Yöntem makalesi

Proteinle İlgili Yeni DNA Zincirlerinin Zenginleştirilmesi ve Dizilenmesi Yoluyla Proteinlerin Zincire Özgü Analizi

DOI:

10.3791/67120

⸱

2 Mayıs 2025

 ,  ,  ,  , 
1Hormel Institute, University of Minnesota, 2West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University, 3Institute for Cancer Genetics, Department of Pediatrics and Department of Genetics and Development, Columbia University Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın zenginlenmesi ve dizilenmesi (eSPAN), iki çoğalan DNA zincirinde kromatin ilişkili proteinin göreceli bolluğunu tespit etmek için geliştirildi ve böylece kromatin replikasyonu ve bağlı süreçler hakkında moleküler içgörüler ortaya çıktı. Bu protokol, maya ve fare embriyonik kök (ES) hücrelerinde eSPAN prosedürlerini tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genom çoğaltması, çift zincirli DNA'yı bireysel antiparalel tek zincirlere ayıran helikazlar dahil olmak üzere repliozom proteinler tarafından organize edilir; bu proteinler çift zincirli DNA'yı ayrı antiparalel tek zincirlere ayırır ve her biri farklı replikasyon modları gerektirir: sürekli (önde) ve kesintili (gecikmeli). Kromatin ile ilişkili proteinlerin in vivo çoğalan DNA zincirleriyle etkileşimlerini anlamak, kromatin montajı ve DNA onarımının DNA çoğalmasına bağlı olarak nasıl etkileşim mekanizmalarını aydınlatmak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, proteinle ilişkili yeni başlayan DNA (eSPAN) zenginleştirme ve dizileme yöntemini sunar; bu yöntem, çoğaltma çatallarındaki yeni ve geride kalan DNA zincirlerinde göreceli protein seviyelerini nicelendirmek için tasarlanmıştır. eSPAN prosedürü, ilgi çekici bir proteinin kromatin immünpresipitasyonu (mayada ChIP) veya hedefler altında bölünmesi ve etiketlenmesi (CUT&Tag; memeli hücrelerinde) ile başlar, ardından proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın bromodeoksiyuridin (BrdU) immünopresipitasyonu ile zenginlenmesi yapılır. İzole edilmiş ssDNA'ya zincire özgü yeni nesil dizileme uygulanır. Bu teknik, bir proteinin önde mi yoksa gecikmeli replikasyon çatallarında zenginleşip zenginleşmediğini belirlemek için kullanılabilir. eSPAN, kromatinle ilişkili proteinlerin genom çapında iplik tercihi sağlar; bunlar arasında replikasyon çatallarındaki histonlar da bulunur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryot organizmalarda, genom çoğaltması, replikasyon kökenleri adı verilen birden fazla bölgeden başlatılır; burada köken tanıma kompleksi (ORC) CMG helikazını da dahil olmak üzere toplama protein mekanizmasına bağlanır ve başlatarak DNAreplikasyonunu başlatır. Her replizom başlangıcındaki replisome mekanizması, iki yönlü hareket eden iki replikasyon çatalıoluşturur 2,3. İkiz replikasyon çatalları, öncü zincirin sürekli sentezi ve gecikmeli zincirin kesintisiz sentezi yoluyla DNA'nın iki ana zincirini çoğaltır. Her replikasyon çatalının bu asimetrik yapısı göz önüne alındığında, öncü ve gecikmeli ipliklerdeki DNA polimerazları dahil olmak üzere çoğaltma bileşenleri farklıdır. Mutant DNA polimerazlara dayalı önceki genetik analizler, DNA Pol ε ve DNA Pol δ'nin iplik çoğalmasını önde ve gecikmeli olarak sorumlu başlıca polimerazlar olduğunugöstermektedir 4,5. DNA polimerazının iplik tercihini tespit etmek için Pu-seq 6,7, HydEn-seq8 ve emRiboSeq veya RiboSeq 9,10 gibi çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Zincir özgüllüğünü disseksiye yönelik bu genetik yöntemler, DNA polimerazlarla sınırlıdır ve herprotein 4,5,11,12 üzerinde mutasyonların getirilmesini gerektirir. Herhangi bir hedef proteinin önde gelen ve geciken DNA replikasyon çatalları zincirleriyle ilişkisini izlemek, DNA çoğaltımı hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır. Bu çabada, maya hücrelerinde önce eSPAN tekniğini (proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın zenginleştirmesi ve dizilenmesi, Şekil 1) geliştirdik. Bir temel kanıt çalışması olarak, önce Pol δ ve Pol δ'nin sırasıyla önde ve gecikmeli ipliklerde zenginleştiğini gösterdik. Ayrıca, replikatif DNA helikazı, tek zincirli DNA bağlayıcı protein (replikasyon proteini A) ve çoğalan hücre nükleer antijeni (PCNA) lambası ile yükleyici replikasyon faktörü C (RFC)13 dahil olmak üzere önemli DNA replikasyon bileşenlerinin iplik tercihini de ortaya çıkardık. Önemli olarak, biz ve diğerleri bu yöntemi ebeveyn histon transferi mekanizmalarını ortaya çıkarmak için kullandık; bu süreç 4 on yılı aşkın süredir çözülemezdi(14,15,16,17).

eSPAN yöntemi iki ardışık adımdan oluşur: hedef proteinin ChIP18 veya CUT&Tag19 ile zenginleştirilmesi ve proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın BrdU immünopresipitasyonu ile zenginlenmesi. Standart bir maya suşunda (W303 veya S288C), ekstrasellüler BrdU veya EdU hücrelere girip kromozomlara dahil olamaz. Bu suşlar, timidin alımı için uygun bir nükleozid taşıyıcıya ve timidini TMP'ye fosforile getirmek için gereken timidin kinazına sahip değildir; bu da BrdU'yu (veya EdU) BrdUMP'ye (EdUMP) dönüştürür. İnsan dengeleyici nükleozid taşıyıcısı 1 (hENT1) ve herpes simpleks virüsü timidin kinazın (HSV-TK) ekspresyonu timidin alımını ve BrdU'nun (veya EdU) BrdUMP'ye (EdUMP)20'ye dönüşümünü artırır. Bu nedenle, eSPAN deneyini maya üzerinde yapmak için suşların BrdU-Dahil (BrdU-Inc) yapısı (HSV-TK ve hENT1)13,21 ile yerleştirilmesi gerekiyordu.

Daha önce, maya22'deki DNA replikasyon proteinleri için eSPAN protokolünü sağlamıştık. Son zamanlarda, CUT&Tag yöntemini memeli hücrelerinde eSPAN protokolüne entegre ettik; böylece çapraz bağlama, kromatin kesme gibi optimizasyon gerektiren teknik olarak zor adımları ele aldık ve başlangıç hücre sayısınıen aza indirdik 17,23. Burada, maya hücreleri kullanılarak görselleştirme için histon eSPAN sağladık (Şekil 2). Bu yöntem, esas olarak değiştirilmiş histon formlarının çoğalan DNA zincirlerindeki dağılımını analiz etmek için kullanılır. Birkaç histon işaretini test ederken, örnek olarak ebeveyn histon H3 üzerindeki bir işaret olan H3K4me3'ü kullandık. Replioz bileşenlerini ve DNA onarımında rol alan faktörleri replikasyon çatallarında analiz etmek için, kromatinin sonikasyon kullanılarak küçük parçalara kesilmesini öneriyoruz22. Memeli hücreleri için, maya23'te tanımlanan ChIP adımının yerine değiştirilmiş Cut&Tag prosedürlerini benimsedik. Bu modifikasyon, başlangıç materyali (hücreler) miktarını azaltır ve en önemlisi, tek zincirli DNA hazırlık kitleri kullanmadan dizileme için eSPAN kütüphanelerinin oluşturulmasını sağlar. Mayalama protokolü için, başlangıç malzemesi miktarı yeterli olduğu için Cut&Tag yöntemini kullanmamayı tercih ettik. Daha da önemlisi, Cut&Tag prosedürlerinin elimizdeki maya hücreleri için tutarlı şekilde etkili olmadığını bulduk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tampon ve reaktif hazırlama yönergeleri için tampon ve reaktif hazırlama kılavuzlarına bakınız (Ek Dosya 1).

1. Tomurcuklanan maya içindeki histon eSPAN

NOT: Çoğu maya suşunda timidin alımı için işlevsel bir nükleozid taşıyıcısı yoktur. DNA'yı eSPAN için BrdU veya EdU ile verimli şekilde etiketlemek için timidin kinaz-pozitif (TK+)süzüm 21 gereklidir. Ayrıca, alfa faktörü kullanılarak hücre döngüsü durdurulması için yalnızca çiftleşme tipi 'A' maya suşları kullanılabilir.

  1. Maya hücresi senkronizasyonu ve BrdU etiketleme (8 saat)
    1. Uygun maya suşundan (TK+) oluşan tek bir kolonini 10 mL YPD ortamına aşılayın ve 30 °C'de sallanan bir kuluçka makinesinde gece boyunca 220 rpm'de büyütün.
    2. Optik yoğunluk, OD600 nm, bir spektrofotometre ile ölçülüp kültürü OD600 ~0.2-0.3 ile taze 200 mL YPD ortamına seyreltin.
    3. Kültürü 30 °C'de 220 rpm'de sallama kuluçkasında OD600 ~0.4-0.5 (genellikle 3-4 saat sürer) kadar büyütün.
    4. 300 μL α faktörü (5 mg/mL) ekleyin ve 25 °C'de, 220 rpm'de 1,5 saat kültür yapın.
    5. 300 μL α-faktör (5 mg/mL) bir doz daha ekleyin ve 25 °C'de, 220 rpm'de 1,5 saat daha büyütür.
    6. %37,5 paraformaldehit fiksasyon çözeltisini hazırlayın ve hücre senkronizasyonu sırasında ortamı (200 mL YPD +HU (hidroksiüre)+ BrdU) 30°C'ye kadar önceden ısıtın.
      DIKKAT: BrdU'yu dikkatli kullanın çünkü potansiyel bir mutajen ve teratozendir. Paraformaldehit potansiyel bir kanserojen olduğundan, zararlı buharlara maruz kalmamak için kimyasal bir buhar kapasosunda %37,5 paraformaldehit çözeltisi hazırlayın.
    7. Hücrelerin morfolojisini (bir çubuk şekli) ışık mikroskobu ile kontrol edin; böylece maya hücrelerinin en az %90'ının G1 fazında olduğundan emin olun; 3 saat G1 durmasından 15 dakika önce. Alternatif olarak, G1arresti 24'ü doğrulamak için floresans-aktifete edilen hücre sıralaması (FACS) analizi yapın.
      NOT: Bu adımda hücre morfolojisini kontrol edin ve G1 tutukluğunu (%90'ı çubuk şeklinde) doğrulayın.
    8. Hücreleri (pellet) 1600 g'de santrifüjle 5 dakika boyunca 4 °C'de toplayın ve hücre pelletini 20 mL buz soğukluğu çift damıtılmış suyla iki kez yıkayın.
    9. Hücreleri önceden ısıtılmış (30 °C) 200 mL YPD +HU+ BrdU ile yeniden süslü olarak yerleştirin.
      NOT: HU salınımının amacı, çoğu maya hücresinin erken replikasyon S fazında olmasını sağlamaktır; bu da tutarlılığı artırır ve sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlar. Log faz hücreleriyle çalışmak gerekiyorsa HU'nun çıkarılması kabul edilebilir.
    10. Hücreleri 30 °C, 220 rpm'de sallanan kuluçka makinesinde 45 dakika kültürleyin.
      NOT: Erken S evresini doğrulamak için FACS analizi yapılabilir. FACS analizi için, G1 hücre popülasyonunu doğru tanımlamak için log-faz örneğinin kontrol olarak dahil edilmesi önemlidir. Verimli BrdU entegrasyonu için hızlı büyüyen hücrelerle başlamak avantajlıdır. Yavaş büyüme kusurlu bazı mutantlar, düşük BrdU etiketleme verimliliği gösterme eğilimindedir. BrdU'nun dahil edilmesinin verimliliği ve BrdU-IP'nin performansı, 1.6.7. adımdan izole edilmiş DNA kullanılarak çoğaltılmış ve çoğaltılmamışbölgeler 22 karşılaştırılarak nicel PCR ile değerlendirilir.
  2. Örnek fiksasyonu ve toplama (1 saat)
    1. Taze hazırlanmış 6 mL %37 paraformaldehit ekleyin, son konsantrasyona %1 ekleyin, iyi karıştırın ve 25 °C'de 20 dakika boyunca hafif çalkalayarak, 90 rpm'de inkübe edin.
    2. Fiksasyonu 12 mL 2.5 M glisin ekleyerek yatıştırın, iyi karıştırın ve 25 °C'de 5 dakika boyunca hafif çalkalayarak, 90 rpm'de inkübe edin.
    3. Hücreleri 1600 g ile oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca pellet yapın. Sonra hücreleri 20 mL soğuk suyla iki kez yıkayarak 1600 g sıcaklıkta 5 dakika boyunca döndürün.
    4. Hücreleri 2 mL vida kapaklı tüplerde (50 mL hücre/tüp) toplayın ve -80 °C'de saklayın.
      NOT: Hücreler bir yıla kadar saklanabilir (duraklama noktası).
  3. Maya hücresi lizisi ve kromatin parçalanması (5 saat)
    1. Hücre pelletlerini erit, nazik vorteksle yeniden süzültü, proteaz inhibitörleri ve antibiyotik karışımı ile 0,4 mL ChIP liz tamponu ile yıkanıp 5.000 g ile 1 dakika boyunca spin yapın.
    2. Proteaz inhibitörleri içeren 0,1 mL ChIP lizin tamponu ve bir antibiyotik karışımı ekleyin, ardından yaklaşık 100 μL cam boncuk (0,5 mm) ekleyin.
    3. 4 °C soğuk odada 3 döngü boyunca (30 saniye açık/kapalı, 1 dakika aralı) boncuk dövülmesiyle lize yapın.
    4. Tüpün dibine 16 G sıcak iğne ile delik aç.
      NOT: İğneyi sıcak tutmak için tüpü ateşe yakın tutmaya çalışın.
    5. Lizat toplayın, tüpü 1,5 mL boş DNA düşük bağlanma tüpüne yerleştirin ve 1600 g seviyesinde 2 dakika RT boyunca santrifüj yapın.
    6. Süpernatantı dikkatlice üfleyin, pelleti rahatsız etmeden (kromatin hücre kalıntı fraksiyonunda olacak).
      DIKKAT: Vakum kullanırken hücre pelletini yanlışlıkla emmemeye dikkat edin.
    7. Hücre pelletlerini, 0,35 mL MNase Sindirim Tamponu'na pipetle takviye edilerek yeniden süzülür; 0,5 mM spermidin ve 0,1 mM 2-merkaptoetanol eklenir.
    8. Reaksiyonlara 10 birim MNase ekleyin, hemen 4-6 kez ters çevirerek nazikçe karıştırın ve 37 °C su banyosunda 20 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Her MNase enzimi partisi için sindirim koşulları, mono-, di- veya tri-nukleozom fraksiyonları için zenginleştirilecek şekilde optimize edilmelidir.
    9. MNase sindirimini 5 μL 0.5 M EDTA ekleyerek nihai konsantrasyon 10 mM EDTA olarak söndürülür. Nazikçe ters çevirerek karıştırın ve tüpleri en az 30 dakika buzda hemen tutun.
      NOT: Bu aşamada örnekler gece boyunca 4 °C'de saklanabilir. MNase sindirim koşulları, mono-, di- veya tri-nukleozom fraksiyonlarının çoğunluğunu (140-450 bp) elde etmek için optimize edilmelidir
    10. Reaksiyon karışımını bioruptor mikrotüpleriyle (1,5 mL) 3 dakika boyunca (yüksek güçlü, 30 saniye açık/kapalı) sonikle geçirin. 10.000 g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca spin yapın.
      NOT: Bu kısa sonikasyon kromatinin tampona salınmasına yardımcı olur.
    11. Süpernatantı yeni tüplere aktarın ve 10.000 g ile 4 °C'de 10 dakika daha döndürün.
    12. Süpernatan (yaklaşık 400 μL) toplayın, örneğin 30 μL'sini giriş DNA'sı olarak alın ve -20 °C'de dondurun. Kalan (~370 μL) hücre lizatını bir sonraki kromatin immünopresipitasyonunda kullanın (adım 1.4.1).
  4. Histon kromatin immünopresipitasyonu (gece boyunca)
    1. Lizata 0,5 μg H3K4me3 antikoru ekleyin ve rotorda 10 rpm'de 4 °C'de gece boyunca nutat yapın.
      NOT: Burada örnek olarak H3K4me3 kullanılmıştır. Antikor miktarı deneysel olarak test edilmelidir.
    2. 15.800 × g ile 4 °C'de 10 dakika boyunca spin yapın ve süpernatantı yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın.
    3. 20 μL önceden yıkanmış protein G Sefaroz boncukları ekleyin (3 kez ChIP lizin tamponu ile yıkanır, rotor üzerinde 3 dakika nutate edilir, boncukları 350 × g, 4 °C'de santrifüjle toplanır) ve 4 °C'de 2 saat kuluçka için.
    4. RT'de 350 × g ile çevirin ve boncukları aşağıdaki sırayla yıkayın.
      1. 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ile her seferinde RT hızında 10 rpm'de döndürerek her iki kez 3 dakika boyunca yıkayın.
      2. 1 mL buz soğukluğu lizis tamponu ile 0.5 M NaCl tampon ile 3 dakika boyunca RT hızında 10 rpm'de rotator üzerinde döndürerek bir kez yıkayın.
      3. 1 mL buz gibi soğuk Tris/LiCl yıkama tamponu ile 3 dakika boyunca 10 rpm'de dönerek RT hızında rotator üzerinde bir kez yıkayın.
      4. Birini 1 mL RT Tris/EDTA yıkama tamponu ile yıkayın (TE tamponu değil, tarif için Ek Dosya 1 ). Pelletten mümkün olan tüm sıvıyı 16 G 1/2 iğneyle dışarı at.
  5. DNA çıkarımı (2 saat)
    1. Yıkanmış boncuklara (1.4.4.4. adımdan itibaren), giriş örneği (1.3.12. adımdan) ve girdaba DNA çıkarımı için 0.1 mL iyi karıştırılmış %10 şelatlayıcı reçine ekleyin.
    2. 100 °C ısı bloğunda 10 dakika kaynatın, sonra RT'ye soğutup ters çapraz bağlantı yapın.
      NOT: Santrifüj tüpleri için stop-pop kilitleme klipsleri, kapanma kapalılığını korumak için şiddetle tavsiye edilir.
    3. Boncuklara 5 μL 20 mg/mL proteaz K ekleyin ve 55 °C'de 30 dakika boyunca 400 rpm'de çalkalayarak inkübe yapın.
    4. Boncukları 100 °C sıcaklık bloğunda 10 dakika daha kaynatarak proteaz K aktivitesini etkisiz hale getirin.
      NOT: Santrifüj tüpleri için stop-pop kilitleme klipsleri, kapanma kapalılığını korumak için şiddetle tavsiye edilir.
    5. Boncukları 6000 g'de RT hızında 2 dakika boyunca döndürün ve süpernatantı kaydedin.
    6. Pellete 100 μL 2XTE ekleyin. Girdabla 6000 g'de RT'de 2 dakika boyunca spin yapın.
    7. Yukarıda alınan üst yüzeyleri (yaklaşık 180 μL) karıştırın ve kaydedin (1.5.5 ve 1.5.6 adımlarından).
    8. 30 μL örnekleri, ssDNA kütüphanesi hazırlamak için DNA arıtma sütunları kullanılarak (giriş olarak 1.3.12 ve H3K4me3 ChIP-seq örnekleri olarak 1.5.7. adımdan başlayarak) 18 μL elülasyon tamponu (EB, PCR arıtma kiti ile sağlanır) olarak arıtın.
      NOT: DNA örnekleri -20 °C'de bir aya kadar (duraklama noktası) saklanabilir.
  6. BrdU immünopresipitasyonu (5 saat)
    1. Örnekleri (yaklaşık 150 μL giriş ve H3K4me3 ChIP) 100 °C ısı bloğunda 5 dakika kaynatın ve hemen 5 dakika buzda soğutun. 15 μL 10x PBS ve + 1,35 mL BrdU IP buffer + 0,5 μL anti-BrdU Ab + 1 μL E.coli tRNA (10 mg/mL) ekleyin.
      NOT: Bu kritik bir adım. Düşük DNA bağlayıcı santrifüj tüplerini kullanarak spesifik olmayan DNA bağlanmasını önleyin.
    2. Rotorda 2 saat boyunca 4 °C'de, 10 rpm'de nutate yapın.
    3. Karışımı, 20 μL protein G Sefaroz boncukları içeren 1,5 mL bir tüpe aktarın (1 mL BrdU IP tamponu ile üç kez yıkanır ve RT'de her yıkama için 10 rpm'de 3 dakika döndürülür) ve rotor üzerinde 4 °C'de 10 rpm'de 1 saat nutate edilir.
    4. 800 × g ile RT'de 1 dakika döndürün ve aşağıdaki şartlara göre yıkın: 1 mL soğuk BrdU IP tamponu ile üç kez, rotorda 3 dakika ve bir kez 1 mL TE tamponla 3 dakika boyunca.
    5. 800 × g'de RT'de 1 dakika boyunca spin yapın ve süpernatantı aspire edin.
    6. Kalan boncuklara 100 × μL TE + %1 SDS tamponu ekleyin. 65 °C'de 5 dakika kuluçka yapın. RT'de 800 × g'de 1 dakika spin yapın.
    7. Üst örtü, DNA arıtma kolonları (BrdU IP ve H3K4me3 eSPAN örneği) kullanılarak 18 μL EB olarak arındırın.
      NOT: Özgül olmayan DNA bağlanmasını önlemek için düşük bağlanma tipli santrifüj tüplerini kullanın. DNA örnekleri -20 °C'de bir aya kadar (duraklama noktası) depolanabilir.
  7. ssDNA kütüphanesi hazırlama ve dizilemesi (3 saat)
    1. Tek zincirli DNA kütüphanelerini, ssDNA ve düşük girdili DNA kütüphanesi hazırlık kiti tarafından sağlanan kılavuzlara göre 15 μL saflaştırılmış girdi, BrdU IP, H3K4me3 ChIP ve eSPAN örnekleri (1.5.8 ve 1.6.7. adımlar dahil) (adaptaz, uzatma ve ligasyon adımları dahil) ile hazırlanın ve elde edilen ligasyon ürününü 20 μL düşük EDTA elülasyon tamponu (DNA Library Prep Kit tarafından sağlanan) haline getirin.
      NOT: Kitle birlikte iki ligasyon arındırma adımı vardır. Bu protokol 200 bp, <1 ng prosedürünü takip eder.
    2. Toplam 50 μL reaksiyon karışımı kullanarak DNA kütüphanesini amplifikasyon (reaktifler ssDNA kütüphanesi hazırlık kiti tarafından sağlanmıştır): 20 μL arındırılmış DNA kütüphanesi, 4 μL W2 reaktif, 10 μL W3 reaktif, 1 μL W4 enzimi, 1,5 μL Indeks I7 primerleri (10 μM, bkz. Ek Oligo Dizisi) ve 1,5 μL Indeks I5 primer (10 μM, bkz. Ek Oligo Dizisi), 16 μL DNazsızddH 2O. PCR karışımını 98 °C'de 30 saniye ısıtın, ardından 18 döngü 10 saniye 98 °C, 30 saniye 60 °C, 1 dakika 68 °C ve 10 dakika 68 °C'de ısıtın.
      NOT: Her kütüphane i7 ve i5 primerlerinin benzersiz bir kombinasyonunu kullanmalıdır. Amplifikasyon döngülerinin sayısı, kütüphanenin miktarına göre ayarlanmalıdır; böylece aşırı amplifikasyon PCR artefaktlarına yol açabilir. eSPAN örneklerindeki tipik düşük DNA miktarı göz önüne alındığında, 18 döngüye kadar kullanın.
    3. PCR ürünlerini 60 μL (1,0x hacm) boncuklarla (önceden 30 °C'ye ısıtılmış) karıştırarak saflaştırın ( bkz. Malzemeler Tablosu).
    4. PCR ürünlerini ve boncukları iyice karıştırın.
      1. RT pozisyonunda 5 dakika beklet. Boncukları manyetik standa 3 dakika boyunca bağlayın ve boncukları (her seferinde 200 μL) taze hazırlanmış %80 etanol ile iki kez yıkayın.
      2. Boncukları 2 dakika boyunca havada kurutup 20 μL düşük EDTA tamponuna elüasyon yapın (DNA Library Prep Kit'te sağlanmıştır).
    5. Yüksek çözünürlüklü elektroforez sistemleri kullanılarak kütüphane konsantrasyonu ve parça boyutu dağılımını ölçün ( bkz. Materyal Tablosu).
    6. Giriş, H3K4me3 ChIP, BrdU IP ve eSPAN örnekleri dahil olmak üzere eşit sayıda bireysel kütüphaneyi bir arada topla ve Illumina dizileme platformuyla paralel eşleştirilmiş uçlu dizileme gerçekleştirin. Veri analiz süreci için bölüm 3'e bakınız.
      NOT: Kalite kontrol sonuçları için değerlendirme kriterleri şunlardır: (i) Adaptör/primer-dimer zirveleri (180 bp'nin altında) tespit edilmemiştir. (ii) Birleştirilecek tüm kütüphaneler benzer ve dar bir boyut dağılımına sahiptir (~300 bp genişliği). Boncukların aşırı kurutulması düşük vermeye yol açabilir; Kontaminasyondan kaçınmak için DNA iş istasyonu kullanın. Kütüphaneler -20°C'de (duraklama noktası) süresiz olarak saklanabilir.

2. Fare ES hücresiyle histon eSPAN

NOT: Fare ES hücresiyle histon eSPAN esasen daha önce yayımlanmış birprotokol 23 ile aynıdır.

  1. Fare ES hücreleri için BrdU etiketleme ve örnek toplama (3 saat)
    1. Fare ES hücrelerini nemlendirilmiş, %5CO2 atmosferinde 37 °C'de ES hücre kültür ortamında yetiştirerek %70-80 birleşime ulaşın. Genel olarak, histon eSPAN için yaklaşık 1 milyon hücre gerekiyordu. Deneylerden 1 gün önce tohum hücreleri kullanılarak hücrelerin üstel aşamada büyümesini sağlamak sağlanır.
    2. Ortamı değiştirin ve hücreleri BrdU ile 50 μM nihai konsantrasyonda 37 °C'de nemlendirilmiş, %5CO2 atmosferiyle 30 dakika boyunca kuluçka yapın.
      NOT: BrdU etiketleme verimliliği nicel PCR analiziyle izlenebilir. Alternatif olarak, BrdU inkorporasyon verimliliğini izlemek için immünofluoresans veya FACS analizi kullanılabilir. Etiketlenmemiş hücreler negatif kontrol olarak kullanılabilir. Bunlar fare ES hücreleri için standart etiketleme koşullarıdır. Değişken proliferasyon oranlarına ve S-faz süresine sahip hücreler için etiketleme koşullarının buna göre ayarlanması önerilir.
    3. Hücreleri buz gibi soğuk PBS ile iki kez nazikçe durulayın.
    4. Hücreleri tripsine edin ve 200 × g ile 5 dakika boyunca pellet yapın.
    5. Hücreleri yavaşça orta seviyeye pipetleyin, tekrar süzülmeleri için ekleyin, sonra sayın. Gerekli hücre sayısını 500 × g ile RT'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    6. Hücre pelletini pipetle 4 mL yıkama tamponu içinde yeniden askıya alın ve süpernatantı atın. 500 × g ile 5 dakika RT'de santrifüj yapın.
    7. Pelletleri tekrar 4 mL yıkama tamponu ve 500 × g seviyesinde 5 dakika RT'de tekrar askıya alın.
    8. Süpernatantı atın ve hücreleri yıkama tamponuna yeniden yerleştirin.
    9. ConA kaplı manyetik boncukları yerleştirin (250000 hücre için 10 μL boncuk kullanın; daha fazla hücre kullanıldığında ölçek artırın) ve 1 mL bağlanma tamponuna tekrar süsleyebilirsiniz. Birden fazla ters çevirmeden sonra, boruları manyetik standa konumlandırın ki boncuklar yerleşsin.
    10. Pipet veya düşük hızlı vakum kullanarak süpernatanları atın. Yıkama adımlarını iki kez tekrarlayın ve boncukları bağlayıcı tampona tekrar askıya alın.
    11. Örneklere önceden yıkanmış ConA kaplamalı mıknatıs boncuklar ekleyin. İyi karıştırın ve RT rejiminde 10-20 dakika döndürün.
    12. Tüpleri bir mıknatıs standına yerleştirerek tüm süpernatanları atabilirsiniz.
  2. Fare ES hücreleri içinetiketleme 19 (2 gün)
    1. Boncukları (2.1.10. adımdan itibaren hücrelerle bağlanmış ConA kaplı mıknatıs boncukları) 200 μL buz soğukluğu antikor tamponu içinde yeniden askıya alın. Negatif kontrol olarak IgG veya ilgi duyulan proteinlere karşı uygun birincil antikor konsantrasyonları ekleyin.
    2. İyi karıştırın ve gece boyunca 4 °C'de nute yapın.
    3. İkincil antikordan 2 μg ve uygun miktarda pA-Tn5'i 1:2 molar oranında karıştırın. Toplam hacmi %50 (v/v) gliserol ile 8 μL/numuneye indirin. İyi karıştırmak için birkaç kez pipet yapın ve RT'de 1 saat kuluçka yapın.
    4. CUT&Tag örneklerini 30 saniye boyunca bir mıknatıs standına yerleştirin ve tüm süpernatantları atın. Boncuk pelletine 1 mL Dig-wash tamponu ekleyin ve birkaç kez ters çevirin.
      NOT: Bundan sonraki yıkama adımlarına (2.2.5-2.2.6) geçiş yaparak, nonspesifik bağlanmayı önlemek için ters çevirme aşamasından sonra boncukların tamponlarda 3-5 dakika kuluçka halinde alınması önerilir.
    5. Tüpleri bir mıknatıs standına yerleştirin ve tüm süpernatantları çıkarın. Boncukları yeniden süspansiyona almak için 200 μL Dig-300 tamponu ekleyin ve her numuneye ikincil antikor ve pA-Tn5 karışımından 8 μL eklenin. Pipetle birkaç kez iyi karıştırdıktan sonra, RT'de 1 saat kuluçka yapın.
    6. Tüpleri bir mıknatıs standına yerleştirin ve tüm süpernatantları çıkarın. Boncukları yeniden asmak için 1 mL Dig-300 tamponu ekleyin ve birkaç kez ters çevirin.
    7. Tüpleri bir mıknatıs standına yerleştirin ve tüm süpernatantları çıkarın. Yıkama adımını 3 kez daha tekrarlayın.
    8. Üst kısımları tamamen çıkarın ve boncukları yeniden süslemek için 250 μL Etiketleme tamponu ekleyin ve 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
      NOT: Termomikserde reaksiyon aşamasında nazik sallama önerilir çünkü boncuklar tüplerin dibine çökebilir.
    9. Tüpleri bir mıknatıs standına yerleştirin ve tüm süpernatantları çıkarın. 1 mL TAPS yıkama tamponu kullanarak boncukları tekrar askıya alın ve birkaç kez ters çevirin.
    10. Tüpleri bir mıknatıs standına yerleştirin ve tüm süpernatanları atın.
    11. Kalan boncuklara 15 mM EDTA, %0,1 (w/v) SDS ve 0,1 mg/mL proteinaz K içeren 250 μL Dig-300 tamponu ekleyin. Vortex'i iyi karıştırıp gece boyunca 37 °C'de hafif sallayarak kuluçka edin.
  3. Fare ES hücrelerinde genomik DNA arındırma ve in vitro etiketleme (gece boyunca)
    NOT: eSPAN için aynı hücrelerden genomik DNA çıkarılır ve in vitro etiketleme için hazırlanır; bu da BrdU-IP-ssSeq için kullanılır. Genomik DNA etiketleme ve onu takip eden BrdU-IP-ssSeq eSPAN normalizasyon amaçları içindir.
    1. Hücreleri 300 μL genomik DNA liz tamponu ve girdabında maksimum hızda tekrar askıya alın, ta ki hiçbir pelet görünmeyecek kadar devam etsin.
    2. Her örnek için 100 μg/mL olan RNase A ekleyin. Birleştikten sonra, 37 °C'de 10 dakika kuluçka yapın.
    3. Her numuneye 100 μL protein çökeltme çözeltisi ekleyin. 15.000 g RT'de 3 dakika boyunca vortex ve santrifüj yaparak iyice karıştırın.
    4. Süpernatantı yeni 1.5 mL tüplere aktararak kurtarın. Örneklere 1x hacim isopropanol ekleyin ve iyi karıştırın.
    5. RT rejiminde maksimum hızda 3 dakika boyunca spin atarak genomik DNA'yı pellet edin. Süperatantları dikkatlice dök.
    6. Her numuneye 1 mL taze hazırlanmış %70 (v/v) etanol ekleyin ve birkaç kez ters çevirin. RT'de maksimum hızda 3 dakika santrifüj yapın.
    7. 15.000 g'de RT hızında 1 dakika boyunca santrifüj yapın ve kalan etanolü P20 pipeti ile çıkarın. 5-10 dakika hava kurutmaya bırakın.
    8. 50 μL ddH2O ekleyin ve genomik DNA'yı yeniden süzültmek için kısa süreliğine vortex ekleyin. 65 °C'de 30 dakika eridin.
    9. Kısa bir süreliğine santrifüj yapın ve süperatantları yeni 1.5 mL tüplere aktarın. DNA konsantrasyonunu spektrofotometre ile nicelikle ölçün.
    10. Tablo 1'de listelendiği gibi in vitro etiketleme reaksiyonunu kurun.
    11. İyi karıştırın ve 37 °C'de 30 dakika boyunca hafif sallayarak kuluçka yapın.
    12. Her numuneye 10 mM EDTA, %0,1 (w/v) SDS ve 0,1 mg/mL Proteinaz K ekleyin. Vortexle iyi karıştırın ve gece boyunca 37 °C'de çalkalayarak inkubasyon yapın.
  4. DNA çıkarımı ve oligo replasmanı (3 saat)
    NOT: DNA çıkarımı için hem fenol-kloroform-izoamil alkol (PCI) hem de kolon arıtma uygulanabilir. Burada, sütun arıtması ile ilgili ayrıntılı prosedürler sunulmaktadır.
    1. Örneklere 1.25 mL (5x hacim) bağlama tamponu (PCR arıtma kitiyle birlikte sağlanan) ekleyin (adımlar 2.2.11 ve 2.3.12.) ve birkaç kez ters çevirerek iyi karıştırın.
    2. Karışımı DNA arıtma kolonlarına (2 mL toplama tüplerinde) yükleyin ve RT'de 10.000 × g sıcaklıkta 30 saniye boyunca santrifüj yapın. Akışı atın.
    3. Sütunlara 600 μL elution tamponu (kit dahilinde) ekleyin ve RT'de 10.000 × g sıcaklıkta 1 dakika boyunca santrifüj yapın. Akışı atın.
    4. Kalan tamponu tamamen çıkarmak için maksimum hızda 2 dakika santrifüj yapın. Kolonları kapakları açık yeni 1.5 mL tüplere yerleştirin ve 1 dakika boyunca hava kurutmasını sağlayın.
    5. Membranın ortasına 32 μL DNaz-serbest ddH2O (veya 10 mM Tris·HCL, pH = 8.0) ekleyin ve 1 dakika dinlenmesine izin verin. Santrifüj maksimum hızda 2 dakika boyunca ve CUT&Tag DNA'sı artık çözelti durumda.
    6. Yeni bir PCR tüpüne 32 μL CUT&Tag DNA örneği ekleyin, ardından 2 μL dNTP karışımı (her biri 2,5 mM), 4 μL 10x ampligaz tamponu ve 2 μL rep-B (10 μM) ekleyin. Nazikçe vurun ve pipetle karıştırın.
    7. Kısa bir süreliğine aşağıdaki programı çalıştırın ve oligo replacement23 için devam edin.
      50 °C, 1 dakika
      45 °C, 10 dakika
      37 °C, 0.1 °C/s rampası
      37 °C, bekle
    8. Termosiklere her tüpe 1 μL T4 DNA polimeraz ve 1 μL ampligaz ekleyin (son hacim, 40 μL/örnek). Nazik pipetle karıştırın.
    9. Reaksiyonu termodöngürde 37 °C'de 30-60 dakika boyunca devam ettirin.
      NOT: DNA, bu adımdan hemen sonra BrdU IP'ye geçilmezse -20 °C'de saklanabilir (güvenli duraklama noktası).
  5. BrdU immünopresipitasyonu (esasen maya protokolüyle aynı) (2 saat)
    1. Örnekleri 1.5 mL DNA düşük bağlanma tüplerine aktarın. Örnekleri 100 °C ısı bloğunda 5 dakika kaynatın ve hemen 5 dakika boyunca buzda soğutun. 15 μL 10x PBS ve + 1,35 mL BrdU IP buffer + 0,5 μL anti-BrdU Ab + 1 μL E.coli tRNA (10 mg/mL) ekleyin.
    2. 4 °C'de bir rotorda 2 saat nutate yapın.
    3. Karışımı, 20 μL protein G Sefaroz boncukları içeren bir tüpe aktarın (her biri 3 dakika boyunca 1 mL BrdU IP tamponu ile üç kez yıkanır).
    4. 4 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
    5. 800 × g ile 1 dakika boyunca spin yapın ve şu şartlara göre yıkayın: 1 mL soğuk BrdU IP tamponu ile üç kez, rotorda 3 dakika; bir kez 1 mL TE tamponu ile 3 dakika sürdü.
    6. 800 × g'de 1 dakika boyunca spin yapın ve süpernatantı aspire edin.
    7. Kalan boncuklara 100 μL TE + %1 SDS tamponu ekleyin. 65 °C'de 15 dakika kuluçka yapın. 800 × g'de 1 dakika boyunca spin yapın.
    8. Üst anatı, DNA arıtma sütunları (BrdU IP ve H3K4me3 eSPAN örneği) kullanılarak 18 μL elution tamponu (kit ile birlikte sağlanmıştır) olarak arındırılır.
  6. PCR amplifikasyonu ve dizileme (1,5 saat)
    1. Tek zincirli DNA kütüphanesi örneklerini farklı indeks kombinasyonlarıyla amplifikasyon ve etiketlemek. PCR reaksiyonunu şu bileşenleri ekleyerek hazırlayın ((Saflaştırılmış DNA [ChIP veya ESPAN], I5-İndeksleme primeri [1 μL], I7-İndeksleme primeri [1 μL], NEBNext Yüksek Doğruluklu 2X PCR Master Karışımı (2x) [10 μL], ddH2O ile 20 μL'ye kadar), örnekleri pipetle karıştırın ve kısa bir süre döndürün.
    2. PCR karışımını 98 °C'de 30 saniye ısıtın, ardından 12-14 döngü 10 saniyelik 98 °C ve 20 saniyelik 63 °C'de, ayrıca 72 °C'de 2 dakikalık bir döngü uygulanır.
    3. PCR ürünlerini, 18 μL paramanyetik boncuklarla (0,8x hacim) 20 μL düşük EDTA tamponuna arındırın.
    4. Yüksek çözünürlüklü elektroforez sistemleri kullanarak kütüphane konsantrasyonunu ve parça boyutu dağılımını ölçün.
    5. Giriş, H3K4me3 ChIP, BrdU IP ve eSPAN örnekleri dahil olmak üzere eşit sayıda bireysel kütüphaneyi bir arada topla ve Illumina dizileme platformuyla paralel eşleştirilmiş uçlu dizileme gerçekleştirin.

3. eSPAN maya hücreleri için veri analizi (1 gün)

NOT: Bu veri analiz süreci yalnızca maya verileri için geçerlidir; ES hücreleri için eSPAN veri analizi, yakın tarihli biryayında belirtildiği gibi takip edilebilir 23.

  1. Ham dizi dosyalarını çıkarın, Trim Galore araçlarıyla adaptör dizilerini kırpın ve çıkış dosyasının boyutunu azaltmak ve hizalama programlarının çökmesini önlemek için 10 bp'den küçük okumaları kaldırın. Eşleştirilmiş okumalar için dosyaların file1_1.fq, file1_2.fq formatında olduğundan emin olun:
    /TrimGalore-0.6.10/trim_galore file.fq-o trim --uzunluk 10 - eşleşmiş
  2. Referans genom için bowtie indeks dosyaları oluşturuldu:
    bowtie2-build genome.fa
  3. Okumaları, Bowtie 2 kullanarak ilgili referans genomuna (maya için Saccharomyces genomu (sacCer3)) eşleyin:
    Bowtie2 -x genom -1 trim_1.fq -2 trim_2.fq --yerel --kuyruk kuyruğu yok --uyumsuz--maxins 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50
  4. SAMtools ile çoklu harita okumalarını kaldırın ve Sambamba araçlarıyla tekrarlayan okumaları çıkarın:
    samtools görünümü -bhs - q 40 input.bam -o output.bam
    sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-static markdup output.bam filtered.bam -r
  5. Watson ve Crick ipliklerinde temiz bam dosyalarından her örnek için ayrı ayrı büyük okuma dosyalarını oluşturmak için deeptools kullanın:
    bamCoverage -b filtered.bam -o watson.bw --filterRNAstrand reverse -bs 1 - extendReads
    bamCoverage -b filter.bam -o crick.bw --filterRNAstrand forward -bs 1 - extendReads
  6. Her örnek için her nükleozompozisyonunda 25 ortalama önyargıyı formüle göre hesaplayın: log2, referans nükleozom konumlandırmasından sonra ileri, Watson zinciri/ters (Crick zinciri) okumaları25 ayrıldı. Bu hesaplamalar için R betikleri https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias. Standart bir hesaplama için aşağıdaki komutları kullanın.
    NOT: Bu adım yalnızca maya verileri için geçerlidir; ES hücreleri için yanlılık hesaplaması, yakın tarihli bir yayın23'te özetlendiği gibi takip edilebilir.
    Rscript cal_bias. R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins.bed
  7. Gerekirse, iplik önyargısını BrdU önyargısına göre ayarlayın:
    Rscript normalize_bias. R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --hedef target_list --kontrol control_list
    NOT: "matrix_files" cal_bias tarafından oluşturulan dosyaların bir listesidir. R alfabesi virgülle ayrılmış. örneğin 'file1', 'file2','file3'. "classes_list", her dosyaya karşılık gelen örnek sınıfların virgülle ayrılmış bir listesidir (örneğin, 'brdu', 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "condition_list", her dosyaya karşılık gelen ve virgülle ayrılmış örnek koşulların bir listesidir. Her dosya, önyargı ayarlaması için sınıf ve koşullara göre eşleştirilecektir. "target_list" classes_list'dan alınan derslerin bir listesidir. Kontroller tarafından ayarlanacak veri olarak görev yapacak sınıfları tanımlayacaktır (örneğin, 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "control_list" sınıf listesinden alınan derslerin bir listesidir. Kontroller tarafından ayarlanacak veri olarak hareket edecek sınıfları tanımlar. Liste uzunluğunun target_list ile aynı olduğundan emin olun (örneğin, 'brdu')
  8. Hesaplama ve ayarlamadan sonra, örnekleri gruplayın ve verilerin görselleştirmelerini oluşturun.
    Rscript draw_bias. R -s' bias_matrix/file1.txt, bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g grup 1,grup 2 --interval=T
    -s, yukarıdaki betikler tarafından oluşturulan önyargı dosyalarının bir listesini gerektirir
    -o, çıktı dosyasıdır
    -g, hesaplamak için deneysel grupları tanımlar; yani ortalama yanlılığı çizmek için biyolojik replikasyonlar.
    --T veya F aralığı, deneysel gruplar içindeki grafiklerde standart hataları göstermek için.
    NOT: Replikasyon kökenleri hakkında bilgi BrdU IP verileriyle tanımlanmıştır. Tek nükleozom pozisyonu bilgisi, daha önce yayımlanmışbir makale 25'ten elde edilmiştir. Fare ES hücre verilerinin analizi için, köken bilgisi OK-seq veriseti 26'dan alınmış ve ortalama yanlılık hesaplaması, önceki çalışma23'te belirtilen protokolü takip etmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

eSPAN, hedef protein hakkında histonlar ve histon modifikasyonları gibi ipliğe özgü bilgi elde etmek için kullanılabilir. Bu temsilci sonuçta, Şekil 2'de belirtilen şematik izlenerek tomurcu maya sistemi kullanılarak örnek toplama ve eSPAN süreçleri gerçekleştirilmiştir. Örnek tedavisi ve toplama, hidroksiüre ile işlenmiş erken S faz durumuna uygun bu protokolü takip eder. İki maya suşu, WT (vahşi tip) ve mcm2-3A mutantı kullanıldı. DNA helikaz alt birimi MCM2, ebeveyn histon H3-H4 ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önde ve gecikmeli replikasyon zincirleriyle ilişkili proteinlerin tespiti, kromatin replikasyon mekanizmalarını ve ilişkili süreci anlamak için önemlidir; bu mekanizmalar insan kanseri araştırmaları ve ilaç direnci mekanizmalarıyla doğrudan ilgilidir. 2D jel, yerli Kromatin immünopresipitasyonu (nChIP), iPOND ve yeni başlayan kromatin yakalama 29,30,31 gibi çeşitli yöntemler, DNA çoğaltımı ve DNA onarımı gibi ilgili süreçleri in...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) ve Hormel Startup Fund (C.Y.) hibeleri tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15575020
1.5 mL DNA düşük bağlanma tüpleri Eppendorf22431021
10x ampligaz tamponuLucigenA1905B
10x PBS Corning21-040-CV
10x TBSBioRad1706435
16 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlid İğnesiBD Biosciences305198
ACCEL-NGS 1S VE DNA KÜTÜPHANE KITIEntegre DNA Teknolojileri10009817ssDNA ve düşük girdili DNA kütüphanesi hazırlık kiti 
Agilent 2100 biyoanalizörü Çevik2100 biyoanalizi
Agilent DNA 1000 kit Çevik5607-1504
Ampligase LucigenA0110KParaformaldehidi dikkatli kullanın, yanıcı katı ve tehlikeli bir yapımdır.
AMPure XPBeckmanA63881
AMPure XP SPRI ReaktifiBeckman CoulterA63882
Anti-BrdU antikor BD Biosciences555627
Anti-H3K4me3 antikor abcamab8580
Otomatik hücre sayacı , model TC10BioRad145-0001
Bacitracin Sigma11702
Bacto peptone Thermo Fisher Scientific211830
Benzamidin Hidroklorür SigmaB2417Yanıcı Katı Maddeler
BrdU SigmaB5002BrdU'yu dikkatli kullanın çünkü potansiyel bir mutajen ve teratozendir.
BSANew England BiolabsB9000S
CaCl2SigmaC4901
Hücre kültürü kuluçka makinesi  Thermo Fisher Scientific  model Forma serisi II su kaplamalı CO2 kuluçka makinesi3140
Hücre kültürü ortamı 
Hücre hattı ES-E14 
Chelex-100 BioRad1422842200– 400 kuru ağ boyutu
Kloroform Sigma366919
Concanavalin A (ConA) kaplı manyetik boncuklar Çok bilimler86057-10
DigitoninMillipore300410-5MG
DMSOSigmaD8418
E. coli  tRNA Sigma10109541001
Etanol Thermo Fisher ScientificBP2818100Etanolü dikkatli kullanın, yanıcıdır
GlikozSigmaG7021
Gliserol SigmaG5516
HCl SigmaH1758
HEPES SigmaH3375
İzopropanol Thermo Fisher ScientificBP26324İzoproponol'ü dikkatle kullanın, yanıcı
KAPA HiFi HotStart Hazır KarışımıRoche7958889001
KClSigmaP9541
KOHSigma221473KOH ile dikkatli davranın, aşındırıcı
Düşük hızlı vakum
Mıknatıs standı MilliporeLSKMAGS08
Mastercycler Gradient PCR Termal CyclerEppendorf5331
MgCl2SigmaM8266
mikrokokk nükleaz  (MNase)WorthingtonLS004798
MinElute PCR arıtma kiti Qiagen28006
Mini boncuk vurucuMini BeadBeater 24 Bozucu607
Mini-santrifüj Eppendorf5424R
MnCl2Sigma244589
Çok platformlu sallayıcıFisherbrand02-217-765
Çok platformlu sarstırıcı kuluçka makinesiKıyaslamaINCU-SHAKER 10L
Çok termal ısı bloğu EppendorfTermomikser C
N-[Tris(hidroksimetil)metil]-3-aminopropansülfonik asit  (TIKLAMA)SigmaT5130200– 400 kuru ağ boyutu
NaCl SigmaS9888
NaOH SigmaS8045NaOH'yu dikkatli kullanın, aşındırıcı
NEBNext HiFi 2× PCR master mixNew England BiolabsM0541
NP-40 Igepal CA-630Termo BilimselJ61055. AP
ParaformaldhydeSigma158127Paraformaldehidi dikkatli kullanın, yanıcı katı ve tehlikeli bir yapımdır.
pA-Tn5 enzimi  Addgene121137
PefablocSigma11429868001
Fenol-kloroform-izoamil alkolü Invitrogen15593049
Pipet P1000, P200, P20 ve P2Eppendorf2231300004
PMSFSigma10837091001
Proteaz inhibitörü kokteyl tabletiSigmaS8830
Proteaz inhibitörü kokteyl tableti  SigmaS8830
Protein G-sefaroz boncukları GE Healthcare17-0618-02
Protein çökeltme çözümüQiagen848023
Protein çökeltme çözümüQiagen848023KOH ile dikkatli davranın, aşındırıcı
Protein çökeltme çözeltisi Qiagen848023
Proteinaz K Sigma311584401
QIAquick PCR arıtma kiti Qiagen28106
RNase ASigma10109169001
SDS SigmaL3771
Spektrofotometre & nbsp;Termo Bilimsel.2000/2000c
Spermidin SigmaS2626
T4 DNA PolNew England Biolabs, M0203
Masa üstü santrifüjü Beckman CoulterAllegra X-5
Tris Sigma11814273001
Triton X-100 SigmaT8787
maya ekstraktı Thermo Fisher Scientific212730

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, S. P., Stillman, B. ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex. Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).
  2. Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).
  3. Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. Eukaryotic DNA replication fork. Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).
  4. Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication. Science. 317 (5834), 127-130 (2007).
  5. Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. Division of labor at the eukaryotic replication fork. Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).
  6. Daigaku, Y., et al. A global profile of replicative polymerase usage. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).
  7. Koyanagi, E., et al. Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome. Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).
  8. Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).
  9. Reijns, M. aM., et al. Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome. Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).
  10. Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).
  11. Stillman, B. DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes. Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).
  12. Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication. Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).
  13. Yu, C., et al. Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall. Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).
  14. Gan, H., et al. The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands. Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).
  15. Yu, C., et al. A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands. Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).
  16. Petryk, N., et al. Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication. Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).
  17. Li, Z., et al. DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands. Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).
  18. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  19. Kaya-Okur, H. S., et al. Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).
  20. Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains. Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  21. Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).
  22. Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast. Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).
  23. Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells. Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).
  24. Rosebrock, A. P. Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).
  25. Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution. Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).
  26. Petryk, N., et al. Replication landscape of the human genome. Nat Commun. 7, 10208(2016).
  27. Foltman, M., et al. Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication. Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).
  28. Jia, J., Yu, C. The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance. Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).
  29. Alabert, C., et al. Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components. Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).
  30. Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).
  31. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).
  32. Ramachandran, S., Henikoff, S. Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing. Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).
  33. Petryk, N., et al. Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq. Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).
  34. Zhong, J., et al. Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application. BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).
  35. Li, Z., et al. Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements. Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).
  36. Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance. Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).
  37. Hanzlikova, H., et al. The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication. Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Yeni Sentezlenen DNA DizilemeProtein li kili DNAKromatin mm nopresipitasyonuBrdU mm nopresipitasyonunc ve Gecikmeli ZincirlerEbeveyn Histon Geri D n mReplikasyon atal ProteinleriTek Zincirli DNA K t phanesiMNase SindirimiZincire zg Dizileme

İlgili makaleler