Eksozomlar önemli klinik potansiyele sahiptir, ancak kolay in vivo klerens ve zayıf stabilite nedeniyle pratik uygulamaları sınırlıdır. Mikroiğneler, fizyolojik engelleri delerek ve kuru halde koruma sağlayarak lokalize uygulamayı mümkün kılarak, böylece eksozom uygulamasının sınırlamalarını ele alarak ve klinik faydalarını genişleterek bir çözüm sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Eksozomların yüklenmesi ve teslimi için mikroiğne yamalarının üretimi ve karakterizasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Ortaya çıkan "yeni nesil" biyoterapötikler ve ilaç dağıtım vektörleri olarak eksozomlar, ilaç dağıtımı ve rejeneratif tıptan hastalık teşhisi ve tümör immünoterapisine kadar çeşitli biyomedikal alanlarda muazzam bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, geleneksel bolus enjeksiyonu ile hızlı klerens ve eksozomların zayıf stabilitesi, klinik uygulamalarını kısıtlamaktadır. Mikroiğneler, eksozomların uygulama bölgesinde kalma süresini uzatan, böylece ilaç konsantrasyonunu koruyan ve sürekli terapötik etkileri kolaylaştıran bir çözelti görevi görür. Ek olarak, mikroiğneler ayrıca biyoaktif maddelerin stabilitesini koruma yeteneğine de sahiptir. Bu nedenle, eksozomların yüklenmesi ve iletilmesi için bir mikroiğne yaması sunuyoruz ve eksozomların izolasyonu, eksozom yüklü mikroiğne yamalarının üretimi ve karakterizasyonu dahil olmak üzere yöntemleri paylaşıyoruz. Mikroiğne yamaları, uç malzemeleri olarak trehaloz ve hyaluronik asit ve destek malzemesi olarak polivinilpirolidon kullanılarak iki aşamalı bir döküm yöntemi ile üretildi. Mikroiğneler, insan derisini simüle etmek için 2 N. Domuz derisine dayanabilen uçlarla sağlam mekanik mukavemet gösterdi ve mikroiğnelerin uçları cilt delinmesinden sonra 60 saniye içinde tamamen eridi. Mikroiğnelerden salınan eksozomlar, morfoloji, partikül boyutu, işaretleyici proteinler ve taze eksozomlarınkiyle karşılaştırılabilir biyolojik işlevler sergiledi, bu da dendritik hücrelerin alımını sağladı ve olgunlaşmalarını teşvik etti.
Giriş
Hücreler tarafından hücre dışı matrise salınan küçük veziküller olan eksozomlar, çeşitli hastalıkların ve kanserlerin tedavisi için potansiyel biyoterapötikler ve ilaç dağıtım vektörleri olarak önerilmiştir1. Biyogenez süreçleri sırasında eksozomlar, fonksiyonel proteinler ve nükleik asitler2 dahil olmak üzere hücrelerin içinden çeşitli biyolojik olarak aktif molekülleri kapsüller. Sonuç olarak, taşıma işlemi sırasında alıcı hücreler tarafından alındığında, eksozomlar hedef hücrelerde gen ekspresyonunu ve hücresel fonksiyonları modüle etme yeteneğine sahiptir3. Bir tür doğal bilgi habercisi olarak, eksozomlar doku yenilenmesinde, bağışıklık regülasyonunda ve bir dağıtım taşıyıcısı olarak tam olarak kullanılmıştır4. Mühendislik teknikleri sayesinde, eksozomların yüzeyinde spesifik ligandlar zenginleştirilebilir, bu da alıcı hücrelerde sinyal olaylarının indüksiyonunu veya inhibisyonunu mümkün kılarveya belirli hücre tiplerini hedefler5. Kemoterapötik ajanlar ayrıca kanser tedavisi için eksozomlara da yüklenebilir6. Ayrıca, eksozomlar, terapötik kargo teslimatı için kan-beyin bariyerini geçme yeteneğine sahiptir ve bu da onları beyin bozukluklarının tedavisi için oldukça umut verici hale getirir7. Lipozomlarla karşılaştırıldığında, eksozomlar gelişmiş hücresel alım ve gelişmiş biyouyumluluk sergiler8. Daha iyi tolerans ve daha düşük toksisite gösterirken diğer hücrelere verimli bir şekilde girebilirler9. Bununla birlikte, eksozomların geleneksel bolus enjeksiyonu, kan dolaşımındaki karaciğer, böbrekler ve dalak tarafından sekestrasyona ve hızlı temizlemeye eğilimlidir10. Ayrıca, eksozomlar in vitro olarak zayıf stabiliteye sahiptir ve klinik uygulamalarını kısıtlayan depolama koşullarına karşı hassastır11.
Bir dizi mikrometrik boyutlu iğne ucu olan mikroiğneler, küçük moleküllü ilaçların12, proteinlerin13, nükleik asitlerin14 ve nanoilaçların15 verilmesi için fizyolojik engellere nüfuz etme yeteneğine sahiptir. Mikroiğneler, cilt yüzeyindeki lezyonları hedeflemek için hassas bir şekilde tasarlanmıştır ve dağınık uçları, hedeflenen bölgede homojen ilaç dağılımı sağlar, böylece terapötik etkilerini artırır16. Mikroiğnelerin tasarımı ve malzeme bileşimi, proteinler ve nükleik asitler gibi biyoaktif maddelerin kuru depolanmasını kolaylaştırarak stabilitelerini arttırır17. Geleneksel enjeksiyon yöntemleri nispeten kısa bir etki süresine sahiptir ve ağrıya neden olarak hastalarda korkuya neden olabilir18. Mikrometre boyutundaki mikroiğne uzunluğu, doku travmasını en aza indirir ve sinir uyarımını önler, böylece ağrıyı ortadan kaldırır ve hasta uyumunu artırır19. Ek olarak, mikroiğnelerin kullanıcı dostu yapısı, hastaların uzman personele ihtiyaç duymadan tedaviyi kendi kendilerine uygulamalarına olanak tanır16. Mikroiğneler cildin yanı sıra gözler20, ağız mukozası21, kalp22 ve kan damarları23 gibi dokularda da kullanılabilir. Eksozomların klinik olarak verilmesi için mikroiğnelerin uygulanması umut verici ve ileriye dönük bir strateji sağlar.
Bu nedenle, eksozom yüklü bir mikroiğne (exo@MN) yaması tanıtıyoruz ve üretim yöntemini açıklıyoruz. Mikroiğne yamaları, mikroiğne uçlarında eksozomların toplanmasını teşvik eden ve böylece dağıtım verimliliğini artıran santrifüjleme ve vakumlu kurutma ile birlikte iki aşamalı bir döküm yöntemi kullanılarak üretildi. Hem iğne uçları hem de destek, mükemmel biyouyumluluk ve suda çözünürlük sergileyen malzemeler kullanılarak yapılmıştır. Eksozomlar için koruma sağlamak için trehaloz ve hyaluronik asit (HA) uç materyaller olarak dahil edildi ve destek materyali olarak mutlak etanol içinde çözünen polivinilpirolidon (PVP) seçildi. Mikroiğne yamasının morfolojisi, mikroskopi ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak karakterize edildi. Mikroiğnenin mekanik testi, cilde nüfuz etme yeteneklerini doğrulamak için bir gerilme ölçer kullanılarak değerlendirildi ve domuz derisi üzerindeki salım hızının 60 s olduğu araştırıldı. Ayrıca, exo@MN'daki hem taze eksozomların hem de eksozomların morfolojisi, boyutu ve protein içeriği, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), nanopartikül izleme analizi (NTA) ve western blotting (WB) kullanılarak karakterize edildi. Eksozomların dendritik hücreler (DC'ler) tarafından içselleştirilmesi, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak karakterize edildi ve DC'lerin olgunlaşması akış sitometrisi ile değerlendirildi. İki tür eksozomun morfolojik karakterizasyonu ve biyolojik işlevleri esasen tutarlıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bölüm 3'te açıklanan deneyler için kullanılan domuz derisi, deney hayvanlarından elde edilmediği için piyasadan yenilebilir domuz kulakları olarak satın alındığından, bu çalışma etik izin gerektirmez.
1. Eksozomların izolasyonu
- Hücre kültürü
- fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin solüsyonu (100×) içeren Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) kültür ortamında fare yumurtalık epitel kanseri hücreleri ID8'i yetiştirin (bkz. Malzeme Tablosu) 15 cm çapında Petri kaplarında.
- ID8 hücrelerini bir CO2 inkübatöründe ( Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de ve% 5 CO2'de
- <<<<
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada, eksozomların izolasyonu, exo@MN yamanın üretimi ve karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz. Şekil 1 , exo@MN yamanın üretimi için süreç akış şemasını göstermektedir. Eksozomlar trehaloz ve HA ile karıştırıldı ve karışım daha sonra mikroiğne kalıbına eklendi ve santrifüjlendi. Bu işlem, eksozomların iğne uçlarında toplanmasını kolaylaştırarak hızlı salınımı teşvik etti. Kuruduktan sonra, PVP çözeltisi ilave edildi ve kalıbı tamamen doldurmak için santrifüjlendi. Tamamen kurudukta...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Şu anda, eksozomları izole etmek için ana yöntemler arasında ultrasantrifüjleme, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, ultrafiltrasyon, çökeltme, immünoaffinite manyetik boncuklar ve mikroakışkanlar24 bulunmaktadır. Küçük iğne ucu boşluklarının neden olduğu mikro iğnelerin sınırlı yükleme kapasitesi nedeniyle, daha fazla yükleme yapmak için eksozom konsantrasyonunu artırmak gerekir. Bu nedenle, hücre kültürü süpernatantını konsantre etmek için ultrafiltrasyonu seçtik ve ardından eksozomları izole etme...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
H. C., F.L.Q ve S.J.M, bu el yazmasındaki verilere dayanarak yapılan bir patent başvurusunun mucitleridir. HC, Medcraft Biotech'in bilimsel kurucusudur. Inc.
Teşekkürler
FLQ, Zhejiang Öncü Ar-Ge Programı (2022C03031), Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2021YFA0910103), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (22274141, 22074080), Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2022ZD28) ve Shandong Eyaleti Taishan Burs Programı (tsqn201909106) tarafından desteklenen desteği takdir etmektedir. HC, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (82202329) mali desteğini kabul eder. Yazarlar, Çin Bilimler Akademisi, Hangzhou Tıp Enstitüsü'ndeki (HIM) Paylaşılan Enstrümantasyon Çekirdek Tesisinde cihazların kullanımını kabul etmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 100x penisilin-streptomisin çözeltileri | Jrunbio Scientific | MA0110 | Hücre kültürü |
| 180 kDa önceden boyanmış protein işaretleyici | Thermo | 26616 | Western blotting |
| % 3 Uranil asetat | Henan Ruixin Deneysel Malzemeler | GZ02625 | Eksozomların morfolojik karakterizasyonu |
| 3D yazıcı | BMF teknolojisi | nanoArch S130 | Kalıp Hazırlık |
| % 4 & ndash; % 20 prekast jel | Genscript | ExpressPlus PAGE GEL | Western blotting |
| 5 kez; SDS-PAGE yükleme tamponu | Titan | 04048254 | Batı lekeleme |
| Anti-fare Alix antikoru | Biolegend | 12422-1-AP | Batı lekeleme |
| Anti-fare CD63 antikoru | Biolegend | ab217345 | Batı lekeleme |
| APC anti-fare CD80 antikoru | Biolegend | 104713 | Antikoru |
| Otomatik ince kaplayıcı | ZIZHU | JBA5-100 | Mikroiğne BCA test kitinin morfolojik karakterizasyonu |
| Beyotime | P0012 | Protein konsantrasyonu deneyi | |
| Santrifüj | Thermo Fisher | Muitifuge X1R pro | Hücre santrifüjü |
| Sirkülasyonlu su vakum pompası | Yuhua Instrument | SHZ-D (III) Filtrasyon | |
| CO2 inkübatörü | Eppendorf | CellXpert C170 | Hücre kültürü |
| Konfokal lazer tarama mikroskobu | Nikon | A1HD25 | Floresan görüntüleme |
| Bakır örgü | Pekin Zhongjingkeyi Teknolojisi | JF-ZJKY/300 | Eksozomların morfolojik karakterizasyonu |
| D- (+) -Trehaloz dihidrat | Aladdin | 5138-23-4 | Mikroiğne üretimi |
| Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s medium | Meilunbio | MA0212 | Hücre kültürü |
| Dulbecco' s fosfat tamponlu salin | Meilunbio | MA0010 | Hücre kültürü |
| Elektroforez sistemi | Bio-rad | PowerPac-basic | Western blotting |
| Fetal sığır serumu | Jrunbio Scientific | JR100 | Hücre kültürü |
| FITC anti-fare CD11c antikoru | Biolegend | 117305 | Antikor |
| Akış sitometrisi | BD | LSR Fortessa | Floresan algılama |
| Jel görüntüleyici | Cytiva | Amersham ImageQuant 800 | Batı lekeleme |
| HRP konjuge anti-tavşan IgG | CST | 7074S | Batı kurutma |
| HTL reçine | BMF teknolojisi | Kalıp hazırlama | |
| Hyaluronik asit (MW = 300 kDa) | Bloomage Biyoteknoloji | 9004-61-9 | Mikroiğne imalatı |
| Daldırma yağı | Nikon | MXA22168 | Floresan görüntüleme |
| İyon temizleyici | JEOL | EC-52000IC | Eksozomların morfolojik karakterizasyonu |
| Mikroskop | Olympus | CKX53 | Mikroiğne ucu çözünme sürecini gözlemleyin |
| Fare yumurtalık epitel kanseri hücresi ID8 | MeisenCTCC | CC90105 | Hücre kültürü |
| Nanopartikül izleme analizi | Parçacık Metrix | ZetaView | Eksozomların boyut analizi |
| Pasifik Mavisi anti-fare I-A/I-E antikoru | Biolegend | 107619 | Antikoru |
| Fenilmetansülfonil florür | Beyotime | ST507 | Proteaz inhibitörleri |
| Plazma temizleyici | Hefei Kejing Malzeme Teknolojisi | PDC-36G | Mikroiğne imalatı |
| Polidimetilsiloksan | Dow Corning | 9016-00-6 | Kalıp hazırlama |
| Polivinilpirolidon (MW = 40 kDa) | Aladdin | 9003-39-8 | Mikroiğne imalatı |
| Prizma | GraphPad | Sürüm 9 | İstatistiksel analiz |
| PVDF membran | Kırlangıç | IPVH00010 | Western blotting |
| Hızlı çıtçıtlı santrifüj | Beckman | 344619 | Eksozom ekstraksiyonu |
| RIPA lizis tamponu | Applygen | C1053 | Lizis membranı |
| Roswell park anıt enstitüsü 1640 | Meilunbio | MA0548 | Hücre kültürü |
| Taramalı elektron mikroskobu | JEOL | JSM-IT800 | Mikroiğne Stereo mikroskobun morfolojik karakterizasyonu |
| Olympus | SZX16 | Morfolojinin karakterizasyonu | |
| Süper ECL algılama reaktifi | Applygen | P1030 | Western blotting |
| Çekme ölçer | Instron | 68SC-05 | Mekanik test |
| Transmisyon elektron mikroskobu | JEOL | JEM-2100plus | Eksozomların morfolojik karakterizasyonu |
| Tris tamponlu salin | Sangon Biotech | JF-A500027-0004 | Batı blotlama |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | Western blotting |
| Ultrasantrifüj | Beckman | Optima XPN-100 | Eksozom ekstraksiyonu |
| Ultrafiltrasyon tüpü | Millipore | UFC910096 | Eksozom konsantrasyonu |
| Vakumlu kurutma fırını | Şangay Yiheng Teknolojisi | DZF-6024 | Mikroiğne |
| Vakum filtrasyon sistemi | imalatı Biosharp | BS-500-XT | Filtrasyon |
Kaynaklar
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (640), 6977(2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).
- Nair, A., et al. Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform. Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).
- Lu, Z., et al. Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models. J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).
- Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes. J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Liao, W., et al. Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy. Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).
- Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).
- Wen, S., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model. Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).
- Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes. Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).
- Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment. Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).
- Zheng, Y., et al. A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination. Macromol Biosci. 23 (12), e2300253(2023).
- Huang, D., et al. Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array. Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).
- Zhou, Z., et al. Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle. Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).
- Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. Microneedles for drug and vaccine delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).
- Bui, V. D., et al. Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles. Biomaterials. 287, 121644(2022).
- Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. Fear of injections in young adults: Prevalence and associations. Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).
- Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).
- Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye. Int J Pharm. 612, 121305(2022).
- Creighton, R. L., Woodrow, K. A. Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa. Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180(2019).
- Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair. ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).
- Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer. Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).
- Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2 (9), 1800021(2018).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162(2016).
- Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer. Carbohydr Polym. 317, 121081(2023).
- Chang, H., et al. Cryomicroneedles for transdermal cell delivery. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
