Method Article

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

DOI:

10.3791/67079

⸱

November 22nd, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Parasitology Laboratory, School of Life Sciences, Jawaharlal Nehru University, 2Laboratory of Malaria and Vector Research and National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimyasal genetik, bir kapı bekçisi kalıntısının, hedef lokusta farklı bir yan zincir içeren bir amino asit ile değiştirilmesini içerir. Burada, cdpk1'in hipomorfik bir alelini içeren mutant bir parazit oluşturduk ve mutant arka planda parazit tarafından benimsenen telafi edici yolları belirledik.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıtma paraziti tarafından ilaçların etkisini bozma mekanizmalarından biri, transkriptomunun yeniden kablolanmasıdır. Etki, çok gen ailesine ait hedef genler için daha belirgindir. CDPK ailesine ait Plasmodium falciparum protein kinazları, kan evresi gelişimi için gereklidir. Bu nedenle, CDPK'lar anti-sıtma bileşiklerinin geliştirilmesi için iyi hedefler olarak kabul edilir. Kimyasal genetik yaklaşımı, tarihsel olarak yüksek ökaryotlarda protein kinazların işlevini aydınlatmak için kullanılmıştır. Genetik manipülasyon yoluyla farklı bir yan zincire sahip başka bir amino asit için kapı bekçisi kalıntısının ikame edilmesini gerektirir. Kapı bekçisi pozisyonunda amino asit ikamesi, bir protein kinazın aktivitesini modüle eder ve hedef genin fonksiyonel olarak tanımlanmasına yardımcı olan çarpmalı kinaz inhibitörleri (BKI'ler) olarak bilinen spesifik bir bileşik sınıfına duyarlılığını değiştirir. Burada, cdpk1'in hipomorfik bir alelini barındıran mutant bir parazit tarafından evrimleşen telafi edici mekanizmaları anlamak için kimyasal genetik yaklaşımından yararlandık. Genel olarak, yaklaşımımız, bireysel kinazlara karşı ilaç direncinin gelişmesini önlemek için aynı anda hedeflenebilecek telafi edici yolların belirlenmesine yardımcı olur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıtma, özellikle 5 yaşın altındaki çocuklarda her yıl milyonlarca ölümden sorumlu olan önde gelen bulaşıcı hastalıklardan biridir1. Sıtmaya karşı klinik olarak mevcut bir aşı yoktur. Ayrıca, en ölümcül insan sıtma paraziti olan Plasmodium falciparum'un, artemisinin 2,3,4,5 adı verilen ön cephe ilacına karşı direnç kazandığı bilinmektedir. Artemisinin direncinin dünya çapında yayılmasını önlemek için hızlı bir şekilde uygulanabilecek yeni ilaç hedeflerinin ve yeni stratejilerin belirlenmesi acil bir gerekliliktir. İlaç etki mekanizmasının ve telafi edici yolların moleküler temelinin daha iyi anlaşılması, ilaç direncinin gelişmesini önlemek için daha iyi stratejiler geliştirilmesine yardımcı olabilir.

Kalsiyum Bağımlı Protein Kinazlar (CDPK'lar) ailesine ait protein kinazlar, eritrositik, seksüel ve pre-eritrositik aşamalar6 sırasında parazit gelişiminin birçok aşamasında çok önemlidir. P'nin eşeysiz replikasyonu sırasında. falciparum, CDPK5'in merozoitlerin olgun şizontlardan çıkışında kritik bir rol oynadığı bilinmektedir7. CDPK5'in koşullu silinmesi, şizontların merozoitleri kan dolaşımına salmasına izin vermez ve bu da parazitin ölümüne yol açar. CDPK5 aracılı parazit çıkışının moleküler mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır ve bir yukarı akış düzenleyicisi olarak protein kinaz G'yi (PKG) içerdiği düşünülmektedir 7,8. CDPK7, halka evreli parazitlerin trofozoit9'a olgunlaşması için gereklidir. CDPK4, sivrisineklerde cinsel evre gelişimi için kritik olan CDPK ailesinin bir başka üyesidir. Parlama işlemi sırasında birden fazla adımda yer alır ve bu nedenle serbest, hareketli, erkek gametlerin oluşumu için kritik öneme sahiptir 10,11,12,13. CDPK1 iç zar kompleksinin fosforilat bileşenleri ve rhoptry14,15. Ayrıca, CDPK1'in koşullu silinmesi, RBC16'nın invazyonunda yer alan proteinlerin hipo-fosforilasyonu ile sonuçlanır. CDPK1'in invazyon sürecinde apikal organellerin boşalmasını düzenlediği gösterilmiştir17. CDPK1 ayrıca SERA5 proteaz18'i fosforile ederek enfekte RBC'den merozoitlerin çıkışına yardımcı olur. Fosforile CDPK1, tercihen merozoitin apikal ucunda lokalize edilir, burada istila işlemi için gerekli olan diğer parazit proteinleri ile etkileşime girebilir19,20. CDPK1 ayrıca sıtma bulaşması ve sivrisineklerdeki parazitin cinsel gelişimi için kritik bir adım olan erkek ve dişi gametlerin oluşumunda da rol oynar21.

Kimyasal genetik yaklaşım, memeli kinazların fonksiyonel rollerinin tanımlanması için tarihsel olarak kullanılmıştır22,23. Yaklaşım, kapı bekçisi pozisyonundaki bir kalıntının farklı bir yan zincirin bir amino asidi ile değiştirilmesini kullanır. Kapı bekçisi kalıntısının değişimi, bitişik bir ATP cebinin boyutunu modüle eder ve bu da, çarpmalı kinaz inhibitörleri (BKI'ler) adı verilen kimyasal bileşiklerin vahşi tipe kıyasla mutant enzime doğru erişilebilirliğini değiştirir. Kapı bekçisi pozisyonundaki hacimli bir kalıntının daha küçük bir kalıntı ile ikame edilmesi, BKI'lere erişime izin verirken, ters ikame kinazı BKI'lere dirençli hale getirir. Bazı durumlarda, geçit tutucu kalıntısının ikamesi, hedef enzimin kinaz aktivitesinde bir azalma ile ilişkilidir ve bu da modifikasyonu fonksiyonel çalışmalar için intoleranslı hale getirir24,25. Kapı bekçisi ikamesinin enzim aktivitesi üzerindeki olumsuz etkisi, intoleransa sahip kinaz25'te ikinci bir bölgede baskılayıcı mutasyon oluşturularak tersine çevrilebilir. Apicomplexan protein kinazlarının işlevini incelemek için kimyasal bir genetik yaklaşım kullanılmıştır. Daha küçük bir kapı bekçisi kalıntısı içeren vahşi tip CDPK4, çarpmış kinaz inhibitörleri BKI-1 ve 1294 tarafından seçici olarak inhibe edildi ve bu da erkek gametogenezi ve ookist gelişiminde bir bloğa yol açtı11,12. CDPK4'teki küçük bir kapı bekçisi kalıntısının hacimli bir metiyonin kalıntısı ile ikame edilmesi, eksflagellasyon11'de BKI aracılı inhibisyonda bir azalmaya yol açtı. Sıtma paraziti ile yakından ilişkili bir Apicomplexan paraziti olan Toxoplasma gondii'nin CDPK1'inin, takizoitler tarafından konak hücrelerin motilitesi ve istilasında rol oynadığı gösterilmiştir26,27. Hayvan modellerinde hastalık patogenezini azaltan spesifik inhibitörler tasarlamak için vahşi tip TgCDPK1'in daha küçük bir kapı bekçisi cebinden yararlanıldı 28,29. P'nin katılımı. falciparum (falciparum) Geç şizogonik gelişim ve gamet oluşumunda Protein Kinaz G (PKG), spesifik farmakolojik inhibitörler30,31 kullanılarak enzimin aktivitesinin inhibe edilmesiyle gösterilmiştir. Treoninin kapı bekçisi pozisyonunda glutamin (T618Q) ile ikame edilmesi, mutant enzimin inhibitörlere duyarlılığını büyük ölçüde azalttı, bu da normal gametogenez ve şizonttan halkaya ilerleme ile sonuçlandı30,31.

Önceki çalışmaların çoğu, hedef kinazların 11,12,22,23,26,30,31 fonksiyonel karakterizasyonu için bir kimyasal genetik yaklaşım kullanmıştır, ancak bu yaklaşımı, bir protein kinazın hipomorfik alelini barındıran parazitlerde telafi edici mekanizmaların gelişimini anlamak için benimsedik. Daha önce, CDPK1'deki vahşi tip kapı bekçisi kalıntısının metiyonin (T145M) ile ikame edilmesinin, mutant enzim32'nin transfosforilasyon potansiyelinde ~ %47 azalmaya yol açtığını göstermiştik. cdpk1'in hipomorfik alelini (cdpk1t145m) içeren bir mutant parazit, diğer CDPK ailesi üyelerinin transkripsiyonel yeniden kablolaması yoluyla CDPK1'in azaltılmış aktivitesi için önceden uyarlanmıştır. Bu stratejinin genel olarak, esansiyel protein kinazların hipomorfik alellerini içeren mutant parazitlerdeki telafi edici mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabileceğine inanıyoruz. Hedef kinazın fonksiyonunu kısmen telafi eden diğer kinazlar, bireysel kinazlara karşı ilaç direncinin gelişmesini önlemek için hedef kinaz ile birlikte aynı anda inhibe edilebilir. Bu, sıtma kontrolü için daha iyi bir strateji olarak hizmet edebilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu S. falciparum parazit suşu (NF54) Alvaro Molina Cruz 21,32,33'ten elde edildi. Parazit kültürü için kullanılan O + insan kırmızı kan hücreleri, Hindistan'ın Yeni Delhi kentindeki Rotary Kan Merkezi'nden elde edildi. Plazmitler, pL6eGFP ve pUF1, Jose-Juan Lopez-Rubio'dan elde edildi. DSM267, Margaret A. Phillips ve Pradipsinh K. Rathod'dan elde edildi. WR99210, Jacobus İlaç Şirketi tarafından sağlandı.

1. Escherichia coli'de rekombinant CDPK1'in ekspresyonu için plazmid yapımı

  1. cdpk1 geninin tam CDS'sini amplifiye etmek için oligonükleotid primer çiftini tasarlayın (PlasmoDB erişim no. PF3D7_0217500) Astar analiz yazılımı kullanmak.
    1. Gene özgü oligonükleotid çifti ile DNA polimeraz kullanarak tam CDS'yi amplifiye edin: Pk1fpgex ve Pk1rpgex (bkz. Tablo 1), 20 μL'lik bir reaksiyon hacminde bir şablon olarak Plasmodium falciparum'dan hazırlanan cDNA kullanarak. PCR amplifikasyon koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 98 ° C'de 2 dakika boyunca ilk denatürasyon, (30 s boyunca 98 ° C'de denatürasyon, 20 s boyunca 52 ° C'de tavlama, 62 °C'de 20 s) x 36, Son uzatma 62 °C'de 10 dakika. PCR ürününü daha fazla kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
  2. Toplam 30 μL reaksiyon hacminde 37 ° C'de 3-4 saat boyunca BamHI (20.000 U / mL) ve NotI (20.000 U / mL) kısıtlama endonükleazları ile 1 μg amplifiye edilmiş PCR ürününü ve 1 μg pGEX4T1 ekspresyon plazmitini sindirin.
  3. Çift sindirilmiş PCR ürününü ve plazmidi saflaştırmak için kolon bazlı bir PCR temizleme kiti kullanın ve üreticinin talimatlarını izleyin.
  4. Toplam 10 μL reaksiyon hacminde 1 μL T4 DNA ligaz kullanılarak 1:5 vektör-kesici uç molar oranında bir ek ile 100 ng çift sindirilmiş, saflaştırılmış pGEX4T1 plazmitini bağlayın. Ligasyon reaksiyonunu gece boyunca 16 ° C'de inkübe edin.
  5. Dönüştür E. Coli Ampisilin (100 μg/mL) içeren LB agar plakaları üzerinde üretici ve plakaya uygun olarak bağlanmış karışıma sahip DH5α yetkin hücreler.
  6. Transformasyondan elde edilen dört bakteri klonunu, üreticinin talimatlarına göre bir mini plazmit saflaştırma kiti kullanarak plazmidi saflaştırarak rekombinant plazmidin varlığı için tarayın. Yukarıda adım 1.3'te açıklandığı gibi BamHI ve NotI kullanarak çift kısıtlama sindirimi ile rekombinant plazmidi onaylayın.
  7. Sanger DNA dizilimi ile doğru dizi için kısıtlama sindirim pozitif klonlarını daha fazla doğrulayın. Dönüştür E. Coli CDPK1 protein ekspresyonu için dizi doğrulanmış plazmit yapısına sahip BLR(DE3) pLysS yetkin hücreleri.

2. E. coli'de rekombinant CDPK1 proteininin ekspresyonu ve saflaştırılması

  1. Rekombinant CDPK1 ifadesi
    1. Tek bir E klonunu aşılayın. Coli Ampisilin (100 μg/mL) içeren 10 mL LB ortamına dizi doğrulanmış plazmit yapısını içeren BLR(DE3) pLysS suşu. Kültürü gece boyunca 37 ° C'de 200-250 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
    2. İkincil kültürü birincil kültürün% 1'i ile aşılayın ve bakteri hücrelerinin 37 ° C'de orta log fazına büyümesine izin verin. İkincil kültürün optik yoğunluğu (OD) 600 nm'de 0.7-0.9'a ulaştığında, 1 mM İzopropil ß-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ekleyerek tam uzunlukta rekombinant CDPK1'in ekspresyonunu indükleyin ve 24 ° C'de 10-12 saat inkübe edin.
    3. Kuluçkanın ardından E'yi hasat edin. 10 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleme ile coli hücreleri. Süpernatanı boşaltın ve hücre peletini tutun.
    4. Lizis tamponunu aşağıdaki bileşimle hazırlayın: 1 mM ditiotreitol (DTT), 0.1 mg / mL lizozim, 1 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1x proteaz inhibitörü kokteyli.
    5. Hücre peletini, lizis tamponunun pelet ağırlık hacminin 10 katı kadar yeniden süspanse edin. Protein denatürasyonuna yol açabilecek lokalize ısınmayı önlemek için hücre süspansiyonunu 9 s Açık, 15 s Kapalı aralıklarla 15 dakika boyunca sonikleştirin.
    6. Lizatı 1 saat boyunca 17.000 x g'da santrifüjleyin ve berrak süpernatanı gece boyunca 4 ° C'de glutatyon boncukları ile inkübe edin. Saflaştırılmış rekombinant CDPK1 proteini elde etmek için aşağıda belirtilen protokolü izleyin.
  2. GST etiketli CDPK1'in saflaştırılması için glutatyon boncukları kullanan afinite kromatografisi
    1. 250 mL bakteri kültürü için 500 μL tamamen yeniden süspanse edilmiş glutatyon boncukları alın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice boşaltın.
    2. Boncukları 5 mL bağlayıcı tampon (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.3) ile yıkayın ve karıştırmak için ters çevirin.
    3. 500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Yıkama ve santrifüjlemeyi 3x-4x için tekrarlayın.
    4. Boncukları bakteri hücresi lizatına ekleyin ve hafif çalkalama (20-30 rpm) ile 4 ° C'de 12 saat inkübe edin.
    5. 500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Süpernatant, bağlanmadan kalan rekombinant CDPK1 miktarını tahmin etmek için kaydedilebilir.
    6. CDPK1'e bağlı boncukları 1 mM DTT içeren PBS ile en az 5-6 kez yıkayın ve ardından 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7.5 ile yıkayın.
    7. Bağlı proteini önce 250 μL elüsyon tamponu 1 (EB1) ile, ardından 250 μL elüsyon tamponu 2 (EB2) ile 2x elute edin. EB1 ve EB2'nin bileşimi sırasıyla 50 mM Tris'te 10 mM indirgenmiş glutatyon, 100 mM NaCl, pH 7.5 ve 50 mM Tris'te 20 mM indirgenmiş glutatyon, 100 mM NaCl ve pH 7.5'tir.
    8. CDPK1'e bağlı boncukları, hafif çalkalama veya uçtan uca döndürme kullanarak oda sıcaklığında (RT) 5-10 dakika boyunca elüsyon tamponları 1 ve 2'de inkübe edin.
    9. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin ve ayrıştırılmış CDPK1 rekombinant proteinini içeren süpernatanı ayrı bir tüpe dikkatlice aktarın.
    10. EB1 ve EB2 ile her biri 2 elevte elde etmek için 2.2.8 ve 2.2.9 adımlarını tekrarlayın.

3. Rekombinant CDPK1 kapı bekçisi mutant proteinlerinin üretilmesi için bölgeye yönelik mutajenez

  1. Dizi doğrulanmış cdpk1 geni içeren pGEX4T1 plazmidini kullanın. E. coli BLR (DE3) pLysS suşunun dönüşümü için kullanılan aynı plazmidi kullanmayı tercih ediyoruz.
  2. Primerleri, vahşi tip cdpk1 gen dizisinde bir kapı bekçisi mutasyonu tanıtacak şekilde tasarlayın. Vahşi tip kapı bekçisi kalıntısı (T145), cdpk1 genindeki bir ACC kodonu tarafından kodlanır. Treonin kapı bekçisini, sırasıyla AGC ve ATG kodonları tarafından kodlanan küçük (serin, T145S) ve hacimli (metiyonin, T145M) kapı bekçisi kalıntılarıyla değiştirin.
  3. Bölgeye yönelik mutajenez için ileri ve geri primerleri tasarlamak için aşağıda belirtilen yönergeleri izleyin.
    1. Her iki astarın da birbirini tamamlayıcı olduğundan emin olun. Mutasyonun her iki tarafında 15-20 değiştirilmemiş dizi nükleotidi tutun. Mutasyona uğramış bölge hariç, dizi için Tm'nin 50 °C ila 55 °C arasında olduğundan emin olun.
  4. cdpk1'in ağ geçidi bekçisi mutant yapılarını oluşturmak için siteye yönelik mutajenez kitini kullanın. İstenen mutasyonu tanıtmak için üreticinin talimatlarını izleyin. Bölgeye yönelik mutajenez için kullanılan primerler Tablo 1'de listelenmiştir.
  5. Parental, metillenmiş plazmidi sindirmek için reaksiyon karışımını 0.5 μL DpnI (20.000 U / mL) enzimi ile muamele edin. Reaksiyon karışımını 37 ° C'de 3 saat inkübe edin. E. coli DH5α yetkin hücreleri DpnI ile muamele edilmiş reaksiyon karışımı ile dönüştürün.
  6. DNA dizilimi yoluyla cdpk1 gen dizisinde istenen mutasyonun girişini doğrulamak için T145M ve T145S plazmit yapılarının her birinin dört klonunu tarayın.
  7. Rekombinant CDPK1 T145M/S proteinlerinin ekspresyonu için E. coli BLR(DE3) pLysS suşundaki dizi doğrulanmış plazmitleri, adım 1.5'te açıklandığı gibi dönüştürün.
  8. CDPK1 geçit bekçisi mutant proteinlerini, vahşi tip CDPK1 proteini için bölüm 2'de açıklanan adımları izleyerek eksprese edin ve saflaştırın.

4. CDPK1'in in vitro kinaz aktivite testi

NOT: Rekombinant vahşi tip CDPK1 ve kapı bekçisi mutant proteinlerinin kinaz aktivitesi, Allen ve ark.34 tarafından tarif edildiği gibi yarı sentetik bir epitop etiketleme yaklaşımı ile değerlendirilir.

  1. 50 μL'lik toplam reaksiyon karışımında CDPK1'in eksojen bir substratı olarak 50 mM Tris, 50 mM MgCl2, 2 μg miyelin bazik proteini (MBP) ile 1x fosfat inhibitörü kokteyli içeren tamponda 50 ng rekombinant proteini inkübe edin.
  2. Kalsiyumun varlığını veya yokluğunu gerektiren koşullara bağlı olarak, kinaz test tamponunda her biri 2.5 mM'lik nihai konsantrasyonu yapmak için sırasıyla CaCl2 veya EGTA ekleyin. Aktarılabilir terminal fosfat grubunun kaynağı olarak kullanmak için tampona 100 μM'lik nihai konsantrasyona ATPγS ekleyin.
  3. Reaksiyon karışımını 30 ° C'de bir su banyosunda 1 saat inkübe edin, ardından 5 mM EGTA ilavesiyle reaksiyon sonlandırın. Reaksiyon karışımına 5 μl 50 mM p-nitrobenzil mesilat (PNBM) ekleyin ve transfosforilasyon MBP ve otofosforile CDPK1'deki fosforile serin ve treonin kalıntılarının alkilasyonu için 2 saat boyunca bir su banyosunda 20 ° C'de inkübe edilmesine izin verin.
  4. Toplam 55 μL reaksiyon karışımına 19 μL 4x SDS numune tamponu ekleyin ve 95 °C'de 5 dakika ısıtın.

5. İn vitro kinaz testinin tiyo-fosforile ürünlerini tespit etmek için Western blot analizi

  1. % 12 SDS-PAGE jeli hazırlayın ve her numuneden 15 μL yükleyin. Otofosforile CDPK1 ve transfosforile MBP'yi görselleştirmek için reaksiyon karışımını ayırın.
  2. Ayrılan proteinleri SDS-PAGE jelinden ıslak transfer yöntemini32 kullanarak bir PVDF membranına aktarın.
  3. RT'de 1 saat boyunca% 0.05 Tween 20 içeren Tris tamponlu salin (20 mM Tris-HCL, pH 7.5, 150 mM NaCl) içinde% 5 yağsız süt ile inkübe ederek PVDF membranı üzerindeki spesifik olmayan bölgeleri bloke edin.
  4. PVDF membranını, bloke edici tamponda 4 ° C'de gece boyunca 1: 2.500 seyreltmede alkillenmiş tiyofosforile eklentilere karşı tavşan birincil antikoru ile inkübe edin.
  5. Gece boyunca inkübasyondan sonra, lekeyi 3x'i her biri 10 dakika boyunca% 0.05 Tween 20 ile Tris tamponlu salin ile yıkayın.
  6. Lekeyi, RT'de 1 saat boyunca 1: 5.000 seyreltmede bloke edici tamponda keçi anti-tavşan ikincil antikoru ile daha fazla inkübe edin, ardından% 0.05 Tween 20 içeren Tris tamponlu salin ile yıkayın.
  7. Üreticinin talimatına göre eşit oranda çözelti A ve çözelti B'yi karıştırarak lekeyi kemilüminesan substrat ile kaplayın ve CDPK1 otofosforilasyonu ve MBP transfosforilasyon sinyallerini elde etmek için karanlık bir odada X-ışını filmi üzerinde maruz bırakın.

6. Ağ geçidi ikamesini tanıtmak içincdpk1 lokusunu hedeflemek için kılavuz dizisinin klonlanması  

NOT: 20 nükleotidin kılavuz dizisi, manuel küratörleme ile seçildi ve aşağıdaki adımlar kullanılarak BtgZI bölgesinde pL6eGFP plazmidinde klonlandı.

  1. pL6eGFP'nin BtgZI enzimi kullanılarak sindirimi
    1. Enzim üreticisinin reaksiyon koşulları protokolünü izleyerek, 60 ° C'de 60 ° C'de 4 saat boyunca 1 μg pL6eGFP plazmid35'i 1 μL BtgZI enzimi (5.000 birim / mL) ile sindirin.
    2. 4 saatlik inkübasyon süresinden sonra, sindirilmiş plazmidi %1'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın ve sindirilmiş plazmidi içeren jel parçasını (~ 9.8 kb) çıkarın. Sindirilmiş plazmiti, üreticinin talimatlarına göre sütun bazlı bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın.
  2. Oligoların tavlanması
    1. 100 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için oligonükleotidleri (Ck1GUIDEFWD ve Ck1GUIDEREV) DNase/RNaz içermeyen suda sulandırın.
    2. Her oligonükleotidin 20 μM'sini 10 mM Tris (pH 8.0), 50 mM NaCl ve 1 mM EDTA içeren bir çözeltide birleştirin. Karışımı 95 °C'de kuru bir banyoda 5 dakika inkübe edin ve reaksiyonun oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Reaksiyon karışımının sıcaklığının RT'ye ulaşması genellikle 1 saat sürer.
    3. Tavlanmış oligonükleotidleri Tris pH 8.0'da 0.5 μM'ye seyreltin, bu da toplam 100 μL'lik bir reaksiyon karışım hacmi ile sonuçlanır.
  3. Füzyon reaksiyonu
    1. pL6CK1G plazmid içeren bir CDPK1 kılavuzu oluşturmak için 1.5 μL seyreltilmiş oligonükleotidi 100 ng BtgZI ile sindirilmiş doğrusallaştırılmış plazmit ile toplam 10 μL'lik bir reaksiyon hacminde 5x In-Fusion enzim ön karışımında birleştirin.
    2. Reaksiyonu 50 ° C'de 15 dakika inkübe edin. E'nin dönüşümüne devam edene kadar reaksiyonu 4 ° C'de saklayın. koli.
      NOT: Uzun süreli depolama için reaksiyon karışımı -20 °C'de saklanabilir.
  4. E'nin Dönüşümü. Coli Yıldız yetkin hücreler
    1. E'ye 2.5 μL reaksiyon karışımı ekleyin. Coli Yıldız yetkin hücreler ve üreticinin protokolünü takip ederek dönüşüm sürecine devam edin.
    2. Dönüştürülmüş yetkin hücreleri LB ampisilin (100 μg/mL) plakası üzerine yerleştirin ve dönüştürülmüş bakterilerin gece boyunca 37 ° C'de büyümesine izin verin.
    3. Dönüştürülmüş kolonileri seçin ve piyasada bulunan bir plazmid mini hazırlık kitini kullanarak plazmidi çıkarın. Plazmit saflaştırması için üreticinin talimatlarına uyun. Sanger DNA dizilimi ile kılavuzun plazmide yerleştirilmesini doğrulayın.

7. Cas9 endonükleaz kısıtlı cdpk1 lokusunun onarımı için homoloji kolunun klonlanması

NOT: Hedef lokusa sokulacak SNP'leri içeren bir homoloji kolu ticari olarak sentezlenir. Genellikle 400-1000 bp uzunluğunda bir homoloji kolu alırız. Homoloji kolu, istenen SNP'lerin dahil edilmesinden sonra modifiye edilmiş lokusun yeniden kesilmesini önlemek için kılavuz RNA bölgesinde ve PAM'da sessiz mutasyonlar içerir. Met veya Ser gatekeeper mutasyonu ve sessiz mutasyonları içeren homoloji kolu (CDPK1'in 133 ila 553 nükleotidlerine karşılık gelir), AflII ve SpeI kısıtlama bölgeleri ile çevrilidir.

  1. 1 μg pL6CK1G ve homoloji kolunu içeren plazmidi, 20 μL'lik bir reaksiyon karışımında 37 ° C'de 4 saat boyunca 0.5 μL AflII (20.000 U / ml) kısıtlama enzimleri kullanarak çift sindirin.
  2. Çift sindirilmiş plazmitlerin tam reaksiyonunu %1.5 agaroz jel üzerinde çalıştırın ve üreticinin talimatlarını izleyerek bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak pL6CK1'in homoloji koluna ve plazmit omurgasına karşılık gelen bantları saflaştırın.
  3. Sindirilmiş homoloji kolunu, T4 DNA ligaz kullanılarak toplam 10 μL'lik bir reaksiyon hacminde 1:5 vektör-insert oranında 100 ng pL6CK1 plazmidi ile bağlayın. Ligasyon reaksiyonunu gece boyunca 16 °C'de inkübe edin. E. coli DH5α yetkin hücreleri, üreticinin talimatlarına göre tam ligasyon karışımı ile dönüştürün.
  4. Pozitif transformantları seçmek için dönüştürülmüş hücreleri ampisilin (100 μg/mL) içeren LB agar plakaları üzerine yerleştirin. LB ampisilin plakasından tek kolonileri seçin ve bir plazmit ekstraksiyon kiti kullanarak plazmiti saflaştırın.
  5. Adım 7.3'te tarif edilenle aynı sindirim koşulunu kullanarak saflaştırılmış plazmidi AflII ve SpeI enzimleri ile sindirerek klonun homoloji kolunun varlığını onaylayın. Homoloji kolunun tam dizisini doğrulamak için Sanger DNA dizilimi ile çift sindirim pozitif klonlarını daha da onaylayın.

8. Sıtma parazit transfeksiyonu için pL6CK1Met, pL6CK1Ser ve pUF1 plazmitlerinin saflaştırılması

  1. Ampisilin (100 μg/mL) içeren LB ortamında pL6CK1Met, pL6CK1Ser ve pUF1'in dizi doğrulanmış klonlarının 5 mL birincil kültürlerini ayarlayın ve 10 saat inkübe edin. Birincil kültürü 1:1000 oranında ikincil kültüre aktarın ve 12 saat daha inkübe edin.
  2. Bakteri kültürünü bir santrifüj şişesinde 10 dakika boyunca 5000 x g'da santrifüjleme ile peletleyin.
  3. Üreticinin protokolüne göre bir plazmit saflaştırma kiti kullanarak plazmitleri izole edin. Parazitin doğrudan transfeksiyonu için plazmit DNA'yı DNase / RNaz içermeyen suda çözün.

9. Plasmodium falciparum'un in vitro kültürlenmesi ve transfeksiyon için sorbitol senkronizasyonu

NOT: P. falciparum insan kırmızı kan hücrelerinde (RBC'ler) in vitro kültür, Trager ve Jensen36 tarafından belirtilen yönteme göre gerçekleştirilir.

  1. NF54 P suşunu çoğaltın. L-glutamin, 25 mM HEPES, 25 mM sodyum bikarbonat ve 50 μg/mL hipoksantin ile desteklenmiş RPMI 1640 içeren tam RPMI (cRPMI) ortamında %2'lik bir hematokritte O + insan eritrositlerinde kültürlenerek falciparum. Ortamı %0,5 AlbuMAX II ve 10 μg/mL gentamisin ile destekleyin ve kültürü %5 O2,% 5 CO2 ve% 90N2 atmosferi altında 37 ° C'de tutun.
  2. Halka aşaması paraziti elde etmek için sorbitol senkronizasyonu için, asenkron parazitleri RT'de 3 dakika boyunca 2.300 x g'da santrifüjleme ile 50 mL'lik bir konik tüpte peletleyin.
  3. Parazitlenmiş eritrositleri 9 hacim% 5 sorbitol ile 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, RBC'leri 3 dakika boyunca 2.300 x g'da santrifüjleme ile aşağı indirin ve sorbitol'ü atın.
  4. Sorbitol ile muamele edilmiş parazitleri eksik RPMI, iRPMI (albümaks ve sodyum bikarbonat içermeyen RPMI ortamı) ile yıkayın ve ardından cRPMI'de inkübe edin. Plazmit transfeksiyonu için bir sonraki döngüde halka aşaması parazitlerini kullanın.

10. Halka evresi parazitinin pL6CK1Met, pL6CK1Ser ve pUF1 plazmitleri ile transfeksiyonu

NOT: Halka evreli parazitlerin plazmit DNA ile doğrudan transfeksiyonu için aşağıdaki adımlar kullanılır.

  1. 30 mL su,240 mM KCl, 0.3 mM CaCl2, 4 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20 mM K2HPO4 / KH2PO4 ve 50 mM HEPES içinde çözerek 2x cytomix tamponu 37 hazırlayın. PH'ı 7.6'ya ayarlayın. Son ses seviyesini 50 mL'ye ayarlayın. Filtre: 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak tamponu sterilize edin. Ardından, 1x sitomiks tamponu elde etmek için 2x cytomix tamponunu steril suyla seyreltin.
  2. Steril 15 mL'lik konik bir tüpte, 100 μL'lik paketlenmiş halka aşamalı parazitlenmiş RBC'ler ekleyin ve bunları 5 mL 1x sitomiks tamponu ile 2 kez yıkayın. Yıkamaları RT'de 3 dakika boyunca 994 x g'da santrifüjleme ile gerçekleştirin.
  3. Yıkadıktan sonra, tamponu çıkarın ve paketlenmiş parazitlenmiş RBC'lere her bir plazmitten 50 μg (T145M mutasyonu oluşturmak için pL6CK1Met / pUF1 ve T145S mutasyonu oluşturmak için pL6CK1Ser / pUF1) ekleyin. Daha sonra plazmid hacmine göre 2x tampon ekleyin ve hacmi 1x tampon konsantrasyonu ile 400 μL'ye ayarlayın.
  4. Yukarıdaki çözeltinin 400 μL'sini her transfeksiyon için 0,2 cm'lik küvetlere aktarın. Aşağıdaki koşulları kullanarak elektropoze edin: 0,31 kV, 950 μF ve direnç Sonsuz olarak ayarlanmıştır.
  5. Elektroporasyonu takiben, transfekte edilen parazitleri küvetten çıkarın, bunları cRPMI ile karıştırın ve toplam hacmi 15 mL olan bir T25 şişesine aktarın. Parazitleri adım 9.1'de belirtilen koşullar altında 2 saat inkübe edin.
  6. İnkübasyondan sonra, transfekte edilen parazitleri 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 3 dakika boyunca 994 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve parazitleri 10 mL eksik RPMI ile yıkayın. Onları 2 gün boyunca taze cRPMI ile kültürleyin ve kültür ortamını 24 saat sonra yenileyin.
  7. 48 saat sonra, cRPMI'yi her bir şişeden çıkarın ve kültürü 2 nM WR99210 ve 150 nM DSM26738 içeren cRPMI'de yeniden süspanse edin. Ardından, 400 μL taze RBC ekleyerek kültürü bir T75 şişesine aktarın. Ortamı 7 gün boyunca WR99210 ve DSM267 içeren cRPMI ile günlük olarak doldurun. Daha sonra, transfeksiyondan sonraki 14. güne kadar her iki ilacı da içeren cRPMI ekleyin.
  8. 14. günde, slayt hazırlama için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde (MCT) 200 μL transfekte edilmiş kültür alikot. RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleme ile hücreleri peletleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri slaydın üzerine aktarın. Başka bir sürgü kullanarak 45° açıyla yerleştirerek lekeleme yapın.
  9. Slaytı metanol içinde sabitleyin ve ultra saf suda 1:10 oranında seyrelterek Giemsa lekesini hazırlayın. Daha sonra slaytı 20 dakika boyunca tamamen Giemsa lekesine batırarak boyayın. Slaytı akan su altında yıkayın ve iyice kurulayın. Ardından, daldırma yağı uygulayarak slaydı 100x büyütmede bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
  10. Parazitler görselleştirildikten sonra, medyayı günlük olarak doldurun ve 2-3 gün boyunca büyümelerine izin verin. Ardından, hedeflenen lokusta hedef gen dizisinde istenen değişikliği doğrulamak için parazitleri çıkarın.
    NOT: Parazitler 14. günde görünmüyorsa, ortamı (her iki ilacı da içeren) 4 gün sonra yenileyin. Paraziti% 30 oranında kesin ve parazitler yeniden ortaya çıkana kadar her 7 günde bir% 2 hematokrit korumak için taze kan ekleyin.

11. İstenen cdpk1 lokusu modifikasyonu ile transgenik parazitin PCR doğrulaması

  1. 2-3 günlük parazit büyümesinin ardından, 500 μL kültür alın ve 1.5 mL MCT'ye aktarın.
  2. Hücreleri 5 dakika boyunca 2.400 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Daha sonra, RBC'leri saponin tedavisi ile parçalayın.
    1. Saponin tedavisi için, 1 mL yeniden süspanse edilmiş parazit peletine 10 μL %10 saponin çözeltisi ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika tutun. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2.400 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Kızarıklık tamamen kaybolana ve siyah renkli bir parazit topağı elde edilene kadar bu adımı tekrarlayın.
  3. Parazit peletini 1 mL 1x PBS ile 2.400 x g'da 5 dakika santrifüjleme ile yıkayın. Daha sonra, peleti 50 μL DNase / RNaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş parazit peletini 95 °C'de 5 dakika ısıtın, ardından 16.200 x g'da 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin. Parazit DNA'sı içeren süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
  4. Yukarıdaki genetik materyali, ck1f1 ve ck1r3wt primer setini (bkz. Tablo 1) kullanarak tam uzunluktaki geni PCR'ye yükseltmek için kullanın, özellikle yukarıda adım 1.2'de açıklandığı gibi homoloji kolunun dışındaki bölgeyi hedefleyin. ck1f1 primerini kullanarak T145M mutasyonunu içeren homoloji bölgesini sıralayın.

12. Klonal transgenik parazitler elde etmek için seyreltmenin sınırlandırılması

  1. Dizi doğrulamasından sonra, 200 μL'de 1 parazitlik bir nihai konsantrasyon elde etmek için transfekte edilmiş parazit kültürünü seyreltin. Daha sonra, 96 oyuklu bir doku kültürü plakasının kuyucuklarına 100 μL seyreltilmiş kültür ekleyin. 1 parazit / 200 μL elde etmek için aşağıdaki adımları (12.2-12.4) gerçekleştirin.
  2. % 2 hematokrit ile 10 mL parazitlenmiş RBC hazırlayın. Yukarıda açıklanan Giemsa boyama yöntemini kullanarak kültürün parazitemi yüzdesini tahmin edin. Ardından, bir hemositometre kullanarak 1:100 seyreltilmiş bir kültürdeki toplam RBC sayısını sayın.
    Toplam RBC Sayısı/mL = Sayılan ortalama RBC sayısı x Seyreltme faktörü x 104
    Parazite edilmiş eritrosit sayısı/mL = (parazitemi yüzdesi x toplam eritrosit/mL sayısı)/100
  3. İlk kültürü 2x seri olarak seyrelterek (her biri 1:100 seyreltme) parazitlenmiş RBC'lerin 1:10.000 seyreltmesini hazırlayın.
  4. 10 mL ortamda toplam 50 parazit elde etmek için seyreltilmiş kültürden uygun bir hacim (mikrolitre cinsinden) ekleyin ve% 2 hematokrit sağlayın. Ardından, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 50 parazit içeren 100 μL ortam ekleyin. Plakayı, karışık gazla (yukarıda adım 9.1'de açıklandığı gibi bileşim) yıkanmış hava geçirmez bir secador içine yerleştirin ve 37 °C'de inkübe edin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
  5. Parazitler ortaya çıkana kadar ortamı her 7. günde bir % 2 hematokrit içeren cRPMI ile değiştirin.
    1. 96 oyuklu plakayı 45°'lik bir açıyla eğin ve RBC'lerin oturmasına izin verin. Serolojik bir pipet kullanarak, ortamı her bir oyuktan dikkatlice çıkarın ve parazit içeren oyuklarda, parazit içermeyen oyuklardaki ortamın pembe rengiyle tezat oluşturacak şekilde sarıya doğru bir renk değişimi gözlemleyin. Bu renk değişimi, parazitlerin ortamı asitleştirmesi nedeniyle oluşur.
  6. Renk değişimini gözlemledikten sonra, renk değişimi sergileyen kuyudan az miktarda kültür çıkarın ve bir slayt üzerinde bir leke hazırlayın ve bunu kuyu konumuna karşılık gelen bir sayı ile etiketleyin. Slaytı Giemsa boyası ile boyayın ve yukarıda anlatıldığı gibi mikroskop altında gözlemleyin.
  7. Kuyu içeriğini, parazitlerin mikroskop altında gözlemlendiği bir T25 şişesine aktarın. Parazitlerin T25 şişesinde 4-5 gün büyümesine izin verin ve ortamı her gün doldurun.
  8. Parazitemi% 2-3'e ulaştığında, 500 μL parazit kültürü çıkarın. Daha sonra, RBC'leri saponin-parçalayın ve bölüm 11'de açıklanan yöntemi kullanarak parazit genetik materyalini çıkarmaya devam edin.
  9. Klonal transgenik parazitlerin oluşumunu doğrulamak için, yukarıda adım 1.1.1'de açıklandığı gibi bir PCR reaksiyonu ayarlayın ve hedef lokusa istenen SNP'lerin girişini doğrulamak için PCR ürününü DNA dizilimi için gönderin.

13. Real-Time PCR kullanarak transkript analizi

  1. Parazitlerin Percoll / Sorbitol saflaştırılması ve senkronizasyonu
    1. Her biri %3'lik 3 mL'lik sıralı katmanlama ve ardından 15 mL'lik konik bir tüpte %40 percoll/sorbitol çözeltileri ile bir Percoll/Sorbitol Gradyanı39,40 hazırlayın.
    2. Gradyanın üzerine, ağırlıklı olarak WT ve CDPK1 T145M'nin şizon evresi parazitini içeren 1-2 mL parazit kültürünü nazikçe katmanlayın.
    3. Sallanan bir kova rotorunda santrifüjde 2,300'e ayarlanmış ivmeyi 15'e ayarlayarak gradyanı RT'de 4 x g'de santrifüjleyin.
    4. Parazitin trofozoit ve şizont aşamalarını içeren orta halkayı, 50 mL'lik taze bir konik tüpte gradyan arayüzünden toplayın.
    5. Parazitleri eşit hacimde 9: 1 (cRPMI: 10xPBS) ekleyerek yıkayın, ardından parazitleri peletlemek için 994 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
    6. Peleti tekrar 19:1 (cRPMI:10xPBS) solüsyonla yıkayın, ardından 994 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
    7. Her bir parazit peletini% 2 hematokrit (37 ° C'de önceden inkübe edilmiş) içeren cRPMI içeren ayrı şişelere ekleyin. Merozoitlerin zenginleştirilmiş şizontlardan taze RBC'lere istilasına izin vermek için şişeleri yukarıda adım 9.1'de açıklanan koşullar altında 4 saat inkübe edin.
    8. 4 saat sonra, yüksek derecede senkronize 0 - 4 saat halka aşaması parazitleri elde etmek için parazitleri yukarıda 9.2-9.4 adımlarında açıklandığı gibi sorbitol ile tedavi edin.
    9. Parazitin 44 - 48 saatlik şizont aşamasını elde etmek için sorbitol tedavisinden sonra senkronize parazitleri 44 saat inkübe edin.
  2. Hem WT hem de CDPK1 T145M parazitlerinin şizontlarından RNA izolasyonu
    1. WT ve CDPK1 T145M parazitlerini istiladan 44-48 saat sonra hasat edin. Parazit peletlerini 1x PBS ile 994 x g'da 5 °C'de 4 dakika yıkayın.
    2. Parazit peletlerini 1 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve adım 11.2.1'de açıklandığı gibi çevredeki RBC'leri parçalamak için saponin ile muamele edin.
    3. Parazit peletini 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi içinde yeniden süspanse edin ve daha sonraki işlemlere kadar -80 °C'de saklayın.
    4. Nükleoprotein komplekslerinin tamamen ayrışması için donmuş peleti 15-30 °C'de çözdürün.
    5. Her mL RNA ekstraksiyon reaktifi başına 200 μL kloroform ekleyin ve tüpleri 15 saniye boyunca elle kuvvetlice çalkalayın. RT'de 2-3 dakika inkübe edin.
    6. Karışımı 16.200 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. RNA yalnızca renksiz üst sulu tabakada kalacaktır. Üreticinin talimatlarına göre bir kit kullanarak RNA'yı izole edin.
  3. WT ve CDPK1 T145M parazitinin RNA'sından cDNA sentezi
    1. RNA içeren numuneleri, kirletici DNA'yı çıkarmak için üreticinin talimatlarını izleyerek bir DNA çıkarma kiti ile tedavi edin.
    2. Üreticinin protokolüne göre bir cDNA Sentez kiti kullanarak izole edilmiş RNA örneklerinden cDNA'yı sentezleyin. Ters transkripsiyon işlemi için oligo-dT primerleri yerine rastgele heksamer primerleri kullanıyoruz.
    3. cDNA hazırlığı sırasında saflaştırılmış RNA'dan genomik DNA kontaminasyonunun taşınmasını dışlamak için cDNA hazırlığı için kullanılan her RNA numunesi için NO-RT (ters transkriptaz enzimi eklenmeden kurulan reaksiyonlar) kontrollerinden emin olun.
    4. Genomik DNA kontaminasyonunu ekarte etmek için tam uzunlukta cdpk1 geni gibi araya giren bir tronik dizi içeren herhangi bir gen segmentini amplifiye ederek cDNA'yı test edin. Adım 1.1.1'de açıklandığı gibi PCR koşulunu kullanın.
  4. WT ve CDPK1 T145M parazitinin transkript ekspresyon analizi
    1. Gerçek zamanlı PCR aracılığıyla 11 farklı genin transkript ekspresyon analizini yapmak için WT ve CDPK1 T145M parazitlerinden hazırlanan cDNA'yı kullanın. 11 hedef gen, CDPK ailesinin 7 üyesini ve RBC invazyonunda yer alan 4 kinazı içerir (gerçek zamanlı PCR için kullanılan genler ve karşılık gelen primerler için Tablo 2'ye bakınız).
    2. Astar sentez yazılımını kullanarak astarlar tasarlayın. Benzer erime sıcaklıklarına sahip gene özgü primerler kullanarak seçilen her genin yaklaşık 120 bp'sini amplifiye edin.
    3. Bir ön karışım kullanarak hedef genleri amplifiye edin ve aşağıdaki döngü parametrelerini kullanarak plakayı gerçek zamanlı bir PCR sisteminde çalıştırın: 3 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon, ardından 10 saniye boyunca 95 ° C'de 40 döngü denatürasyon, 20 saniye boyunca 52 ° C'de tavlama ve 30 saniye boyunca 62 ° C'de uzatma.
    4. İki temizlik geni, gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) ve treonin tRNA ligaz (ThrRS)32 kullanarak her genin ekspresyon seviyesini normalleştirin. WT kontrolüne kıyasla CDPK1 T145M parazitindeki her bir hedef kinazın nispi ekspresyonunu hesaplayın.
    5. R istatistiksel analiz paketini kullanarak istatistiksel analizi gerçekleştirin. Alternatif olarak, başka bir analiz yazılımı kullanın.
      NOT: RNA-Seq veya mikroarray gibi global transkriptomik yöntemler, mutant parazitlerde WT'ye kıyasla transkriptom yeniden kablolamasının daha geniş bir görünümünü elde etmek için üstün yaklaşımlardır.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant WT CDPK1, N-terminal Glutatyon S-transferaz (GST) etiketine sahip bir füzyon proteini olarak eksprese edilir ve GST afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılır. Saflaştırılmış CDPK1 proteini, anti-CDPK1 ve anti-GST antikorları kullanılarak Western blot yoluyla tespit edildi (Şekil 1). WT CDPK1'deki treonin bekçi kalıntısı (T145), sırasıyla CDPK1T145M ve CDPK1T145S mutant rekombinant proteinler üretmek için bölgeye yönelik mutajenez kullanılarak Met ve Ser ile değiştirildi (Şekil 2). Tüm rekombinant CDPK1 proteinlerinin kinaz aktivitesini değerlendirmek için in vitro kinaz testi yapıldı. Kinaz aktivitesi, Western blot formatında spesifik bir antikor kullanılarak tiyo-fosfat ester grubunu tespit ederek yarı sentetik bir epitop etiketleme yaklaşımı34 kullanılarak test edildi (Şekil 3). Kapı bekçisi ikamesinin CDPK1'in otofosforilasyon aktivitesi ve CDPK1'in eksojen bir substratı olarak kullanılan MBP'nin transfosforilasyonu üzerindeki etkisi, ilgili otofosforilasyon ve transfosforilasyon bantlarının yoğunluğunun ölçülmesiyle değerlendirildi. Metiyonin kapı bekçisine sahip mutant CDPK1, ~% 53 transfosforilasyon aktivitesini korurken, kapı bekçisi konumunda bir serin varlığı, substrat transfosforilasyonunun tamamen kaldırılmasına yol açtı (Şekil 3). Thr'den Met'e (T145M) kapı bekçisi ikamesine yol açan SNP'ler, iki plazmit sistemi kullanılarak CRISPR-Cas9 aracılığıyla endojen cdpk1 lokusunda tasarlandı (Şekil 4 ve Şekil 5). T145S ikamesi ile mutant parazitler, muhtemelen Ser kapı bekçisinin CDPK1 aktivitesi üzerindeki ölümcül etkisi nedeniyle üretilemedi. CDPK1T145M mutant parazitler, sınırlayıcı seyreltme yöntemi kullanılarak alt klonlandı ve kapı bekçisi ikamesi, CDPK1T145M mutant parazitin oluşumunu doğrulamak için Sanger dizilemesi yoluyla doğrulandı. CDPK ailesinin 7 üyesi ve parazitin geç şizogonik gelişiminde yer alan diğer 4 kinaz dahil olmak üzere 11 farklı kinazın transkript seviyeleri gerçek zamanlı PCR kullanılarak test edildi (Şekil 6). 11 farklı kinazın ekspresyon seviyeleri, temizlik genlerine normalize edilmiş CDPK1T145M mutant ve vahşi tip (WT) parazitler arasında karşılaştırıldı. CDPK aile üyelerinin transkript ekspresyonu, WT parazitine kıyasla CDPK1T145M mutantında değiştirildi (Şekil 6). CDPK1T145M mutantında daha yüksek ekspresyon gösteren transkriptler, CDPK1T145M mutant parazitinde CDPK1'in işlevini telafi ediyor olabilir.

figure-results-1
Şekil 1: Tam uzunlukta rekombinant vahşi tip (WT) PfCDPK1'in karakterizasyonu. N-terminal Glutatyon S transferaz (GST) etiketi ile kaynaşmış tam uzunlukta WT CDPK1 proteini afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve SDS-PAGE'de ayrıldı. CDPK1, Coomassie Brilliant Blue R-250 lekeli poliakrilamid jelde gösterildiği gibi ~ 87 kDa'lık tahmin edilen moleküler kütleye göç etti. SDS-PAGE'de ayrılan rekombinant protein, bir PVDF membranına aktarıldı ve anti-CDPK1 ve anti-GST antikorları ile Western blot analizi için işlendi. SDS-PAGE'deki tam uzunlukta rekombinant CDPK1'e karşılık gelen bant, her iki antikorla da tespit edildi ve proteinin kimliğini doğruladı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Saflaştırılmış rekombinant CDPK1 geçit bekçisi mutant proteinlerinin karakterizasyonu. (A) TgCDPK1 ve PfCDPK1'in birincil amino asit dizisinin hizalanması (Plasmodb erişim no. PF3D7_0217500). PfCDPK1'in 145 pozisyonundaki treonin, TgCDPK128'deki kapı bekçisi pozisyonu olan glisin 1'e karşılık gelir (kırmızıyla vurgulanmıştır). (B) WT CDPK1'de üçlü kodon ACC (siyah daire) tarafından kodlanan Thr kapı bekçisi kalıntısının (kırmızıyla vurgulanmıştır) karikatürist temsili. CDPKT145M'da Met (sarı ile vurgulanmış) ve CDPKT145S'de Ser (mavi ile vurgulanmıştır) ile rekombinant mutant CDPK1 proteinleri oluşturmak için kapı bekçisi kalıntısının bölgeye yönelik mutajenez ile ikame edilmesi. (C) CDPK1'in rekombinant WT ve mutant proteinlerinin SDS-PAGE profili. Rekombinant WT ve kapı bekçisi mutant proteinleri, GST afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve SDS-PAGE'de ayrıldı. Tüm rekombinant proteinler, ~ 87 kDa'lık beklenen moleküler ağırlığa uygundur. M- moleküler ağırlık merdiveni. (D) Rekombinant CDPK1 WT ve mutant proteinlerin Western blotlama yoluyla karakterizasyonu. CDPK1'in rekombinant WT ve gatekeeper mutant proteinleri SDS-PAGE'de ayrıldı ve Western blotlama için PVDF membranına aktarıldı. SDS-PAGE'deki tam uzunlukta rekombinant WT ve mutant CDPK1 proteinlerine karşılık gelen bantlar, anti-CDPK1 ve anti-GST antikorları ile tespit edildi ve tüm rekombinant proteinlerin kimliğini doğruladı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: CDPK1'deki Gatekeeper ikamesi, mutant enzimlerin kinaz aktivitesinde bir azalmaya yol açar. (A) CDPK1 proteininin kinaz aktivitesini tespit etmek için yarı sentetik epitop etiketleme yaklaşımının karikatürist temsili. Burada sadece transfosforilasyon aktivitesi gösterilmiştir. CDPK1 proteini tiyofosforilatları, aktarılabilir bir terminal tiyofosfat grubu kaynağı olan ATPγS (katı sarı üçgen) varlığında dışsal bir substratı (S, katı yeşil kare) içerir. Tiyofosforile kalıntı, p-nitrobenzil mesilat (PNBM) ile muamele edilerek alkillenir ve daha sonra alkillenmiş tiyofosfat eklentisini spesifik olarak tanıyan bir antikor ile tespit edilen bir tiyofosfat ester oluşturur. (B) İn vitro kinaz aktivite testi, kapı bekçisi ikamesinin rekombinant CDPK1 mutant proteinlerinin otofosforilasyonu ve transfosforilasyon potansiyeli üzerindeki etkisini test etmek için yarı sentetik bir epitop etiketleme yaklaşımı kullanılarak kullanıldı. Tüm rekombinant proteinler kalsiyuma bağımlı kinaz aktivitesi gösterir. CDPK1'in oto-fosforilasyonu ve eksojen bir substrat olan miyelin bazik proteininin (MBP) trans-fosforilasyonu, yalnızca kalsiyum klorür (Ca2 +) varlığında belirgindi, ancak Ca2 + iyonlarının spesifik bir şelatörü olan EGTA varlığında fosforilasyon tespit edilmedi. Kapı bekçisi mutantları, azalmış otofosforilasyon aktivitesi gösterirken, MBP'nin transfosforilasyonu CDPK1T145S yılında tamamen iptal edildi. CDPK1T145M, daha önce bildirildiği gibi transfosforilasyon potansiyelini (~ S) korur32. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: CRISPR-Cas9 kullanılarak cdpk1 lokusunda kapı bekçisi konumunda SNP'leri tanıtmak için plazmitlerin yapımı. 432 ila 451 bp'ye karşılık gelen 20 nükleotidlik bir kılavuz dizisi, pL6CK1G oluşturmak için pL6eGFP plazmidindeki BtgZI kısıtlama bölgesinde klonlandı. İstenen SNP'leri (T145M veya T145S, yeşil ile gösterilen karşılık gelen kodon) ve kalkan mutasyonlarını (kırmızı ile gösterilmiştir) içeren bir homoloji kolu (421 bp), sırasıyla pL6CK1GT145M ve pL6CK1GT145M oluşturmak için AflII ve SpeI kısıtlama enzim bölgeleri içinde pL6CK1G'de klonlandı. Kalkan mutasyonları, istenen düzenlemeden sonra değiştirilmiş lokusun yeniden kesilmesini önler. İkinci bir plazmidde kodlanan Cas9 endonükleaz olan pUF1, pL6CK1GT145M/S plazmidinden eksprese edilen kılavuz RNA yardımıyla cdpk1 lokusu içindeki hedef bölgeye yönlendirilir. Cas9, hedef bölgede PAM dizisinin 5 'tarafına doğru çift iplikçik kopması sağlar. DSB, pL6CK1GT145M/S plazmidindeki homoloji kolu kullanılarak onarılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: P'nin şematik gösterimi. cdpk1 lokusunda kapı bekçisi mutasyonunun (T145M) tanıtılması için CRISPR plazmitleri ile falciparum transfeksiyonu. i) Asenkron P. Falciparum kültürü, senkronize halka aşamalı parazitler elde etmek için sorbitol ile muamele edilir. ii) Senkronize halka aşamalı parazitler, tampon çözelti içinde yeniden süspanse edilmiş pL6CK1GT145M/S ve pUF1 plazmitleri ile birlikte bir elektroporasyon küvetine alınır. iii) Parazitler 310 volt, 950 μF ve sonsuz dirençte elektropore edilir. iv) Transfeksiyonu takiben, parazitler taze tam RPMI ortamı (cRPMI) içeren bir T25 şişesine aktarılır ve 48 saat boyunca kültürlenir. 48 saat sonra, transfekte edilen parazitler, WR99210 ve DSM267 ilaçları ile desteklenmiş cRPMI'ye geçirilir ve T75 şişesinde genişletilir. v) 14. günde slaytlar hazırlanır ve Giemsa boyası kullanılarak boyanır. vi) Daha sonra, parazitleşmiş eritrositlerin varlığını değerlendirmek için kan yayması bir ışık mikroskobu altında görüntülenir. vii) Görselleştirme üzerine, parazitlerin ilaçların varlığında büyümesine izin verilir. Daha sonra, parazitler, hedef cdpk1 lokusunun istenen modifikasyonunun doğrulanması için PCR ve DNA dizilimi şablonunu elde etmek üzere işlenir. viii) Doğrulamayı takiben, 96 oyuklu bir plakada sınırlayıcı seyreltme ayarlanarak klonal transgenik parazitler elde edilir. ix) Pozitif kuyucuklardan klonal transgenik parazitler T25 şişelerine aktarılır ve büyümelerine izin verilir. x) Klonal transgenik parazitler, DNA dizilimi ve kromatogramın analizi yoluyla PCR ve kapı bekçisi konumunda istenen SNP'lerin varlığı yoluyla daha da doğrulanır. Şekil32'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) yoluyla hedef genlerin transkript analizi için kullanılan adımların şematik gösterimi. i ) S. Ağırlıklı olarak olgun Schizon evre parazitleri olan Falciparum kültürü, aynı döngüde sorbitol tedavisi ile elde edilir. ii) Parazitler, olgun şizont evre parazitlerin zenginleştirilmesi için 15 mL'lik bir konik tüp içinde 70/40 Percoll / sorbitol gradyanı üzerine nazikçe katmanlanır. iii) @ ve p kişisel / sorbitol interfazındaki siyah renkli halka, 50 mL'lik taze bir tüpe aktarılır, işlenir ve cRPMI'de yeniden süspanse edilir. Şizont evresinde zenginleştirilmiş parazitler, istila için 37 ° C'de önceden inkübe edilmiş taze RBC'ler ile inkübe edilir. iv) Parazitler 4 saat boyunca kültürlenir ve daha sonra yüksek oranda senkronize 0-4 saat halka aşamalı parazitler elde etmek için% 5 sorbitol ile muamele edilir. v) Parazitler, yüksek derecede senkronize 44-48 saat şizont evre parazitleri elde etmek için sorbitol sonrası 44 saatlik ek bir tedavi için daha fazla kültürlenir. vi) Senkronize parazitler, RBC'lerden serbest bırakılması için saponin ile muamele edilir ve RNA ekstraksiyon reaktifinde saklanır. Toplam RNA, RNA ekstraksiyonu yeniden askıya alınmış parazitlerden izole edilir. vii) cDNA, izole edilen RNA'dan hazırlanır. viii) Gene özgü primerler kullanılarak hedef genleri amplifiye etmek için cDNA şablonuyla gerçek zamanlı bir PCR deneyi kurulur. Plaka, gerçek zamanlı bir PCR sistemi üzerinde çalıştırılır. ix) Transkript ifade verileri bir analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Grafik, CDPK1 T145M parazitlerinde vahşi tipe (WT) kıyasla 11 kinazın diferansiyel transkript ekspresyon seviyelerini temsil etmektedir. Bu rakam32'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gen adıAstar dizisi
Pk1fpgexATGCGCGGATCCATGGGTGTGTTCACAAAGTTCAAACG
Pk1rpgexATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCAAATTTTGTGCATC
Ck1T145S SerisiGTTTGATGTTTTTGAAGATAAATATTTTTTTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145S_antisenseTTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC
CK1T145MGTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAATATATTTTTTTTTATTTAGTAATTGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145M_antisenseTTCCCCACCTTCATAAAATTATTACTAAAAAATATCTTATCTTCAAAAACATCAAAC
Ck1GUIDEFWDTAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA
Ck1GUIDEREVTTCTAGCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA
ck1f1 ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG
CK1R3WTTGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG

Tablo 1: Çalışmada Kullanılan Primerlerin Listesi.

Gen Adıİleri AstarTers Astar
CDPK1 (PF3D7_0217500)GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATCATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT
CDPK2 (PF3D7_0610600)GGAACAGGAGAATTTACAACGACTGTATACATAATAACACCACTAGACCAG
CDPK3 (PF3D7_0310100)CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGGCAGCGTCCATTGTAAG
ACATCTTTTTATTAAATC
CDPK4 (PF3D7_0717500)ATACTTCTCTCAGGGTGCCCCTTATCACTAATTTTTTT
GAATTGTGGTAAATCG
CDPK5 (PF3D7_1337800)GGAGGTCGAAGATATGGATAÇGAATAGTATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG
CDPK6 (PF3D7_1122800)CCTCCCGTAGATAAGAATATATTATCTATCGATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC
CDPK7 (PF3D7_1123100)AGTCCTAAAAAAGATATA
TAAAGAACTAGGTAGTAG		TTTAAAAATAATCTTTCCCCACCACCC
PKA (PF3D7_0934800)AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGGCTTTTGTTTCTTCTTAAA
AATGTAAAAAATTCTCC
Paket (PF3D7_1436600)AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGCCATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC
PKB (PF3D7_1246900)CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACGGAGAGCGCAATTAGCCATATTG
PI3K (PF3D7_0515300)CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAGATCACATTTGTTATACTT
ATTATCATCACATTTGTT
GAPDH (PF3D7_1462800)GGAAGGAAAGATATCGAAGTAGGGGTTACCTCACATGG
ThrRS (PF3D7_1126000)CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTTTAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC

Tablo 2: Gerçek zamanlı PCR analizi için kullanılan primerlerin dizisi ile birlikte hedef genlerin listesi (PlasmoDB kimlik numarası).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CDPK1'in hipomorfik bir alelini içeren mutant bir transgenik parazitin oluşturulması, rekombinant enzimlerle in vitro kinaz aktivite verilerine dayanmaktadır. Mümkün olduğu kadar çok sayıda mutant rekombinant protein üretmek daha iyidir. P. falciparum genomu oldukça AT açısından zengin olduğundan, E'de rekombinant proteinlerin ekspresyonu. Koli, kodon optimizasyonu gerektirebilir. Bu, mutant enzimin kinaz aktivitesi üzerindeki kapı bekçisi ikamesinin kapsamlı bir değerlendirmesine yardımcı olacaktır. Transfosforilasyon potansiyelinin azalmasına neden olan kapı bekçisi ikamesi, bir alelik değişim transgenik paraziti oluşturmak için seçilir. Buna paralel olarak, kinazın transfosforilasyon aktivitesini tamamen ortadan kaldıran bir kapı bekçisi ikamesi, negatif bir kontrol olarak alınmalıdır. Alelik değişim parazitini oluştururken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önemli husus, test mutasyonu ve negatif kontrol ile birlikte eşanlamlı bir mutasyonun tanıtılmasıdır. cdpk1 lokusunda eşanlamlı bir mutasyon içeren parazitin üretilmesi, test mutasyonunu tanıtırken herhangi bir teknik hatayı ekarte etmek için önemli bir iç kontrol görevi görür. Ayrıca, eşanlamlı mutasyon taşıyan transgenik parazit, WT paraziti yerine tüm karşılaştırmalı çalışmalar için bir kontrol olarak kullanılabilir.

Kapı bekçisi mutant parazit 32,35'i oluşturmak için iki plazmidli bir sistem kullandık. Bununla birlikte, SNP'nin hedef lokusa sokulmasının etkinliği, iki plazmit sistemi yerine tek bir plazmit sistemi kullanılarak arttırılabilir41. Tek plazmit sisteminde, CRISPR-Cas9 aracılı gen düzenlemesi için gerekli olan tüm kritik elementler iki yerine tek bir plazmide dahil edilir. Tek plazmit, Cas9 endonükleazını kodlar, tracrRNA ve kılavuz RNA'dan oluşan sgRNA'yı kopyalar ve hedef bölgede Cas9 endonükleaz tarafından sokulan çift iplikli kopmanın onarımı için bir homoloji kolu içerir. İki plazmit sisteminde, parazitler her iki plazmit ile birlikte transfekte edilir. İki plazmit sisteminde her iki plazmiti aynı anda alan parazitlerin sayısı, tek plazmit sistemine kıyasla düşük olacağından, bu nedenle, CRISPR aracılı gen düzenlemenin etkinliği, iki plazmit sisteminde tek plazmit sistemine kıyasla daha düşüktür. Alternatif olarak, homoloji kolunun doğrusal bir fragman olarak veya bir ilaç seçim markörü (kurtarma plazmidi) olmayan bir plazmid içinde sağlandığı bir intihar kurtarma stratejisi42 de kullanılabilir. Cas9 endonükleaz ve sgRNA kodlama kılavuzu RNA, bir ilaç seçim kaseti (intihar plazmidi) içeren bir plazmitte sağlanır. İlaç seçim kaseti olmayan doğrusal bir fragman veya plazmitin parazit replikasyonu sırasında kaybolma olasılığı daha yüksek olduğundan, Cas9 endonükleaz tarafından hedef lokusa sokulan çift iplikli kopma, sınırlı bir süre için mevcut olabilen homoloji kolu kullanılarak kolayca onarılmalıdır. Bu stratejinin iki plazmit sistemine göre bazı avantajları vardır, çünkü daha verimlidir ve homoloji kolunu farklı bir plazmitte alt klonlamaya gerek yoktur. CRISPR-Cas9 gen düzenlemesinin diğer varyasyonları da hedef lokus43'te SNP'yi tanıtmak için düşünülebilir.

cdpk1 lokusunda T145M ikamesini tanıtmak için kılavuz bölgeyi manuel olarak seçtik. Chopchop 44, CRISPOR45, CCTop46, Cas-OFFinder47 gibi ücretsiz olarak kullanılabilen çeşitli çevrimiçi yazılımlar kullanılarak hedef lokusta çift iplikli kopmayı tanıtmak için uygun bir kılavuz dizisi seçilebilir. Bu yazılımlar, her bir kılavuz dizisinin verimliliğini sağlamanın yanı sıra, CRISPR-Cas9 aracılı bir gen düzenleme deneyinin başarı oranını artıran hedef dışı ve özgüllük puanlarını da sağlar.

Sıtma parazitlerinin transfeksiyonu için farklı yöntemler mevcuttur. Transfeksiyon deneyleri için halka aşamalı parazitler kullanıyoruz48,49, ancak RBC'lerin plazmitlerle ön yüklenmesi de parazit transfeksiyon çalışmaları50 için başarıyla kullanılmıştır. Bu yöntemde, RBC'ler, elektroporasyon yoluyla belirli bir parametre seti altında plazmitlerle transfekte edilir ve daha sonra saflaştırılmış geç evre parazitlerle enfeksiyon için kullanılır. Parazitler, plazmitlerle önceden yüklenmiş RBC'leri istila eder. Plazmitlerle önceden yüklenmiş RBC'ler içindeki büyümeleri sırasında, parazit bilinmeyen bir mekanizma50 yoluyla plazmit DNA'sını alır. Plazmitlerle doğrudan transfeksiyon için çok olgun saflaştırılmış şizon evre parazitler gerektiren parazit transfeksiyonu için kullanılabilecek başka bir yöntem daha vardır. Saflaştırılmış şizontların transfeksiyonu için kullanılan alet 4D-nükleofektör51'dir. Bir transfeksiyon yönteminin seçimi, mevcut kaynaklara ve başarı oranına bağlı olarak farklı araştırma grupları arasında değişir. Bir grup için üç yöntemden hangisinin işe yaradığını kontrol etmek ve bunu sonraki transfeksiyon deneyleri için kullanmak iyi bir fikirdir. Transfeksiyon etkinliğini daha da artırmak için iki yöntem ardışık olarak uygulanabilir. Örneğin, ilk transfeksiyon adımı, halka aşamalı parazitleri ve ardından plazmitlerle önceden yüklenmiş taze RBC'lerin eklenmesini kullanabilir.

CDPK1T145M parazitlerde transkript analizi için önceki literatüre veya CDPK ailesinin üyelerinin varlığına dayanan kontrole kıyasla sadece birkaç gen seçtik. Bununla birlikte, CDPK1'in hipomorfik bir alelini içeren transgenik parazitte küresel transkripsiyonel yeniden kablolamanın kapsamlı bir görünümünü elde etmek için RNA-Seq veya mikrodizi gibi yaklaşımlar kullanılabilir.

Bu çalışmada kullanılan yöntem, ilaç baskısı altında telafi edici mekanizmaların gelişimini anlamak için sıtma parazitinin diğer kinazlarına da uygulanabilir. Bu teknikle elde edilen bilgiler, ilaç direncinin gelişmesini ve yayılmasını önlemek için kombinasyon ilaçlarının stratejik olarak konuşlandırılmasında yararlı olabilir. Fonksiyonel tamamlama gösteren iki veya birden fazla kinazları hedeflemek, sıtma kontrolü ve eliminasyonu için tek tek kinazları hedeflemekten daha iyi bir stratejidir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkezi Enstrümantasyon Tesisi, Yaşam Bilimleri Okulu, JNU aracılığıyla sağlanan destek ve tesisleri kabul ediyoruz. Biyoteknoloji Bölümü'nden (BT/PR28256/MED/29/1313/2018) AB'ye mali destek de minnetle kabul edilmektedir. Jose-Juan Lopez-Rubio'ya pL6eGFP ve pUF1 plazmitlerini sağladığı için teşekkür ederiz. Finansman kuruluşunun, çalışmanın hazırlanmasında ve yayınlanması kararında hiçbir rolü yoktur. MS, Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi'nden JRF-SRF Bursu sahibidir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x fosfat inhibitörü kokteyliSigma-Aldrich04906 845001
AflIINEBR0520S
Albumax II Gibco11021-037
Anti-GST antikoruThermoFisher ScientificG7781
Anti-Fare HRPSigma-AldrichA4416
Anti-Tavşan HRPSigma-AldrichA6154
BamHINEBR3136S
BtgZ1NEBR0703S
SantrifüjThermoFisher ScientificSorvall legend micro 17R
Santrifüj (Bakteri hücresini peletlemek için)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R
Santrifüj (Paraziti peletleme/işlemek için)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnINEBRO1765
D-Sorbitol Sigma-AldrichS1876
E. coli BLR(DE3) pLysS yetkin hücrelerSigma-Aldrich69956
E. coli DH5a Yetkin HücrelerTakara Bio9057
Elektroporasyon Küvetleri, 0,2 cm boşlukBioRad1652086
ElektroporatörBioRadGenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP kemilüminesan reaktifG-Bioscience7860-003
GentamisinThermoFisher Scientific15750078
Giemsa LekeHimediaS011-100ML
Glutatyon Sefaroz 4BGE Sağlık17075601
HEPES, Serbest AsitMerck391338
HipoksantinMerck4010CBC
İnfüzyon HD klonlama KitiTakara Bio1711641A
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708880EDU
MBP, fosforillenmiş  Merck13-110
NotINEBR3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF   Takara Bio740424
NucleoSpin Jel ve PCR temizleme Mini kitiTakara Bio740609
PercollGE Healthcare17-0891-01
p-nitrobenzil mesilat (PNBM)AbcamAb138910
Primestar Max DNA PolimerazTakara BioR045A
Proteaz inhibitörü kokteyliRoche
Qiaprep Spin Miniprep Kiti Qiagen27106
QuikChange II XL siteye yönelik mutajenez kitiAgilent200521
RNeasy Mini kitiQiagen74104
RPMI-1640ThermoFisher Scientific31800-105
SaponinSigma-Aldrich47036
Sodyum BikarbonatSigma-AldrichS5761
SpeI-HFNEBR3133S
SuperScript III Birinci İplikli Sentez kitiThermoFisher Scientific18080-051
T4 DNA LigazThermoFisher Scientific15224017
Tiyofosfat ester antikoruAbcamAb92570
11836170001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Malaria Report 2023. , World Health Organization. Geneva. (2023).">World Health Organization. World Malaria Report 2023. , World Health Organization. Geneva. (2023).
  2. Emergence, transmission dynamics and mechanisms of artemisinin partial resistance in malaria parasites in Africa. Nat Rev Microbiol. 22 (6), 373-384 (2024).">Rosenthal, P. J., Asua, V., Conrad, M. D. Emergence, transmission dynamics and mechanisms of artemisinin partial resistance in malaria parasites in Africa. Nat Rev Microbiol. 22 (6), 373-384 (2024).
  3. The emergence of artemisinin partial resistance in Africa: how do we respond. Lancet Infect Dis. S1473-3099 (24), 00141-00145 (2024).">Rosenthal, P. J., et al. The emergence of artemisinin partial resistance in Africa: how do we respond. Lancet Infect Dis. S1473-3099 (24), 00141-00145 (2024).
  4. The clinical impact of artemisinin resistance in Southeast Asia and the potential for future spread. FEMS Microbiol Rev. 41 (1), 34-48 (2017).">Woodrow, C. J., White, N. J. The clinical impact of artemisinin resistance in Southeast Asia and the potential for future spread. FEMS Microbiol Rev. 41 (1), 34-48 (2017).
  5. Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum. Lancet Infect Dis. 14 (6), 449-450 (2014).">Amaratunga, C., Witkowski, B., Khim, N., Menard, D., Fairhurst, R. M. Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum. Lancet Infect Dis. 14 (6), 449-450 (2014).
  6. CDPKs: The critical decoders of calcium signal at various stages of malaria parasite development. Comput Struct Biotechnol J. 19, 5092-5107 (2021).">Sharma, M., et al. CDPKs: The critical decoders of calcium signal at various stages of malaria parasite development. Comput Struct Biotechnol J. 19, 5092-5107 (2021).
  7. A plant-like kinase in Plasmodium falciparum regulates parasite egress from erythrocytes. Science. 328 (5980), 910-912 (2010).">Dvorin, J. D., et al. A plant-like kinase in Plasmodium falciparum regulates parasite egress from erythrocytes. Science. 328 (5980), 910-912 (2010).
  8. Calcium-dependent protein kinase 5 is required for release of Egress-specific organelles in Plasmodium falciparum. mBio. 9 (1), e00130-e00218 (2018).">Absalon, S., et al. Calcium-dependent protein kinase 5 is required for release of Egress-specific organelles in Plasmodium falciparum. mBio. 9 (1), e00130-e00218 (2018).
  9. Regulation of Plasmodium falciparum development by calcium-dependent protein kinase 7 (PfCDPK7). J Biol Chem. 289 (29), 20386-20395 (2014).">Kumar, P., et al. Regulation of Plasmodium falciparum development by calcium-dependent protein kinase 7 (PfCDPK7). J Biol Chem. 289 (29), 20386-20395 (2014).
  10. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 4 is critical for male gametogenesis and transmission to the mosquito vector. mBio. 12 (6), e0257521(2021).">Kumar, S., et al. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 4 is critical for male gametogenesis and transmission to the mosquito vector. mBio. 12 (6), e0257521(2021).
  11. A specific inhibitor of PfCDPK4 blocks malaria transmission: chemical-genetic validation. J Infect Dis. 209 (2), 275-284 (2014).">Ojo, K. K., et al. A specific inhibitor of PfCDPK4 blocks malaria transmission: chemical-genetic validation. J Infect Dis. 209 (2), 275-284 (2014).
  12. Transmission of malaria to mosquitoes blocked by bumped kinase inhibitors. J Clin Inves. 122 (6), 2301-2305 (2012).">Ojo, K. K., et al. Transmission of malaria to mosquitoes blocked by bumped kinase inhibitors. J Clin Inves. 122 (6), 2301-2305 (2012).
  13. Multiple short windows of calcium-dependent protein kinase 4 activity coordinate distinct cell cycle events during Plasmodium gametogenesis. Elife. 6, e26524(2017).">Fang, H., et al. Multiple short windows of calcium-dependent protein kinase 4 activity coordinate distinct cell cycle events during Plasmodium gametogenesis. Elife. 6, e26524(2017).
  14. The motor complex of Plasmodium falciparum: phosphorylation by a calcium-dependent protein kinase. J Biol Chem. 283 (45), 30980-30989 (2008).">Green, J. L., et al. The motor complex of Plasmodium falciparum: phosphorylation by a calcium-dependent protein kinase. J Biol Chem. 283 (45), 30980-30989 (2008).
  15. Phosphorylation of Rhoptry protein RhopH3 is critical for host cell invasion by the malaria parasite. mBio. 11 (5), e00166-e00220 (2020).">Ekka, R., Gupta, A., Bhatnagar, S., Malhotra, P., Sharma, P. Phosphorylation of Rhoptry protein RhopH3 is critical for host cell invasion by the malaria parasite. mBio. 11 (5), e00166-e00220 (2020).
  16. PfCDPK1 mediated signaling in erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Nat Commun. 8 (1), 63(2017).">Kumar, S., et al. PfCDPK1 mediated signaling in erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Nat Commun. 8 (1), 63(2017).
  17. Characterization of Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 1 (PfCDPK1) and its role in microneme secretion during erythrocyte invasion. J Biol Chem. 288 (3), 1590-1602 (2013).">Bansal, A., et al. Characterization of Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 1 (PfCDPK1) and its role in microneme secretion during erythrocyte invasion. J Biol Chem. 288 (3), 1590-1602 (2013).
  18. Calcium-dependent phosphorylation of Plasmodium falciparum serine repeat antigen 5 triggers merozoite egress. J Biol Chem. 293 (25), 9736-9746 (2018).">Iyer, G. R., et al. Calcium-dependent phosphorylation of Plasmodium falciparum serine repeat antigen 5 triggers merozoite egress. J Biol Chem. 293 (25), 9736-9746 (2018).
  19. Phosphoproteomics reveals malaria parasite Protein Kinase G as a signalling hub regulating egress and invasion. Nat Commun. 6, 7285(2015).">Alam, M. M., et al. Phosphoproteomics reveals malaria parasite Protein Kinase G as a signalling hub regulating egress and invasion. Nat Commun. 6, 7285(2015).
  20. Phosphorylation-dependent assembly of a 14-3-3 mediated signaling complex during red blood cell invasion by Plasmodium falciparum merozoites. mBio. 11 (4), e01287-e01320 (2020).">More, K. R., et al. Phosphorylation-dependent assembly of a 14-3-3 mediated signaling complex during red blood cell invasion by Plasmodium falciparum merozoites. mBio. 11 (4), e01287-e01320 (2020).
  21. PfCDPK1 is critical for malaria parasite gametogenesis and mosquito infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (4), 774-779 (2018).">Bansal, A., et al. PfCDPK1 is critical for malaria parasite gametogenesis and mosquito infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (4), 774-779 (2018).
  22. Development of a chemical genetic approach for human aurora B kinase identifies novel substrates of the chromosomal passenger complex. Mol Cell Proteomics. 11 (5), 47-59 (2012).">Hengeveld, R. C., et al. Development of a chemical genetic approach for human aurora B kinase identifies novel substrates of the chromosomal passenger complex. Mol Cell Proteomics. 11 (5), 47-59 (2012).
  23. Design of allele-specific inhibitors to probe protein kinase signaling. Curr Biol. 8 (5), 257-266 (1998).">Bishop, A. C., et al. Design of allele-specific inhibitors to probe protein kinase signaling. Curr Biol. 8 (5), 257-266 (1998).
  24. Targeting the gatekeeper residue in phosphoinositide 3-kinases. Bioorg Med Chem. 13 (8), 2825-2836 (2005).">Alaimo, P. J., Knight, Z. A., Shokat, K. M. Targeting the gatekeeper residue in phosphoinositide 3-kinases. Bioorg Med Chem. 13 (8), 2825-2836 (2005).
  25. A second-site suppressor strategy for chemical genetic analysis of diverse protein kinases. Nat Methods. 2 (6), 435-441 (2005).">Zhang, C., et al. A second-site suppressor strategy for chemical genetic analysis of diverse protein kinases. Nat Methods. 2 (6), 435-441 (2005).
  26. Toxoplasma gondii calcium-dependent protein kinase 1 is a target for selective kinase inhibitors. Nat Struct Mol Biol. 17 (5), 602-607 (2010).">Ojo, K. K., et al. Toxoplasma gondii calcium-dependent protein kinase 1 is a target for selective kinase inhibitors. Nat Struct Mol Biol. 17 (5), 602-607 (2010).
  27. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).">Lourido, S., et al. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
  28. Inhibition of calcium dependent protein kinase 1 (CDPK1) by Pyrazolopyrimidine analogs decreases establishment and reoccurrence of central nervous system disease by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 60 (24), 9976-9989 (2017).">Rutaganira, F. U., et al. Inhibition of calcium dependent protein kinase 1 (CDPK1) by Pyrazolopyrimidine analogs decreases establishment and reoccurrence of central nervous system disease by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 60 (24), 9976-9989 (2017).
  29. Optimizing small molecule inhibitors of calcium-dependent protein kinase 1 to prevent infection by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 56 (7), 3068-3077 (2013).">Lourido, S., et al. Optimizing small molecule inhibitors of calcium-dependent protein kinase 1 to prevent infection by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 56 (7), 3068-3077 (2013).
  30. Gametogenesis in malaria parasites is mediated by the cGMP-dependent protein kinase. PLoS Biol. 6 (6), e139(2008).">McRobert, L., et al. Gametogenesis in malaria parasites is mediated by the cGMP-dependent protein kinase. PLoS Biol. 6 (6), e139(2008).
  31. The malaria parasite cyclic GMP-dependent protein kinase plays a central role in blood-stage schizogony. Eukaryot Cell. 9 (1), 37-45 (2010).">Taylor, H. M., et al. The malaria parasite cyclic GMP-dependent protein kinase plays a central role in blood-stage schizogony. Eukaryot Cell. 9 (1), 37-45 (2010).
  32. Reduced activity of mutant calcium-dependent protein kinase 1 is compensated in Plasmodium falciparum through the action of protein kinase G. mBio. 7 (6), e02011-e02016 (2016).">Bansal, A., et al. Reduced activity of mutant calcium-dependent protein kinase 1 is compensated in Plasmodium falciparum through the action of protein kinase G. mBio. 7 (6), e02011-e02016 (2016).
  33. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 2 is critical for male gametocyte exflagellation but not essential for asexual proliferation. mBio. 8 (5), e01656-e01717 (2017).">Bansal, A., Molina-Cruz, A., Brzostowski, J., Mu, J., Miller, L. H. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 2 is critical for male gametocyte exflagellation but not essential for asexual proliferation. mBio. 8 (5), e01656-e01717 (2017).
  34. A semisynthetic epitope for kinase substrates. Nat Methods. 4 (6), 511-516 (2007).">Allen, J. J., et al. A semisynthetic epitope for kinase substrates. Nat Methods. 4 (6), 511-516 (2007).
  35. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nat Biotechnol. 32 (8), 819-821 (2014).">Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nat Biotechnol. 32 (8), 819-821 (2014).
  36. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).">Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
  37. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res. 20 (11), 2902(1992).">van den Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res. 20 (11), 2902(1992).
  38. Structure-guided lead optimization of triazolopyrimidine-ring substituents identifies potent Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase inhibitors with clinical candidate potential. J Med Chem. 54 (15), 5540-5561 (2011).">Coteron, J. M., et al. Structure-guided lead optimization of triazolopyrimidine-ring substituents identifies potent Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase inhibitors with clinical candidate potential. J Med Chem. 54 (15), 5540-5561 (2011).
  39. The evolution of the new permeability pathways in Plasmodium falciparum--infected erythrocytes--a kinetic analysis. Exp Parasitol. 114 (4), 253-258 (2006).">Krugliak, M., Ginsburg, H. The evolution of the new permeability pathways in Plasmodium falciparum--infected erythrocytes--a kinetic analysis. Exp Parasitol. 114 (4), 253-258 (2006).
  40. Fractionation of mouse malarious blood according to parasite developmental stage, using a Percoll-sorbitol gradient. Ann Parasitol Hum Comp. 62 (5), 418-425 (1987).">Ginsburg, H., Landau, I., Baccam, D., Mazier, D. Fractionation of mouse malarious blood according to parasite developmental stage, using a Percoll-sorbitol gradient. Ann Parasitol Hum Comp. 62 (5), 418-425 (1987).
  41. Optimized CRISPR-Cas9 genome editing for Leishmania and its use to target a multigene family, induce chromosomal translocation, and study DNA break repair mechanisms. mSphere. 2 (1), e00340-e00416 (2017).">Zhang, W. W., Lypaczewski, P., Matlashewski, G. Optimized CRISPR-Cas9 genome editing for Leishmania and its use to target a multigene family, induce chromosomal translocation, and study DNA break repair mechanisms. mSphere. 2 (1), e00340-e00416 (2017).
  42. A redesigned CRISPR/Cas9 system for marker-free genome editing in Plasmodium falciparum. Parasit Vectors. 9, 198(2016).">Lu, J., et al. A redesigned CRISPR/Cas9 system for marker-free genome editing in Plasmodium falciparum. Parasit Vectors. 9, 198(2016).
  43. CRISPR: a revolutionary tool for genome engineering in the protozoan parasites. , Genome Engineering via CRISPR-Cas9 System, Academic Press. (2020).">Sharma, M., Bansal, A. CRISPR: a revolutionary tool for genome engineering in the protozoan parasites. , Genome Engineering via CRISPR-Cas9 System, Academic Press. (2020).
  44. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).">Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  45. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).">Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  46. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).">Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).
  47. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).">Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  48. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (4), 973-977 (1995).">Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. H., Su, X. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (4), 973-977 (1995).
  49. Transformation with human dihydrofolate reductase renders malaria parasites insensitive to WR99210 but does not affect the intrinsic activity of proguanil. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10931-10936 (1997).">Fidock, D. A., Wellems, T. E. Transformation with human dihydrofolate reductase renders malaria parasites insensitive to WR99210 but does not affect the intrinsic activity of proguanil. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10931-10936 (1997).
  50. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic Acids Res. 29 (3), 850-853 (2001).">Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic Acids Res. 29 (3), 850-853 (2001).
  51. Adaptation of the genetically tractable malaria pathogen Plasmodium knowlesi to continuous culture in human erythrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 531-536 (2013).">Moon, R. W., et al. Adaptation of the genetically tractable malaria pathogen Plasmodium knowlesi to continuous culture in human erythrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 531-536 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Malaria ParasiteCompensatory PathwaysProtein KinasesCDPK FamilyChemical GeneticsHypomorphic AlleleCRISPR Cas9 EditingDrug ResistanceKinase InhibitionTranscriptional Rewiring

Related Articles