Yöntem makalesi

Doğal Mikrobiyomlu Laboratuvar Fareleri için Bir Tesisin İşletilmesi ve Biyolojik Muhafaza Prosedürleri: İmmünofenotipleme Prosedürü

DOI:

10.3791/67100

⸱

13 Aralık 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BIH QUEST Center for Responsible Research, Berlin Institute of Health (BIH) at Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R), 3Institute of Microbiology, Infectious Diseases and Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 4Experimental and Clinical Research Center (ECRC) & Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC), 5Department of Experimental Neurology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, Klinik und Hochschulambulanz für Neurologie, 6Center for Stroke Research Berlin, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 7Einstein Center for Neuroscience, 8German Center for Cardiovascular Research (DZHK), partner site Berlin, 9Department of Neuropathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 10Cluster of Excellence, NeuroCure, 11German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Berlin, 12Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 13Institute of Animal Welfare, Animal Behavior and Laboratory Animal Science, Freie Universität Berlin, 14Forschungseinrichtungen für Experimentelle Medizin/FEM, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 15Department of Pediatric Respiratory Medicine, Immunology and Critical Care Medicine, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 16German Center for Lung Research (DZL), associated partner site, Berlin, 17Department of Infectious Diseases, Respiratory Medicine and Critical Care, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 18Division of Toxicology, Institute of Clinical Pharmacology and Toxicology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 19Institute of Immunology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 20German Cancer Research Center, 21German Cancer Consortium, partner site Berlin, 22Department of Radiology (including Pediatric Radiology), Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 23Department of Microbiome Research, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), 24Department of Medicine II, Faculty of Medicine, Medical Center - University of Freiburg

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, örnek olarak immünofenotipleme için kan örneklemesini kullanarak "Yabani fareler" için bir tesisin mikrobiyal muhafaza önlemleri de dahil olmak üzere yapısını ve işletme prosedürlerini açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Yabani fareler" gibi doğal bir mikrobiyom ile laboratuvar farelerinin kullanılması, insan süper organizmasına yakın benzerlikleri nedeniyle hem temel hem de uygulamalı bilim için umut verici bir araştırma aracı sunmaktadır. Bununla birlikte, bakteriler, virüsler ve parazitler dahil olmak üzere çeşitli mikrobiyomları barındıran bu farelerin yetiştirilmesi ve bakımı, araştırma kurumlarındaki hayvancılık tesisleri için önemli zorluklar doğurmaktadır. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, Charité - Universitätsmedizin Berlin'de "Yabani fareleri" barındırmak için özel bir tesis konsepti geliştirildi. Bu yaklaşım, doğal mikrobiyomu etkin bir şekilde içermek ve böylece daha yüksek hijyen standartlarına sahip alanları korumak için belirli yapısal özelliklere ve operasyonel protokollere sahip bir tesis tasarlamayı içeriyordu.

İmmünofenotipleme için hem belirlenmiş patojen içermeyen (SPF) hem de "Wildling farelerinden" kan örneklemesi için bir metodoloji gösterilmekte ve tesiste uygulanan iş akışı ve biyolojik sınırlama önlemleri vurgulanmaktadır. Dikkate değer sonuçlar, doğal bir mikrobiyoma maruz kalan "yabani farelerin", sıkı hijyen koşulları altında yetiştirilen ve bakımı yapılan farelerde önemli ölçüde azalan farklı bağışıklık hücresi popülasyonları geliştirdiğini ortaya koymaktadır.

Bu çalışmanın önemi, araştırmacılara doğal bir mikrobiyoma ve insan yetişkinlerininkine benzer olgun bir bağışıklık sistemine sahip farelere erişim sağlama potansiyelinde yatmaktadır. Bu yaklaşım, klinik öncesi bulguların klinik uygulamaya çevrilebilirliğini artırabilir ve böylece biyomedikal araştırma alanını ilerletebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farelerde deney yapmak, klinik öncesi ve toksikolojik araştırmalar gibi temel ve uygulamalı bilimlerde hala vazgeçilmezdir. Ancak biyolojik gürültüyü azaltmayı ve deney sonuçlarındaki değişkenliği en aza indirmeyi amaçlayan laboratuvar ortamlarında hijyenin standardizasyonu, doğal mikrobiyotanın büyük ölçüde dışlanmasına yol açmıştır. Bu nedenle, hijyenik olarak standartlaştırılmış, belirlenmiş patojen içermeyen (SPF) laboratuvar farelerinin doğduğu ve tutulduğu koşullar, insanların ve hayvanların normalde maruz kaldığı gerçek dünya koşullarından farklıdır. Laboratuvar koşulları ile insan hastalıklarının meydana geldiği doğal ortamlar arasındaki bu uyumsuzluk, "standardizasyon yanılgısına" yol açmaktadır: deneysel koşullardaki varyasyonun en aza indirilmesinin translasyonel sonuçları iyileştirdiğini varsaymak. Bununla birlikte, gerçekte, bulguların biyolojik alaka düzeyini sınırlar 1,2. Örneğin, araştırmalar, SPF farelerinde mikrobiyal ve çevresel çeşitliliğin olmamasının, immünolojik ve klinik öncesi çalışmaların geçerliliğini baltalayarak az gelişmiş bir bağışıklık sistemine yol açabileceğini göstermiştir3.

Fare modellerindeki biyolojik çeşitliliği ele almak için, yabani ve evcil hayvan dükkanı fareleri 3,4,5,6,7,8 ile birlikte barınma, kommensallere sıralı maruz kalma9, hayvanları dış mekan muhafazalarında 10 veya büyük hayvanlardanyatak takımlarında11 ve vahşi farelerden dışkı nakli12 dahil olmak üzere, her biri kendi avantajları ve sınırlamaları olan çeşitli yaklaşımlar önerilmiştir. Klinik öncesi ve toksikolojik araştırmalar için umut verici yeni bir fare modeli, doğal bir mikrobiyom barındıran standart laboratuvar faresi suşlarından oluşan "Wildling fareleri" modelidir13. Bu "Yabani fareler", laboratuvar faresi türlerinden elde edilen embriyoların doğada yakalanan farelere nakledilmesiyle üretilir. Doğum sırasında, laboratuvar faresi suşları, insan doğumu sırasında meydana gelen doğal aşılamayı taklit ederek taşıyıcı annelerinin doğal mikrobiyomunu edinir13. "Yabani fareler", doğal mikrobiyomları nesiller boyunca korunarak diğer laboratuvar faresi türleri gibi yetiştirilebilir.

"Yabani fareler", tipik olarak SPF fare tesislerinden dışlanan bakteriler, virüsler ve parazitler dahil olmak üzere çeşitli bir mikrobiyotaya ev sahipliği yapar. Sonuç olarak, araştırma tesislerinde doğal bir mikrobiyomun korunması, bu mikropların genel SPF hijyen standartlarından ödün vermeden kontrol altına alınması gerektiğinden, zorluklar ortaya çıkarmaktadır.

Charité - Universitätsmedizin Berlin'de, "Yabani fareler" için özel bir tesis kuruldu ve SPF alanlarından sıkı biyolojik sınırlama önlemleriyle ayrıldı. Tesis, SPF alanları korunurken "Yabani farelerin" doğal mikrobiyomunun korunmasını sağlayan üreme ve deney odalarını içermektedir (Şekil 1).

Charité'nin kolonisinin kurucu çiftleri, Almanya'daki Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Erlangen Üniversite Hastanesi, Mikrobiyom Araştırma Bölümü'nde kurulan "Yabani fareler" kolonisinden ithal edildi. Onlara bir sağlık sertifikası verilir ve koloni kurucularının ithalatından önce zoonotik patojenler için genişletilmiş bir panel ile izlenirler. Sentineller, zaman içinde mikrobiyomu izlemek için kullanılacaktır. Hem SPF hem de "Yabani fareler" aynı koşullar altında barındırılır. Fareler, tercihen beş fareden oluşan gruplar halinde tip II uzunluğunda, ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde (IVC) yetiştirilir ve tutulur. Tesis içi sıcaklık 22 °C, aydınlık/karanlık döngüsü ise 12 saattir. Fareler standart tahıl bazlı yemek ve musluk suyu alır. "Yabani fareler" için yatak takımlarının ve zenginleştirme öğelerinin sterilizasyonu gereksizdir. Bununla birlikte, bu öğelerin otoklavlanması, SPF farelerinin bulunduğu alanlarda malzemelerin karışmasını önler.

Bu protokolde, hem SPF hem de "Wildling fareleri" için immünofenotipleme prosedürleri gösterilmekte ve "Wildling faresi" tesisindeki katı mikrobiyal muhafaza protokolleri vurgulanmaktadır. Bu önlemler, doğal bir mikrobiyom taşıyan farelerle çalışmanın faydalarını sağlarken SPF ortamlarının bütünlüğünü sağlar.

figure-introduction-1
Şekil 1: Yabani fareler için tesisin yerleşimi. E1 = tesise erişim. Oklar tesise giriş rotasını gösterir. E2 = tesis dışından laminer hava akımı kabinine erişim. PA = hava duşlu personel hava kilidi. AS = hava duşu. R1, R2 = Yabani farelerin yetiştirilmesi için odalar. R3 = Yabani fareleri tutmak için oda. R4 = SPF farelerini tutmak için yer. PR1 = SPF fareleri için prosedür odası. PR2 = Yabani fareler için prosedür odası. SB = steril çalışma tezgahı. EE = acil çıkışlar. CR = LAF kabininin önündeki soyunma odası. LAF = koruyucu hava akımı altındaki müdahaleler için laminer hava akışı kabini. A = otoklav. ER = ekipman odası. Yeşil oklar, SPF hayvanlarıyla çalışırken erişilebilen rotaları temsil eder ve sarı oklar, hava duşundan sonra Wildling fareleriyle çalışmak için mevcut yolları gösterir. Mavi oklar sadece hayvancılık personelinin erişimini gösterir. Kırmızı çizgi, alanı E1'den PR2 üzerinden veya E2'den CR üzerinden erişilebilen iki bölüme ayıran LAF kabininin içindeki cam duvarı işaretler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Yabani fareler" tesisi ve canlı hayvanları içeren prosedürler, hayvan deneylerinden sorumlu devlet dairesi "Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin" (LAGeSo) tarafından onaylandı. Protokolün en önemli adımları Şekil 2'de özetlenmiştir.

1. Wilding tesisine erişim sağlama

  1. Sorumlu hayvan refahı görevlisinden tesisin işletme ve biyolojik muhafaza prosedürleri hakkında kişisel bir giriş yapın.
  2. "Yabani fareler" tesisine girmek için transponder anahtarını alın ve çevrimiçi rezervasyon sistemi üzerinden prosedür odalarını ayırtın.

2. "Yabani fareler" için tesise giriş

  1. Giysileri soyunma odasına bırakın.
  2. Alan kıyafetlerine geçin: pantolon, kasak ve tek kullanımlık ayakkabı kılıfları (Şekil 3).

3. SPF alanındaki SPF farelerinden kan örneklemesi

  1. SPF farelerini (erkek ve dişi, 8-20 hafta) tutuldukları odadan (R4) kapalı bir IVC kafesinde SPF hayvanları için prosedür odasına (PR1) aktarın.
  2. Laminer akış tezgahını açın ve çalışma alanı yüzeyini %70 Vol. etanol ile dezenfekte edin. Tezgahın içinde çalışın.
  3. Kırılma veya zarar görme riskinin artmasını önlemek için kılcal borularda kırık veya yontulmuş bölümler olup olmadığını kontrol edin.
  4. İzofluran ile kısa bir genel anestezi altında (oksijenle zenginleştirilmiş tıbbi havada% 5 izofluranda indüksiyon, ardından bakım için% 1.5 -% 2.0), pedal çekme refleksinin kaybından sonra (ayak parmağı sıkışması ile belirtildiği gibi), boynun tırnağını kavrayarak farelerin boyun damarlarını sıkıştırın.
  5. Bir elinizi kullanarak, başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak hayvanın kafasını sabitleyin. Gözün medial kantusuna 45°'lik bir açıyla güzel zarın altına yeni bir kılcal damar yerleştirin. Kılcal damarın göz küresi ile gözün kemikli yörüngesi arasında yer aldığından emin olun.
    NOT: Travmayı önlemek için kılcal borunun ucunun göz yüzeyine temas etmesine izin vermeyin.
  6. Kılcal damarı hafif bir eksenel dönme hareketiyle sinüs zarından geçirin. Kan akana kadar yörüngenin arkasındaki tüpü döndürmeye devam edin. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (yaklaşık 1 damla) içeren bir kan alma tüpünde en az 15 μL kan toplayın.
  7. Kılcal damarı çıkarmadan önce, dokuya kanamayı minimumda tutmak için boynun tırnağındaki tutuşu gevşetin. İyi bir hemostaz sağlamak için, kanamayı durdurmak için temiz bir gazlı bez veya bez kullanın.
  8. Kan ve EDTA'yı karıştırmak için tüpü hafifçe döndürün. Tüpü sallamayın. Kan örneğini buz üzerinde saklayın.
  9. Çalışma yüzeyini dezenfekte edin ve laminer akış tezgahını kapatın. SPF farelerini kapalı bir IVC'de SPF muhafaza odasına (R4) geri koyun.

4. "Yabani fareler" için alana giriş

  1. Hava duşunun (PA) antresindeki ayakkabıları ve çorapları çıkarın. Alan çorapları ve Tyvek tulumu, saç filesi, gerekirse pamuklu eldivenler, nitril eldivenler ve yüz maskelerinden oluşan tam vücut kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin (Şekil 3).
  2. Yapışkanlı zemin kaplaması ile çoraplarla hava duşuna girin. Hava duşu yaparken kolları kaldırın ve 360° dönüş yapın.
  3. Hava duşundan çıkın ve diğer taraftaki alan ayakkabılarını giyin.

5. "Yabani farelerden" kan örneklemesi

  1. "Yabani fareleri" (erkek ve dişi, 8 - 20 hafta) kapalı bir IVC kafesinde tutuldukları odadan (R3) prosedür odasına (PR2) aktarın.
  2. Laminer akış tezgahını açın ve çalışma alanı yüzeyini dezenfekte edin.
  3. Bölüm 3, adım 2-8'de SPF farelerinden numune almak için açıklanan prosedürleri izleyin.
  4. Kan örneklemesini tamamladıktan sonra eldivenleri değiştirin. Tüm malzemeleri ve yüzeyleri dezenfekte edin. Laminer akış tezgahını kapatın.

6. "Yabani fareler" bölgesinden kan örneklerinin laminer hava akımı (LAF) kabini aracılığıyla dışa aktarılması

NOT: Prosedür odası (PR2), malzeme kilidi ve steril müdahale odası olarak hizmet veren bir LAF kabini içerir. Numuneler LAF kabini aracılığıyla dışarı aktarılır. İç mekana hem içeriden (E1 ve PR2 üzerinden) hem de dışarıdan (E2 ve CR üzerinden) Wildling alanına erişilebilir ve ortadan sürgülü kapılı bir cam duvar ile bölünmüştür (Şekil 1). Malzemeleri dışa aktarmak için iki kişi gereklidir: Kişi 1 (Wildling alanının içinde [PR2 aracılığıyla]) 6.1 ve 6.2 adımlarını gerçekleştirecektir. Kişi 2 (Wildling alanının dışında [E2 üzerinden] ) 6.3-6.5 adımlarını gerçekleştirecektir.

  1. Numune kaplarını dezenfekte edin. Numune kaplarını LAF kabininin cam duvarındaki sürgülü kapıdan çıkarın.
  2. Numune kaplarının 2 numaralı kişiye transferi tamamlandıktan sonra, LAF kabininin diğer tarafındaki 2 numaralı kişiden (kabinin önlük kilidinde koruyucu giysi giyen) koruyucu giysi alın ve atın. Tüm yüzeyleri dezenfekte edin.
  3. LAF kabininin önündeki erişim LAF'ında koruyucu giysi giyin (CR, Şekil 1).
  4. Wildling bölgesinden dezenfekte edilmiş numune kaplarını LAF kabininin cam duvarındaki sürgülü kapıdan temas etmeden alın.
  5. Koruyucu giysileri çıkarın ve bertaraf etmek için sürgülü kapıdan LAF kabininin iç alanına geçirin.

7. "Yabani fareler" için tesisten çıkış

  1. Tek kullanımlık tulumları ve alan ayakkabılarını alanın içinde bırakın. Saç filesini, lastik eldivenleri ve yüz maskesini atın.
    NOT: Ayakkabılar ve tulumlar tekrar kullanılabilir.
  2. Alan çoraplarıyla hemen hava duşuna girin. Hava duşu yaparken kollarınızı kaldırın ve 360° dönüş yapın.
  3. Hava duşundan çıkın ve alan çoraplarını çamaşır toplayıcıya yerleştirin. Çorapları, ayakkabıları ve tek kullanımlık galoşları giyin. Çamaşırhane toplayıcısındaki soyunma odasında alan kıyafetlerini yatırın. Soyunma odasındaki kıyafetleri değiştirin

8. Kan örneklerinin işlenmesi ve analiz edilmesi

  1. Kan örneklerini laboratuvara getirin.
    1. Florofor konjuge antikor boyama kokteyli hazırlayın: Her örnek için 0.25 μL Alexa Fluor 700 anti-fare CD45, 0.25 μL Brilliant Violet 605 anti-fare TCR-β zinciri, 0.25 μL APC anti-fare CD4, 0.25 μL Brilliant Violet 785 anti-fare CD8, 0.25 μL FITC anti-fare CD44 ve 0.25 μL PerCP / Cyanine5.5 anti-fare CD62L antikoru 50 μL akış sitometrisi tamponuna ekleyin (fosfat tamponlu tuzlu su, 2 mM EDTA,% 0.1 sığır serum albümini, 4 ° C). Adım 8.8'e kadar buz üzerinde karanlıkta kalın.
      NOT: Kullanılan floroforlar, numune alımı için kullanılacak akış sitometresinin konfigürasyonuna uyarlanabilir.
  2. Kan alma tüplerini dezenfekte edin. 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpe 2 mL buz gibi soğuk akış sitometri tamponu ekleyin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin.
  3. Kan alma tüpünü açın. Akış sitometrisi, tampon ve nabız girdabı içeren tüpe 10 μL kan ekleyin.
  4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün.
  5. Süpernatanı aspire edin. 1 mL kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu, nabız girdabı ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 3 dakika inkübe edin.
  6. 100 μL 10x PBS ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün.
  7. 8.5-8.6 adımlarını tekrarlayın.
  8. Süpernatanı aspire edin. 50 μL antikor boyama kokteyli, girdap ekleyin ve karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
  9. 1 mL akış sitometrisi tamponu ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün.
  10. Süpernatanı aspire edin. 180 μL akış sitometrisi tamponu ekleyin.
  11. Canlı/ölü ayrımı için 20 μL SYTOX Blue Dead Cell Stain (son konsantrasyon 1:1000) ekleyin.
  12. Bir akış sitometresinde örnekler alın ve akış sitometresi toplama yazılımını veya akış sitometrisi veri analiz programını kullanarak verileri analiz edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Yabani fareler" potansiyel olarak SPF tesislerinden dışlanan mikroorganizmaları barındırır ve bu da sıkı hijyen standartlarını destekleyen araştırma kurumlarındaki hayvancılık uygulamaları için bir zorluk teşkil eder. Geçtiğimiz 4 yıl boyunca, Charité - Universitätsmedizin Berlin ve Alman Laboratuvar Hayvanlarını Koruma Merkezi'ndeki (Bf3R) bilim adamları ve veterinerler, işbirlikçi bir çaba yoluyla sıkı biyolojik sınırlama önlemlerini içeren, doğal bir mikrobiyomlu farelere adanmış bir tesis geliştirdiler (Şekil 1). Bu tasarımı gerçekleştirmek için, mevcut bir fare tesisi, bir hava duşu ve laminer bir hava akışı kabininin kurulumu da dahil olmak üzere kapsamlı bir yeniden yapılanmaya tabi tutuldu. "Yabani fareler" ve SPF farelerinin yetiştirildiği ve tutulduğu alanlar hava duşu ile ayrılır ve her iki alanda da belirlenmiş prosedür odaları bulunur. Termostabil malzeme, "Yabani fareler" için alanı yalnızca otoklav yoluyla terk ederken, numuneler gibi termolabil malzemeler, laboratuvar alanlarında daha fazla işlem için LAF kabini aracılığıyla dışa aktarılabilir (Şekil 2). SPF hijyen koşullarının korunduğu alanların kirlenmesini önlemek için tüm biyolojik sınırlama önlemlerine sıkı sıkıya bağlı kalmak esastır (Şekil 3). Toplu olarak, Charité - Universitätsmedizin Berlin'deki "Yabani fareler" için tesisin tasarımı ve biyolojik sınırlama önlemleri, bilim insanlarına doğal bir mikrobiyom barındıran farelerle araştırma yapma fırsatı sunarken, mikroorganizmaların hayvan tesisinin daha yüksek hijyen seviyelerine sahip alanlarına yayılmasını etkili bir şekilde önler.

Akış sitometrisi, hücresel immünolojide altın standart yöntemdir ve değişen çevresel koşullara yanıt olarak kan ve dokulardaki bağışıklık hücresi popülasyonlarını sorgulamak için kullanılır. Örneğin, yetişkin insanlar, kanda dolaşan ve çevreden gelen mikroorganizmalara maruz kaldıklarında gelişen önemli sayıda hafıza T hücresine sahiptir3. Burada, SPF koşulları altında yetiştirilen ve tutulan farelerin kanındaki ve "Yabani farelerin" kanındaki hafıza T hücrelerini araştırmak için akış sitometrisi kullanıldı (Şekil 4). Doğal bir mikrobiyom ile kolonize edilmiş "yabani fareler", farklı bir hafıza T hücresi popülasyonu sunar. Buna karşılık, SPF koşulları altında yetiştirilen ve tutulan fareler, kan dolaşımındaki hafıza T hücrelerini büyük ölçüde azaltmıştır. Bu nedenle, akış sitometrisi, farklı mikrobiyal ortamların bağışıklık bölmesi üzerindeki etkisini karakterize edebilir. Ek bağışıklık hücresi belirteçleri dahil edilerek veri granülasyonu arttırılabilir. Uçuş Süresine Göre Sitometri (CyTOF) ve spektral akış sitometrisi gibi akış sitometrisinde yakın zamanda geliştirilen yaklaşımlar, çok sayıda parametre hakkında bilgi edinilmesine ve böylece aynı kan ve doku örneğinde ölçülebilen bağışıklık hücresi (alt) popülasyonlarının sayısının genişletilmesine olanak tanır. Ayrıca, hücresel sitokin üretimi, doğal bir mikrobiyoma yanıt olarak hücrelerin işlevi hakkında bilgi sağlayan akış sitometrisi ile de değerlendirilebilir.

figure-results-1
Şekil 2: Wildling tesisindeki iş akışı. Kan örneklemesi ve örnek işleme örnektir, ancak doku örneklemesi ve histoloji ile cerrahi müdahaleler gibi diğer prosedürlerle değiştirilebilir. Kısaltmalar için Şekil 1 açıklamasına bakınız. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 3: SPF ve Yabanıl alanlar için kişisel koruyucu ekipman (KKD) gereksinimlerinin karşılaştırılması. SPF alanında (solda), standart KKD tek bir koruyucu giysi katmanından oluşur. Buna karşılık, Wildling alanı (sağda) hava duşuna girmeden önce üç aşamalı bir KKD işlemi gerektirir: tulumun altına bir kasac (koruyucu iç çamaşırı = adım 1) giyilir (adım 2). Bu ek katman, hijyenin korunmasına ve alanlar arasında çapraz kontaminasyonun önlenmesine yardımcı olur. Hava duşundan sonra, Wildling alanı için özel ayakkabılar giyilmelidir (3. adım). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 4: "Yabani fareler"in immünofenoti. Erkek SPF farelerinden (n = 5 fare) ve 14 haftalık "Yabani fareler" (n = 5 fare) kan örnekleri, CD45, TCR-β zinciri, CD4, CD8, CD44 ve CD62L'ye karşı bir florofor konjuge antikor kokteyli ile boyandı. Sayılar, ebeveyn kapısı ± standart sapmanın oranıdır. Geçit stratejisi, SPF ve "Yabani farelerden" gelen son iki leke dışında, SPF fareleri için gösterilmiştir. "Yabani farelerde" merkezi ve efektör bellek T hücreleri, SPF koşulları altında yetiştirilen ve sürdürülen farelere kıyasla artar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğal bir mikrobiyomlu fareler, insan süper organizmasına daha yakın benzerlikleri nedeniyle temel ve uygulamalı bilim için umut verici bir araştırma aracıdır 3,9,10,11,12. Biyolojik karmaşıklığı fare modellerine dahil etme girişimleri, her biri kendi avantajları ve sınırlamaları olan çeşitli yaklaşımların geliştirilmesine yol açmıştır 3,7,8,9,10,11,12. "Yabani fareler", kontrollü bir laboratuvar ortamının faydalarını doğal bir mikrobiyomla birleştirir. Bu yaklaşım, karmaşık biyolojik etkileşimleri incelemek için gerekli olan doğal mikrobiyal çeşitliliği korurken deneysel koşullarda stabiliteyi korur. Sonuç olarak, "Yabani farelerde" geliştirilen ve test edilen biyomedikal tedaviler, klinik uygulamalara başarılı bir şekilde çevrilmesi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Bununla birlikte, hangi klinik öncesi hastalık modellerinde "Yabani fareler" in SPF farelerinden daha üstün olduğu belirlenmelidir. Ayrıca, doğal bir mikrobiyoma sahip fareler, tipik olarak kurumsal tesislerden dışlanan, yüksek oranda bulaşıcı solucanlar gibi mikroorganizmaları barındırır. Bu nedenle, bu farelerle üreme ve çalışma, araştırma kurumlarındaki hayvancılık uygulamaları için zorluklar ortaya çıkarmaktadır.

"Yabani fareler" için bir tesisin kurulması, Charité - Universitätsmedizin, Alman Laboratuvar Hayvanlarını Koruma Merkezi (Bf3R) ve Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg'deki (FAU) bilim adamları, veterinerler ve kurumsal yetkililerin ortak bir çabasını içeriyordu. Tesis konsepti geliştirildikten sonra, mevcut bir fare tesisi, sıkı biyolojik sınırlama önlemlerini dahil etmek için kapsamlı bir yeniden yapılanmaya tabi tutuldu. Tesis, insan patojenleri ile yapılan araştırmalarla ilgili biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) operasyonları için onaylanmıştır.

Burada, "Yabani fareler" için tesisteki işletim ve biyolojik sınırlama prosedürleri, örnek olarak akış sitometrisi ile immünofenotipleme için kan örneklemesi kullanılarak açıklanmaktadır. Mikroorganizmaların hayvan tesisinin diğer alanlarına yayılmasını önlemek için "Yabani fareler" için tesiste çalışırken biyolojik sınırlama önlemlerine sıkı sıkıya bağlı kalmak zorunludur. Bu, araştırma grubu başına tesise erişimin mümkün olduğunca az kişiyle sınırlandırılmasını içerir. Ek olarak, tesise ilk erişim sağlanmadan önce kurumsal hayvan refahı görevlisi tarafından yürütülen zorunlu bir tanıtım oturumu gereklidir. Wildling tesisi içinde çalışmak için genel bilgiler ve Standart İşletim Prosedürleri (SOP) ayrıca dahili bir web sitesinde ("Wildling wiki")14,15 mevcuttur.

Tesis içinde çalışırken, KKD'nin uygun şekilde giyilmesi gerekir. Örneğin, parazitlerin yumurtaları potansiyel olarak ona yapışabileceğinden, saç ağının dışında hiçbir saçın açıkta kalmamasını sağlamak önemlidir. Deney hem "Yabani fareler" hem de SPF farelerini içeriyorsa, önce SPF fareleri ele alınmalıdır. Tesis içindeki "Yabani fareler" ve SPF fareleri için alanlar bir hava duşu ile ayrılmıştır ve her alan belirlenmiş prosedür odaları ile donatılmıştır. Bu odalar, çevrimiçi bir rezervasyon sistemi aracılığıyla rezerve edilebilir, bu da sorunsuz çalışma süreçleri ve tesis içinde sınırlı sayıda kişi sağlar. Prosedür odası (PR1, PR2, LAF) başına alan başına en fazla iki kişinin aynı anda her bariyerde çalışmasına izin verilir. Prosedürlerin etik ve yetkin bir şekilde yürütülmesini sağlamak için ek personel gerektiren deneyler için istisnalar geçerlidir. Fareler, mikrobiyal muhafazayı ve iş güvenliğini sağlamak için yalnızca laminer akış tezgahı altında açılabilen kapalı IVC kafeslerinde kendi alanlarındaki odalar arasında transfer edilir. "Yabani fareler" alanındaki prosedür odası ayrıca bir laminer hava akımı (LAF) kabini içerir. Bu LAF kabini, embriyo transferi de dahil olmak üzere "Yabani farelerin" diseksiyonu ve cerrahisi için kullanılmalıdır. Embriyo transferi, yeni "Yabani fare" modelleri oluşturmak için kullanıldığından, "Yabani fareler" bağlamında kritik bir prosedürdür. Örneğin, genetiği değiştirilmiş (GDO) fare suşlarından embriyoların vahşi tip "Yabani farelere" aktarılması, Wildling GDO suşları oluşturmak için kullanılır. LAF kabini, "Yabani fareler" alanı dışındaki bir kişiyle koordinasyon gerektiren numunelerin ihracatı için de kullanılır. Bitişik laboratuvar alanında daha fazla numune işleme gerçekleştirilebilir, bu da araştırmacıların "Yabani farelerden" alınan numunelerin işlendiği yerleri sınırlarken zamana duyarlı malzemeleri yerinde kullanmalarına olanak tanır.

Diğer tüm malzemeler Wildling tesisinin içinde kalmalı veya tesisten ayrılmadan önce otoklavlanmalıdır. Mesai sonrası tüm malzeme ve yüzeyler BSL2 şartlarına uygun dezenfektanlar ile dezenfekte edilmektedir. "Yabani fareler" için tesise giren kişilerin aynı gün başka herhangi bir hayvan tesisine girmeleri yasaktır.

Tesisteki araştırmalar, "Sağlık ve Hastalıkta Yabani Fare Modeli (Wildling HeaD)" bilimsel konsorsiyumu çerçevesinde yürütülmekte ve "Yabani fareler" ile çalışan bilim adamları arasındaki iletişimin yanı sıra yöntem ve uzmanlık alışverişini kolaylaştırmaktadır. Konsorsiyum, Berlin Sağlık Enstitüsü (BIH) QUEST Sorumlu Araştırma Merkezi'ndeki Responsible PrecliniX tarafından desteklenmektedir ve bu da hayvan çalışmaları ön kayıt prosedürlerine, sağlam deney tasarımına ve kalite yönetimine (www.bihealth.org/en/quest/service/service/responsible-preclinix) yardımcı olmaktadır.

Özetle, güvenli ve etik klinik öncesi araştırmaları desteklemek için sıkı biyolojik sınırlama önlemleriyle donatılmış, son teknoloji bir tesis oluşturulmuştur. Bu tesis, doğal bir mikrobiyom barındıran "Yabani fareler" in çalışmasını kolaylaştırarak, kontrollü laboratuvar koşulları ile gerçek dünya benzeri mikrobiyal ortamlar arasındaki boşluğu etkili bir şekilde doldurmaktadır. Tarif edilene benzer bir tesis inşa etmek için, yüksek biyolojik sınırlama ortamlarının etkili bir şekilde tasarlanmasını ve işletilmesini sağlamak için bilim adamlarının, veterinerlerin ve kurumsal yetkililerin uzmanlığını içeren ekip bilimine ve disiplinler arası işbirliğine öncelik vermek esastır. Ek olarak, sıkı biyolojik sınırlama önlemlerinin uygulanması, kapsamlı eğitim sağlanması ve net Standart İşletim Prosedürleri (SOP'ler) geliştirilmesi çok önemlidir. Dahili bir wiki gibi verimli bir iletişim yapısı oluşturmak ve deneysel koşulları sürekli olarak izlemek ve doğrulamak, tesisin "Yabani fareler" gibi karmaşık modelleri yönetmedeki etkinliğini ve güvenliğini daha da artıracaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Charité 3R| Değiştir - Azalt - İyileştir. S.P.R., Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) Emmy Noether-Programm RO 6247/1-1 (proje ID 446316360), DFG SFB1160 IMPATH (proje ID 256073931) ve TRR 359 PILOT (proje ID 491676693) tarafından desteklenmiştir. S.J., Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) JO 1216/2-1 ve Alman Multipl Skleroz Derneği (DMSG e.V.) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 700 anti-fare CD45 antikoruBioLegend103127Klon 30F-11
Hayvan YemiAltromin1324
APC anti-fare CD4 antikoruBioLegend100515Klonu RM4-5
Kan alma tüpüGreiner450475MiniCollect K3E, K3EDTA
Sığır Serumu AlbüminiSigma-AldrichA9647-100G
Brilliant Violet 605 anti-fare TCR-beta zincir antikoruBioLegend109241Klonu H57-597
Parlak Menekşe 785 anti-fare CD8 antikoruBioLegend100749Klonu 53-6.7
KılcalHirschmann9000210Hirschmann mini kapakları, Na-hep
EDTACorning46-034-CI
FITC anti-fare CD44 antikoruBioLegend103021Klon IM7
PerCP/Siyanin5.5 anti-fare CD62L antikoruBioLegend104431Klon MEL-14
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (10x)Gibco12579099
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x)Gibco14190094
RBC parçalama tamponuBioLegend420302
Yuvarlak Tabanlı Polistiren TüpSarstedt55.476.005
SYTOX Mavi Ölü Hücre LekesiInvitrogenS34852
Tyvek genel (DuPont)Fisher Scientific11371633

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Voelkl, B., Wurbel, H., Krzywinski, M., Altman, N. The standardization fallacy. Nat Methods. 18 (1), 5-7 (2021).
  2. Voelkl, B., et al. Reproducibility of animal research in light of biological variation. Nat Rev Neurosci. 21 (7), 384-393 (2020).
  3. Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
  4. Caruso, R., Ono, M., Bunker, M. E., Nunez, G., Inohara, N. Dynamic and asymmetric changes of the microbial communities after cohousing in laboratory mice. Cell Rep. 27 (11), 3401-3412.e3 (2019).
  5. Labuda, J. C., Fong, K. D., Mcsorley, S. J. Cohousing with dirty mice increases the frequency of memory T cells and has variable effects on intracellular bacterial infection. Immunohorizons. 6 (2), 184-190 (2022).
  6. Martin, M. D., et al. Cd115(+) monocytes protect microbially experienced mice against e. Coli-induced sepsis. Cell Rep. 42 (11), 113345(2023).
  7. Burger, S., et al. Natural microbial exposure from the earliest natural time point enhances immune development by expanding immune cell progenitors and mature immune cells. J Immunol. 210 (11), 1740-1751 (2023).
  8. Tabilas, C., et al. Early microbial exposure shapes adult immunity by altering cd8+ t cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (49), e2212548119(2022).
  9. Reese, T. A., et al. Sequential infection with common pathogens promotes human-like immune gene expression and altered vaccine response. Cell Host Microbe. 19 (5), 713-719 (2016).
  10. Leung, J. M., et al. Rapid environmental effects on gut nematode susceptibility in rewilded mice. PLoS Biol. 16 (3), e2004108(2018).
  11. Sbierski-Kind, J., et al. Distinct housing conditions reveal a major impact of adaptive immunity on the course of obesity-induced type 2 diabetes. Front Immunol. 9, 1069(2018).
  12. Rosshart, S. P., et al. Wild mouse gut microbiota promotes host fitness and improves disease resistance. Cell. 171 (5), 1015-1028.e13 (2017).
  13. Rosshart, S. P., et al. Laboratory mice born to wild mice have natural microbiota and model human immune responses. Science. 365 (6452), eaaw4361(2019).
  14. Dirnagl, U., Kurreck, C., Castanos-Velez, E., Bernard, R. Quality management for academic laboratories: Burden or boon? Professional quality management could be very beneficial for academic research but needs to overcome specific caveats. EMBO Rep. 19 (11), e47143(2018).
  15. Dirnagl, U., Kurreck, C., Bernard, R., Przesdzing, I. Premier. , https://premier-qms.org/ (2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Yavru FarelerKan rne i AlmaLaboratuvar Fareleri TesisiHayvan Bak mmm n H cre Pop lasyonlarKi isel Koruyucu EkipmanHava Du u

İlgili makaleler