Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Psödostratifiye Akciğer Hava Yolu Epitelinin Siliyer Fonksiyonunun ve Membran Geçirimsizliğinin Belirlenmesi

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67094

⸱

21 Şubat 2025

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

Bu makalede

Özet

Hava-sıvı arayüz kültürü, akciğer hava yolunun apikal tarafını taklit eden primer normal insan bronşiyal epitel hücrelerini farklılaştırarak psödostratifiye hava yolu epiteli geliştirmek için yaygın olarak kullanılır. Burada, siliyer fonksiyon ve membran bütünlüğü gibi biyofiziksel özelliklerini izleyerek kalitesini belirlemek için kolay bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Hava-sıvı arayüzünde (ALI) primer akciğer hava yolu epitel hücrelerinin ayırt edilmesi, akciğer hava yolunun apikal tarafını taklit eden çok hücreli psödostratifiye bir hava yolu epiteli geliştirmek için popüler bir tekniktir. Primer akciğer hava yolu hücrelerinin farklılaşması beklenirken, siliyer fonksiyon ve membran geçirimsizliği gibi biyofiziksel özelliklerin değerlendirilmesi, hava yolu epitelinin kalite değerlendirmesini sağlar ve deneyin güvenilirliğini sağlar. Burada, ALI kültüründe çok hücreli psödostratifiye hava yolu epitelinin geliştirilmesi için basit bir protokol tanımlanmış ve iki önemli biyofiziksel özelliği değerlendiriyoruz: siliyer fonksiyon ve membran geçirimsizliği. Siliyer fonksiyonu belirlemek için, ters çevrilmiş bir mikroskoba bağlı yüksek hızlı bir kamera kullanarak 4 haftalık farklılaşmış bir hava yolu epitelinin siliyer hareketini yakaladık ve ardından Simon Amon Video Analizi (SAVA) sistemini kullanarak siliyer atım frekansını (CBF) ölçtük. Ayrıca hava yolu epitelinin epitel bariyer bütünlüğünü belirlemek için volt-ohm metre kullanarak transepitelyal elektrik direncini (TEER) ölçtük.

Giriş

Astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ve kistik fibroz gibi kronik solunum yolu hastalıkları, dünya çapında başlıca sağlık sorunlarından bazılarıdır1. İnsan gribi A virüsü, respiratuar sinsityal virüs (RSV) ve şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) gibi virüslerin neden olduğu solunum yolu hastalıklarının yaygınlığı da ekonomik ve halk sağlığı yüküneneden olmaktadır 2. Bu nedenle, geri dönüşü olmayan solunum dokusu hasarına yol açan solunum yolu hastalıkları için tedavi rejimlerinin geliştirilmesine büyük ihtiyaç vardır. Solunum epitel dokusunun kendisi sadece oksijen alımında rol oynamakla kalmaz, aynı zamanda vücudu istilacı patojenlerden ve tehlikeli kimyasallardan korumak için bir bariyer sağlar3. Solunum epiteli, üç ana hücre tipinden oluşan karmaşık bir hücresel organizasyona sahiptir: kirpikli hücreler, goblet hücreleri ve bazal hücreler. Son zamanlarda, hava yolu epiteli4'te yeni fakat nadir iyonosit hücrelerinin varlığı hakkında bir rapor yayınlanmıştır. Karmaşık doku, antimikrobiyal peptitlerin salgılanması, adaptif bir bağışıklık tepkisini aktive etmek için sitokin salınımı ve mukosiliyer klerens5 gibi doğuştan gelen bağışıklık tepkileri sağlamak için koordineli bir şekilde işlev görür. Uygun bir hava yolu modelinin olmaması, solunum yolu enfeksiyonlarının incelenmesinin ve tedavilerin geliştirilmesinin önündeki engellerden biridir.

Hava-sıvı arayüzü (ALI) modeli, solunum yolu hastalıkları üzerine araştırmalar için önemli bir araç haline geliyor6. Etkili bir in vitro akciğer hava yolu modelidir, çünkü birincil akciğer hava yolu hücreleri, genellikle hava yolunun apikal tarafında bulunan en az üç tip hücreden oluşan psödostratifiye bir hava yolu epiteline farklılaşır. İlk olarak, siliyer hücreler hava yolunun apikal tarafının çoğunu kaplar ve mukosiliyer klerense katkıda bulunur. İkincisi, goblet hücreleri mukus üretir ve hava yolunun apikal tarafında siliyer hücrelerle birlikte bulunan en büyük hücrelerdir. Üçüncüsü, bazal hücreler hava yolunun bazal tabakasında bulunur ve farklı epitel hücrelerine farklılaşan progenitör hücrelerdir 5,7. İyonositler ve tutam hücreleri hava yolu epitelinde nadir olmakla birlikte, siliyer fonksiyon ve membran geçirgenliğinde de rol oynayabilirler4. Bu teknik, in vivo akciğer ortamını taklit etmeyen geleneksel batık hücre kültüründen farklıdır. ALI, sağlıklı insanlardan, astımlı hastalardan ve KOAH'lı hastalardan elde edilen primer epitel hücrelerinden üretildiğinden, enfeksiyon ve hastalık patofizyolojisine verilen yanıtları incelemek için daha çeşitli bir platform sunar.

ALI tarafından geliştirilen kültürlerin sağlık değerlendirmesi, kültürlenmiş hücrelerin canlılığını, işlevselliğini ve fizyolojik uygunluğunu sağlayarak izlenmesi gereken önemli bir husustur. ALI kültürlerinin bütünlüğüne, güvenilirliğine ve tekrarlanabilirliğine olan güveni artırır. Daha önce yayınlandığı gibi, grubumuz iki biyofiziksel parametreyi değerlendirerek ALI kültür bütünlüğünü değerlendirmektedir: siliyer atım frekansını (CBF) ölçerek siliyer fonksiyon ve transepitelyal elektrik direncini (TEER) belirleyerek epitel bariyer bütünlüğünü değerlendirmektedir6,7,8. Mukosiliyer klerens (MCC), siliyer hücreler tarafından taşınan hava yolu epitelinin önemli özelliklerinden biridir. Kirpikli hücrelerin yüzeyindeki kirpikler adı verilen özel organeller, hava yolu epitelinin mukoza tabakasına sıkışmış enfeksiyonların ve solunan parçacıkların hava yollarını temizlemek için metakronal dalgalar halinde atar. Etkili MCC tamamen uygun siliyer aktiviteyebağlıdır 9. İyi bir CBF, sağlıklı, sağlam bir hava yolu epitelinin göstergesidir; bu nedenle, ALI kültürleri için CBF'nin izlenmesi, epitelin bütünlüğü hakkında değerli bilgiler sağlar10. CBF'yi ölçmenin birden fazla yolu olmasına rağmen, örneğin, yüksek hızlı video mikroskobu11 ve faz çözümlü Doppler optik koherens tomografi12, her yöntem teknik uzmanlık ve özel ekipman gerektirir. Bu protokolde, diferansiye hava yolu epitelinin CBF'sini ölçmek için daha kolay ve daha az teknik bir yol sunuyoruz. Ayrıca, epitel dokularının bütünlüğünü ve bariyer fonksiyonunu gösteren aynı epitelin TEER'sini ölçmek için bir yöntem tanımladık13.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Protokol, biyogüvenlik seviyesi 2 laminer akış başlığı (biyogüvenlik kabini) altında steril bir durumda gerçekleştirilmelidir. Tüm ortam ve çözeltiler kullanımdan önce 37 °C'de çözülmelidir. Santrifüjleme 4 °C'de yapılmalıdır. Deneyde kullanılan tüm materyallerin steril olması gerekmektedir. Birincil hücreler (tanımlanmamış donör), Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi'nde (UNMC), Omaha, NE'de Dr. Kristina Bailey ile işbirliği içinde elde edildi. Birincil hücreler, kimliği belirsiz donörlerdendir ve hücreler NIH İnsan Deneği kapsamına girmez. Hücreler, Kuzey Dakota Üniversitesi, Grand Forks, ND ve UNMC, Omaha, NE arasında onaylanmış bir Malzeme Transfer Anlaşması (MTA) kapsamında elde edildi. Burada 4 adet NHBE hücresi kullandık. Daha yüksek pasajlı NHBE hücrelerinin (pasaj 8'e kadar) da hava yolu epiteline farklılaştığı gösterilmiş olsa da, 1 ila 4 arasındaki pasajlar arasında tüm genom transkripsiyon profillerinde belirgin bir fark olmadığı için rutin olarak dört NHBE hücresi kullanıyoruz 6,14.

1. Birincil hücre kültürü

NOT: Birincil hücrelerin dikkatli bir şekilde kullanılması çok önemlidir. Tüm protokol, birincil hücrelerin sert muamelesinden ve aşırı pipetlenmesini önlemelidir.

  1. Steril bir serolojik pipet kullanarak, kabı önceden kaplamak için 100 mm'lik bir doku kültürü (TC) kabına 5 mL kollajen ekleyin. TC kabını kollajen ile oda sıcaklığında (RT) 20 dakika inkübe edin.
  2. Steril bir serolojik pipet kullanarak, kollajeni TC kabından aspire edin ve bunu% 2 (h / h) penisilin-streptomisin ve% 1 (h / h) amfoterisin B ile desteklenmiş 8 mL önceden çözülmüş tam hava yolu epitel hücresi (AEC) ortamı ile değiştirin (Tablo 1).
  3. Bir flakon (5 x 105 hücre içeren) primer normal insan bronşiyal epitel (NHBE) hücrelerini 37 ° C'de bir su banyosunda çözün.
  4. 5 mL'lik steril serolojik pipet ile, NHBE hücrelerini iklimlendirmek için hücrelere damla damla 1 mL önceden çözülmüş tam AEC ortamı ekleyin ve tüm hücreleri steril 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
  5. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 212 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Ortamı tüpten nazikçe atın ve tüpte kalan orta damlalardaki hücreleri hafifçe vurarak yeniden süspanse edin.
    NOT: Aşırı ve sert vurmalardan kaçınılmalıdır.
  6. 5 mL'lik steril bir serolojik pipet kullanarak, yeniden süspanse edilmiş hücrelere yavaşça 2 mL tam AEC ortamı ekleyin ve tüm hücreleri toplayın.
  7. Hücreleri, 8 mL tam AEC ortamı ile önceden eklenmiş plakaya ekleyin. Tabaktaki hücreleri eşit şekilde dağıtmak için TC kabını yana doğru hareket ettirin.
  8. Hücreleri 37 °C'de% 85 -% 95 nemli CO2 hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. 24 saat sonra, NHBE hücrelerini mikroskop altında TC kabına bağlanmaları ve büyümeleri için 10x veya 20x'te gözlemleyin. Hücreler ortamda asılı kalırsa, bu ölü hücreleri gösterir.
  9. 48 saat sonra, eski besiyerini TC kabından steril bir serolojik pipetle aspire edin.
  10. Steril bir serolojik pipet kullanarak, hücrelere 10 mL önceden ısıtılmış, tam AEC ortamı ekleyin. Medyayı yavaşça bir köşeye ekleyin; Hücrelerin üstüne doğrudan dökmekten kaçının.
  11. Hücreler %95-100 birleşmeye ulaşana kadar tüm AEC ortamını her 48 saatte bir değiştirin.

2. Hava-Sıvı arayüz kültürü

  1. Bir P200 pipeti kullanarak, 0,4 μm gözenekli polyester membranlı (bundan sonra ekler olarak anılacaktır) önceden kaplanmış 6,5 mm'lik bir transwell ek parçasına 100 μL kollajen ekleyin ve 20 dakika boyunca RT'de inkübe edin.
  2. Steril bir serolojik pipet ile, ortamı birleşen NHBE hücrelerinden aspire edin.
  3. TC kabının bir köşesine steril bir serolojik pipet ile 5 mL 1x Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salini (DPBS) ekleyin.
  4. Hücreleri yıkamak için plakayı hafifçe döndürün ve 1x DPBS'yi steril bir serolojik pipetle aspire edin. Protokol sırasında herhangi bir adımda hücrelerin kurumadığından emin olun.
  5. Serolojik bir pipet kullanarak, hücrelere 5 mL TripsinLE ekleyin ve tüm hücreler plakanın alt yüzeyinden ayrılana kadar nemli bir CO2 hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
  6. Steril bir serolojik pipet kullanarak, tüm hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Steril bir serolojik pipet ile TC kabına 3 mL tripsin ekleyin ve kalan hücreleri toplayın.
  7. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 212 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Ortamı atın ve tüpte kalan tripsin damlalarındaki hücreleri yeniden süspanse etmek için tüpe hafifçe vurun.
  8. Serolojik bir pipet kullanarak, yeniden süspanse edilmiş hücrelere 2 mL tam AEC ortamı ekleyin.
  9. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
  10. Hücreleri, her bir ek 200 μL'lik bir hacimde 5 x 104 hücre alacak şekilde tam AEC ortamıyla seyreltin.
  11. Steril forsepslerle, ekleri 24 oyuklu bir kültür kabında boş bir kuyuya aktarın.
  12. Bir P1000 pipeti kullanarak, plakanın bazal kuyucuğuna 500 μL tam AEC ortamı ekleyin.
  13. Steril forseps kullanarak, ekleri eklenen eksiksiz AEC ortamı ile bazal kuyuya geri aktarın.
  14. Bir P200 pipeti ile, ekin apikal tarafına 200 μL'lik tam AEC ortamında 5 x10 4 yeniden askıya alınmış NHBE hücresi ekleyin. Hücreleri 37 °C'de %85 - %95 nemli CO2 hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
  15. 24 saat sonra, kuyuda birleşik bir tabaka oluşturup oluşturmadıklarını görmek için hücreleri mikroskop altında gözlemleyin.
    NOT: Hücreler birleşik bir tabaka oluşturmazsa, bazal AEC ortamını, hücreler birleşik bir tek katman oluşturana kadar her 48 saatte bir taze, tam AEC ortamı ile değiştirin. Bazal ortamı değiştirirken, ekleri steril forseps ile boş kuyuya aktarın. Eski besiyerini bir P1000 pipeti ile aspire edin, taze besiyeri ekleyin ve ekleri yeni, eksiksiz AEC besiyerine geri yerleştirin.
  16. Hücreler birleştikten sonra, ekleri steril forseps ile boş bir kuyuya aktarın. Bir P1000 pipeti kullanarak tüm bazal AEC ortamını aspire edin.
  17. Bir P1000 pipeti ile, bazal kuyucuğa %2 (h/h) penisilin-streptomisin ve %1 (h/h) amfoterisin B ile desteklenmiş 500 μL taze tam hava-sıvı arayüz farklılaştırması (ALI) ortamı ekleyin.
  18. Steril forseps kullanarak ekleri ilave edilmiş tam ALI ortamı ile bazal kuyuya aktarın. Bir P200 pipeti kullanarak, apikal AEC ortamını kuyudan nazikçe aspire edin.
    NOT: Apikal taraf, tam ALI ortamı ile eklenmemelidir. Herhangi bir hücre ayrılmasını önlemek için AEC ortamını apikal taraftan dikkatlice aspire edin.
  19. Hücreleri nemli bir CO2 hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin. 48 saat sonra, ekleri steril forseps ile boş bir kuyuya aktarın.
  20. Bir P1000 pipeti kullanarak eski ortamı aspire edin ve taze 500 μL tam ALI ortamı ekleyin.
  21. Steril forsepslerle, ekleri taze ortamla kuyuya geri yerleştirin. Tam ALI ortamını her 48 saatte bir 28. güne (dört hafta) kadar değiştirmeye devam edin.
  22. 28. günde, bir P200 pipeti kullanarak, eklerin apikal tarafına 100 μL 1x DPBS ekleyin ve nemli bir CO2 hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. 1x DPBS'yi bir P200 pipeti ile aspire edin.
    NOT: DPBS, doğrudan hücrelere değil, duvara dökülerek eklenmelidir. DPBS'yi aspire ederken, epitele dokunmaktan ve kuvvetli pipetlemeden kaçının çünkü epiteldeki herhangi bir hasar epitel (doku benzeri) bütünlüğünü tehlikeye atabilir.
  23. Farklılaşmanın 2. haftasından itibaren, mikroskop altında epitel üzerindeki mukusa bağlı olası daha koyu bir tabakayı gözlemleyerek mukus üretimini değerlendirin. Aşırı mukus, DPBS yıkama ile giderilebilir. Kısaca, 24 oyuklu bir plaka üzerindeki eklerin apikal tarafına 200 μL 1x DPBS ekleyin ve plakayı nemli bir CO2 hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. DPBS'yi çıkarın ve plakayı nemli bir CO2 hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de tutun.

3. Siliyer atım frekansının belirlenmesi

NOT: 37 °C'de CBF tayini için (gerekirse), mikroskobun 37 °C'de %5CO2 ve nem sağlayan bir ortam odası inkübatörüne sahip olması gerekir.

  1. Mikroskobu bağlı bilgisayarı ve ortam odası ile açın. Ekleri içeren plakayı mikroskop tablasına yerleştirmek için haznenin kapısını açın.
  2. Plaka sahneye yerleştirildikten sonra hazneyi kapatın. Mikroskop aşaması çalıştırma düğmesini kullanarak, ekleri görünüme getirmek için plakayı hareket ettirin.
  3. Faz kontrast modunda 20x büyütme lensini seçin. Plakayı mikroskobun merceğinden gözlemleyin ve ayar düğmesini kullanarak hücreyi odaklayın.
  4. Bilgisayar ekranında, SAVA sistem simgesine tıklayın. Mikroskoba bağlı bilgisayarda SAVA programı kurulmalıdır.
  5. Yazılım arayüzünde, Deneyi Yapılandır'a tıklayın. Bir sonraki sekmede, Deney Oluştur'a tıklayın.
  6. Yeni bir sekme görünecektir, Deney Dizini Adını Girin alanına verilerin saklanacağı dizinin ayrıntılarını ve Deney Açıklamasını Girin alanına deney ayrıntılarını verin ve ardından Tamam'a tıklayın.
  7. Oluşturulan ve Denemeler altındaki Dizin'de gösterilen Deneme'ye tıklayın.
  8. Değiştir'e tıklayın ve Örnek Açıklamada örnek ayrıntıları sağlayın. Bu sekmeden çıkmak için Ekle'ye ve ardından Çıkış'a tıklayın.
  9. Deneme yuvasındaki ana yazılım arayüzünde, ana arayüzdeki açılır menüden oluşturulan denemeyi seçin.
  10. Video Kaydet'e tıklayın ve bilgisayar ekranında siliyer vuruş frekansını (CBF) izleyin. Ekran odaklanmış siliyer hareketi gösterecektir.
  11. Her kesici uç için, saniyede 120 kare hızında 2,1 sn boyunca 6 farklı rastgele alan kaydedin. CBF verilerini izlemek için Videoyu Kaydet'e tıklayın.
  12. Verileri analiz etmek için yazılım arayüzündeki Videoyu Analiz Et'e tıklayın. Bir sonraki sekmede, Tamam'a tıklayın.
  13. Aşağıdaki sekmede Tümünü Analiz Et'e tıklayın. Her deney için oluşturulan elektronik tabloyu bilgisayardaki bilgisayar SAVA veri toplama klasörüne indirin.
  14. Veri sunumu için Gauss ortalama frekansını alın.

4. Transepitelyal elektrik direncinin ölçülmesi

NOT: TEER kantitasyonu, hava yolu epitelinin apikal tarafında sıvıya ihtiyaç duyar. Bu protokolü oluşturmak için, halihazırda bazal ortamı (deneysel) içeren eklerde hava yolu epitelinin apikal tarafına 100 μL 1x DPBS veya 500 μL 1x DPBS ekleyin.

  1. Güç anahtarını kullanarak EVOM2 volt ohmmetreyi açın. Test Direncini GİRİŞ yuvasındaki EVOM2'ye bağlayın.
  2. EVOM2 ekranındaki okumayı izleyin. 1000'in üzerinde veya altındaysa, kalibrasyona ihtiyacı vardır. Forseps kullanarak, EVOM2 volt ohmmetredeki ADJ anahtarını düzgün bir 1000 okuma gösterene kadar çevirin.
  3. Deneysel kontrol okuması için boş bir ek alın. Bir P200 pipeti kullanarak, boş ekin apikal tarafına 100 μL 1x DPBS eklenirken, bir P500 pipeti ile bazal tarafa 1 μL 1x DPBS eklenir.
  4. Test Direncinin bağlantısını kesin ve STX2 elektrodunu EVOM2 üzerindeki INPUT yuvasına bağlayın. STX2 elektrodunu %70 etanol ile nazikçe temizleyin.
  5. STX2 elektrodunu, daha kısa elektrot bacağını her bir ekin apikal kısmında ve daha uzun elektrot bacağını bazal kısımda tutarak 1x DPBS ile boş ek parçaya yerleştirin.
  6. Okuma, hareket veya diğer belirlenemeyen nedenlerden dolayı dalgalanabileceğinden, sabit okumayı EVOM2 ekranına kaydedin.
  7. STX2 elektrodunu, 28 günlük farklılaşmış epitel ile ek parçaya yerleştirin, daha kısa elektrot bacağını her bir ekin apikal kısmında ve daha uzun elektrot bacağını ortamdaki bazal kısımda tutun.
  8. Sabit okumayı EVOM2 ekranına kaydedin. Güvenilir bir ortalama hesaplamak için birkaç bağımsız okuma yapın. Hesaplama için arka planı (boş kesici uç okuması) deneysel kesici uç okumasından çıkarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Primer NHBE hücrelerinin iki bağımsız tanımlanmamış donörden (iki sigara içmeyen, sağlıklı yetişkin veya KOAH'lı yetişkin, 50 yaş üstü kadınlar) ayırt edilmesinden elde edilen hava yolu epitelinin hem siliyer fonksiyonunu hem de membran geçirimsizliğini değerlendirdik. Siliyer fonksiyonu belirlemek için 28 günlük diferansiye hava yolu epitelinin KBF'sini belirledik. CBF'nin her iki hava yolu epiteli için en az 3 Hz'e ulaştığını gözlemledik, bu da daha önce yayınlanan sonuçlarla karşılaştırılabilirdi (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İnsan primer hava yolu epiteli (ALI kültürü), fonksiyon ve mekanizmaları araştırmak ve hayvan kullanımını azaltmak için biyolojik değerlendirmeler için in vitro akciğer modeli olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır14. ALI'nin herhangi bir tek katmanlı batık kültüre göre çeşitli avantajları vardır. Örneğin, akciğer hava yolununapikal tarafını taklit eden doku benzeri bir psödostratifiye hava yolu epiteli sağlar 6,7,14

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH P20GM113123 ve UND SMHS pilot hibesi ile finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x DPBSThermo Fisher Scientific, ABD14190-144
Havayolu Epitel Hücre Büyüme OrtamıPromoCell, AlmanyaC-21060
Amfoterisin BThermo Fisher Scientific, ABD15290-026
EVOM2 volt OhmmetreDünya Hassas Aletleri, ABDUygulanamaz
Heparin ÇözeltisiSTEMCELL teknolojileri, ABD07980
Hidrokortizon stoğuSTEMCELL teknolojileri, ABD07926
Mikroskop: Mikroskopla ilişkili 120f/sn yüksek hızlı kamera (Basler) ile Leica DMI8 (Leica Mikroskop). Microsope ayrıca sahne odası inkübatörü i8 ile sabitlenmiştir.Leica, ABDUygulanamaz
Penisilin-StreptomisinCorning, ABD30-002-CI
PneumaCult-ALI Bazal Medium STEMCELL teknolojileri, ABD05002
PureColAdvanced BioMatrix, ABD5005
Sisson-Ammons video analiz (SAVA) sistemi. Yazılım V.2.1.15 Amson Engineering, ABDUygulanamaz

Kaynaklar

  1. GBDCRD Collaborators. Global burden of chronic respiratory diseases and risk factors, 1990-2019: an update from the Global Burden of Disease Study 2019. E Clin Med. 59, 101936(2023).
  2. Fendrick, A. M., Monto, A. S., Nightengale, B., Sarnes, M. The economic burden of non-influenza-related viral respiratory tract infection in the United States. Arch Intern Med. 163 (4), 487-494 (2003).
  3. LeMessurier, K. S., Tiwary, M., Morin, N. P., Samarasinghe, A. E. Respiratory barrier as a safeguard and regulator of defense against Influenza A virus and Streptococcus pneumoniae. Front Immunol. 11, 3(2020).
  4. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  5. Calven, J., Ax, E., Radinger, M. The airway epithelium-A central player in Asthma pathogenesis. Int J Mol Sci. 21 (23), 8907(2020).
  6. Talukdar, S. N., et al. RSV-induced expanded ciliated cells contribute to bronchial wall thickening. Virus Res. 327, 199060(2023).
  7. Osan, J., et al. Goblet cell hyperplasia increases SARS-CoV-2 infection in chronic obstructive pulmonary disease. Microbiol Spectr. 10 (4), e0045922(2022).
  8. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  9. Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (4), a028241(2017).
  10. Rhee, C. S., et al. Ciliary beat frequency in cultured human nasal epithelial cells. Ann Otol Rhinol Laryngol. 110 (11), 1011-1016 (2001).
  11. Scopulovic, L., Francis, D., Pandzic, E., Francis, R. Quantifying cilia beat frequency using high-speed video microscopy: Assessing frame rate requirements when imaging different ciliated tissues. Physiol Rep. 10 (11), e15349(2022).
  12. Jing, J. C., Chen, J. J., Chou, L., Wong, B. J. F., Chen, Z. Visualization and detection of ciliary beating pattern and frequency in the upper airway using phase resolved Doppler optical coherence tomography. Sci Rep. 7 (1), 8522(2017).
  13. Yuksel, H., Turkeli, A. Airway epithelial barrier dysfunction in the pathogenesis and prognosis of respiratory tract diseases in childhood and adulthood. Tissue Barriers. 5 (4), e1367458(2017).
  14. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) Cell 3D Cultures for in vitro Lung Model Studies. Sci Rep. 9 (1), 500(2019).
  15. Osan, J. K., DeMontigny, B. A., Mehedi, M. Immunohistochemistry for protein detection in PFA-fixed paraffin-embedded SARS-CoV-2-infected COPD airway epithelium. STAR Protoc. 2 (3), 100663(2021).
  16. Talukdar, S. N., McGregor, B., Osan, J. K., Hur, J., Mehedi, M. Respiratory Syncytial Virus Infection Does Not Induce Epithelial-Mesenchymal Transition. J Virol. 97 (7), e0039423(2023).
  17. Christopher, A. B., et al. The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia. Front Pediatr. 2, 111(2014).
  18. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1, 14(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hava-Sıvı ArayüzüSiliyer Atım FrekansıTransepitelyal Elektriksel DirençYalancı Çok Katlı EpitelBronşiyal Epitel HücreleriYüksek Hızlı MikroskopiSAVA Sistemi
Psödostratifiye Akciğer Hava Yolu Epitelinin Siliyer Fonksiyonunun ve Membran Geçirimsizliğinin Belirlenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.