Burada, yetişkin Xenopus laevis'i (Afrika pençeli kurbağası) döner bir dövme makinesi ile dövme yöntemlerini açıklıyoruz. Doğru dövme, birkaç ay süren ve hayvanları araştırma ve kayıt tutma amaçları için kolayca ayırt edilebilir hale getiren koyu, kolay okunabilir rakamlarla sonuçlanır.
Yöntem makalesi
Xenopus laevis'i Döner Dövme Makinesi ile Dövme Yöntemleri
Bu makalede
Özet
Özet
Hayvan modelleri, biyomedikal araştırmaların kapsamını genişleterek gelişimsel, moleküler ve hücresel biyoloji anlayışımızı geliştirir ve araştırmacıların insan hastalıklarını modellemesine olanak tanır. Bireysel hayvanları kaydetmek ve izlemek, araştırmacıların çalışma için gereken hayvan sayısını azaltmasına ve hayvan refahını iyileştirmek için uygulamaları iyileştirmesine olanak tanır. Memelileri işaretlemek ve izlemek için kulak delme ve kulak küpeleri de dahil olmak üzere iyi belgelenmiş birkaç yöntem mevcuttur. Bununla birlikte, sucul amfibi türlerini işaretleme yöntemleri sınırlıdır, mevcut kaynaklar modası geçmiş, etkisiz veya aşırı derecede maliyetlidir. Bu el yazmasında, Xenopus laevis'i döner bir dövme makinesiyle işaretlemek için yöntemleri ve en iyi uygulamaları özetliyoruz. Doğru dövme, yüksek kaliteli dövmelerle sonuçlanır, bireyleri araştırmacılar için kolayca ayırt edilebilir hale getirir ve hayvanların sağlığı için minimum risk oluşturur. Ayrıca, hızla solan ve hayvanlara gereksiz yere zarar veren dövmelere neden olabilecek düşük kaliteli dövmelerin nedenlerini de vurguluyoruz. Bu yaklaşım, araştırmacıların ve veteriner hekimlerin amfibileri işaretlemelerine, biyolojik kopyaları ve transgenik çizgileri izlemelerine ve hayvan sağlığının doğru kayıtlarını tutmalarına olanak tanır.
Giriş
Hayvan modelleri, insan sağlığı ile ilgili soruları araştırmak için yararlı araçlardır. Uygulamada, hayvan modellerini kullanan biyomedikal araştırmalar, sağlıklı bir hayvan kolonisinin dikkatli bir şekilde düzenlenmesini ve sürdürülmesini gerektirir. Etik hayvan muamelesi ve yetiştiriciliği için en iyi uygulamalar, deney için gereken hayvan sayısını azaltmayı ve hayvan refahını sağlamak için uygulamaları iyileştirmeyi amaçlamaktadır1. Pençeli kurbağa cinsi, Xenopus laevis (X. laevis; Afrika pençeli kurbağası) ve Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Batı pençeli kurbağa), X. laevis'in Güney Afrikalı doktorlar tarafından ilk gebelik testlerini yapmak için kullanıldığı 1930'lardan beri biyomedikal araştırmalarda kullanılmaktadır2. Modern hamilelik testleri artık kurbağa gerektirmese de, Xenopus araştırmasının rolü devam ediyor. Biyomedikal araştırmalar için Xenopus kullanmanın avantajları arasında iyi açıklamalı genomları3, büyük yumurta kavramalarının yıl boyunca indüklenebilir yumurtlaması4 ve in vitro fertilizasyona uygun harici olarak bırakılan yumurtalar yer alır. Bu özellikler onları omurgalı embriyolojisi ve gelişimi 5,6,7, temel moleküler ve hücresel biyoloji 7,8,9,10 ve insan hastalıklarının modellenmesi 7,11,12,13 için yararlı bir varlık haline getirir.
Bireysel Xenopus hayvanlarını izlemek için güvenilir yöntemler, biyolojik kopyaları kaydetmek ve araştırmada titizliği ve tekrarlanabilirliği geliştirmek için gereklidir. Xenopus sıklıkla gruplar halinde barındırıldığından, hayvan işaretlemesi araştırmacıların bireysel hayvanları kolayca izlemesine olanak tanır4. Hayvanların doğru bir kaydını tutmak, zamandan ve kaynaklardan tasarruf sağlayabilir ve hayvanların sağlığını takip etme yeteneğini geliştirebilir. Örneğin, hayvanların bireysel olarak tanımlanması, transgenik Xenopus hatları oluşturmak için organizasyon iş akışlarını iyileştirebilir, çünkü bu, hayvanların organizasyonunu ve bireysel olarak tanımlanmasını gerektiren14 dizileme ile doğrulanan belirli genotiplere sahip birden fazla kurbağa nesli gerektirir. Bu, özellikle bu mutasyonlar kolayca ayırt edilebilir yetişkin fenotiplerinden yoksun olduğunda geçerlidir. Benzer şekilde, temel hücresel ve gelişimsel biyolojiyi incelemek için Xenopus oositlerinin ve embriyolarının kullanılması, bireysel hayvanların izlenmesinden fayda sağlar. Yumurtlamayı indükledikten sonra, hiper yumurtlama sendromu gibi sağlık komplikasyonlarını önlemek için hayvanların en az 3 ay dinlenmesi gerekir15. Bireysel tanımlama yöntemleri, hayvanların çok sık yumurtlamaya teşvik edilmemesini sağlar.
Hayvanların işaretlenmesi ve izlenmesi, laboratuvar personelinin hayvanların sağlık sorunlarını izlemesine de olanak tanır. Aynı genotipteki hayvanların hastalanması, transgen ile ilişkili aşırı akrabalı yetiştirme veya beklenmeyen sağlık sorunlarını gösterebilir. Benzer şekilde, son yumurtlamadan sonra hastalanan hayvanlar, reaktifler, malzemeler veya tekniklerle ilgili sorunları gösterebilir. Hayvanları ve sağlıklarını izlemek, laboratuvar personelinin ve veteriner hekimlerin, endişeler yeniden ortaya çıktığında takip etmelerini ve gelecekteki hastalıkları önlemek için önleyici tedbirler almalarını sağlar. Memelilerde çok sayıda tanımlama yöntemi vardır. Fareler için kalıcı yöntemler arasında kulak delme, kulak küpeleri, dövme ve deri altı mikroçipler bulunur16. Bunlar, bir koloni veya kafes içindeki hayvanları net ve güvenilir bir şekilde ayırt edebilir ve laboratuvar personeli tarafından kolayca uygulanabilir. Kulak delme gibi yöntemler minimal invazivdir, yalnızca bir parça özel ekipman gerektirir ve çoğu yaştaki hayvanlar için işe yarar. Bu sistemler fareler için basit ve kullanışlı olsa da, kurbağalarda kullanımları benzersiz bir dizi zorluk sunar. Kurbağalar ve diğer amfibiler bir kulak kepçesinden (dış kulak yapısı) yoksundur. Bazı araştırmacılar hayvanın çenesine, ayak parmağına veya arka bacağına etiketler yapıştırmıştır17,18. Bu yaklaşım çeşitli sorunlara yol açtı: çene etiketleri tahrişe neden oldu ve ajite kurbağalar ön ayaklarıyla etiketleri çıkarmaya çalıştı17. Ayak etiketleri, ayak parmakları arasındaki dokumayı delerek hareketi bozdu ve kaybolma riskini taşıdı. Bu nedenle, amfibiler tanımlama için kendi yöntemlerine ihtiyaç duyarlar. Tarihsel olarak, amfibileri işaretlemek için ayak parmağı kırpma da kullanılmıştır17,19. Ayak parmağı keskin bir makasla kırpılır ve hayvan, ön ayaklardaki ve arka ayaklardaki ayak parmaklarının uzunluğu veya ayak parmağının geriye doğru uzadığı açı (semenderlerde) ile tanımlanabilir. Bununla birlikte, bu yöntem, ayak parmağının kırpılmasının hayvanın hareketini bozabileceğine dair etik kaygıyı ortaya çıkarmaktadır17. Ek olarak, bu kanamaya neden olabilir ve enfeksiyon riski oluşturabilir. Kurulan bir diğer işaretleme sistemi, kurbağanın bir kısmından derinin alındığı ve cerrahi olarak başka bir kısmına tutturulduğu deri otogreftleridir. Örneğin, bir kurbağanın sırtını veya omzunu göğsünden20 açık renkli bir deri grefti kullanarak işaretlemek için bir yöntem tarif edilmiştir. Deri greftleri ayrıca sınırlamalar ve risklerle birlikte gelir: prosedür invazivdir ve potansiyel olarak ölümcül bir rahatsızlık olan Aeromonas hydrophila enfeksiyonu veya kırmızı bacak riskini ortaya çıkarır; otogreftin tamamen iyileşmesi 6 haftaya kadar sürer; Ve açıklanan yöntemlerle, bir otogreft20 koymak için sınırlı yerler nedeniyle sadece 6 kurbağa bir arada barındırılabilir.
Daha az invaziv markalama yaklaşımları arasında cam boncuklar ve transponder yongalarıbulunur 17,19. Cam boncuk yönteminde, cam boncuklar küçük bir dikişe geçirilir ve kurbağanın derisine dikilir. Bu, en az 60 farklı renk kombinasyonu ile deri otogreftlerinden daha fazla değişkenlik sağlar. Bununla birlikte, dikişin dışarı çıkma ve boncukların kaybolmasına neden olma riski vardır. Alternatif olarak, kurbağanın dorsal lenf kesesinde deri altına bir mikroçip transponder implante edilebilir. Bu, en kalıcı işaretleme yöntemi olarak kabul edilir ve potansiyel olarak sonsuz sayıda hayvanın ayrı ayrı tanımlanmasını ve kataloglanmasını sağlar. Bununla birlikte, bu aynı zamanda en pahalı yöntemdir, çünkü bireysel mikroçipler pahalıdır ve büyük bir koloninin işaretlenmesi maliyetli olacaktır. Mikroçipler ayrıca19'u okumak için özel bir tarayıcı gerektirir. Xenopus tanımlaması için yaygın bir yaklaşım, hayvanların doğal renklendirmesine ve desenlerine atıfta bulunmaktır. Bu, özellikle yetişkinlik boyunca kalan farklı desenlere sahip olan X. laevis gibi kurbağalar için iyi çalışır. Bununla birlikte, bu desenler zamanla stresle değişebilir ve kurbağalar şeffaf ve renkli kaplar arasında hareket ettirildiğinde renklenme farklı görünebilir15. Ek olarak, bu tanımlama yöntemi, X. laevis'e kıyasla daha az belirgin işaretleme desenlerine sahip olan X. tropicalis veya renk işaretlemesi olmayan albino hayvanlar için daha az kullanışlıdır21. Farklı işaretlere sahip türler için bile, laboratuvar personeli işaretlerin yerleşimini ve boyutunu farklı şekilde yorumlayabilir ve bu da tanımlamada hatalara neden olabilir. Bu nedenle, hayvanları fotoğraflamak, ek bir tanımlama yöntemiyle birlikte en güvenilir olanıdır. Bu nedenle, Xenopus hayvanlarını kolayca ayırt edilebilir, kalıcı ve minimal invaziv bir teknik kullanarak işaretlemeye ve tanımlamaya çalışıyoruz.
Amfibilere dövme yapma yöntemlerini açıklayan sınırlı sayıda yayınlanmış kaynak vardır. Dövme, ısı markaları, gümüş nitrat markaları ve donma markaları dahil olmak üzere diğer markalama teknikleriyle birlikte tanımlanmıştır17. Aynı kaynakta, 27G hipodermik iğne ile rakamlar çizilerek dövme yapıldı ve işlemin, bir rakam veya başka bir işaret şeklinde bir tel kullanan diğer markalama tekniklerinin aksine, enfeksiyona neden olmadığı not edildi. Başka bir kaynakta, kurbağaları işaretlemek için bir elektrikli dövme makinesi (titreşimli bir iğne olarak tanımlanır) kullanıldı, ancak teknik hakkında çok az ayrıntı verildi 17,19. Yazarlar, kurbağanın koruyucu balçık tabakasını rahatsız ederek bu prosedürün kırmızı bacak riskini artırdığı konusunda uyarıyorlar. Hem tamamen noninvaziv (fotoğraflar gibi) hem de kalıcı (mikroçipler gibi) bir işaretleme veya tanımlama yöntemi olmasa da, dövme etkili bir uzlaşma sağlar. Dövme, deri otogreftleri gibi diğer tekniklere kıyasla nispeten basittir. Ek avantajlar arasında daha küçük bir öğrenme eğrisi ve nispeten ucuz ekipman bulunur. Sucul amfibileri dövmek, araştırmacıları korkutabilecek ve başarılı hayvan işaretlemesini bozabilecek bazı zorluklarla birlikte gelir. Bu makale, araştırmacılara yetişkin Xenopus'u döner bir dövme makinesiyle dövme yapmak için iyi belgelenmiş yöntemler sağlamayı amaçlamaktadır.
Protokol
Açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Dartmouth College'ın Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Ekipman kurulumu
NOT: Prosedür için bir iş akışı ve örnek bir tezgah kurulumu dahildir (Şekil 1).
- Dövme tabancasını ve ayak pedalını güç kaynağına bağlayın. Ayak pedalını çalışma yüzeyinin altına yerleştirin.
- Dövme tabancasının montajı
- Bir Alyan anahtarı veya altıgen tornavida kullanarak tutamaktaki vidaları gevşetin (Şekil 2A, kırmızı daire içine alınmış).
- Plastik ucu tutamağın içine sonuna kadar sokun. Yerinde tutmak için vidayı sıkın.
- Metal boruyu tutamağın arkasına yerleştirin (Şekil 2A). Bu ayarlanacaktır, bu nedenle uzunluğunun yarısına kadar yerleştirin. Yerinde tutmak için vidayı sıkın.
- Tutamağın ön tarafındaki plastik uca rahatça oturması için tutamağın arkasından bir dövme iğnesi sokun (Şekil 2B).
- İğnenin ve metal borunun arkasını tüp kelepçesinden kaydırın. Metal boruyu, iğne plastik uca rahatça oturacak şekilde ayarlayın (Şekil 2B). Boru cl'yi elle sıkınamp tüp hareket edemeyecek duruma gelene kadar (Şekil 2C).
- Siyah O-ringi çıkarın ve iğneyi rotor koluna asın; iğneyi yerine sabitlemek için O-ringi değiştirin (Şekil 2C).
- Güç kaynağındaki voltajı, cildi delmek için yeterli güç olacak, ancak kontrol edilmesi zor olacak kadar güçlü olmayacak şekilde ayarlayın. Güç kaynağı prize takılıp bağlandıktan sonra, makinenin çalıştığından emin olmak için ayak pedalına basın. İğneyi kendinize veya diğer personele doğrultmamaya dikkat edin.
NOT: Bu protokolde kullanılan dövme makinesi en iyi 6.0 ile 9.0 V arasında çalışır, ancak bu, dövme makineleri ve voltaj kaynakları arasında değişebilir ve ampirik olarak belirlenmelidir. - 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün kapağını veya sağlanan plastik bir mürekkep kabını siyah dövme mürekkebi ile yaklaşık dörtte üçü kadar doldurun.
2. Anestezi
- Anesteziyi, bir yetişkin dişi X. laevis kurbağasını batıracak kadar büyük bir tankta hazırlayın.
- Kurbağa için güvenli (klorsuz) su kullanarak, 1,5 g / L'lik son konsantrasyona trikserin ve 3,5 g / L'lik son konsantrasyona sodyum bikarbonat ekleyin. Çözünmesi için karıştırın. Bu çözeltinin pH'ı 7.15'tir.
DİKKAT: Trikain tahriş edicidir.
- Kurbağa için güvenli (klorsuz) su kullanarak, 1,5 g / L'lik son konsantrasyona trikserin ve 3,5 g / L'lik son konsantrasyona sodyum bikarbonat ekleyin. Çözünmesi için karıştırın. Bu çözeltinin pH'ı 7.15'tir.
- Bir kurbağayı anestezi tankına batırın. Kurbağanın anestezi uygulanana kadar (7-8 dakika) tricaine solüsyonuna batırılmış halde kaldığından emin olun.
- Kurbağanın tam olarak uyuşturulup uyuşturulmadığını kontrol etmek için onu kaldırın, baş aşağı tutun ve tek ayağını sıkıca sıkın. Kurbağa ürkmezse veya tepki vermezse, dövme yapılabilir.
- Kurbağaların anestezi alması sürekli olarak 10 dakikadan fazla sürerse, sodyum bikarbonat ile tamponlanmış taze trikain çözeltisi hazırlayın.
NOT: Kurbağalar tricaine solüsyonu15'te 30 dakikadan fazla zaman geçirmemelidir.
3. Dövme
NOT: Canlı bir hayvana dövme yaptırmadan önce, sert bir kabuğu olan bir meyve parçası (limon veya muz gibi) üzerinde pratik yapmak faydalı olabilir.
- Dövme yapmadan önce kurbağalar için bir kurtarma tankı hazırlayın. Bir depoyu 10-15 L taze kurbağa için güvenli su ile doldurun ve bir Strafor adası ekleyin. Bu, kurbağanın boğulmadan uyanması için bir yüzey sağlayacaktır.
NOT: Fermuarlı bir torba içine yerleştirilmiş bir strafor soğuk nakliye konteynerinin kapağı kullanılarak bir strafor adası yapılabilir. - Anestezi uygulanmış kurbağayı kuru bir kağıt havlu veya tezgah kağıdı üzerine sırt üstü koyun (Şekil 3A). Kurbağalarla ilgili tüm işler için ağartılmamış (kahverengi) kağıt havlu kullanın.
- Kuru, tüy bırakmayan bir mendil kullanarak kurbağanın göğsündeki suyu ve mukusu silin.
- Kurbağanın göğsünün ortasındaki sternumu parmaklarınızla bulun ve baskın olmayan elinizi kullanarak cildi gergin tutun.
- Kurbağayı işaretlemek
- Monte edilmiş dövme tabancasını çalışma yüzeyine göre dikey olarak tutun ve iğneyi mürekkebe batırın (Şekil 3B).
- Monte edilmiş dövme tabancasını dikey tutarak, ayak pedalına basmadan önce iğnenin ucunu kurbağanın derisine bastırın. Eşit basınç uygularken kurbağanın derisine çizgiler çizin.
NOT: Bazı küçük kanama veya kızarıklıklar, küçük cilt dökülmesi gibi normaldir. - İğne kurbağanın derisine takılıyorsa, iğnedeki fazla mürekkebi veya cildi bir mendille temizleyin. Dövme sırasında fazla mürekkep olması normaldir.
- Kurbağanın göğsü, işaretlenen alanı net bir şekilde göremeyecek kadar fazla mürekkeple kaplıysa (Şekil 3C), fazla mürekkebi kurbağa için güvenli su ve bir mendille temizleyin (Şekil 3C'). Ardından kuru bir mendille nemi çekin ve mürekkeplemeye devam edin.
NOT: Dövme yapmadan önce bir şişe kurbağa için güvenli su hazırlanabilir. - Fazla mürekkebi sildikten sonra koyu, okunaklı sayılar kalana kadar aynı alanı mürekkeplemeye devam edin (Şekil 3D). Tüm işareti veya sayıyı tek bir vuruşta çizmek yerine, özellikle eğriler için art arda daha küçük vuruşlar yapın.
4. Kurtarma
- Bir kağıt havluyu kurbağa için güvenli suyla ıslatın ve strafor adanın üzerine düz bir şekilde yerleştirin (Şekil 4A).
- Kurbağaların ayakta duran tanklara geri döndürülmesi
- Kurbağayı suya bakacak şekilde havlunun üzerine göbeği yatırın (Şekil 4B). Kağıt havlunun yarısını kurbağanın arka yarısının üzerine katlayın ve ellerinizi kaplayarak kurbağanın üstünü ıslatın. Bir kurbağa anesteziden çıktığında (dövmeden yaklaşık 1 saat sonra), bağımsız olarak suya girecek ve normal şekilde yüzecektir.
- Dövme tamamen iyileştikten sonra kurbağaları 24 saat sonra uzun süreli konutlara geri koyun.
5. Temizlik ve ekipman bakımı
- Dövme iğnelerinin yeniden kullanılması ve otoklavlanması
- Mürekkebi gevşetmek için iğneleri %100 izopropanol ve deiyonize suda durulayın ve çözünmemiş kalan mürekkebi ovalayın.
- Fırçaladıktan sonra, iğneleri metal bir otoklav kutusuna yerleştirin veya alüminyum folyo ile sarın ve kuru bir döngüde 30 dakika boyunca otoklavla sarın.
- Dövme makinesinin veya diğer ekipmanın parçalarında mürekkep varsa,% 100 etanol ve bir kağıt havluyla silin.
- Anestezik çözelti, yaklaşık% 0.5'lik bir nihai trikin konsantrasyonuna sahiptir. Bunu kurumsal tehlikeli atık yönetimi yönergelerine göre atın.
- Ekipman depolama ve bakımı
- Mümkünse, dövme makinesini kuru bir odada saklayın. Aşırı nem, elektrikli bileşenlere zarar verir ve makinenin ömrünü kısaltır.
- Dövme makinesini iyi çalışır durumda tutmak için, titreşimlerden22 gevşemediğinden emin olmak için rotor üzerindeki yatağı (Şekil 2C) kontrol edin. Bu, bir Alyan anahtarı veya altıgen tornavida ile sıkılabilir.
- Ayda yaklaşık bir kez, rotor kolundaki yatağı kalın bir yağlama gresi22 kullanarak yağlayın.
- Bazı dövme makinelerinde rotor kolu sıkışabilir ve titremez. Bunu düzeltmek için rotor kolunu çevirin veya yayı iğne alçaltılmış konumda olacak şekilde sıkıştırın (Şekil 2C).
Sonuçlar
Yüksek kaliteli dövmeler, kurbağanın göğsünde koyu, okunaklı vuruşlara sahip olacak ve birkaç metre uzaklıktan net bir şekilde ayırt edilebilecektir (Şekil 5A). Genel olarak, daha büyük sayılar ve işaretler okunabilirlik için daha iyidir, ancak daha uzun adlar ve sayılar kurbağanın göğsüne rahatça sığacak şekilde küçültülebilir. Dövmenin uzun ömürlülüğünü değerlendirmek daha zordur, ancak yüksek kaliteli kurbağa dövmeleri en az 3-6 ay boyunca karanlık ve okunaklı kalmalıdır (Şekil 5D-D '). Bir dövme solduktan sonra, aynı teknik kullanılarak rötuşlanabilir.
Kötü teknik hayvanlara zarar vermez, ancak hızla solan dövmelere neden olabilir (Şekil 5B) ve bu da daha sık rötuşlara yol açar. Aşırı hevesli dövme kanamaya ve kızarıklığa neden olabilir ve bir kurbağayı yanlış bir kurtarma pozisyonuna yerleştirmek kasıtsız boğulmaya neden olabilir.
Dövmelerin kalitesi ve tekniğin etkinliği, dövmeyi takip eden aylarda değerlendirilebilir (Şekil 5E). İyileşme döneminden sonra kurbağa üzerinde mürekkep olduğu sürece, dövme başarılı olarak kabul edilir.
Şekil 1: Protokol iş akışı ve tezgah kurulumu. (A) İş akışı ve zamanlama. (1) Kurbağalar, kurbağa güvenli suda çözülmüş 1.5 g / L trikain ve 3.5 g / L sodyum bikarbonat, pH 7.15 çözeltisinde anestezi altında 7-8 dakika harcarlar. Bir kurbağaya dövme yapılırken, anestezi tankında güverteye ikinci bir kurbağa yerleştirilebilir. Bir seferde sadece bir kurbağa tricaine solüsyonunda olabilir. (2) Kurbağalar dövme yaptırmak için yaklaşık 10 dakika su harcarlar. Süre, dövmenin boyutuna ve laboratuvar personelinin deneyimine bağlı olarak değişecektir. (3) Bilinçsiz kurbağalar boğulmalarını önlemek için 30-45 dakika strafor üzerine yerleştirilir ve kurumasını önlemek için ıslak bir kağıt havlu ile örtülür. (4) Dövme yapıldıktan sonra, kurbağalar 24 saat boyunca taze kurbağalar için güvenli durgun suda iyileşirler. İyileştikten sonra kurbağalar kolonilerine geri dönebilirler. (B) Örnek bir çalışma alanı için tezgah kurulumu. Ağartılmamış bir kağıt havlu olan dövme çalışma alanı, tezgahın ortasında yer almaktadır. Dövme makinesi ve voltaj kaynağı kağıt havlunun solundadır. Bunlar personelin baskın tarafına yerleştirilir (personel solaktır). Bir mürekkep kabı ve dövme mürekkebi, voltaj kaynağının yanına ve dövme çalışma alanının yolundan uzağa yerleştirilir. Ayak pedalı, voltaj beslemesi ile aynı taraftadır. Bu ayak pedalına basmak dönme hareketini kontrol eder. Tüy bırakmayan mendiller ve kurbağa için güvenli su içeren bir sıkma şişesi kağıt havlunun sağındadır. Bunlar, dövme sırasında kurbağanın derisindeki fazla mürekkebi temizlemek için kullanılır. Dövme makinesindeki vidaları sıkmak ve gevşetmek için bir Alyan anahtarı kullanılır. Bu, dövme makinesini monte etmek ve sökmek için kullanılır. Dövme işlemi sırasında anestezi tankı ve ekstra kağıt havlular da tezgah üzerinde bulundurulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dövme makinesi montajı. (A) Dövme iğnesinin, tutamağın ve ilgili bileşenlerin demonte edilmiş görüntüsü. Metal tutamak üzerindeki vidalar kırmızı daire içine alınmıştır. (B) Tutamağa uygun şekilde monte edilmiş dövme iğnesinin görüntüsü. (C) Dövme tabancasına monte edilmiş dövme iğnesi ve kabzasının görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kurbağa dövmesi için konumlandırma ve referans görüntüleri. (A) Bir kağıt havlu üzerinde yüzü yukarı bakacak şekilde yatan bir kurbağanın görüntüsü. Ok, kurbağanın göğüs kemiğini gösterir. (B) Kurbağa mürekkepleyen laboratuvar personelinin görüntüsü. (C) Mürekkep oluşturma sırasında, (C) ve (C') fazla mürekkebin yıkanmasından sonraki sayıların görüntüleri. (D) Mürekkeplemeden hemen sonra, iyileşmeden önce kurbağa dövmesinin görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Dövme sonrası iyileşme. (A) Strafor adası. Strafor buz kutusu kapağı, fermuarlı bir torbanın içine yerleştirilir. (B) Dövme sonrası kurtarma pozisyonundaki kurbağalar. Strafor adaları tipik olarak 1 veya 2 kurbağaya sığabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Temsili sonuç örnekleri. (A) Dövme yapıldıktan 24 saat sonra yeni bir dövme. (B) Düşük kaliteli teknikler. (B)'de, dövme makinesi düzgün bir şekilde monte edilmemişti, ancak yine de dönme hareketi yapabiliyordu. Bu fotoğraf dövme yapıldıktan 4 ay sonra çekildi. (B')'de, dövme makinesi düzgün bir şekilde monte edilmemişti ve dönme hareketi yapamıyordu. Bu fotoğraf dövme yapıldıktan 6 ay sonra çekildi. (C) Yanlış monte edilmiş dövme makinesi. Metal boru ve plastik uç mevcut değil ve metal tutamak, dövme makinesinin geri kalanına doğru şekilde sabitlenmemiş. Lastik bant, iyi bir teknik ve uygun ekipman kurulumu ile dövme yapılmış bir kurbağanın (D) öncesi ve sonrası (D') dönme hareketini bozar. (D) dövmeden hemen sonra, (D') ise dövmeden 4 ay sonra çekildi. (E
Tartışma
İnsanları dövmek binlerce yıl öncesine dayanan bir sanattır ve insanlar kendilerini dövme yaptıkları sürece hayvanları da dövme yapmışlardır veya markalamışlardır23. Hayvanları, özellikle memelileri işaretlemek için ekipman ve teknikler iyi kurulmuş, iyi belgelenmiş ve geniş çapta erişilebilirdir. Hayvanları işaretlemek başlangıçta hayvancılık ve hırsızlık caydırıcılarını ayırt etmek için23 olsa da, biyomedikal araştırmalardaki rolü de aynı derecede önemli hale gelmiştir.
Amfibi dövme yapmanın bir yararı, dövmelerin 24 saat içinde iyileşmesi ve iyi dövmelerin birkaç ay sürmesidir (Şekil 5D '). Dövme, amfibilerin barınması ve yetiştirilmesi için birçok avantaj sağlar. Dövmeler, araştırmacıların ve veterinerlik personelinin, daha koyu renk tonlarına sahip tanklarda bile, görülmesi ve yorumlanması kolay sayılar kullanarak tek tek hayvanları kolayca ayırt etmelerini sağlar19. Bu prosedür, 2 yaşın üzerindeki kurbağalar için önerilmeyen deri otogreftlerine kıyasla herhangi bir yetişkin kurbağa üzerinde de yapılabilir15. En önemlisi, dövme, X. laevis'in göğsüne rahatça oturan en az üç basamaklı çok sayıda hayvanın tanımlanmasına izin verir (Şekil 5A).
Boncuk veya etiket takmakla karşılaştırıldığında, dövme düşebilecek hiçbir şey bırakmaz ve sınırlı tahrişe neden olur17. Ek olarak, dövme, markaya bir tel şekillendirmeyi gerektiren diğer markalama tekniklerinden daha fazla çok yönlülük sağlar. Prosedürün kendisi deri otogreftlerinden çok daha az yıkıcıdır çünkü hiçbir doku çıkarılmaz. Bununla birlikte, otogreftler gibi, dövme de kısmen invazivdir ve küçük bir yaralanma veya enfeksiyon riski taşır. Bu, herhangi bir hayvanı işaretlemenin gerekli bir parçasıdır, ancak araştırmacıların dövme sırasında aşırı kanamaya karşı dikkatli olmaları ve hayvanları A. hydrophilia enfeksiyonu açısından izlemeleri önemlidir. Bu, dövme öncesinde, sırasında ve sonrasında temiz bir çalışma alanı sağlayarak ve hayvanlar kolonilerine geri gönderilmeden önce dövmelerin tamamen iyileşmesini sağlayarak önlenebilir. Bu makaleyi yazarken ve geliştirirken, kurbağaların hiçbiri dövme nedeniyle kalıcı olarak yaralanmadı veya ölmedi. Bu prosedürün bir sınırlaması, yalnızca 1 yaşından büyük yetişkin kurbağalar üzerinde test edilmiş olmasıdır. Şimdiye kadar, bu protokolle hiçbir kurbağa yavrusu dövmesi yapılmadı. Ek olarak, bu prosedür, göğsünde koyu renklenme olan ve dövmeleri daha az fark edilebilir hale getirecek olan X. tropicalis için optimize edilmemiştir21. Gelecekte, bu dövme protokolü, X. tropicalis ile ilgili hususları içerecek şekilde güncellenebilir.
Xenopus habitatı sucul4 olduğundan, bu dövmelerin zamanla solması normaldir. Dövmelerin sık sık değiştirilmesi ihtiyacı, tükürük ve içeceklerle sürekli temas nedeniyle epidermal dövmelerden daha hızlı solan ağız içindeki insan dudak dövmelerinde belgelenmiştir24. Bununla birlikte, bir dövmenin uzun ömürlülüğü büyük ölçüde dövme tekniğine bağlıdır. Kötü teknik, yanlış monte edilmiş bir dövme makinesinden (Şekil 4C) veya yetersiz voltaj kaynağı ayarlarından kaynaklanabilir. Voltaj çok düşük ayarlandığında, iğnenin cilde nüfuz etmesini önleyerek soluk izler veya çizgiler oluşur. Voltajın çok yüksek ayarlanması hayvana gereksiz yere zarar verir. Kötü dövmenin bir başka yaygın kaynağı, personel dövme tabancasını tutarken yanlış iğne konumlandırması veya basıncından kaynaklanır. Çok az basınçla dövme yapmak, voltajı çok düşük ayarlamakla aynı etkiye sahiptir ve hızla solan soluk bir dövmeye neden olur (Şekil 5B'). Dövme yaparken, iğne kurbağanın derisini delmek yerine üzerinden sıyırıyormuş gibi hissedebilir. Çok fazla basınçla dövme yapmak, gözle görülür veya kontrol edilemeyen kanamalara neden olur. En iyi dövme, kısa bölümler halinde mürekkepleme ve ağır, tutarlı basınçla geri çekilme çizgileri ile sabırla ve metodik bir şekilde yapılır.
Genel olarak, amfibilerde dövme yaparak hayvan işaretlemenin faydaları, dezavantajlardan daha ağır basmaktadır. Biyomedikal araştırmalarda Xenopus'un bireysel olarak izlenmesi, biyolojik kopyaların izlenmesinde bilimsel titizliği mümkün kılar, araştırmacıların ve veterinerlik personelinin bireysel hayvanların refahını değerlendirmesine olanak tanır ve hayvanın uzun vadeli sağlığını korumak için uygun yumurtlama sıklığını sağlar. Hayvan araştırmalarının 3R'si ile ilgili olarak - arıtma, azaltma ve uzaklaştırma - bu protokol en çok iyileştirme ve azaltmaile ilgilidir 1. Kurbağaları işaretlemek, araştırmacıların ve veteriner hekimlerin sağlık sorunlarını izlemelerini ve kurbağalara deneyler arasında yeterli dinlenme süresi verildiğinden emin olmalarını kolaylaştırır. Bu, hayvanlardan toplanan veri ve örneklerin daha yüksek kalitede olmasını sağlamanın yanı sıra hayvancılık ve bakım uygulamalarını iyileştirerek araştırma sürecini iyileştirir. Ayrıca deneylerde tekrarlanabilirliği artırmaya yardımcı olur. Ek olarak, hayvanların işaretlenmesi, yeniden kullanılmalarını sağlar ve bu da gereken toplam hayvan sayısını azaltır. Özellikle yüksek kaliteli yumurtalar bırakan veya diğer deneylerde en yararlı olan kurbağalar, araştırma için daha uygun olarak işaretlenebilir ve tanımlanabilir. Kurbağalar sürekli olarak deneyler için yararlı değilse, tanımlanabilir ve koloniden çıkarılabilir, bu da kaynak ve alan tasarrufu sağlar. Bu makalenin amacı, amfibi dövmeciliğindeki en iyi uygulamaları belgelemek ve Xenopus laboratuvarlarına ayrıntılı, kolay erişilebilir bir dövme protokolü sağlamaktır. Bu uygulama, kısmen mevcut yayınlanmış kaynakların sınırlı olması nedeniyle Xenopus alanında henüz yaygın değildir. Bu kaynak, araştırmacıların hayvanları güvenli ve etkili bir şekilde işaretlemelerini, büyük koloniler için kayıt tutmayı iyileştirmelerini ve biyomedikal araştırmalarda amfibilerin kullanımını iyileştirmelerini sağlayacaktır.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.
Teşekkürler
Dartmouth College'ın Karşılaştırmalı Tıp ve Araştırma Merkezi'ne bu protokolde kullanılan hayvanlar için günlük yetiştiricilik sağladığı için teşekkür ederiz. Ayrıca protokolün test edilmesindeki ve hayvanların fotoğraflanmasındaki yardımları için Leah Jacob ve Adwaita Bose'a da teşekkür ederiz. Son olarak, dövme pratiği eğitimi için Ann Miller'ın laboratuvarına teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibesi R00 GM147826 JL'ye tarafından desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 3 iğneli yuvarlak astar | Dünya Çapında Dövme Kaynağı | 1203RLB | Paketlenmiş steril |
| 5 İğne Yuvarlak Tek Kullanımlık ULTRA | Dünya Çapında Dövme Kaynağı | HTIPRS5-U | Paketlenmiş steril |
| 5 iğneli yuvarlak gömlekler | Dünya Çapında Dövme Kaynağı | 1205RLB | Paketlenmiş steril |
| 7 iğneli yuvarlak gömlekler | Dünya Çapında Dövme Kaynağı | 1207RLB | Paketlenmiş steril |
| Klips Kablosu | Dünya Çapında Dövme Kaynağı | N/A | |
| Inkpots | Dünya Çapında Dövme Kaynağı | N/A | |
| Kimwipes, hassas görev mendilleri | Fisher Scientific | 06-666A | |
| RCA | Bağlantısı Dünya Çapında Dövme Kaynağı | N/A | |
| Scream Mürekkep Zifiri Siyah, 1oz | Dünya Çapında Dövme Kaynağı | SI101 | |
| Sodyum bikarbonat (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Paslanmaz çelik kulplar | Dünya Çapında Dövme Kaynağı | Yok | |
| Stealth 2.0 Döner Dövme Makinesi | Dünya Çapında Dövme Kaynağı | Yok | |
| Stealth 2.0 Döner Dövme Makinesi Kutu | Seti Dünya Çapında Dövme Kaynağı | STEALTH2-SET | |
| Strafor adası | N/A | N/A | Bu bir strafor soğuk nakliye konteynerinin kapağıdır |
| Trikain (etil 3-aminobenzonat metansülfat) | Sigma-Aldrich | E10521 | DİKKAT: TAHRİŞ EDİCİ |
| Ağartılmamış kağıt havlular | Grainger | 2U229 | Kağıt havlular ağartılmamış olmalıdır, çamaşır suyu amfibiler için toksiktir |
| Dünya | Çapında Gerilim Kaynağı Dövme Kaynağı | N/A | |
| Yıkama şişesi (kurbağa için güvenli su ile) | Fisher Scientific | FB0340923T | Kurbağa güvenli su klorsuzdur, pH 7.0-8.5, iletkenlik 1200-1800 uS |
| X. laevis yetişkin dişi | Xenopus1 | N/A | |
| N/A | Bu çanta strafor adasını tutacak kadar büyük olmalıdır |
Kaynaklar
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals (Basel). 9 (10), 754(2019).
- Elkan, E. R. The Xenopus pregnancy test. British Med J. 2, 1253-1256 (1938).
- Vize, P. D., Zorn, A. M. Xenopus genomic data and browser resources. Dev Biol. 426 (2), 194-199 (2017).
- Sive, H. Xenopus: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Press. (2023).
- Borodinsky, L. N. Xenopus laevis as a model organism for the study of spinal cord formation, development, function and regeneration. Front Neural Circuits. 11, 90(2017).
- Hoppler, S., Conlon, F. L. Xenopus: Experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200(2020).
- Fisher, M., et al. Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase. Genetics. 224 (1), 018(2023).
- Slater, P. G., Hayrapetian, L., Lowery, L. A. Xenopus laevis as a model system to study cytoskeletal dynamics during axon pathfinding. Genesis. 55 (1-2), 22994(2017).
- Bermudez, J. G., Chen, H., Einstein, L. C., Good, M. C. Probing the biology of cell boundary conditions through confinement of Xenopus cell-free cytoplasmic extracts. Genesis. 55 (1-2), 23013(2017).
- Stooke-Vaughan, G. A., Davidson, L. A., Woolner, S. Xenopus as a model for studies in mechanical stress and cell division. Genesis. 55 (1-2), 23004(2017).
- Blackburn, A. T. M., Miller, R. K. Modeling congenital kidney diseases in Xenopus laevis. Dis Model Mech. 12 (4), 038604(2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Dev Biol. 426 (2), 325-335 (2017).
- Wheeler, G. N., Brändli, A. W. Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: Lessons from zebrafish and Xenopus. Dev Dyn. 236 (6), 1287-1308 (2009).
- Carron, M., et al. Evolutionary origin of Hox13-dependent skin appendages in amphibians. Nat Commun. 15 (1), 2328(2024).
- Schultz, T. W., Dawson, D. A. Housing and husbandry of Xenopus for oocyte production. Lab Animal. 32 (2), 34-39 (2003).
- Cadillac, J. Animal identification systems used for mice. , The Jackson Laboratory. (2006).
- Donnelly, M. A., Guyer, C., Juterbock, J. E., Alford, R. A. Techniques for marking amphibians. Meas Monitor Biol Div: Std Meth Amphibians. , Smithsonian Institute Press. 277-284 (1994).
- Hutchens, S. J., Deperno, C. S., Matthews, C. E., Pollock, K. H., Woodward, D. K. Visible implant fluorescent marker: A reliable marking alternative for snakes. Herpetol Rev. 39 (3), 301-303 (2008).
- Hoogstraten-Miller, S., Dunham, D. Practical identification methods for African clawed frogs (Xenopus laevis). Lab Animal. 26 (7), 36-38 (1997).
- Loopstra, J. A., Zwart, P., Verhoeff-de Fremery, R., Vervoordeldonk, F. J. M. Marking of African clawed toads (Xenopus laevis). Improvement of a skin autograft technique. New Dev Biosci: Their Implicat Lab Animal Sci. , 311-316 (1988).
- Rodel, M. Xenopus tropicalis. AmphibiaWeb. , (2001).
- Worldwide Tattoo Supply. Stealth 2 Rotary Tattoo Machine Intro & Maintenance. Worldwide Tattoo Supply. , (2015).
- Khan, S. U., Mufti, O. The hot history and cold future of brands. J Manager Sci. 1 (1), 75-84 (2007).
- Catlett, T. All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups & More. Healthline. , (2019).
Yeniden basım ve izinler
