Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Endotel Hücre Tepkilerini İncelemek için Substrat Sertliğini ve Akışını Entegre Eden İn Vitro Model

1.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67081

⸱

19 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  , 
1Chemical Engineering Department, Northeastern University, 2Bioengineering Department, Northeastern University, 3Laboratoire de BioMécanique et BioIngénierie (BMBI), UMR CNRS, Sorbonne Universités, Université de Technologie of Compiègne (UTC), 4Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 5Neuroscience Department, Albert Einstein College of Medicine

Bu makalede

Özet

İlgili vasküler akış koşulları altında vasküler endotel hücrelerinin (EC'ler) kültürlenmesi için ayarlanabilir jelatin bazlı bir substrat sentezledik ve karakterize ettik. Bu biyomimetik yüzey, hem fizyolojik hem de patolojik koşulları taklit ederek, EC davranışı üzerindeki mekanik kuvvetlerin incelenmesini sağlar ve vasküler sağlık ve hastalık mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı geliştirir.

Özet

Vasküler sağlığı ve ateroskleroz gibi hastalıkların başlangıcını anlamak için çok önemli olan doku sertliği ve kayma stresinin endotel hücre (EC) fonksiyonu üzerindeki birleşik etkilerini araştırmayı amaçlayan yenilikçi bir in vitro model sunuyoruz. Geleneksel olarak, çalışmalar, kesme gerilimi ve alt tabaka sertliğinin EC'ler üzerindeki etkilerini bağımsız olarak araştırmıştır. Bununla birlikte, bu entegre sistem, vaskülatür mekanik ortamının daha kesin bir simülasyonunu sağlamak için bu faktörleri birleştirir. Amaç, insan EC'lerini kullanarak çeşitli doku sertlik seviyelerinde ve akış koşullarında EC mekanotransdüksiyonunu incelemektir. Jelatin metakrilat (GelMA) hidrojellerini ayarlanabilir sertliğe sahip sentezleme ve birleşme elde etmek için bunları EC'lerle tohumlama protokolünü detaylandırıyoruz. Ek olarak, laminer akış ve uygun kesme gerilimi seviyeleri ile karakterize edilen fizyolojik akış koşulları oluşturmak için hesaplamalı akışkanlar dinamiği simülasyonları ile desteklenen uygun maliyetli bir akış odasının tasarımını ve montajını açıklıyoruz. Protokol ayrıca konfokal mikroskopi için floresan etiketlemeyi de içerir ve hem doku uyumu hem de akış koşullarına EC yanıtlarının değerlendirilmesini sağlar. Bu model, kültürlenmiş EC'leri çoklu entegre mekanik uyaranlara maruz bırakarak, hipertansiyon ve yaşlanma gibi faktörlerin EC fonksiyonunu ve EC aracılı vasküler hastalıkları nasıl etkileyebileceğine dair kapsamlı araştırmalara olanak tanır. Bu araştırmalardan elde edilen bilgiler, vasküler hastalıkların altında yatan mekanizmaların aydınlatılmasında ve etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde etkili olacaktır.

Giriş

Kan damarlarının iç yüzeyini döşeyen endotel, damar sağlığının korunmasında çok önemli bir rol oynar. Endotel hücreleri (EC'ler), damar tonusu kontrolü, seçici geçirgenlik, hemostaz ve mekanotransdüksiyon 1,2 dahil olmak üzere çeşitli kardiyovasküler fonksiyonların düzenlenmesinde merkezi öneme sahiptir. Araştırmalar, EC disfonksiyonunu ateroskleroz gelişiminde birincil rol ile sıkı bir şekilde ilişkilendirmiştir. Özellikle, EC'ler kan akımı ve alttaki damar dokuları ile etkileşime girdikleri arayüzlerde çeşitli mekanik kuvvetlerle karşılaşırlar 3,4. Birkaç çalışma, EC disfonksiyonunu, kan akışından kaynaklanan sıvı kesme gerilimi ve doku sertliğigibi vasküler ortamdaki mekanik faktörlerdeki anormal değişikliklerle ilişkilendirmiştir 5,6,7.

Bununla birlikte, önceki araştırmalar, doku sertliği ve kayma gerilmesinin EC fonksiyonu üzerindeki birleşik etkilerini anlamada sınırlı ilgi görmüştür. Araştırma sonuçlarını ateroskleroz ve diğer kardiyovasküler hastalıklar için etkili tedavilere dönüştürme yeteneğini geliştirmek için, bu alanda kullanılan hücresel modellerin iyileştirilmesi esastır. İnsan EC'leri kullanarak ve bunları ya kesme gerilimine ya da değişen sertlik seviyelerinesahip substratlara maruz bırakarak hücresel modellerin insancıllaştırılmasında önemli ilerleme kaydedilmiştir 8,9,10. Bununla birlikte, dinamik akış ortamlarını ayarlanabilir sertlik özelliklerine sahip EC substratları ile entegre eden hücresel modellerin benimsenmesi ve iyileştirilmesi yavaş ilerlemiştir. Buradaki zorluk, akış kanalı içindeki akış parametrelerindeki değişiklikleri önlemek ve aynı zamanda sağlam ve iyi yapışmış EC tek katmanlarının yetiştirilmesini kolaylaştırmak için şişmeyen EC substratlarının tasarlanmasında yatmaktadır. Bu engellerin üstesinden gelebilen bir in vitro model, hipertansiyon, yaşlanma ve akış koşullarının EC mekanotransdüksiyonunu, vasküler sağlığı ve nihayetinde ateroskleroz gelişimini işbirliği içinde nasıl etkilediğine dair daha etkili araştırmaları kolaylaştırabilir. Dönen plakalar ve mikroakışkan cihazlar dahil olmak üzere, substrat sertliğini kontrol ederken hücrelere kesme gerilimi uygulamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Döner plaka yönteminde, hücreler iki plaka arasına yerleştirilir ve plakaların dönme hareketi yoluyla kesme gerilimi uygulanır. Bu yöntem daha az karmaşıktır ve hızlı bir model sağlar; Bununla birlikte, merkezde sıfır kesme gerilimi ve çevrede maksimum kesme gerilimi11 ile uzamsal kayma gerilimi varyasyonundan muzdariptir.

Öte yandan, mikroakışkan cihazlar, alt tabaka sertliğini ve akış koşullarını kontrol etme yeteneğine sahip yeni nesil araçları temsil eder. Bu sistemler, laminer akış koşulları altında mikrovasküler sistemleri taklit etmek için uygundur. Bununla birlikte, aterosklerozun bu tür cihazlarla incelenmesi pratik değildir, çünkü ateroskleroz rahatsız akışlı büyük damarlarda meydana gelir11. Bu makale, farklı akış koşulları altında EC substratlarındaki değişen sertlik seviyelerinin etkilerini inceleyebilen uygun maliyetli bir sistem sunarak EC çalışmalarının kritik araştırma alanına katkıda bulunmayı amaçlamaktadır. Sistem, patolojik ve fizyolojik kan damarlarını taklit etmek için farklı sertliklere sahip substratları entegre eder. Bu protokol, fizyolojik ve patolojik sertliği temsil eden, sırasıyla 5 kPa ve 10 kPa şişme ve sertlik seviyeleri olmayan jelatin bazlı hidrojeller oluşturma yöntemini ana hatlarıyla belirtir. Ek olarak, bu alt tabakaları entegre edebilen paralel plakalı bir akış odasının inşası detaylandırılmıştır. Kayma gerilmesi ve akış koşullarını değerlendirmek için hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) kullanıldı. EC kültürü için hidrojellerin hazırlanması ve 6 saatlik bir akış deneyinin yürütülmesi açıklanmış, ardından deney sonrası immün boyama üzerine bir tartışma yapılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. GelMA'nın Sentezi

  1. 0,2 M'lik bir susuz sodyum karbonat çözeltisi ve 0,2 M'lik bir sodyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın.
  2. 46 mL sodyum bikarbonat çözeltisini 15 mL sodyum karbonat çözeltisi ile karıştırın ve 139 mL deiyonize (DI) su ekleyin. Gerekirse 0,1 M NaOH ve HCl kullanarak pH'ı 9,5'e ayarlayın.
  3. Domuz derisinden 10 g tip A, 300 çiçekli jelatini, %10 w/v konsantrasyonda 100 mL karbonat-bikarbonat tamponuna ekleyin.
  4. Jelatini 55 °C'lik bir su banyosu kullanarak çözün ve çözeltiyi manyetik bir karıştırıcı kullanarak 700 rpm'de karıştırın. Tamamen çözündükten sonra, jelatin çözeltisinin pH'ını 0,1 M NaOH kullanarak 9,5'e ayarlayın.
  5. Metakrilasyonu başlatmak için, çözeltiye damla damla 938 μL metakrilik anhidrit (MAH) ekleyin. Jelatin çözeltisi içindeki MAH'ın ilk dağılımını, merkezden farklı derinlikler ve radyal mesafeler dahil olmak üzere çeşitli konumlara enjekte ederek iyileştirin.
  6. Işığa maruz kalmayı önlemek için reaksiyon kabını alüminyum folyoya sarın. Sıcaklığı 55 °C'de tutun ve reaksiyonu tamamlamak için çözeltiyi 500 rpm'de 1 saat karıştırın (Şekil 1A)12.
    NOT: Reaksiyon, 7.4'ün altındaki bir pH'ta durur.
  7. 1,8 L aseton içeren bir adet 2 L'lik beher ve 0,3 L aseton içeren bir adet 0,6 L'lik beher hazırlayın.
  8. Elde edilen GelMA solüsyonunu, çökeltmeyi sağlamak için 200 RPM'de karıştırırken 2 L'lik behere damla damla ekleyin13. Çökelmiş ürünün toplanmasını en üst düzeye çıkarmak için, daha kolay aktarım için çekirdeklenme yeri olarak paslanmaz çelik bir çubuk veya spatula yerleştirin.
  9. Ürünü daha büyük beherden daha küçük olana aktarın ve kurutma adımına geçmeden önce 10 dakika bekletin. Çökeltilmiş GelMA beyaz lifler olarak görünmelidir.
  10. Ürünü emici kağıt üzerinde toplayın, oda sıcaklığında (RT) vakumlu fırında kurutun ve daha fazla kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
    NOT: Ürünün proton nükleer manyetik rezonans (1H NMR) yoluyla kimyasal karakterizasyonuna ilişkin ek ayrıntılar, daha önce yayınlanmış bir çalışmada8 bulunabilir.

2. Cam tuzlanması

NOT: Hidrojellerin cam kızaklara takılması, düz ve düz bir yüzey sağlar, taşımayı kolaylaştırır ve akıştan türetilen kesme gerilimi altında stabilite sağlar. Camın 3- (trimetoksisilil) propil metakrilat ile işlevselleştirilmesi, yüzey özelliklerini geliştirmek ve polimerizasyon işlemi sırasında hidrojellerin kovalent bağlanmasını sağlamak için gereklidir.

  1. Düz mikroskop slaytlarını (1 mm kalınlığında) bir cam kesici kullanarak nihai hidrojel boyutlarına benzer parçalar halinde hassas bir şekilde kesin. Cam yüzeyin işlenmesini engelleyebilecek yüzey kirleticilerini ve kalıntıları temizlemek için kesilen slaytları sabunla yıkayın.
    NOT: Gerekirse, cam slaytları etanolde 5 dakika boyunca sonikleştirin, ardından havayla kurutun.
  2. Mutlak etanol içinde% 0.5'lik bir 3- (trimetoksisilil) propil metakrilat çözeltisi hazırlayın. DI suyunda% 10'luk bir buzlu asetik asit çözeltisi hazırlayın. % 3'lük bir buzlu asetik asit nihai konsantrasyonu elde etmek için çözeltileri karıştırın.
    NOT: Buzlu asetik asit çözeltisi büyük miktarlarda hazırlanabilir ve saklanabilir.
  3. Cam yüzeylerin engellenmediğinden emin olmak için cam slaytları bir cam kapta düzenleyin. Elde edilen çözeltiyi cam slaytların üzerine dökün ve reaksiyonun tamamlanması için 80 rpm'de bir külbütör üzerinde yaklaşık 5 dakika tutun. Sıkışan hava kabarcıklarını çıkararak cam kızakların her iki tarafının da değiştirildiğinden emin olun.
  4. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, çözeltiyi aspire edin ve cam slaytları etanol 2x ile yıkayın. Slaytları havayla kurutun ve RT'de karanlıkta saklayın.
    NOT: Cam kızaklar bu koşullar altında 1 ay boyunca modifikasyonlarını korurlar.

3. Hidrojel hazırlama

  1. Redoks kaynaklı serbest radikal polimerizasyon yöntemi kullanarak hidrojeller üretin.
    1. Son alt tabakayı şekillendirmek için iki parçalı Politetrafloroetilen (PTFE) kalıpları uygun derinlikte ve 10mm2 açıklık pencereleriyle birleştirin. Tasarım sürecinde polimerizasyon sonrası hidrojelin yüksekliğinde %25'lik bir büzülmeyi hesaba katın. Sızıntıyı önlemek için kalıpların düz olduğundan ve alt ve üst plakalara sıkıca sabitlendiğinden emin olun.
      NOT: Tasarlanan kalıp boyutları, kasıtlı olarak amaçlanan hidrojel boyutundan %10 daha büyüktür. Bu tasarım birden fazla amaca hizmet eder: kalıp ayrılması üzerine yanların zarar görmesini önler, safsızlıkları veya kabarcıkları yanlara iterek hidrojelin yüzey düzgünlüğünü arttırır ve yüksek oranda çapraz bağlı hidrojellerin dengeleme sonrası suyu ittiği ve büzülmeye neden olduğu sinerez etkisi nedeniyle dengelemeden sonra beklenen %25'lik büzülmeyi telafi eder. Büzülme miktarı protokol8'de belirtilmiştir.
    2. Hidrojellerin düzgün bir yüzeye ve sabit bir yüksekliğe sahip olmasını sağlamak için, modifiye edilmiş cam slaytları kalıbın üst plakasından askıya alın ve polimer çözeltisini enjekte etmek için dar bir açıklık sağlayın. Modifiye edilmiş cam kızakları asmak için bir kapak camı kullanın (Şekil 1B).
    3. Kapak camını oluşturmak için kalıptan %20 daha büyük düz mikroskobik cam kesin. Kısa kenarlara iki ara parça takın. Ara parça kalınlığını aşağıdaki gibi hesaplayın:
      Ara parça kalınlığı = 1.33 x nihai jel kalınlığı + 1 (modifiye edilmiş camın kalınlığı) - kalıbın derinliği
    4. Kapak camının uzun kenarlarına, ara parçaların takıldığı aynı yüze ince bir tabaka hücre uyumlu sızdırmazlık gresi sürün.
    5. Değiştirilmiş cam sürgüyü iki ara parça arasındaki kapak camına takın.
    6. Kapak camını kalıba yerleştirin, böylece ara parçalar kalıba oturur ve modifiye edilmiş cam kalıba uzanır. Bu kurulum, modifiye edilmiş cam ile kalıbın tabanı arasında nihai hidrojel yüksekliğinin 1.33'ü kadar bir boşluk sağlar.
    7. GelMA'yı 5 kPa ve 10 kPa hidrojeller için sırasıyla %4 ve %10 w/v'de DI suda çözün ve 45 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
      NOT: GelMA, ısıya duyarlı bir polimerdir ve çözelti sıcaklığının 45 °C'de tutulması, polimerizasyondan önce katılaşmayı önler ve düz hidrojellerin üretilmesi için çok önemli olan çözelti viskozitesini azaltır.
    8. Polimer çözeltisine TEMED (5 kPA hidrojel için 24 mM, 10 kPa hidrojel için 6.25 mM) ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: TEMED tek başına polimerizasyonu başlatmaz, bu nedenle devam etmeden önce kalıpların, pipetlerin ve çözeltilerin hazırlandığından emin olun.
    9. GelMA çözeltisine APS (5 kPA hidrojel için 24 mM, 10 kPa hidrojel için 24,5 mM) ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: APS eklemek polimerizasyonu başlatır ve hidrojeller hızlı bir şekilde oluşabilir ve kusurlu hidrojelleri önlemek için derhal harekete geçilmesini gerektirir. Rijitlik ölçümleri hakkında daha fazla ayrıntı daha önce yayınlanmış bir çalışmadabulunabilir 8.
    10. Elde edilen çözeltiyi asılı cam sürgü ile RT'deki kalıp arasındaki açıklığa dikkatlice pipetleyin ve çapraz bağlanmasına izin verin. Kılcal kuvvet, polimer çözeltisini kalıba sürer. Jellere kabarcık eklemekten kaçının ve pipet ucunda az miktarda çözelti kaldığında pipetlemeyi durdurun.
      NOT: Polimerizasyon sırasında, GelMA'nın metakrilat grupları, modifiye edilmiş cam slaytlar üzerindeki metakrilat kalıntıları ile reaksiyona girer ve bu da hidrojelin cama kimyasal olarak bağlanmasına neden olur.
    11. 15 dakika sonra reaksiyon tamamlanır. İğne gibi keskin bir nesne kullanarak alt tabakayı kalıptan ayırın ve alt tabakayı ayırmak için kapak camından uzağa kaydırın.
    12. Hidrojelleri, plastik film ile kapatılmış 100 mm'lik bir Petri kabında 1x fosfat tamponlu tuzlu suya (PBS) aktarın ve kalan reaktanları ve yan ürünleri uzaklaştırmak için 37 °C'de dengeleyin.
    13. Hidrojel nihai boyutlardan biraz daha büyük olduğundan, akış odası penceresi için gereken boyutlara uyacak şekilde yanlardaki fazla jeli kesin.
    14. Hidrojel boyutlarını doğrulamak için akış odasını kullanın. Hidrojel ile kalıp arasında boşluklar veya akış modellerini etkileyebilecek herhangi bir kusur olmadan hidrojelin akış odasına düzgün şekilde oturduğundan emin olun. Akış odasındaki akış modelini etkileyebilecek ve olumsuz hücre davranışına yol açabilecek şekil düzensizlikleri varsa, hidrojeli statik koşullar için saklayın.
    15. Sterilizasyon için dört hidrojeli 1x PBS içeren bir Petri kabına aktarın.
  2. Hidrojeli aşağıda açıklandığı gibi %70 etanol kullanarak sterilize edin.
    1. Kademeli hidrojel dehidrasyonu için %25, %50 ve %70 alkol solüsyonları hazırlayın.
      NOT: Kademeli dehidrasyon yapılmazsa, daha sert hidrojeller büzülebilir ve kırılabilirken, daha yumuşak hidrojellerin yüzeyinde kırışıklıklar oluşabilir.
    2. Hidrojel içeren Petri kabından 1x PBS solüsyonunu aspire edin. 5 kPa ve 10 kPa hidrojelleri 15 dakika daldırmak için her Petri kabına% 25 etanol çözeltisi ekleyin.
    3. % 25 alkol çözeltisini aspire edin. 5 kPa ve 10 kPa hidrojelleri 15 dakika daldırmak için her Petri kabına %50 alkol solüsyonu ekleyin.
    4. % 50 alkol çözeltisini aspire edin. 5 kPa ve 10 kPa hidrojelleri 5 dakika daldırarak her Petri kabına %70 alkol solüsyonu ekleyin. Petri kabını 100 rpm'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
    5. 5 kPa hidrojelleri 40 dakika ve 10 kPa hidrojelleri 20 dakika su altında bırakın.
      NOT: 5 kPa hidrojellerin, 10 kPa hidrojellere kıyasla kontaminasyona daha yatkın olduğu gözlemlenmiştir.
    6. Numuneleri bir biyogüvenlik kabinindeki 6 oyuklu bir plakaya aktarın ve hidrojelleri steril PBS kullanarak 2x-3x yıkayın.

4. Kaplama hidrojelleri

  1. 3 mg jelatini 50 mL steril PBS'de (1x magnezyum ve kalsiyum tuzu ile) çözerek 60 μg/mL'lik bir jelatin çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 37 °C'de bir su banyosunda 30 dakika veya tüm jelatin tamamen eriyene kadar ısıtın.
  2. Steril filtre, 0.2 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak kaplama solüsyonunu filtreleyin. Her bir kuyucuk plakasından 1x PBS çözeltisini aspire edin ve her bir hidrojelin tam olarak kaplanmasını sağlamak için her bir oyuğa jelatin çözeltisi ekleyin. Kontaminasyon riskini en aza indirmek için, kaplama çözeltisine 40 birim / mL penisilin ve 10 μg / mL streptomisin ekleyin.
  3. Her bir kuyucuk plakasını 37 °C,% 5 CO2 inkübatörde 45 dakika inkübe edin. Hidrojelleri 1x PBS solüsyonu ile yıkayın.
  4. PBS'yi aspire edin ve hücre kültürü ortamı ekleyin.
  5. İki günden fazla olmamak üzere, hidrojelleri hücre kültürü ortamında tutun ve hücre tohumlanana kadar 37 °C,% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.
    NOT: Fibronektinin mükemmel hücre bağlanma özelliklerine rağmen, EC'lerin aterosklerotik durumlarda endojen fibronektin biriktirmesi nedeniyle kullanımı hakkında bir endişe vardır ve bu da proinflamatuar bir yanıta yol açabilir. Kimyasal olarak uyarılmış hücre tepkilerinden kaçınmak için fibronektin kullanmaktan kaçınırız. Ek olarak, Orr ve ark. fibronektin kaplamanın, kollajen I kaplamaya kıyasla, aterojenik genleri yukarı regüle ettiğini gösterdi. Spesifik olarak, hücreler arası adezyon molekülü 1 (ICAM-1), vasküler hücre adezyon molekülü 1 (VCAM-1) ve Nükleer faktör-κB (NF-κB)14'ün ekspresyon seviyelerinin arttığını gözlemlediler.

5. Substratlar üzerine hücre tohumlama

  1. Mevcut ayrılma protokollerini izleyerek hücre süspansiyonunu hazırlayın ve bir hemositometre8 kullanarak hücreleri sayın.
  2. Ortamı hidrojellerden iyice aspire edin. Her örneğe 50.000 hücre/cm2 ekleyin. Hücre taşmasını önlemek için her örneğe uygun hacimde hücre süspansiyonu ekleyin.
    NOT: Daha sert yüzeyler daha hidrofobiktir; Bu nedenle, substrat yüzeyinde ıslanabilirliği ve hücre süspansiyonu dağılımını iyileştirmek için adımlar arasındaki süreyi en aza indirin.
  3. Hücre tohumlu hidrojelleri 37 °C, %5 CO2 inkübatörde 2 saat inkübe edin. Hücreler jellere bağlandıktan sonra numunelere hücre kültürü ortamı ekleyin.

6. Akış odası imalatı

NOT: Akış odasını tasarlama yaklaşımı uygun maliyetlidir ve imalat ve kullanım için minimum uzmanlık gerektirir.

  1. Akış kalitesini, kesme gerilimi altında hidrojel bütünlüğünü ve akış deneyleri sırasında potansiyel gerçek zamanlı biyobelirteç çalışmalarını görsel olarak değerlendirmek için oda imalatı için poli (metil metakrilat) kullanın. Oda tasarımı, bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak oluşturulmuştur. Akış odası bir patent için başvuruda bulunulmuştur ve bu cihazla ilgili ayrıntılar mevcut protokolde açıklanamaz.
  2. Akış odasındaki akış koşullarının hesaplamalı değerlendirmesi
    1. Tasarlanan akış odasının (. SLDPRT dosyaları) son oda kurulumunu oluşturmak için.
    2. Kesme gerilimini analiz etmek için hidrojel yüzeyine teğet olan akışın merkez çizgisi boyunca bir çizgi çizin. Kapalı bir kontrol hacmi tanımlamak için giriş ve çıkış açıklıklarını kapatın.
    3. CAD yazılımındaki Eklentiler sekmesinden Flow Simulation'ı açın. Akış Simülasyonu sekmesinde, özelliklere girmek için Sihirbaz özelliğini açın. Birim sistemini belirtin ve basıncı ve gerilim birimlerini dyne/cm2 olarak ayarlayın.
    4. Fiziksel özelliklerde sıvı akışını ve yerçekimini kontrol edin. Z bileşeninde yerçekimini -9.8'e ayarlayın; X ve Y bileşenleri sıfır olmalıdır.
    5. Geometri İşleme'de analiz türü için Dahili'yi seçin. Varsayılan sıvı olarak Su'yu seçin.
      NOT: Ortamın su gibi davrandığını varsayalım.
    6. Akış türü için Laminer ve Türbülanslı'yı seçin. Duvarı adyabatik bir duvar olarak tanımlayın ve Duvar Durumu'nda yüzey pürüzlülüğüne girin.
    7. Başlangıç koşullarında sıcaklığı 37,5 °C'ye (310,65 K) ayarlayın. Akış Simülasyonu projelerinde hesaplama alanını tanımlayın ve tüm kontrol hacmini kapsadığından emin olun.
    8. Akışkan alt alanını tanımlamak için akışkanla arayüz oluşturan tüm duvarları seçin. Sınır Koşulu'nda, giriş kapağının iç yüzeyini Giriş Hacmi Akışı olarak belirleyin ve akış hızını (Q) ve düzgün akışı belirtin. Ardından, çıkış kapağı sızdırmazlığının iç yüzeyini statik basınç olarak atayın.
    9. Mevcut hesaplama kaynaklarına göre Global Mesh Boyutu'nu belirleyin. Simülasyonu başlatmak için Çalıştır'a basın.
    10. Tamamlandıktan sonra, kesme gerilimi grafikleri ve akış simülasyonları dahil olmak üzere istenen sonuçları gözden geçirin.
    11. Farklı hızlarda uygulanan kesme gerilimini hesaplamak için 6.2.8 ila 6.2.10 arasındaki adımları çeşitli akış hızlarıyla tekrarlayın. Akış hızı-kesme gerilimi ilişkisini kurmak için regresyon analizini kullanın.
    12. Simülasyonun gerçekçiliğini artırmak için sistemin hidrojel boyutlarındaki değişikliklere karşı toleransını değerlendirin.

7. Düzgün laminer akış çalıştırın

  1. Hücreleri 5 kPa ve 10 kPa hidrojeller üzerinde kültürledikten sonra, hücre tek tabakasının 37 °C,% 5 CO2 inkübatörde birleştiğinden emin olun. Her hidrojel üzerinde tek bir hücre tabakası elde edilmelidir.
  2. Paralel plakalı akış odası sisteminin otoklavlanabilir bileşenlerini (paslanmaz çelik vidalar, spatula, forseps, conta ve ortam haznesi) 30 dakikalık yerçekimi otoklav döngüsü ile sterilize edin. Diğer parçaları (akrilik bileşenler ve rezervuar kapatıcı/damperler) UV ışığına maruz kalarak sterilize edin.
  3. Akış odası cihazını bir biyogüvenlik kabinine monte edin. Hidrojel numunelerini cihaza sabitleyerek homojenliği sağlayın. Akış için yetersiz sayıda numune mevcutsa, hidrojellere eşit boyutta bir dolgu maddesi kullanın.
  4. Kabarcık oluşumunu en aza indirmek ve montaj sırasında hücre kurumasını önlemek için haznenin iç yüzeyini ve hidrojel yüzeylerini önceden ıslatın.
  5. Giriş haznesine yeterli miktarda medya ekleyin, montaj sırasında medyanın %20-30'unun çıkış haznesine akmasına izin verin. Giriş rezervuarını bir damper/mühürleyici kullanarak hava geçirmez şekilde kapatın.
    NOT: Giriş rezervuarında oluşan basınç akışı yönlendirir ve herhangi bir hava sızıntısı akış hızlarını değiştirir. Dış boruda kabarcık oluşup oluşmadığını sızdırmazlık maddesi kusurlarını kontrol edin.
  6. Basınç farkını belirlemek için çıkış damperini atmosferik basınca ayarlayın. Cihazı ve rezervuarları 37 °C, %5CO2 inkübatöre yerleştirin. Cihaz hortumunu inkübatörün dışına yerleştirilmiş bir peristaltik pompaya bağlayın (Şekil 1C).
  7. 3.6 dyne/cm2 uygulamaya başlamak için pompayı açın. Akış hızını 2 mL/dk'lık artışlarla kademeli olarak artırın (ör., yaklaşık 8 dyne /cm2 uygulayana kadar 10 dakika sonra 65 mL/dk'dan 85 mL/dk'ya ulaşın).
  8. 12 dyne/cm2 kesme gerilimine ulaşana kadar akış hızını 2,5 mL/dk'lık artışlarla daha da artırın.
    NOT: Hücrelerin dinamik duruma uyum sağlaması için zaman tanıyın, çünkü hızlı akış hızı artışları hücreleri ayırabilir ve tek tabakaya zarar verebilir.
  9. 6 saat sonra akışı durdurun, cihazı inkübatörden çıkarın ve akış odasını sökün. Daha sonra, hidrojel numunelerini altı oyuklu bir plakaya aktarın.
  10. Numuneleri buz gibi soğuk PBS ile yıkayın ve hücreleri immün boyama için sabitleyin veya protein izolasyonu için parçalayın.

8. Yüksek büyütmeli konfokal mikroskopi için immünoboyama kurulumu

NOT: Çalışma verimliliğini artırmak için, tek bir numunede birden fazla biyolojik hedefin incelenmesini sağlayan küçük porsiyon hidrojellerin immün boyaması için bir yöntem geliştirilmiştir.

  1. Biyopsi zımbaları veya 3 veya 4 mm çapında tercih edilen kesici aletler hazırlayın.
  2. Boyama odası olarak bir pipet ucu kutusu kullanın. Pipet ucu kutusunun altına ıslak bir kağıt havlu koyarak uzun süreli inkübasyon sırasında lekelenme çözeltisinin buharlaşmasını kontrol etmek için hazneyi nemlendirin.
  3. Bireysel numuneler için küçük çözelti havuzları oluşturarak antikor tüketimini azaltın. Uç kutusu rafını şeffaf bir filmle örtün, çukurlar oluşturmak için filmi parmak ucunuzla raf deliklerine hafifçe bastırın. Çukurları 70 μL PBS ile doldurun.
  4. Tek bir hidrojeli boş bir Petri kabına aktarın ve bir biyopsi zımbası veya tercih edilen kesme aleti kullanarak kesin. Temsili bir numune alanını kesmek için bir mikroskop kullanın. Konfokal mikroskopi sorunlarını önlemek için dolu bir jel silindiri kesin.
  5. Kesilen hidrojel numunelerini adım 8.3'te oluşturulan çukurlara yerleştirin. Standart protokol15'e göre boyama yapın. Son boyama yıkamasından sonra, hidrojel kalınlığına uygun bir silikon kauçuk tabaka elde edin.
    NOT: Tercihen, daha iyi sızdırmazlık için tek tarafı yapışkan olan bir tabaka kullanın. Bu çalışmada, aktin lifleri, 1:20'lik bir seyreltmede Phalloidine konjuge edilmiş bir floresan ikincil antikor kullanılarak boyandı.
  6. Kauçuk levhayı 15 mm x 15 mm kareler halinde kesin. Biyopsi zımbası veya tercih edilen kesme aleti kullanarak 6 mm'lik bir delik açın.
  7. Kauçuğu bir mikroskopi lamel (no. 1.5) üzerine takarak bir numune kabı oluşturun. Numune hala mevcutken çukurlara 10 μL ıslak montaj ortamı ekleyin ve karanlıkta 10-15 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu çalışma için, montaj ortamı, boyama protokolünü kısaltmak için 0.9 μg / mL 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeriyordu.
  8. Numuneyi boyama odasından çıkarın ve adım 8.7'de oluşturulan kaba yerleştirin. Numunenin üzerine 1-2 μL montaj ortamı uygulayın.
    NOT: Montaj ortamının miktarı, yüksek büyütme oranlarında görüntü kalitesini etkiler. Aşırı veya yetersiz montaj ortamı görüntü netliğini tehlikeye atabilir.
  9. Üstüne başka bir lamel yerleştirin ve numunenin cama temas ettiğinden emin olmak için hafifçe bastırın. Numuneleri mikroskopi görüntülemeye kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 , bir metakrilasyon reaksiyonu yoluyla GelMA sentezi sürecini özetleyen deney düzeneğini göstermektedir. Elde edilen ürün daha sonra üzerine EC'lerin ekildiği hidrojel substratı imal etmek için kullanıldı. Daha sonra, hücreler 12 dyne /cm2'de 6 saatlik bir akış deneyi için akış odasına sokuldu.

1Metakrilasyon reaksiyonunun başarısını değerlendirmek için H NMR spektroskopisi kullanıldı (Şekil 2A).<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Vasküler sistem, çeşitli kuvvetlerin hücresel davranışı önemli ölçüde etkilediği dinamik bir ortamdır. Kardiyovasküler hastalıklarda biyolojik olayları bu kuvvetleri dikkate almadan incelemek yanlış olacaktır. Bu nedenle, vasküler mekanik ortamı taklit edebilen hücresel modeller çok önemlidir. Araştırmacılar, bu kuvvetlerin hücresel davranış üzerindeki etkisini vurgulamada önemli ilerleme kaydettiler11. Bununla birlikte, insan vücudundaki hem patolojik hem de fizyolojik koşullar altında hücre davr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, Mekanik Olarak Ayarlanabilir Alt Tabakaya Sahip Akış Odası unvanıyla geçici bir patent başvurusu (No. 63/634,853) yapıldığını ve başka hiçbir rakip menfaatin bulunmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, akış odasının imalatındaki yardımları için Robert Egan'a şükranlarını sunarlar. Yazarlar, deneyler sırasındaki yardımları için Lucas McCauley'e teşekkür eder. Ek olarak, konfokal mikroskoplara erişim sağlamak için Northeastern Üniversitesi'nin Canlı Sistemlerin Kimyasal Görüntüleme Enstitüsü'nün (CILS) temel tesislerine teşekkür etmek isterler. Yazarlar, Ulusal Sağlık Enstitüleri (SB'ye verilen NIH 1R01EB027705) ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF KARİYER Ödülleri: SB'ye DMR 1847843 ve EE'ye 1846962) tarafından sağlanan finansman desteğini kabul etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(trimetoksisilil) propil metakrilat, tetrametiletilendiamin (TEMED)İnvitrojen15524-010Hidrojel İmalatı
3- (Trimetoksisilil) Propil MetakrilatSigma-Aldrich440159Cam Tuzlanması
4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren montaj ortamıVektör LaboratuvarlarıH-1200İmmün boyama
AsetonThermo Fisher ScientificsA18-4GelMA Sentezi
Alexa Fluor 555 Phalloidin Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi8953Sİmmün Boyama
Amonyum Persülfat (APS)Bio-Rad1610700Hidrojel İmalatı
Şeffaf Çizilmeye ve UV ışınlarına dayanıklı dökme akrilik levha (45/64 '')McMaster-CARR8560K165Akış Odası İmalatı
Konfokal MikroskopCarl Zeiss Meditex AGZeiss LSM 800İmmün Boyama
Covidien Monoject Sert Paket 60 mL İğnesiz ŞırıngaFisher   22-031-375Akış Deneyi
EC büyüme kitiAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)PCS-100-041Hücre Kültürü
Etanol 200 KanıtDecon Labs2701Cam Tuzlanma
Domuz derisinden Jelatin Tip A (300 çiçek)Sigma-AldrichG1890GelMA Sentezi
Buzul Asetik AsitThermo Fisher Scientifics9526-33Cam
Tuzlanma Yüksek Saflıkta Yüksek Sıcaklık Silikonu Kauçuk LevhaMcMaster-Carr87315K74Akış Odası İmalatı
İnsan Göbek Veni Endotel Hücreleri (HUVEC)Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)PSC-100-010Hücre Kültürü
M3x30mm Makine Vidaları Altıgen Soket Yuvarlak Başlı Vida 304 Paslanmaz Çelik Bağlantı Elemanları Cıvataları 20 adetUxcellB07Q5RM2TPAkış Odası İmalatı
Masterflex L/S Kolay Yüklemeli Dijital Sürücü® Hassas boru için 3 pompa kafası; 115/230 VACVWR#MFLX77921-65Akış Deneyi 
Masterflex L/S Hassas Pompa Hortumu, Puri-Flex, L/S 25; 25 ftVWR#MFLX96419-25Akış Deneyi 
Metakrilik Anhidrit (MAH)Sigma-Aldrich276685GelMA Sentezi
ParaformaldehitThermo Fisher Scientifics043368.9MHücre Kültürü
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Gibco14080-055Genel
Sodyum BikarbonatFisher KimyasalS233-3GelMA Sentezi
Sodyum KarbonatFisher KimyasalS263-500GelMA Sentezi
SOLIDWORKS eğitim sürümü
SOLIDWORKS Öğrenci Sürümü Masaüstü, 2023SolidWorksN/AAkış Odası Tasarımı
Vasküler Bazal OrtaAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)PCS-100-030Hücre Kültürü

Kaynaklar

  1. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  2. Suowen, X., et al. Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacotherapies. Pharmacol Rev. 73 (3), 924(2021).
  3. Jansen, K. A., Atherton, P., Ballestrem, C. Mechanotransduction at the cell-matrix interface. Sem Cel Dev Biol. 71, 75-83 (2017).
  4. Tarbell, J. M., Pahakis, M. Y. Mechanotransduction and the glycocalyx. J Int Med. 259 (4), 339-350 (2006).
  5. Topper, J. N., Cai, J., Falb, D., Gimbrone, M. A. Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress. Proc Natl Acad Sci. 93 (19), 10417-10422 (1996).
  6. Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events. Circulation. 121 (4), 505-511 (2010).
  7. Bonetti, P. O., Lerman, L. O., Lerman, A. Endothelial dysfunction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (2), 168-175 (2003).
  8. Hamrangsekachaee, M., et al. Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348(2023).
  9. Mensah, S. A., et al. Flow-regulated endothelial glycocalyx determines metastatic cancer cell activity. FASEB J. 34 (5), 6166-6184 (2020).
  10. Russell-Puleri, S., et al. Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38. Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).
  11. Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research. Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).
  12. Zhu, M., et al. Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency. Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).
  13. Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system. Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).
  14. Orr, A. W., et al. The subendothelial extracellular matrix modulates NF-kappaB activation by flow: a potential role in atherosclerosis. J Cell Biol. 169 (1), 191-202 (2005).
  15. Hamrangsekachaee, M., Baumann, H. J., Pukale, D. D., Shriver, L. P., Leipzig, N. D. Investigating mechanisms of subcutaneous preconditioning incubation for neural stem cell embedded hydrogels. ACS Appl Bio Mater. 5 (5), 2176-2184 (2022).
  16. Rezaeeyazdi, M., Colombani, T., Memic, A., Bencherif, S. A. Injectable hyaluronic acid-co-gelatin cryogels for tissue-engineering applications. Materials. 11 (8), 1374(2018).
  17. Belvitch, P., Htwe, Y. M., Brown, M. E., Dudek, S. Cortical actin dynamics in endothelial permeability. Curr Top Membr. 82, 141-195 (2018).
  18. Krishnamoorthy, S., Noorani, B., Xu, C. Effects of encapsulated cells on the physical-mechanical properties and microstructure of gelatin methacrylate hydrogels. Int J Mol Sci. 20 (20), 5061(2019).
  19. Jin, Q., et al. Bioprinting small-diameter vascular vessel with endothelium and smooth muscle by the approach of two-step crosslinking process. Biotechnol Bioeng. 119 (6), 1673-1684 (2022).
  20. Villard, P., et al. Autoclavable and injectable cryogels for biomedical applications. Adv Healthcare Mater. 8 (17), 1900679(2019).
  21. Bencherif, S. A., et al. Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels. J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).
  22. Rogers, Z. J., Zeevi, M. P., Koppes, R., Bencherif, S. A. Electroconductive hydrogels for tissue engineering: Current status and future perspectives. Bioelectricity. 2 (3), 279-292 (2020).
  23. James, B. D., Allen, J. B. Vascular endothelial cell behavior in complex mechanical microenvironments. ACS Biomater Sci Eng. 4 (11), 3818-3842 (2018).
  24. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), e4688(2012).
  25. Fioretta, E. S., Fledderus, J. O., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Influence of substrate stiffness on circulating progenitor cell fate. J Biomech. 45 (5), 736-744 (2012).
  26. Geemen, D. v, et al. F-Actin-anchored focal adhesions distinguish endothelial phenotypes of human arteries and veins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (9), 2059-2067 (2014).
  27. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Comm Biol. 4 (1), 764(2021).
  28. Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions. Biomicrofluidics. 5 (3), 32006(2011).
  29. Inglebert, M., et al. The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton. Biomicrofluidics. 14 (2), 024115(2020).
  30. Noria, S., et al. Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress. Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).
  31. Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing. Cancers (Basel). 13 (19), 4754(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Endotel HücrelerKayma GerilmesiGelMA HidrojelleriAkış OdasıLaminer AkışKonfokal MikroskopiMekanotransdüksiyonVasküler Hastalıklar
Endotel Hücre Tepkilerini İncelemek için Substrat Sertliğini ve Akışını Entegre Eden İn Vitro Model
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.