üretimi için basitleştirilmiş ve uygun maliyetli bir yaklaşım geliştirdik ve serbestçe hareket eden farelerde birden fazla bölgede sinyallerin kayıtlarını gerçekleştirdik. Çok bölgeli elektrofizyoloji ve kalsiyum sinyal kaydının yanı sıra optogenetiğin kullanılması, nöbet tutuşturma modelinde bölgeler arasında nöronal aktivitelerin ortaya çıkarılmasını sağladı.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epilepsi, birden fazla beyin bölgesini içeren senkronize anormal deşarjlarla karakterize nörolojik bir hastalıktır. Fokal lezyonlar, ilişkili nöral devreler yoluyla epileptik sinyallerin yayılmasını kolaylaştırır. Bu nedenle, kritik beyin bölgelerinden yerel alan potansiyelinin (LFP) in vivo kaydı, nöbet yayılımında yer alan devrelerin deşifre edilmesi için gereklidir. Bununla birlikte, elektrot üretimi ve implantasyonu için mevcut yöntemler esneklikten yoksundur. Burada, birden fazla bölgede elektrofizyolojik kayıtlar (LFP'ler ve elektroensefalografi [EEG]) için tasarlanmış kullanışlı bir cihaz sunuyoruz. Ek olarak, optogenetik manipülasyon ve kalsiyum sinyal kaydını LFP kaydı ile sorunsuz bir şekilde entegre ettik. Epileptik nöbetler sırasında birkaç ayrı bölgede, artan kalsiyum sinyalizasyonu ile birlikte sağlam deşarjlar gözlendi. Bu çalışmada kullanılan yaklaşım, beynin çeşitli bölgelerinde senkronize nöral kayıtlar için uygun ve esnek bir strateji sunmaktadır. Bu bozukluklarda yer alan birden fazla bölgenin nöral profilleri hakkında bilgi sağlayarak nörolojik bozukluklarla ilgili araştırmaları ilerletme potansiyeline sahiptir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epilepsi, konvülsiyonlar, duyusal bozukluklar ve bilinç kaybı olarak ortaya çıkan tekrarlayan nöbetlerle karakterize yaygın bir nörolojik durumdur1. Epilepsinin altında yatan patofizyolojik mekanizmalar karmaşıktır ve birbirine bağlı birden fazla beyin bölgesini içerir 2,3. Nörogörüntülemedeki son gelişmeler, epilepsi 4,5 ile ilgili büyük ölçekli ağlara ışık tutmuştur. Bununla birlikte, epilepsinin oluşumu ve yayılmasının altında yatan karmaşık devre ve ağ mekanizmalarının anlaşılması, kısmen çok bölgeli nöral kayıt tekniklerinin yetersiz uygulanması nedeniyle sınırlı kalmaktadır6. Bu nedenle, farklı beyin bölgelerindeki nöral aktiviteyi aynı anda izleyebilen esnek, entegre bir yöntem geliştirmek zorunludur.

Elektrofizyolojik kayıtlar, nöbetleri yakalamak ve epilepsi varlığını belirlemek için yapılır7. Elektrofizyolojik aktivitenin kaydedilmesi dışında, epilepsi çalışmalarında belirli nöral popülasyonların kesin kalsiyum aktivitesine artan bir vurgu yapılmaktadır 8,9. Kalsiyum indikatör sentezindeki ve çeşitli prob tasarımlarındaki gelişmeler, araştırmacıları beyindeki nöronal aktivite ve nöral maddelerdeki değişiklikleri yakalamak için fiber fotometriyi benimsemeye sevk etmiştir10,11. Nöronal aktiviteyi tespit etmek için iki bağımsız yöntem, yani elektrofizyoloji ve fiber fotometri kaydı, dinamik nöronal süreçlerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırarak birbirini tamamlar.

Ek olarak, senkron kayıt ve modüle edici nöral aktivite, beynin hem ağ hem de hücresel düzeyde işleyişi hakkında bilgi edinmek için çok önemlidir. Bu yaklaşım, araştırmacıların beynin karmaşık süreçlerini gerçek zamanlı olarak gözlemlemelerini ve manipüle etmelerini sağlar. Optogenetik, seçici stimülasyon veya inhibisyon için ayırt edici yeteneği nedeniyle, nöral sinyallemeyi araştırmak için vazgeçilmez bir araç olarak ortaya çıkmıştır12. Sinirbilimde çok bölgeli elektrofizyolojik kaydın yaygın uygulamalarınarağmen13, çok bölgeli elektrofizyolojik kaydın fiber fotometri ve optogenetik manipülasyon ile entegrasyonu sınırlı kalmaktadır. Daha da önemlisi, çok bölgeli elektrotların üretilmesi ve implante edilmesi için mevcut yöntemler esneklikten yoksundur14. Bu sınırlamalar, birden fazla bölgedeki belirli devre işlevlerini ve etkileşimlerini inceleme kapasitemizi engeller. Burada, çıra kaynaklı nöbetlerde ve diğer nöropsikiyatrik bozukluklarda bölgeler arasındaki nöronal süreçlere ışık tutan, uygun maliyetli ve kullanışlı bir çok bölgeli in vivo kayıt yaklaşımı sunuyoruz.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Fudan Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nden onay aldı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi tarafından tasarlanan kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak yürütüldü. Bu çalışmada kullanılan hayvan sayısını en aza indirmek için mümkün olan tüm önlemler alınmıştır. Her adımı gerçekleştirmek için gereken süre ilgili adımlara dahil edilir.

1. Elektrotların hazırlanması (Şekil 1)

  1. Uygun uzunlukta tungsten tel (~ 20 mm) kesin ve tungsten telini (1.6-2 mm) ortaya çıkarmak için bir ucundan yalıtım katmanını yakın. Telin diğer ucunu "L" şeklinde bükün (bkz. Şekil 1A, ~1 dk)
  2. Tungsten telin "L" ucunu dikkatlice fiber optik üzerine yerleştirin (bkz. Şekil 1B, ~1 dk).
    NOT: Tungsten tel, optik fiberin ucundan 0,2-0,4 mm daha uzun olmalıdır.
  3. Bir damla yapıştırıcı batırın ve optik fiberin ve tungsten telin arayüzüne uygulayın (bkz. Şekil 1C, ~ 1 dakika). Sıvının yüzey gerilimi nedeniyle, tungsten tel optik fibere bağlanacaktır.
  4. Yapıştırıcıyı bir kez uygulayın ve kurumasını bekleyin. Ardından ikinci bir kat uygulayın. Bu, tungsten tel ile optik fiber arasındaki bağı daha da sıkılaştıracaktır (bkz. Şekil 1C, ~ 1 dakika).
    NOT: Uygulama işlemi sırasında, yapıştırıcının optik fiberin ucuna akmasını önlemek için özen gösterilmelidir, çünkü bu onun geçirgenliğini etkileyebilir.
  5. "L" şeklinin köşesinde, optik fiberin tabanını ve tungsten telini birbirine sıkıca yapıştırmak için yapıştırıcı kullanın (~ 1 dakika).
    NOT: Artan temas alanı ve yapışkan damlacığın küresel katılaşması, optik fiber ile tungsten tel arasında sağlam bir bağ sağlar.
  6. Tungsten tel ile dişi konektörün pimi arasında bir bağlantı kurmak için lehimleme kullanın (bkz. Şekil 1D, her biri için ~ 3 dakika)
    NOT: Tungsten tel ısıya duyarlı olmadığından, lehimlemenin başarı oranı, iki bileşeni fiziksel olarak birleştirmek için pim yuvası konumunun kesilmesiyle şekillendirilen metal bir manşon ile yaklaşık% 100'e çıkarılabilir. Daha sonra, manşonu dolduran lehim, takılan tungsten tel ile pim arasında sabit bir bağlantı sağlar.
  7. Deney tasarımına göre, gerekli sayıda optrodu lehimleyin (bkz. Şekil 1E, ~10 dk)
    NOT: Bu çalışmada üç optrod kullanılmıştır.
  8. Emaye teli uygun uzunlukta (~ 30 mm) kesin ve her iki ucundaki yalıtımı yakın. Emaye telin bir ucunu vidanın tabanının etrafına sarın ve lehimleyin. Emaye telin diğer ucunu bir havya aracılığıyla dişi konektörün pimlerine bağlayın, kafatası elektrodu için EEG kaydı ve toprak bağlantısı görevi görür (bkz. Şekil 1F, ~ 5 dk)
    NOT: Emaye telin esnekliği nedeniyle, kafatasını ve dişi konektörün pimlerini bağlamak uygundur. Emaye teli bir vidanın etrafına sardıktan sonra lehimleme, yüzeye monte lehimlemeden daha güvenilirdir.
  9. Dişi konektörü kapsüllemek ve lehim bağlantılarının tamamen sarıldığından emin olmak için dişi konektörün pim dizisine sıcakta eriyen yapıştırıcı uygulayın. Sıcakta eriyen yapıştırıcının katılaşması sırasında, implantasyon sırasında yer kaplamasını en aza indirmek için yapıştırıcıyı plastik bir levha kullanarak şekillendirin (bkz. Şekil 1F, ~ 3 dk)
    NOT: Sıcakta eriyen yapıştırıcı kullanımıyla ilişkili potansiyel yanma riskleri nedeniyle, AB yapıştırıcı daha güvenli bir alternatif olarak kabul edilir.
  10. Ardından, parlaklığı ve iletkenliği ölçmek için bir ışık yoğunluğu ölçer ve dijital multimetre kullanın. Bu testleri geçtikten sonra kurulum kullanıma hazırdır (bkz. Şekil 1G, ~2 dk)
    NOT: Lazerlerle çalışırken, her zaman lazer ışığının belirli dalga boyuna ve gücüne uygun koruyucu gözlük takın. Işığın en az %80'ini yama kablosunun ucundan implante edilebilir fiberin ucuna iletmek için yüksek kaliteli fiberler gereklidir. Ek olarak, tungsten telin ucundan pim başlığı yuvasına olan direnç, kabul edilebilir bir 1-5 Ω aralığı ile ölçülmüştür.
  11. Kullanmadan önce hazırlanan elektrotları 15 dakika boyunca %75 alkole batırın, ardından steril tuzlu suya (~ 16 dakika) aktarın.
    NOT: Kapsüllenmiş elektrot cihazının toplam ağırlığı (0.6701 ± 0.01123 g, n = 4) farelerin aktivitesini etkilemez. Elektrotlar, plazma sterilizasyonu kullanılarak önceden sterilize edilir.

2. Elektrot implantasyonu için protokol (Şekil 2)

  1. Fareleri izofluran (% 2 -% 4) ile uyuşturun ve stereotaksik bir aparatta sabitleyin (bkz. Şekil 2A, ~ 2 dakika). Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için fare gözlerinde göz merhemi kullanın. Kraniyal insizyonun çevresine lidokain uygulayın ve 5 mg / kg'lık bir dozda deri altı carprofen enjeksiyonu yapın.
    NOT: Uygun anestezizasyon, doğrultma refleksinin olmaması ve ayak parmağının sıkışmasına yanıt kaybı ile doğrulanır. Uzun süreli cerrahi prosedürler için enjekte edilebilir bir anestezik kullanmak daha uygundur.
  2. Hayvanı stereotaksik aparata sabitledikten sonra, kafa derisini kafatasının kenarı boyunca kesin ve bregma ve lambda pozisyonlarını ortaya çıkarmak için kafatası yüzeyini% 75 alkolle silin (bkz. Şekil 2B, ~ 3 dakika).
    NOT: Cerrahi öncesi prosedür, saçın kırpılmasını, cerrahi bölgenin dezenfekte edilmesini, aletlerin ve cerrahi aletlerin önceden sterilize edilmesini içerir.
  3. Beyni düzleştirin ve bir mikro matkap kullanarak ilgilenilen bölgelerin (ROI) üzerinde delikler (~ 0,8 mm) açın. İlgili virüsleri bir şırınga pompası ile enjekte edin (bkz. Şekil 2C - F, ~20 dk).
    NOT: Bu çalışmada yer alan virüsler ve ROI'ler ile ilgili detaylı bilgi Materyal Tablosu ve Şekil 3'te gösterilmiştir.
  4. Optrodları bir tutucu ile tutun ve uçlarını bregma noktasına getirin, bu konumu 'sıfır' olarak ayarlayın. Bregma noktasını referans koordinat olarak kullanarak, optrodları hedef bölgelere taşıyın (bkz. Şekil 2G, ~3 dk). Optrodes'i virüs enjeksiyon bölgesinin 0.3 mm yukarısına yerleştirin.
    NOT: Dikey implantasyon stratejisinde, fiber optik manşonun kalınlığına ve yüksüğün dış çapına bağlı olarak iki elektrot arasındaki minimum mesafe yaklaşık 2 mm'dir. Açılı bir yerleştirme yöntemi, yakın konumdaki bölgelerden eşzamanlı kayıt için kullanılabilir.
  5. Optik fiberleri ilgili beyin bölgelerine yerleştirdikten sonra, açıkta kalan dokuyu kaplamak için etraflarına az miktarda doku yapıştırıcısı sürün. Ardından, sırayla ek yapıştırıcı ve biraz diş çimentosu uygulayın. Diş çimentosu katılaştıktan sonra, tutucuyu dikkatlice serbest bırakın (bkz. Şekil 2H, ~5 dk).
  6. Her yeni optrode implantasyonundan önce, adım 2.4'ün tekrarlanmasını içeren yeniden kalibrasyon yapın (bkz. Şekil 2I).
    NOT: Her implantasyon için, optrode'u bregma'da 'sıfır' noktası olarak konumlandırın.
  7. Tüm optrodları implante ettikten sonra, bir mikromatkap (~ 1 dakika) kullanarak 'Zemin' için lambda noktasının arkasındaki delikleri ve 'EEG' için neokorteksin üzerindeki delikleri açın.
    NOT: Delinen deliğin boyutunun (~1.1 mm) vidanın çapına uygun olması gerekir.
  8. Kafatası vidalarını korteksin üzerindeki ve lambda noktasının arkasındaki deliğe yerleştirin (bkz. Şekil 2J, ~5 dk).
    NOT: Kafatası vidaları sırasıyla EEG kaydı ve topraklama için kullanılır.
  9. Tungsten telleri ve emaye telleri, implantasyon alanının üzerine yerleştirilecek ve kafatasının dışına maruz kalmayacak şekilde düzenleyin. Dişi konektörün konumunu bir tutucu kullanarak sabitleyin (bkz. Şekil 2K, ~2 dk).
  10. Elektrot cihazı ile kafatası arasında sağlam bir bağlantı sağlamak için implantasyon bölgesini diş çimentosu ile doldurun. Kafaya bağlantı için dişi konektörün yerleştirme deliklerini açıkta bırakarak dahili kabloları kapsülleyin.tage (bkz. Şekil 2L, ~6 dk).
  11. Diş çimentosu sertleştikten sonra, açıkta kalan kafa derisinin çevresine cilde iyot uygulayın ve ardından hayvanı bir ısıtma pedine (~ 1 dakika) yerleştirin.
    NOT: Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanın gözetimsiz bırakılmadığından emin olun. Sağkalım cerrahisi boyunca steril koşullar korunmalıdır.
  12. Ameliyat sonrası iyileşmeyi desteklemek için antibiyotik ve analjezik uygulayın.
    NOT: Ameliyat geçiren hayvanlar, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların yanına tekrar sokulmaz. Hayvanlara 3 gün boyunca her gün intraperitoneal seftriakson sodyum (180 mg/kg) enjeksiyonları ve deri altı karprofen (5 mg/kg) enjeksiyonları ve lidokain jeli uygulandı. Davranış testini tamamlamak için hayvanların belirli bir süre boyunca hayatta kalmaları gerekir. Daha sonra,% 4 -% 5 izofluran kullanılarak ötenazi yapılacak, ardından viral enfeksiyonu ve elektrot implantasyon bölgelerini değerlendirmek için perfüzyon ve doku kesiti alınacaktır.

3. İn vivo beyin kaydı için protokol

  1. Sinyal kaydı ve davranış testi (açık alan testi)15 yapmadan önce, fareyi çevreye alıştırmak için 3 günlük nazik bir kullanım sürecinden geçtiğinden emin olun.
    NOT: Bu çalışmada, fareler serbestçe hareket etmeleri için açık bir alana (42 cm × 42 cm) yerleştirildi ve nöbet davranışlarını gözlemlememize izin verildi.
  2. Fareleri izofluran (% 2 -% 4) ile uyuşturduktan sonra, başlığı yerleştirmeden önce optik fiberleri kayıt bölgesinin sırasına göre sırayla bağlayın.tage.
  3. 635 nm ışık darbesini 20 Hz'de %10 görev döngüsüyle ayarlayın. Kayıt sırasında ışık stimülasyonunu 10 saniye (200 darbe) olarak ayarlayın. Fiber optik uçlardaki yoğunluğu 3 mW olarak ayarlayın.
  4. Gcamp6m sinyallerini 470 nm LED kanalı ile 30 Hz örnekleme hızında davranışsal test periyodunda kaydetmek için bir fiber fotometri sistemi kullanın.
  5. Kalsiyum sinyallerini, LFP'leri ve EEG'yi optogenetik stimülasyon altında karşılık gelen davranışsal performanslarla birlikte aynı anda kaydedin (bkz. Şekil 3).
  6. Kaydedilen verilerde zamansal tutarlılığı sağlamak için transistör-transistör mantığı (TTL) sinyal senkronizasyon etiketlemesini kullanın.

4. Veri işleme

  1. Fotometri verilerini MATLAB yazılımına yükleyin. Ardından, kalsiyum sinyalinin trendini azaltmak için özel kodlama (Ek Dosya 1) kullanın.
  2. Floresan yoğunluğundaki değişiklikleri denklem (1) ile tanımlayın:
    ΔF/F = (Ft - F0)/ F0 (1)
    Burada Ft gerçek zamanlı kalsiyum sinyali floresan değerlerini temsil eder ve F0 olaydan önceki ortalama temel floresan yoğunluğunu gösterir.
  3. Elektrofizyolojik verileri, 1000 Hz örnekleme hızını MATLAB'a aktarın (Ek Dosya 2).
  4. Kalsiyum sinyalizasyonunun ve elektrofizyolojik verilerin görüntülenmesini senkronize işaretleyicilerle uyumlu olarak koordine edin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetik nöbetler sırasında çeşitli beyin bölgelerindeki nöronal aktiviteyi gözlemlemek için optogenetiği çok bölgeli elektrofizyolojik kayıt ve kalsiyum görüntüleme ile birleştirdik. Bu amaçla, CaMKIIα promotörü (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)16 kontrolü altında ChrimsonR'yi eksprese eden adeno-ilişkili bir virüs (AAV), kemirgenlerde klasik bir epileptojenik bölge olan piriform kortekse (ROI 1)17 enjekte edildi. Ek olarak, AAV-hsyn-Gcamp6m18 üç bölgeye enjekte edildi ( Şekil 3A'da gösterildiği gibi ROI 1-3). Daha sonra bu bölgelere özel yapım oprodlar implante edildi ve karşı kafatasına EEG elektrotları implante edildi (Şekil 3B).

ChrimsonR ve Gcamp6m, 4 hafta sonra hedef beyin bölgelerinde yüksek oranda eksprese edildi (Şekil 3C). Fareler, ChrimsonR-pozitif nöronları aktive etmek için 20 Hz'de kısa bir 10 saniyelik fotostimülasyonun ardından genelleştirilmiş nöbet davranışları sergiledi. Eşzamanlı çoklu fiber fotometri ve elektrofizyoloji teknikleri kullanarak serbestçe hareket eden farelerde ROI'lerden kalsiyum aktivitelerini ve LFP sinyallerini topladık (Şekil 3D). Bu bölgelerde kısa optogenetik stimülasyon ile Ca2 + aktivitelerinde kayda değer artışlarla birlikte sağlam deşarjlar ortaya çıkarıldı (Şekil 3E). Opto-uyarıcı bölgede, optogenetik proteinlerin 30 Hz'lik bir örnekleme frekansında mavi ışıklı bir LED aracılığıyla aktivasyonu ile indüklenen 30 Hz'lik bir yanıt gözlendi. Kayıt kanallarında 50 Hz elektrik hattı paraziti gözlenmedi. Bu sonuçlar, optogenetik stimülasyon altında birden fazla bölgede senkronize elektrofizyolojik ve kalsiyum sinyal yanıtlarının güvenilir bir şekilde kaydedilmesini göstermiştir.

figure-results-1
Şekil 1: Esnek optrode'un şematik tasarımı. (A) "L" şeklindeki tungsten tellerin ve optik fiberlerin hazırlanması. (B) Optik fiberler ve tungsten teller yapışkan bant üzerine yerleştirildi. (C) Optik fiber ve tungsten tel yapıştırıcı kullanılarak birbirine yapıştırıldı. (D,E) Tungsten teller konektöre kaynaklandı. (F) Vidalar konektöre kaynaklandı ve konektör sıcakta eriyen yapıştırıcı ile kapsüllendi. (G) Optrode tertibatı üzerinde kalite denetimleri yapılmıştır. G, toprak elektrodu için iğne deliğini temsil eder; R, referans elektrot için iğne deliğini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: İmplantasyon cerrahisinin iş akışı. (A) Fare stereotaksik bir cihaza sabitlendi. (B) Kafa derisi çıkarıldı ve kafatası yeterince açığa çıkarıldı. (C) Enjeksiyon cam borusu pompaya bağlandı. (D) Farenin kafası yatay konuma ayarlandı. (E,F) Delikler açıldı ve virüs enjekte edildi. (G) Optrode, sahibi tarafından kavrandı. (H) Optrode ilgili bir alana implante edildi ve diş çimentosu ile sabitlendi. (I) Her implantasyondan önce sıfır pozisyonunun yeniden ayarlanması. (J) Optrode implantasyonundan sonra EEG elektrotları implante edildi. G/R: toprak elektrodu ve referans elektrodu pin konumlarında kısa devre yaptı. (K) Teller sırayla düzenlendi ve konektör sabitlendi. (L) Elektrot cihazı diş çimentosu ile sarılmış ve sabitlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İn vivo senkron elektrofizyolojik ve kalsiyum kaydı. (A) Viral enjeksiyonlar için deneysel tasarım. (B) Optrode implantasyonunun deneysel şeması. (C) Konfokal görüntüler, hedef bölgelerde virüs ekspresyonunu gösterir. Ölçek çubuğu = 200 μm. (D) Serbestçe hareket eden bir durumda optogenetik stimülasyon, senkron elektrofizyolojik ve kalsiyum kaydının şeması. (E) Kalsiyum sinyallerinin (üstte), LFP (ortada) sinyallerin, EEG'nin (altta) ve karşılık gelen güç spektrogramlarının temsili izleri. Kırmızı çizgi: 10 sn ışık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Kalsiyum sinyali için kodlama dosyaları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: LFP sinyali için kodlama dosyaları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, birden fazla bölgede in vivo nöral sinyal kaydı için kendi kendine yapılan bir optrode cihazı kullandık. Bu sistemin eşzamanlı optogenetik stimülasyon, kalsiyum sinyal kaydı ve elektrofizyolojik kayıt için fizibilitesi doğrulanmıştır. Burada açıklanan elektrot hazırlama yöntemi verimli ve uygun maliyetlidir. Deneysel tasarıma göre, ilgili beyin bölgelerinden gelen sinyalleri kaydedebiliriz. Optrodes'in stratejik düzenlemesi, beynin birden fazla bölgesinden bol miktarda bilginin potansiyel olarak çıkarılmasına izin verir. Çok modlu algılama paradigmalarının entegrasyonu, beyin bölgeleri arasındaki ilişkileri açıklığa kavuşturarak karmaşık nöral devreleri incelemek için fırsatlar sağlar.

Bu çalışmanın temsili verilerinde, tüm yerel beyin bölgesinin geniş spektrumlu nöronlarından gelen kalsiyum sinyalleri ve elektrofizyolojik sinyaller aynı anda kaydedildi. Transgenik hayvan yapım teknolojisindeki(19,20) gelişmelerin ardından, Cre-fareleri ve FlpO-farelerin eksprese edici-Gcamp virüsü ile kombinasyonu, belirli nöronlardan gelen nöral aktivitenin kaydedilmesine izin verir. Bu nedenle, bu yöntem, bu entegre yaklaşımlar aracılığıyla farklı beyin bölgelerindeki belirli nöronların tepkilerini çözmemize izin verir. Ek olarak, çeşitli analitik yöntemler, birden fazla beyin bölgesinden toplanan elektrofizyolojik ve kalsiyum sinyallerinin analizinde faydalı olacaktır. Örneğin, tutarlılık analizi ve Granger nedensellik analizi, farklı beyin bölgeleri arasında yeni teorik iletişim özellikleri elde etmek için kullanılabilir 21,22,23. Ayrıca, devre izleme tekniklerindeki gelişmeler, beyin bölgeleri arasındaki yapısal bağlantıların çözülmesine yardımcı olmaktadır24. Bu entegre teknolojiler, çeşitli beyin alanlarındaki ilişkili tepkilerin anlaşılmasını geliştirdi ve devrelerde ve ağlarda bağlantı ve etkileşim anlayışında devrim yarattı.

Bu çalışmada epilepsinin optogenetik çıra modellemesi kullanılmıştır. Optogenetik, epilepsi25,26 çıra modelindeki elektriksel stimülasyona kıyasla sadece daha yüksek zamansal çözünürlük değil, aynı zamanda gelişmiş hücre özgüllüğü de sunar. Ek olarak, ışık iletimi ve kalsiyum kaydının aynı optik fiber üzerinden gerçekleştirilmesini sağlar. Çok bölgeli aktivite tespitleri ve optogenetik modülasyonlar, kapalı döngü epilepsi müdahale yöntemlerini tamamlayacak, inhibitör modülasyon yoluyla birden fazla beyin bölgesinde düzenleyici müdahalelere izin verecek ve böylece anti-epileptik etkileri artıracaktır27,28. Bu cihazların kronik ağrının tespiti ve kapalı döngü müdahalesi için mevcut diğer nöromodülasyon teknolojileriyle birleştirilmesi de önemlidir29,30. Ayrıca, bu yaklaşım, uyku bozuklukları31 ve Alzheimer hastalığı gibi diğer nörolojik bozukluklara da uzanabilir, burada 40 Hz salınımlar ve duyusal girdiyi takiben bilgi işleme, çok bölgeli in vivo kayıt32 yoluyla aydınlatılmasını gerektirir. Bu nedenle, bu çok yönlü yaklaşımı ustaca uygulamak, birden fazla bölge arasındaki etkileşimler hakkındaki anlayışımızı derinleştirecek ve çeşitli hastalıklarda hassas tedaviler için değerli bilgiler sağlayacaktır.

Bu optrode tespit yönteminde, gelecekteki araştırmalarda geliştirilebilecek sınırlamalar mevcuttur. LFP sinyalleri kolayca elde edilirken, mevcut yöntem33 ile ani yükselme aktivitelerinin tespiti zor olmaya devam etti. Tungsten telini çok kanallı esnek elektrotlarla değiştirmeyi hedefliyoruz. Elyafın kalınlığı ve tutkal yapıştırıcısının güvenliği dikkatlice düşünülmelidir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, ifşa etmek için rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31871085), Şanghay Doğa Bilimleri Vakfı (21ZR1407300), Şanghay Belediye Bilim ve Teknoloji Büyük Projesi (2018SHZDZX01), ZJ Lab ve Şanghay Beyin Bilimi ve Beyinden İlham Alan Teknoloji Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
8-32 adaptörPlexonÖzel siparişDişi konektörü ve başlığı bağlayın.tage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherryTaitoolBioscience S0371-94 x 1012 VG/mL 
AAV-hsyn-Gcamp6mTaitoolBiyobilim S0471-94 x 1012 VG/mL 
DAPISigma236276Titreli 1:500
Diş ÇimentosuNew Century Dental430205
Elektrofizyolojik kayıt sistemiPlexonOmniplex
Emaye telN/AÖzel sipariş edilenÇap = 0,2 mm
Dişi konnektörN/AÖzel sipariş edilen1,25 mm aralıklı
TutkalLoctite45282
LazerChangchun Yeni EndüstrilerBH81563635 nm 
MATLABMathWorksR2021b
MicrodrillRWD78001
Çok kanallı fiber fotometriThinkerTechFPS-SS-MC-LED
Optik fiberXi'an BogaoL-200UMHedeflenen beyin bölgelerinin derinliğine göre uygun fiber uzunluğunu seçin.
PFA Kaplı Tungsten telA-M Sistemi795500Çıplak 0.002 "; Kaplamalı 0.0040 "
Güç ölçerThorlabsPM100D
Stereotaksik FxrameRWD68807
Doku yapıştırıcısı3M1469SB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Devinsky, O., et al. Epilepsy. Nat Rev Dis Primers. 4, 18024(2018).
  2. Piper, R. J., et al. Towards network-guided neuromodulation for epilepsy. Brain. 145 (10), 3347-3362 (2022).
  3. Bertram, E. H. Neuronal circuits in epilepsy: Do they matter. Exp Neurol. 244, 67-74 (2013).
  4. Goodman, A. M., Szaflarski, J. P. Recent advances in neuroimaging of epilepsy. Neurotherapeutics. 18 (2), 811-826 (2021).
  5. Caciagli, L., Bernhardt, B. C., Hong, S. J., Bernasconi, A., Bernasconi, N. Functional network alterations and their structural substrate in drug-resistant epilepsy. Front Neurosci. 8, 411(2014).
  6. Dai, Y., et al. In vivo microelectrode arrays for detecting multi-region epileptic activities in the hippocampus in the latent period of rat model of temporal lobe epilepsy. Micromachines (Basel). 12 (6), 659(2021).
  7. Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A. Electrophysiological biomarkers of epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 334-346 (2014).
  8. Grienberger, C., Giovannucci, A., Zeiger, W., Portera-Cailliau, C. Two-photon calcium imaging of neuronal activity. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 67(2022).
  9. Akerboom, J., et al. Optimization of a gcamp calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  10. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive gcamp calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615 (7954), 884-891 (2023).
  11. Wu, Z., Lin, D., Li, Y. Pushing the frontiers: Tools for monitoring neurotransmitters and neuromodulators. Nat Rev Neurosci. 23 (5), 257-274 (2022).
  12. Vierock, J., et al. Bipoles is an optogenetic tool developed for bidirectional dual-color control of neurons. Nat Commun. 12 (1), 4527(2021).
  13. Luo, W., et al. Acquiring new memories in neocortex of hippocampal-lesioned mice. Nat Commun. 13 (1), 1601(2022).
  14. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  15. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods Mol Biol. 1916, 99-103 (2019).
  16. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  17. Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Front Neural Circuits. 9, 27(2015).
  18. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  19. Birling, M. C., Dierich, A., Jacquot, S., Herault, Y., Pavlovic, G. Highly-efficient, fluorescent, locus directed cre and flpo deleter mice on a pure c57bl/6n genetic background. Genesis. 50 (6), 482-489 (2012).
  20. Huang, T., et al. Identifying the pathways required for coping behaviours associated with sustained pain. Nature. 565 (7737), 86-90 (2019).
  21. Likhtik, E., Stujenske, J. M., Topiwala, M. A., Harris, A. Z., Gordon, J. A. Prefrontal entrainment of amygdala activity signals safety in learned fear and innate anxiety. Nat Neurosci. 17 (1), 106-113 (2014).
  22. Tavares, L. C. S., Tort, A. B. L. Hippocampal-prefrontal interactions during spatial decision-making. Hippocampus. 32 (1), 38-54 (2022).
  23. Lu, Y., et al. Optogenetic dissection of ictal propagation in the hippocampal-entorhinal cortex structures. Nat Commun. 7, 10962(2016).
  24. Liu, Q., Wu, Y., Wang, H., Jia, F., Xu, F. Viral tools for neural circuit tracing. Neurosci Bull. 38 (12), 1508-1518 (2022).
  25. Christenson Wick, Z., Krook-Magnuson, E. Specificity, versatility, and continual development: The power of optogenetics for epilepsy research. Front Cell Neurosci. 12, 151(2018).
  26. Paschen, E., et al. Hippocampal low-frequency stimulation prevents seizure generation in a mouse model of mesial temporal lobe epilepsy. Elife. 9, e54518(2020).
  27. Gummadavelli, A., Zaveri, H. P., Spencer, D. D., Gerrard, J. L. Expanding brain-computer interfaces for controlling epilepsy networks: Novel thalamic responsive neurostimulation in refractory epilepsy. Front Neurosci. 12, 474(2018).
  28. Vandekerckhove, B., et al. Technological challenges in the development of optogenetic closed-loop therapy approaches in epilepsy and related network disorders of the brain. Micromachines (Basel). 12 (1), 38(2020).
  29. Li, Z. J., Zhang, L. B., Chen, Y. X., Hu, L. Advancements and challenges in neuromodulation technology: Interdisciplinary opportunities and collaborative endeavors. Sci Bull (Beijing). 68 (18), 1978-1982 (2023).
  30. Zhang, Q., et al. A prototype closed-loop brain-machine interface for the study and treatment of pain. Nat Biomed Eng. 7 (4), 533-545 (2023).
  31. Varela, C., Wilson, M. A. Mpfc spindle cycles organize sparse thalamic activation and recently active ca1 cells during non-rem sleep. Elife. 9, e48881(2020).
  32. Adaikkan, C., et al. Gamma entrainment binds higher-order brain regions and offers neuroprotection. Neuron. 102 (5), 929-943.e8 (2019).
  33. Muthmann, J. O., et al. Spike detection for large neural populations using high density multielectrode arrays. Front Neuroinform. 9, 28(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Electrophysiological OptrodesIn Vivo RecordingLocal Field PotentialMulti Region RecordingOptogenetic StimulationCalcium SignalingFiber PhotometryEEG RecordingNeural Circuit AnalysisEpilepsy Models

Related Articles