Yöntem makalesi

Kemirgen Kalp Dokusundan Sağlam Mitokondriyal İzolasyon

DOI:

10.3791/67093

⸱

23 Ağustos 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Michigan State University, 2Department of Kinesiology, Michigan State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri ile ilgili biyoenerjetik ve metabolomik çalışmalar, mitokondrilerin birçok hastalıkta çok yönlü rolünü ortaya koymuştur, ancak bu organeller için izolasyon yöntemleri farklılık göstermektedir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntem, yüksek kaliteli mitokondriyi birden fazla doku kaynağından saflaştırma yeteneğine sahiptir. Kalite, solunum kontrol oranları ve yüksek çözünürlüklü respirometri ile değerlendirilen diğer metriklerle belirlenir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal izolasyon, metabolik bozuklukları ve hastalıkları incelemek için moleküler biyoloji ve biyokimya alanlarındaki öncüler tarafından oluşturulan prosedürleri takiben onlarca yıldır uygulanmaktadır. Mitokondriyal fizyolojiyi ve biyoenerjetik bilimi doğru bir şekilde araştırmak için tutarlı mitokondriyal kalite gereklidir; Bununla birlikte, araştırmacılar için yayınlanmış birçok farklı izolasyon yöntemi mevcuttur. Farklı deneysel stratejiler farklı izolasyon yöntemleri gerektirse de, temel prensipler ve prosedürler benzerdir. Bu protokol, küçük hayvanlar ve hücreler de dahil olmak üzere çeşitli doku kaynaklarından iyi bağlanmış mitokondriyi çıkarabilen bir yöntemi detaylandırır. Özetlenen adımlar arasında organ diseksiyonu, mitokondriyal saflaştırma, protein miktar tayini ve çeşitli kalite kontrol kontrolleri yer alır. Yüksek kaliteli mitokondriyi tanımlamak için kullanılan birincil kalite kontrol metriği, solunum kontrol oranıdır (RCR). RCR, oksidatif fosforilasyon sırasındaki solunum hızının ADP yokluğundaki hıza oranıdır. Alternatif metrikler tartışılmaktadır. Bu protokol kullanılarak doku kaynaklarına göre yüksek RCR değerleri elde edilirken, araştırmacıların bireysel ihtiyaçlarına uyacak şekilde birkaç adım optimize edilebilir. Bu prosedür sağlamdır ve sürekli olarak hayvan modelleri ve doku kaynakları arasında ortalamanın üzerinde RCR değerlerine sahip izole mitokondri ile sonuçlanmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, belirli hücre fonksiyonları için optimize edilmiş sitoplazmik enerjik koşullar oluşturan hücre altı organellerdir. Hücresel, doku ve organizma düzeyindeki çalışmalar mitokondriyal fonksiyon hakkında bilgi sağlayabilirken, organelleri izole etmek, başka türlü mümkün olmayan bir deneysel kontrol düzeyi sunar. Mitokondriyal izolasyonlar 1940'lardan beri gerçekleştirilmekte ve çeşitli hücre ve dokularda metabolizma ve solunumun mekanik çalışmalarına izin vermektedir 1,2. Mitokondrinin tarihsel önemi de iyi belgelenmiştir3. ATP'nin ana üreticileri olarak mitokondri, optimal hücresel ve organ fonksiyonu için hayati önem taşıyan birçok kilit rol oynar4. Mitokondriyal matris içinde, substratlar TCA döngüsü tarafından oksitlenir ve NADH ve UQH2 5,6 gibi indirgeyici eşdeğerler ve hareketli elektron taşıyıcıları üretir. Sitokrom C, mitokondriyal biyokimyasal reaksiyon ağındaki üçüncü ana hareketli elektron taşıyıcısıdır7. Bu moleküller daha sonra iç mitokondriyal zara8 gömülü elektron taşıma sisteminin (ETS) transmembran kompleksleri tarafından oksitlenir. ETS'nin redoks reaksiyonları, matristen zarlar arası boşluğa proton translokasyonu ile birleştirilir. Bu işlemler, ATP9,10 üretmek için ADP'yi Pi ile F 1 F0 ATP sentaz ile fosforile etmek için kullanılan bir elektrokimyasal proton gradyanı oluşturur. Her komplekste meydana gelen bireysel süreçler, Clark tipi elektrotlar veya mikroplaka oksijen tüketimi tahlilleri11,12 kullanılarak yüksek çözünürlüklü respirometri ile araştırılabilir. Ek olarak, izole mitokondri kullanan hastalık modelleri ve tedavileri, belirli patolojilerin ilerlemesinde mitokondriyal fonksiyonun etkisini veya önemini belirleyebilir. Bunun, mitokondriyal disfonksiyonun kalp yetmezliğini nasıl etkilediğini aydınlatmak için yakıt ve substrat dağıtımındaki değişikliklerin kullanıldığı kardiyoloji alanında verimli olduğu kanıtlanmıştır 13,14,15,16. Mitokondrinin ayrıca diyabet, kanser, obezite, nörolojik bozukluklar ve miyopatiler gibi diğer hastalık durumlarının gelişimini de etkilediği bilinmektedir17,18. Bu nedenle, izole edilmiş veya saflaştırılmış mitokondri kullanımı, kaynak dokuda oksidatif metabolizma ve ATP üretiminin mekanik araştırmalarını mümkün kılar.

Biyoenerjetik araştırmalardaki önemleri nedeniyle mitokondriyal izolasyon protokolleri sıkıntısı yoktur. Ek olarak, dokular ve hücreler içindeki mitokondri alt popülasyonlarına göre uyarlanmış oldukça spesifik yöntemler bulunabilir19,20. Temel prosedür adımları, izolasyon yöntemleri arasında benzerdir, ancak mitokondri miktarını ve kalitesini iyileştirmek için tampon bileşiminde, homojenizasyon adımlarında ve santrifüjleme dönüşlerinde değişiklikler yapılabilir. Bu yönlerdeki değişiklikler, dokunun metabolik talebine, genel organ fonksiyonuna, mitokondriyal yoğunluğa ve diğer faktörlere dayanmaktadır. Karaciğer ve iskelet kası gibi dokularda, mitokondriyal bütünlüğü korumak ve mitokondriyal membranlara verilen hasarı sınırlamak için el tipi homojenizatörler kullanılır21. Bununla birlikte, böbreklerden izole edilirken, bazı protokoller daha iyi sonuçlar elde etmek için manuel olarak çalıştırılan homojenizasyon veya ticari kitlerin kullanılmasını önermektedir22. Her iki yöntem de fonksiyonel mitokondri sağlasa da, organellerin kalitesi, bu protokolleri kullanarak izolasyonları tamamlamak için gereken ek süre nedeniyle tehlikeye girebilir. Santrifüjleme, çekirdekler ve diğer organeller gibi hücresel bileşenleri mitokondri23'ten ayırdığı için mitokondriyal proteinin ekstraksiyonu için de hayati önem taşır. İzolasyon işlemi sırasında, daha saf izolatlar elde etmek için diferansiyel veya yoğunluk bazlı santrifüjlemenin uygulanıp uygulanmayacağı tartışılmaktadır24. Yoğunluk santrifüjü, mitokondriyi peroksizomlar gibi benzer özgül ağırlığa sahip organellerden ayırabilirken, bu yöntemlerden elde edilen mitokondrinin, diferansiyel santrifüjleme kullanılarak izole edilen mitokondriye kıyasla in situ organel fonksiyonunu daha iyi temsil edip etmediği iyi bilinmemektedir. Mitokondriyal fizyoloji alanında, yoğunluğa dayalı santrifüjleme tercih edilir ve izolat saflığını artırmak için kolayca değiştirilebilir. G-kuvvetlerindeki, santrifüjleme süresindeki ve santrifüjleme dönüşlerinin sayısındaki değişikliklerin dahil edilip edilmediği, mitokondriyal saflaştırma üzerindeki etkileri nedeniyle deneyden önce dikkate alınmalıdır. Ayrıca, izolasyon sırasında tartışmasız en önemli adım olan mitokondriyal resüsüspansiyon, kazıma, girdap bazlı karıştırma veya homojenizasyon kullanımı ile çalışmalar arasında büyük farklılıklar gösterir 23,25,26. Bu tiplerin mekanik olarak yeniden süspansiyonu çok aşındırıcı olabilir ve mitokondrinin zar bütünlüğünü bozabilir. Bu nedenle bunu düzeltmek için nazik yıkama yapılmalıdır. Çok sayıda modülasyona ve önerilen metodolojilere rağmen, kemirgen modelleri için yüksek tekrarlanabilirlik ve uyarlanabilirliğe sahip daha az kapsamlı protokol vardır.

Burada açıklanan yöntemler, küçük hayvan kalp dokusundan saflaştırılmış, iyi bağlanmış mitokondri veren ayrıntılı, sağlam ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Gösterildiği gibi, bu yöntem, mitokondriyi böbreklerden, karaciğerden ve kültürlenmiş hücrelerden izole etmek için her deneyin ve/veya laboratuvar ortamının özel ihtiyaçlarını karşılamak için kolayca uyarlanabilir. Mitokondriyi burada listelenmeyen dokulardan ve diğer hayvanlardan izole etmek için daha fazla değişiklik yapılabilir. Tüm izolasyonlar için kullanılan tampon tarifleri sağlanır ve gerekirse değiştirilebilir. Yayınlanmış diğer protokollere benzer şekilde, motorlu homojenizasyon ve diferansiyel santrifüjleme uygulanır; Bununla birlikte, izolasyon kaynağına bağlı olarak tutarlı bir şekilde yüksek kaliteli mitokondriyal izolatlar sağlamak için hem kesme süresinde hem de numunelerin santrifüjlenme kuvvetinde ayarlamalar yapılır. Özellikle, bu protokol, mitokondriyal zar bütünlüğünün korunmasına ve organellerin genel işlevselliğinin korunmasına yardımcı olan peletlenmiş mitokondriyi yeniden süspanse etmek için pipetleme yoluyla nazik yıkama kullanarak diğerlerinden farklıdır. Mitokondriyal protein, ya toplam protein tayini ya da sitrat sentaz aktivitesinin ölçülmesiyle ölçülür. Bu izolasyon yönteminin faydası ve geniş uygulanabilirliği, çeşitli organizmalar ve doku kaynakları arasında elde edilen solunum kontrol oranlarının (RCR) değerleri ile daha da desteklenmektedir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm omurgalı hayvanların kullanımı ve tedavisi, Michigan Eyalet Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilen ve kabul edilen onaylanmış protokollere uygun olarak gerçekleştirildi. Bu protokol hem erkek hem de dişi Hartley albino kobayları ve Sprague Dawley (SD) sıçanları kullanılarak tasarlanmıştır. Kobaylardan kardiyak mitokondri izolasyonu için hayvanlar 4-6 haftalık (300-450 g) yaşlarda sakrifiye edildi. Her iki cinsiyetten SD sıçanlardan kardiyak mitokondri 10-13 haftalık (250-400 g) yaşlar arasında elde edildi. Tamponlar için tarifler Tablo 1'de açıklanmıştır ve önceden hazırlanmalıdır. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Deney hazırlığı

  1. İzolasyona başlamadan önce, iki adet 50 mL'lik santrifüj tüpünü "Spin 1 ve 2" ve "Spin 3" olarak etiketleyin.
  2. Tüpleri, yeni çözülmüş izolasyon tamponunu (IB), keskin kıyma makasını, monte edilmiş homojenizasyon probunu ve 5 mL'lik bir beher veya eşdeğer büyüklükte bir kabı buzun üzerine yerleştirin.
  3. Sonraki solunum tahlilleri için ısıtmak üzere yeni çözülmüş solunum tamponunu (RB) bir inkübatöre yerleştirin.
  4. Soğutmalı bir santrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutun.
  5. Tüm ekipmanın düzenlendiğinden ve "Spins 1 ve 2" etiketli tüpe Bacillus licheniformis'ten 20 μL 7-15 U/mg proteaz eklendiğinden emin olun.
  6. Kardiyopleji tamponu (CB, Tablo 1), cam kanül ve bir vana valfi takılı plastik boru kullanarak kanülasyon yoluyla perfüzyon için yerçekimine bağlı bir basınç sistemi kurun.
  7. Cerrahi aletleri düzenleyin ve kalbin diseksiyonu ve kanülasyonu için uygun makas ve forseps ekleyin.
    NOT: Tüm su saf kalitede olmalıdır (18.2 MΩ · cm)

2. Doku diseksiyonu

  1. Hayvanlara steril heparin sülfat intraperitoneal olarak 500 U / kg'lık bir dozda enjekte edin.
  2. Heparin uygulamasından sonra hayvanın indüksiyon odasında 15 dakika oturmasına izin verin. Bu süre zarfında, hayvanları tamamen oksijenlendirmek, sakinleştirmek ve ilgilenilen doku üzerinde olumsuz sonuçlara yol açabilecek stresi en aza indirmek için 2 L / dk saf O2 gazı verin.
  3. Anestezi indüksiyonunu% 0.5'te sürekli bir izofluran akışı ile başlatın. 1 dakika sonra %1'e yükseltin. %5'e ulaşılana kadar her dakika %1 artırmaya devam edin. % 5'e ulaştığında 1 dakika bekleyin ve hayvanın solunum düzenini izleyin.
  4. Solunum yavaşladığında ve yorulduğunda (yaklaşık 6.5 dakika işaretinde), izofluran ve oksijen akışını kapatın.
  5. Hayvanı indüksiyon odasından hızlı bir şekilde çıkarın ve bir pençe sıkarak ve kornea refleksini kontrol ederek uygun anestezik derinliği kontrol edin. Hayvan her iki uyarana da yanıt verirse, indüksiyon odasına geri koyun, anestezi uygulayın ve anestezik derinlik kontrolünü tekrarlayın.
  6. Uygun anestezi derinliğine ulaşıldığında, servikal omurgayı sertleştirmek için bir giyotinle hızlı bir şekilde dekapitasyon yapın ve yüzüstü gövdeyi buzun üzerine yerleştirin.
  7. Köprücük kemiğinden, göğüs kafesi boyunca yan göğüs kafesi boyunca ilerleyen iki paralel dikey kesi yapın. Kesilerin lateral torakstaki kaburgaları kesecek kadar derin olduğundan emin olun, ancak kalp veya büyük damarlar gibi intratorasik yapılara zarar vermekten kaçının.
    NOT: Dikey kesi boyutları, kullanılan hayvana bağlıdır. Gine domuzu ve sıçan kullanılıyorsa, diyaframa kesin (sıçanlar için yaklaşık 6,35 cm ve kobaylar için 11 cm). Fare kullanıyorsanız, standart bir torakotomi27 yapın.
  8. Ön göğüs boşluğunu yerinden çıkarmak için bir hemostat kullanarak kalbi açığa çıkarın ve açıkta kalan göğüs boşluğunu buzla doldurun. Bu adım, sıcak iskemi süresini en aza indirir ve izole edilen organellerin canlılığını arttırır.
  9. Timus ve perikardları kör bir şekilde incelemek ve kalbi tamamen ortaya çıkarmak için cımbız kullanın.
  10. Forseps kullanarak, aortu ortaya çıkarmak ve tanımlamak için kalbe hafif düşük çekiş uygulayın. Aort, kalbin tabanından ayrılan en kalın büyük damardır. Pulmoner ven gibi diğer büyük damarlar, aorttan belirgin şekilde daha yarı saydamdır.
  11. Aortu aort kökünün yaklaşık 4-6 mm yukarısında, ancak karotis dallanma noktalarının altında kesin.
  12. Aortu kanül edin ve kalbi28,29 buz gibi soğuk kardiyopleji (CB) solüsyonu ile yerçekimine bağlı bir basınç başlığı kullanarak koroner arterler kandan temizlenene ve organ beyazlamış görünene kadar perfüze edin.
    NOT: Büyük kemirgenler için 1.8-2.2 mm'lik bir kanül çapı iyi sonuç verirken, daha küçük kemirgenler için 1.4-1.8 mm'lik bir çap aralığı önerilir. Retro-perfüzyon, koroner damarların kandan arındırılması için 15-30 saniyeden fazla sürmemelidir.
  13. Atriyumu, kıkırdaklı kapak dokusunu ve yağ dokularını diseksiyon yaparak ventriküler miyokardı izole edin.
  14. Ventrikülleri 0.1-0.2 mL buz gibi IB içeren önceden soğutulmuş 10 mL'lik bir behere yerleştirin.
  15. Dokuyu keskin cerrahi makasla parçalar yaklaşık 1 mm olana kadar kıyın3.

3. Mitokondriyal saflaştırma ve protein miktar tayini

  1. Kıyılmış dokuyu, proteaz solüsyonunu içeren "Spin 1 ve 2" etiketli önceden soğutulmuş santrifüj tüpüne aktarın.
  2. 25 mL'lik son hacme buz gibi IB ekleyin.
  3. Motorlu bir el tipi rotor-stator homojenizatörü kullanarak, dokuyu 18.000 rpm'de buz üzerinde 20-25 saniye boyunca dağıtın.
  4. Homojenize dokuyu "Spin 1 ve 2" etiketli bir tüpte 8.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı (proteaz içeren) atık damacanaya dökerek atın ve kalan proteazı çıkarmak için peleti 5 mL IB ile nazikçe durulayın.
  6. Durulamayı attıktan sonra, peleti taze buz gibi IB ile hafif girdap ile 25 mL'lik son hacme kadar yeniden süspanse edin.
  7. 800 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı (mitokondri içerir) "Spin 3" etiketli önceden soğutulmuş 50 mL'lik bir tüpe hafifçe dökerek çıkarın. Dökerken, peletin gevşek üst kısmının yerinden çıkmamasına dikkat edin. Alternatif olarak, süpernatanı toplamak için bir transfer pipeti veya striptiz kullanılabilir.
  9. Süpernatanı 8000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  10. Elde edilen süpernatanı atın ve mitokondri içeren peleti koruyun.
  11. Tüpün iç duvarındaki fazla süpernatanı emmek için tüy bırakmayan bir mendil kullanın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. Peletleri mümkün olduğunca buz üzerinde 4 °C'de tutun.
  12. Mitokondriyi yeniden süspanse etmek için, tüpün dibine 80 μL buz gibi soğuk IB ekleyin. IB'yi pelet üzerinde tekrar tekrar yıkayarak peleti nazikçe yeniden süspanse edin.
  13. Kabarcık oluşturmasını önlemek için, 40-60 μL arasında bir hacim elde etmek ve iletmek üzere bir mikropipet ayarlayın.
  14. Mitokondriyal pelet dağıldıkça, peletlenmiş mitokondriyi verimli bir şekilde yeniden süspanse etmek için mikropipet hacmini artırın. Pipet ucuyla pelete dokunmaktan kaçının ve kabarcık yapmaktan kaçının.
  15. Yeniden askıya alındıktan sonra, mitokondriyi önceden soğutulmuş bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve stok mitokondri olarak etiketleyin. Toplam yeniden süspansiyon hacmini not edin.
  16. Numunedeki mitokondriyal protein konsantrasyonunu belirlemek için, üreticinin talimatlarında tanımlandığı gibi iyi bilinen BCA veya Bradford protein testlerini kullanarak bir toplam protein tahlili yapın.
    NOT: Verimi değerlendirmek için alternatif veya tamamlayıcı bir strateji, sitrat sentaz aktivitesini belirlemektir. Referans olarak, mitokondriyal içerik, Vinnakota ve ark.30'da açıklanan protokol izlenerek ölçülebilir.

4. Kalite kontrol kontrolleri

  1. Önceden soğutulmuş bir mikrosantrifüj tüpünde, mitokondriyal stoğu IB ile istenen çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
    NOT: Mitokondriyal stoklar, kalp dokusundan izolatlar kullanılırken respirometri deneyleri için 0.1 mg / mL nihai konsantrasyonda çalışmak üzere 40 mg / mL'ye seyreltilir.
  2. Oksigraf odalarını, tıpaları ve mikrolitre şırıngaları respirometri tahlillerinde kullanmadan önce temizlemek için damıtılmış suyla on kez durulayın.
  3. Mitokondriyal izolatların canlılığını ve kalitesini test etmek için, oksigraf odalarına 2,3 mL solunum tamponu (RB) yükleyin ve oksijen tüketim sinyalinin yaklaşık 10 dakika boyunca veya oran 0'a yakın olduğunda 37 ° C'de dengelenmesine izin verin.
  4. Sinyal dengelendikten sonra, durdurucuları aşağı doğru itin ve durdurucunun kılcal damarından çıkan fazla tamponu aspire edin.
  5. Tamponlarda veya mitokondriyal numunede kalan kalsiyumu şelatlamak için mikrolitrelik bir şırınga kullanarak 1 mM EGTA ekleyin.
  6. Solunumu beslemek için 5 mM sodyum piruvat ve 1 mM L-malat ekleyin.
  7. Substratların eklenmesini takiben, çalışma konsantrasyonunu elde etmek ve solunumun 5 dakika boyunca gerçekleşmesine izin vermek için bir bolus seyreltilmiş mitokondri ekleyin. Bu döneme LEAK veya State 2 solunumu denir.
  8. 5 dakika işaretinde, OXHPOS olarak da adlandırılan Durum 3 solunumunu başlatmak için 500 μM ADP'lik bir bolus ekleyin ve mitokondrinin anoksiye kadar nefes almasına izin verin.
  9. Durum 3 sırasındaki maksimum oksijen tüketimi oranını, Durum 2'de ADP'nin eklenmesinden hemen önceki oksijen tüketim oranına bölerek solunum kontrol oranını (RCR) hesaplayın (bkz. Şekil 1).
    NOT: 1 - 1/RCR alternatif bir RCR ifadesi, 0 ile 1 arasında sınırlanan bir kalite ölçütü olarak da kullanılabilir; ancak, RCR 10 olduğunda bu metriği kullanarak kaliteyi ayırt etmeyi > zorlaştırır (bkz. Şekil 2).
  10. Sonraki tahliller için oksigrafı temizlemek için odaları ve tıpaları 10 kez saf suyla durulayın. Respirometri tamamlandıysa, hazneleri %70 etanol ile doldurun ve bir sonraki kullanıma kadar haznelere tıpaları yerleştirin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal izolasyonun tamamlanmasının ardından, izolatların kalitesi ve işlevselliği, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak oksijen tüketim oranlarının (JO2) ölçülmesi yoluyla test edilmelidir. Bunu yapmak için, mitokondriyal stoklar, izole kardiyak mitokondri kullanılarak yapılan tüm respirometri testleri için 2 mL RB'de 0.1 mg / mL'lik çalışma konsantrasyonlarına izin vermek için 40 mg / mL'ye seyreltildi. Solunum, bir kalsiyum şelatörü olan 1 mM EGTA varlığında 5 mM sodyum piruvat ve 1 mM L-malat ile beslendi ve Durum 2 solunumu oluşturmak için 5 dakika dengelenmesine izin verildi. Bu durum sırasında, oksijen tüketim oranları ortalama 45-55 pmol/mL/s veya 27-33 nmol/mg/dk olmalıdır. Elektroda bağlı oksijen tüketim oranının farkında olun ve gerektiğinde uygun arka plan düzeltmelerini yapın. Oksidatif fosforilasyon (Durum 3), 5 μM ADP'lik bir bolus ile 5 dakika işaretinde başlatılır. Alt tabaka eklemeleri ve temsili izleme Şekil 1'de detaylandırılmıştır. Fonksiyonel mitokondri, Şekil 2'de gösterildiği gibi, doku kaynağına göre değişen ADP'nin eklenmesinden sonra JO2'de ani bir artışa sahip olacaktır. EGTA kullanılmadan, artık kalsiyum, mitokondriyal konsantrasyona, substrat mevcudiyetine ve diğer çevresel faktörlere bağlı olarak OXPHOS sırasında maksimum JO2 oranları üzerinde değişken etkilere sahiptir. Tampon bileşimi, mitokondriyal membran bütünlüğünün ve işlevselliğinin korunması için önemlidir. Protokol boyunca bahsedilen tüm tampon tarifleri Tablo 1'de daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve burada açıklanan tüm mitokondriyal preparatlar için kullanılabilir.

Mitokondrinin başarılı bir şekilde izole edilmesi, Tablo 2'de gösterildiği gibi, her tür ve doku kaynağı için verilen aralıkta yer alan RCR değerlerinin elde edilmesiyle gösterilir. Bu protokol kullanılarak toplanan verilere dayanarak, kobay, sıçan veya farelerden kardiyak mitokondri izole ediliyorsa, RCR'ler sırasıyla ≥16, ≥8 ve ≥5 olmalıdır. Sıçan karaciğerinden veya böbreğinden izole ediliyorsa, RCR'ler ≥6 olmalıdır, hücrelerden gelen RCR'ler ise 3.8'in üzerindeyse kabul edilebilir olarak kabul edilir. RCR değerleri bu aralıkların altına düşerse veya respirometri izlemelerinde kalitatif farklılıklar varsa, kontaminasyondan kaynaklanan sorunları ekarte etmek için yeni RB ve substratlar ile ek bir test yapılması önerilir. 1-1/RCR dönüşümü 0 ile 1 arasında değerler sınırlasa da, RCR değeri 10'dan büyük olduğunda cinsiyetler veya türler arasında mitokondriyal kaliteyi karşılaştırırken bu ölçüm önerilmez. Bu nedenle, tüm deneyler sırasında standart RCR değerleri (Durum 3/Durum 2 veya OXPHOS/LEAK) ölçülmüştür. Mitokondriyi fare kalplerinden, karaciğerden, böbreklerden ve hücrelerden daha iyi izole etmek için bu protokolde yapılabilecek modülasyonlarla ilgili bilgiler Tablo 3'te ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

figure-results-1
Şekil 1: Yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak yapılan kalite kontrol kontrolleri için ilgi alanları. Solunum odaları 2 mL RB ile yüklendi ve oksijen tüketim oranı 0'a yakın olana kadar 37 ° C'de dengelenmeye bırakıldı. Dengelendikten sonra, 5 mM sodyum piruvat ve 1 mM L-malat ile birlikte bir kalsiyum şelatörü olan 1 mM EGTA ilave edildi. Bu substratların eklenmesini takiben, istenen çalışma konsantrasyonunda (0.1 mg / mL) mitokondri ilave edildi ve Durum 2 solunumuna (sarı) ulaşmak için 5 dakika solunum yapmasına izin verildi. 5 dakika işaretinde, Durum 3 solunumunu (kırmızı) başlatmak için 500 μM ADP eklendi. RCR'ler, Durum 3 ile Durum 2'yi karşılaştırmak için kırmızı ve sarı kutularla gösterilen oksijen tüketim oranlarının ortalaması alınarak zamana göre belirlendi. Durum 4, yeşil kutu ile gösterilir ve ATP'nin ekstramitokondriyal ATPaz hidroliz periyodunu temsil eder ve sitokrom C deneylerinde dış zar bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılabilir. Görüntülenen veriler SD sıçan kardiyak mitokondri kullanılarak toplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Hayvan ve doku kaynaklarında temsili JO2 izlemeleri ve solunum kontrol oranları. İzole edilmiş mitokondrinin kalitesi, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak oksijen tüketim oranlarının ölçülmesiyle test edildi. Solunum, 1 mM EGTA varlığında 5 mM sodyum piruvat ve 1 mM L-malat ile beslendi. Durum 2 solunumunun stabilize olması için mitokondri ve substratların 5 dakika solunum yapmasına izin verildi. ADP ilavesinden sonra maksimum oksijen tüketimi oranları, her doku için solunum kontrol oranlarını (RCR'ler) hesaplamak için ADP'den önceki Durum 2 oksijen tüketimi oranlarıyla karşılaştırıldı. Mitokondriyal kalite, PL kontrol verimliliği standartları ile karakterize edilen 1-1 / RCR değerleri hesaplanarak daha da değerlendirildi. Her izlemenin sağındaki çubuk grafikler, belirli bir doku için erkek (mavi) ve dişi (yeşil) ortalama RCR ve SD'± 1-1/RCR değerlerini gösterir. (A), (B) ve (C) sırasıyla kobaylar, Sprague Dawley (SD) sıçanları ve Friend lösemi virüsü B (FVB) fare kalpleri kullanılarak toplanan verileri ifade eder. (D) ve (E) SD sıçan karaciğeri ve böbreğinden elde edilen sonuçları detaylandırırken, (F) HEK293 hücrelerini ifade eder. Üç büyük karaciğer lobu toplanırken, her iki böbrek de izolasyon için kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Tampon tarifleri. İzolasyon işlemi boyunca kullanılan kardiyopleji tamponu (CB), izolasyon tamponu (IB) ve solunum tamponu (RB), listelenen talimatlara göre önceden hazırlanmalıdır. CB 4 °C'de bir aya kadar saklanabilirken, IB ve RB -80 °C'de 4 ay saklanabilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Solunum kontrol oranı analizi. Fonksiyonel analizler için mitokondriyal izolasyon, hem erkek hem de dişi kemirgenlerde ve ayrıca HEK293 hücrelerinde çok çeşitli tür ve doku kaynaklarında gerçekleştirildi. Her cinsiyetin, doku kaynağının ve türün örneklem boyutu, SD'± ortalama RCR ve 1-1/RCR değerleri ile birlikte detaylandırılmıştır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Protein verimini artırmak için farklı dokular için mitokondriyal izolasyon protokolüne önerilen modülasyonlar. Doku kaynağına göre proteaz ve santrifüj miktarlarındaki değişiklikler görüntülenir. Ortalama toplam protein (mg) miktarları, BSA protein testinin sonuçlarından ve nihai mitokondriyal peletin yeniden süspansiyon hacminden hesaplandı. Değerler ortalama ± SD olarak rapor edilir. Santrifüjleme sütununda yer alan kalın talimatlar, süpernatantın atılıp atılmayacağı, tutulup tutulmayacağı veya bir havuzda toplanıp toplanmayacağı konusunda tavsiyede bulunur. Atma, süpernatantın bir biyolojik atık kabına atılmasını ifade ederken, tutma ve havuzlama, süpernatantın sırasıyla bir sonraki santrifüj tüpüne aktarılmasını veya son dönüş için toplanmasını ifade eder. Protokolde yapılan değişikliklerle ilgili daha fazla ayrıntı tartışma bölümünde bulunabilir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde kısaca tarif edilen yöntemlere bağlı kalmak, diğer doku tiplerine ve kaynaklarına ek olarak, küçük kemirgenlerin kalp dokusundan iyi bağlanmış mitokondrinin izolasyonunu sağlayacaktır. Genel olarak, işlem toplam 3-3,5 saat sürmelidir, bu süre zarfında tüm hayvan dokusu, numuneleri ve izolatları, bozulmayı sınırlamak için mümkün olduğunca 4 °C'de buz üzerinde kalmalıdır. Bu prosedür sağlamdır ve kullanılan deneysel hedeflere ve modellere daha iyi uyması için çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Doku diseksiyonu işlemi sırasında yapılabilecek bir modülasyon, heparinin dışlanmasıdır. Heparin, kan pıhtılarının(31 ) oluşumunu önlemek için uygulanır, ancak kalp kanüle edilir ve yeterince hızlı bir şekilde perfüze edilirse (dekapitasyondan sonraki 1,5 dakika içinde) gerekli değildir. Ayrıca, daha büyük kemirgenler için CB kullanılarak kalbin perfüzyonu önerilir, bu nedenle fare kalpleri veya diğer organlarla çalışırken, kıyma ve ilk homojenizasyondan önce IB yıkamalarının dahil edilmesi tavsiye edilir. Bu adım, diseksiyon işleminden taşınan kanın atılmasını sağlar. Diğer değişiklikler, mitokondriyal protein verimini artırmak için homojenizasyon ve santrifüjleme hızlarındaki değişiklikleri içerir. Yukarıda özetlenenler, kardiyak mitokondriyi kobay ve sıçanlardan izole etmek içindir. Daha da önemlisi, bu protokol mitokondriyi kemirgen karaciğeri, böbrekler, fare kalpleri ve hücrelerden izole etmek için uyarlanabilir. Belirli doku tiplerine ve hayvanlara dayalı olarak proteaz, homojenizasyon ve santrifüjleme hacminde önerilen değişiklikler Tablo 3'te daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Son santrifüjleme adımından saflaştırılmış mitokondriyal peletin oluşumundan sonra, mitokondri önceden soğutulmuş IB'de yeniden süspanse edilmelidir. Eklenen IB hacmi, mitokondriyal peletin boyutuna bağlıdır, ancak kobaylar ve sıçanlar için yaklaşık 80 μL'dir. Fare kalplerinden izole ediliyorsa, yeniden süspansiyon için 60 μL IB eklenir. Mitokondriyi ilk kez izole ederken, stok çözeltisini seyreltmemek için daha küçük hacimlerde IB eklenmesi tavsiye edilir. Karaciğer ve böbreklerden alınan numunelerin saflaştırılmasından sonra oluşan mitokondriyal peletlerin kıvamı nedeniyle, resüspanse için çok daha az IB (20 μL) eklenmelidir. Diğer yöntemler, mitokondriyal membranlar için aşındırıcı olabilen ve genel bütünlüğü azaltabilen kazıma yoluyla mekanik yeniden süspansiyonun kullanılmasını önermektedir32,33. Bu protokolü kullanırken, mitokondrinin kalitesini artırmak için peletin IB ile nazikçe yıkanması tavsiye edilir. Bu işlem sırasında, zarın yırtılmasına ve proteinin yanlış katlanmasına34 yol açabileceğinden, pipetin ucuyla kabarcık oluşturmamaya veya peleti bozmamaya dikkat edin. Pipetin yalnızca ilk durağına kadar itmek, kabarcık oluşma olasılığını azaltmaya yardımcı olabilir. Peletin tamamı süspansiyon haline gelene kadar nazik pipet yıkama yapılmalıdır. Gine domuzu ve sıçanlardan elde edilen kardiyak mitokondri için toplam resüspansiyon verimi 150-200 μL olmalı ve açık kahverengi renkte görünmelidir. Daha konsantre numuneler, kahverenginin daha koyu bir tonu olacaktır ve mitokondriyal proteinin miktar tayininden sonra istenen çalışma konsantrasyonu aralığına uyacak şekilde seyreltilebilir.

BSA kullanan standart protein tahlilleri, mitokondriyal protein miktar tayini için optimaldir35. Protein tahlilleri, üreticinin protokolü tarafından tanımlanan önerilen süreler ve sıcaklıklar için geciktirilmeli ve inkübe edilmelidir. İzole mitokondri için, 37 °C'de 30 dakika inkübe etmek, iyi yayılmış renk gelişimi ve doğru protein miktar tayini sağlar. Toplam protein miktarını ölçerken, protein tahlil sonuçlarının kalibrasyon aralığında olmasını sağlamak için ilk önce yeniden askıya alınan mitokondri ve IB'nin 1:50, 1:100 ve 1:200 oranlarında seyreltilmesi önerilir. Standart olarak BSA kullanılarak protein tahlillerinin nasıl yapılacağına ilişkin daha fazla ayrıntı, üreticinin kitine göre sağlanmıştır, bu nedenle burada listelenen öneriler geçerli olmayabilir. Her numunedeki mitokondriyal içeriği belirlemek için bir CS testi de yapılmalıdır. Bu test iyi bilinmektedir ve mitokondriyal alt tipler36 arasındaki biyolojik farklılıklar incelenirse daha fazla normalizasyona izin verir.

Protein tayinini takiben, respirometri deneyleri için istenen nihai çalışma konsantrasyonunu elde etmek için mitokondriyal stok seyreltilmelidir. Gine domuzlarından ve sıçan kalplerinden izole edilen mitokondri 40 mg / mL'ye seyreltilir ve bu stokun 5 μL'si solunum odasına eklenerek 0.1 mg / mL'lik bir çalışma konsantrasyonu elde edilir. Tek fare kalplerinden veya böbreklerden ve karaciğerden izole ediliyorsa, mitokondriyal stoğun seyreltilmesi gerekli olmayabilir. İstenilen konsantrasyonları elde etmek için daha büyük hacimlerde mitokondri de eklenebilir. Durum 2 sırasında 35-55 pmol / mL / s arasındaki oksijen tüketim oranları çoğu respirometri analizi için kabul edilebilir28. RCR'lerin nasıl yürütüldüğü ve analiz edildiği ile ilgili ayrıntılar Şekil 1'de ve temsili sonuçlar bölümünde açıklanmıştır; Bununla birlikte, solunumun piruvat ve malat tarafından beslendiğine dikkat etmek önemlidir. Süksinat ve rotenon gibi diğer substrat koşulları, P/O oranı ve diğer biyoenerjetik değişkenler farklı olduğundan farklı RCR değerlerine neden olacaktır37. Solunum yakıtları olarak piruvat ve malatın kullanılması, maksimum TCA döngüsü döngüsüne ve indirgeyici eşdeğerlerin üretimine yakın bir şekilde elde edilir; bununla birlikte, 5 mM piruvat, 1 mM L-malat ve 20 mM süksinat ile maksimum TCA döngüsü aktivitesi ve birleştirilmiş ETS fonksiyonu elde edilir. Durum 3 sırasında oksijen tüketim oranlarını ölçmek için oksidatif fosforilasyonu uyarırken, ADP, adenin nükleotid translokatörünün38 ADP'si için tahminiKD'nin en az 10 katı konsantrasyonlarda eklenir. Bu, 350 μM ADP'den daha büyük boluslarla elde edilebilir ve bu nedenle tüm deneysel deneylerde 500 μM kullanılmıştır. Durum 3'ün süresi çok kısaysa, uzatmak için daha düşük mitokondriyal konsantrasyonlar kullanılabilir. Solunumun daha fazla analizi için, deneysel parametrelere daha iyi uyması için sisteme verilen ADP konsantrasyonunamodülasyonlar yapılabilir 39. Bu protokol ilk geliştirilirken, mitokondriyal izolatların40 dış zar bütünlüğünü değerlendirmek için bir sitokrom C testi kullanıldı. RCR değerleri beklenen aralıkların altındaysa, dış zar hasarının önemli olup olmadığını değerlendirmek için sitokrom C testini yapın. Bunu yapmak için, solunum odasına 10 μM sitokrom C ekleyin ve solunumdaki artışın Durum 4 oranının% 5 veya 10'unun altında olduğunu doğrulayın. Beklenen aralıklar daha önce yayınlanmış çalışmalardan bulunur ve türe, dokuya ve substrata özgüdür. Sitokrom c ilavesi, Durum 4 solunumunu %10'un üzerinde uyarırsa, hasarlı mitokondriyi uzaklaştırmak için son 8.000 x g spin tekrarlanabilir. Bununla birlikte, dış zar hasarı bir hastalık fenotipinin bir parçası olabilir ve bu nedenle sitokrom C testi bu akılda tutularak yorumlanmalıdır41. Düşük (%<10) sitokrom C ile uyarılmış etkilere sahip tutarlı bir şekilde yüksek RCR değerleri elde edildiğinde, bu test yalnızca RCR değerleri kabul edilebilir aralıkların dışındaysa gerekli ve tavsiye edilir. Sitokrom C testi% <10 ise ve RCR değerleri Tablo 2'de detaylandırıldığı gibi beklenen aralığın dışındaysa, 10 kez damıtılmış su ile yıkadıktan sonra yeni RB ile respirometri testini tekrarlayın. Hala azalmış oranlar gözlenirse, sorunu teşhis etmek için taze reaktiflerin (piruvat, malat, EGTA ve ADP) yapılması gerekir. Ek olarak, sitokrom C testleri, ELISA'lar ve TMRE33,42 gibi mitokondriyal boyaların kullanılması yoluyla gerçekleştirilebilir. Doku tipine ve kaynağına bağlı olarak, bu seçenekler dış zar bütünlüğünü belirlemek için daha uygun olabilir.

Kardiyak mitokondriyi izole etmek için kullanılan bu protokolün önemli bir sınırlaması olmasa da, bu yöntemleri kullanırken bazı hususların dikkate alınması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Mitokondriyal izolatların kalitesi, sıcaklıktan ve hem kalbi perfüze etmek hem de saflaştırılmış peleti yeniden süspanse etmek için geçen süreden büyük ölçüde etkilenir. Bu nedenle, burada bildirilenlerle karşılaştırılabilir RCR'ler elde etmek için bu süreçlere aşinalık gerekebilir. Ek olarak, izolasyon işlemi sırasında kullanılan tamponların ve çözeltilerin bileşimi, mitokondriyal bütünlüğü ve işlevi doğrudan etkilediği için önemlidir43. Tablo 1'de listelenen tamponlar referans olarak verilmiştir ve çeşitli doku kaynakları boyunca iyi bağlanmış mitokondrinin izolasyonuna izin vermiştir, ancak solunum analizlerinde klorür miktarını sınırlamak için değişiklikler yapılabilir, çünkü bu adenin nükleotid translokasyonu ve ETS fonksiyonu28 ile etkileşime girebilir. Tampon bileşimi, karaciğer mitokondrisini daha iyi izole etmek için de değiştirilebilir. Karaciğerin yağ asidi konsantrasyonları yüksek olduğundan, beklenen aralığın dışında RCR'ler gözlenirse, organ ve kıyma dokusunun yüksek konsantrasyonlarda BSA içeren bir tampon ile yıkanması tavsiye edilir. Karaciğer bölümlerinden elde edilen mitokondriyal izolatların kalitesi iyi bağlanmış ve tutarlı olmasına rağmen, bu değişiklik organel fonksiyonunun iyileşmesine neden olabilir. Ayrıca, bu yöntemleri kullanan hücrelerden mitokondri izolasyonunun, potansiyel bir sınırlama oluşturan büyük miktarda kültürlenmiş hücre gerektirdiği de kabul edilmelidir. Ayrıca, bu protokol hücresel izolatlar için özel olarak tasarlanmamıştır, ancak uygulandığında başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, kültürlenmiş hücreler için hedeflenen izolasyon yöntemleri daha iyi kullanılabilir. Alternatif olarak, mitokondriyal kaliteyi değerlendirmek için araştırmacılar, RCR'leri hesaplamak için floresan probları tercih edebilirler. Spektroflorometrik yöntemler, özellikle daha düşük miktarlarda protein ekstrakte ediliyorsa popüler bir seçimdir44,45.

Genel olarak, bu protokol, kobay ve sıçan gibi küçük hayvanlardan iyi bağlanmış kardiyak mitokondriyi tutarlı bir şekilde izole etmek için kullanılabilir. Fare kalplerinden, karaciğerden, böbreklerden ve hücrelerden mitokondriyal izolasyona izin vermek için homojenizasyon hızlarını, santrifüjleme sürelerini ve dönüş sayısını değiştirerek protein verimini artırmak için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, bu protokol, deniz lamprey46 gibi memeli olmayan türlerin mitokondriyal fonksiyonunu araştırmak ve ayrıca klasik ve kriyo-elektron mikroskobu40,47 kullanarak yapısal analiz yapmak için kullanılacak kadar genel ve sağlamdır. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, sağlam hücre ve doku sistemlerinde mitokondriyal davranışın araştırılmasına odaklanırken, bu yöntemler kullanılarak izole edilmiş mitokondriden elde edilen bilgilerin genişliği ve derinliği, metabolomik, oksidatif stres ve ATP üretimi üzerindeki etkileri ortaya koymaktadır. İyi bağlanmış mitokondrinin izolasyonu, araştırmacıların, tüm hücre modellerinde başka türlü mümkün olmayan hastalık gelişimi ve ilerlemesinin temel yönlerini araştırmalarına olanak tanır. Bu protokolün çok yönlülüğü nedeniyle, kardiyovasküler hastalık, diyabet ve nörolojik bozukluklar gibi patolojilerde gözlenen mitokondriyal enerjideki değişiklikler burada açıklanan metodoloji kullanılarak araştırılabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar açıklanacak bir şey olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daniel A. Beard ve Kalyan C. Vinnakota'ya bu protokole yaptıkları temel katkılardan dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma NSF KARİYER hibesi MCB-2237117 tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.7 mL mikrosantrifüj tüpleri
10 mL cam beherOrgan diseksiyonu ve kıyma için
50 mL santrifüj tüpleriSantrifüj
Adenozin 5'-difosfat monopotasyum tuzu dihidratSigma A5285Respirometri tahlilleri
BSA Protein Test KitiTermo KantifikPI23225Mitokondriyal protein miktar tayini
DekstrozSigma DX0145Tampon (CB) için
Etilen glikol-bis (2-amino-etileter) -N, N, N ', n'-tetraasetik asit Sigma E4378Tamponlar (CB ve IB) ve respirometri deneyleri için
Cam kanülRadnotiKobay ve sıçan kalbi perfüzyonu
Heparin sodyum domuz mukozasıSigma SRE0027-250KUHayvan IP enjeksiyonu
Yüksek çözünürlüklü respirometreClark tipi elektrot; 2 mL odacıklı oksigraf
İndüksiyon odası
İzofluranSigma 792632Anestezi 
L-malik asitSigma 02288-50GRespirometri tahlilleri
Magnezyum klorür heksahidratSigma M9272Tampon (RB)
MannitolSigma için MX0214Tampon (IB) Mikrolitre
şırıngalar5 & ndash arasında değişen boyutlar; 50 ve mikro; L
Mikroplaka okuyucu37 ° C'de inkübe edebilmelidir; C 
MOPSSigma 475898Tüm tamponlar için
O2 tankı
OMNI THQ HomojenizatörOMNI International 12-500Benzer rotorlu stator homojenizatörler çalışacak
pipetler Hacimler  2– 20 ve mikro; L; 20– 200 ve mikro; L; 200– 1000 ve mikro; L
Potasyum klorürSigma P3911Tamponlar için (RB ve CB)
Potasyum fosfat dibazikSigma 795496Tamponlar için (IB ve RB)
Bacillus licheniformis Sigma'dan proteaz P5459
Sodyum klorürSigma S9888Tampon (CB)
Sodyum piruvatiçin Fisher biyoreaktifleriBP356-100Respirometri tahlilleri
SükrozSigma 8510-OPTampon (IB)
için Cerrahi diseksiyon kitiHayvan ve doku kaynağına bağlıdır
Masa üstü santrifüj4 dereceye kadar soğumalıdır; C 
için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  2. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  3. Ernster, L., Schatz, G. Mitochondria: A historical review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  4. Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease. Nat Commun. 11 (1), 102(2020).
  5. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  6. Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).
  7. Kalpage, H. A., et al. Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis. Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).
  8. Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. Mitochondrial respiratory chain complexes. Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).
  9. Mitchell, P., Moyle, J. Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).
  10. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  11. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).
  12. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  13. Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association. Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).
  14. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  15. Holzem, K. M., et al. Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts. FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).
  16. Cordero-Reyes, A. M., et al. Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function. J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).
  17. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  18. Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).
  19. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  20. Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide. PLoS One. 7 (9), e44667(2012).
  21. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  22. Micakovic, T., et al. Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes. Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).
  23. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).
  24. Hubbard, W. B., et al. Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue. Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).
  25. Zhou, D., et al. Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).
  26. Hernandez-Camacho, J. D., et al. Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays. J Vis Exp. (180), e63336(2022).
  27. Farrugia, G. E., et al. A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts. STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).
  28. Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function. PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).
  29. Vinnakota, K. C., et al. Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2). Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).
  30. Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria. Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).
  31. Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. Statpearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).
  32. Sercel, A. J., et al. Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer. STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).
  33. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. J Vis Exp. (97), e52076(2015).
  34. Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential. PLoS One. 7 (10), e47254(2012).
  35. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  36. Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster. J Vis Exp. (155), e59454(2020).
  37. Tomar, N., et al. Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).
  38. Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis. FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).
  39. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709(2011).
  40. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).
  41. Zhou, Z., et al. Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease. Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).
  42. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members. Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).
  43. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate. J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  44. Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer. Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).
  45. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).
  46. Huerta, B., et al. Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites. Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).
  47. Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism. PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mitokondriyal Safla t rmaSolunum Kontrol OranProtein KantifikasyonuOrgan DiseksiyonuBiyoenerjetik BozulmaKalsiyum Fosfat Gran lleriKalp Yetmezli iMitokondriyal Fizyoloji

İlgili makaleler