Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Eritropoezinin Etkinliğini Değerlendirmek için Kapsamlı Bir Boru Hattı İn Vitro ve Ex Vivo

1.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67123

⸱

10 Ocak 2025

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

Bu makalede

Özet

Eritropoezin modellenmesi, bu süreçteki aktörlerin biyolojik önemini kavramak ve farklılaşma kusurlarını hafifletebilecek yeni terapötik yaklaşımları değerlendirmek için değerli bir şans sağlar. Burada, CD34+ hematopoietik kök ve progenitör hücreleri ex vivo olarak etkili bir şekilde ayırt etmek için basit ve güvenilir bir yöntem tanımlanmıştır.

Özet

Günlük kırmızı kan hücresi kotasını (günde yaklaşık 280 ila 20 milyar hücre) oluşturmaktan sorumlu oldukça dinamik ± verimli bir süreç olan eritropoez, bireysel sağlığın korunması için çok önemlidir. Bu yoldaki herhangi bir aksaklık, sağlık sorunlarına yol açan önemli sonuçlara yol açabilir. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, küresel nüfusun tahminen %25'i anemi belirtileri gösteriyor. Bu protokol, göbek kordonu kanı (UCB) veya sağlıklı donörlerden alınan kan gibi kaynaklardan hematopoietik kök ve progenitör hücreler (HSPC'ler) kullanılarak ve hastaların kemik iliğinden izole edilen HSPC'lerle ex vivo olarak hem in vitro olarak insan eritroid hücrelerinin nasıl üretileceğini açıklar. Genetik yaklaşım kullanılarak, ilgilenilen genler HSPC'lerde modüle edilebilir ve eritropoez üzerindeki etkileri, farklılaşma sürecinin çeşitli aşamalarında izlenebilir. Bu yöntem, HSPC'lerin olgun eritroid hücrelere farklılaşma kapasitesini bozan, artıran veya kurtaran bileşiklerin taranmasına ve eritroid farklılaşma süreci sırasında ilgilenilen genlerin rolünün araştırılmasına izin verir.

Giriş

Her gün yaklaşık 280 milyar kırmızı kan hücresi (RBC) tüm vücutta oksijen taşınmasını sağlamak için kemik iliğinde üretilir1. Eritropoez, hematopoietik kök hücrelerden olgun, fonksiyonel kırmızı kan hücreleri üreten ince ayarlanmış bir farklılaşma sürecidir. Miyelodisplastik sendrom, aplastik anemi, talasemi ve konjenital diseritropoietik anemi dahil olmak üzere hem edinilmiş hem de doğuştan gelen birçok hastalık bu süreci etkileyebilir2.

Bozulmuş eritropoezin klinik belirtisi, dünya çapında önemli bir morbidite nedeni olan anemidir. Anemi belirtileri yorgunluk, nefes darlığı ve baş dönmesinden kalp yetmezliği ve kalp durması gibi yaşamı tehdit eden durumlara kadar değişir3. Dünya çapında 1,8 milyar insanı etkileyen anemiile 4, bu koşulları ve altta yatan mekanizmaları araştırmak için eritropoezin ex vivo modellenmesi küresel bir öncelik olmaya devam etmektedir. Burada açıklanan yöntem, hem sağlıklı hem de hastalıklı eritroid farklılaşmasını incelemek için basit ve sağlam bir model sağlamayı amaçlamaktadır. Bu model, bu süreçte belirli genlerin rollerinin diseksiyonuna izin verir ve anemik hastalara fayda sağlayabilecek bileşiklerin test edilmesini sağlar. Tarihsel olarak, etkisiz eritropoezin modellenmesi, bazı hastalıklı kemik iliklerinde kök hücre azlığı ve kemik iliği nişini taklit eden zorluklar da dahil olmak üzere birçok zorluğa sahip olmuştur.

Önceki çalışmalar benzer veya daha karmaşık protokoller kullanmıştır; örneğin, Bondu ve ark. eritroid farklılaşma kokteylinden IL6'yı çıkarmadan önce 4 gün boyunca eritropoietin (EPO), kök hücre faktörü (SCF) ve interlökin-6 (IL6) dahil olmak üzere bir sitokin kokteyli kullandılar, aksine, Yip ve ark. sitokin kokteyllerine sadece 7 günlük sıvı kültürden sonra EPO eklediler. Elvarsdóttir ve ark. eritroid hücrelerin en yüksek genişlemesini ve olgunlaşmasını kolaylaştırmak için CD34+ hücreleri için üç boyutlu (3D) bir kültür modeli geliştirdi, eritroblastik adaların ve enükleasyonlu eritrositlerin oluşumu da dahil olmak üzere, halka sideroblastları 5,6,7,8 . Bu protokol, hücreleri genişletirken sadece üç sitokin kullanır (yani, SCF, trombopoietin [TPO] ve FMS benzeri tirozin kinaz 3 [FLT3]) ve tüm farklılaşma süreci boyunca tutulan üç sitokin (yani, EPO, IGF1 ve SCF). Bu farklı çalışmalarda paylaşılan temel kriterlerden biri, CD34 + hücrelerinin kullanımıdır. Bu hücrelerin kökeni değişse de, bu farklı protokollerde tutarlı bir şekilde kullanılırlar. Kaynaklar, granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF) mobilize edilmiş hastalardan veya kemik iliği ponksiyonlarından toplanabilen yetişkin kemik iliği örnekleri elde etmek için UCB'nin non-invaziv toplanmasından daha invaziv prosedürlere kadar değişebilir. Genel olarak, sıvı kültür modelleri 14 gün boyunca taşınırken, 3D modeller hücreleri daha uzun süreler boyunca koruyabilir. Bu protokoller, genetik hastalıkların ve eritropoezdeki bozulmaların modellenmesi için gereklidir. Kısa firkete RNA (shRNA) knockdown'ları gibi genetik yaklaşımlar, ilgilenilen genleri susturmak ve eritropoezdeki rollerini incelemek için kullanılabilir. Gen susturmanın etkisi daha sonra farklılaşmanın çeşitli aşamalarında izlenebilir ve hem sağlıkta hem de hastalıkta anemiyi incelemek için ex vivo bir insan kırmızı kan hücresi üretimi modeli sağlar. Bu protokol, CD34+ kordon kanı hücrelerinin, gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP) gibi bir muhabir geni yapısal olarak eksprese eden shRNA ile transdüksiyonunu içerir ve örneklerin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile sıralanmasına izin verir. Hücreler daha sonra 2 hafta boyunca farklılaşma ortamında inkübe edilir ve akış sitometrisi analizi ve immünokimya boyaması ile izlenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Birincil örneklemler üzerinde yapılan araştırmalar kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir (REC referansı: 21/EE/0133; IRAS proje kimliği: 283103).

1. Lentivirus üretimi

NOT: Lentivirüsler, steril koşullar altında biyogüvenlik seviyesi L2 olan bir laboratuvarda üretilmelidir. Bu laboratuvar için gerekli tüm KKD, çift eldiven de dahil olmak üzere giyilmelidir. Kirlenmiş malzeme, otoklavlanmış bir çöp kutusuna atılmadan önce virüsit dezenfektan ile dekontamine edilir. Burada, süreci göstermek için bir EGFP raportör genini barındıran bir shRNA karıştırma (kontrol) kullanılır.

1. Gün

  1. Jelatini 37 °C'de bir su banyosunda tamamen eriyene kadar ısıtın. Jelatini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 0.1 oranında seyreltin.
  2. 150 mm'lik bir tabağı 2 mL% 0.1 jelatin ile kaplayın. Virüs başına 2 tabak kullanın. Bulaşıkları 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  3. Jelatin kaplı tabak başına 5 milyon HEK293T hücreyi 20 mL'lik %10 Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) tohumlayın ve hücreleri 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin.

2. Gün

  1. Hücrelerin yaklaşık% 50 birleşmeye ulaştığını kontrol edin. Transfeksiyondan 2 saat önce hücre tabakasını bozmadan ortamı 22 mL% 10 DMEM ile değiştirin.
  2. Transfeksiyon karışımını hazırlayın.
    NOT: Daha büyük bir hacim kalsiyum-fosfat çökelti oluşumunu etkileyebileceğinden, tabak başına bir transfeksiyon karışımı hazırlanır.
    1. Reaksiyon karışımını 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde şu şekilde hazırlayın: 32 μg plazmit, 20 μg PAX (pCMVdR8.74) plazmit, 9 μg VSVG (pMD.G2) plazmid ve hacmi H2O kullanarak 1125 μL'ye getirin.
    2. Reaksiyona 125 μLCaCl2 ekleyin ve bir silindir üzerinde oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
    3. Ayrı bir 15 mL santrifüj tüpünde 1.25 mL 2x HEPES hazırlayın.
    4. Hafifçe girdap yaparken reaksiyon karışımına damla damla 2x HEPES ekleyin, ardından karışımı RT'de 10 dakika boyunca bir silindire koyun.
  3. Reaksiyonu hücrelere spiral bir düzende damla damla dağıtın ve ortamı homojenize etmek için plakayı çapraz şekilli bir şekilde hafifçe hareket ettirdikten sonra hücreleri 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin.

3. Gün

  1. Hücre tabakasını rahatsız etmeden ortamı 16 mL% 10 DMEM ile değiştirin.

4. Gün

  1. Süpernatanı toplayın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Hücre tabakasını bozmadan her plakaya 16 mL taze DMEM ekleyin.

5. Gün

  1. Süpernatanı toplayın ve 4. günden itibaren süpernatan ile bir araya getirin. 0,45 μM filtre ile kalıntıları ortadan kaldırmak için filtreleyin.
  2. Ultrasantrifüjleme için her 30 mL (gün 4 + gün 5) süpernatanı konik bir tüpe aktarın. Tüpleri, gerekirse konik taban için adaptörlerle birlikte döner bir kovaya ekleyin.
  3. Tüpleri 0,02 g hassasiyetle yüz yüze dengeleyin ve 4 °C'de 2 saat boyunca 90.000 x g'da ultrasantrifüj edin.
  4. Süpernatanı atın ve tüp başına 200 μL kök hücre ortamı ekleyin. Tüpleri parafilm ile kapatın ve tüpü çalkalama altında 2-4 saat soğuk bir odada inkübe edin.
  5. Her virüsten 20 μL alikot yapın ve şişeleri -80 ° C'de saklayın. Her virüsün 2 μL'sini saklayın ve 400 μL DMEM ekleyin.
    NOT: Bu seyreltme titrasyon için kullanılacaktır.

2. Lentivirüs titrasyonu

NOT: Lentivirüsler, steril koşullar altında biyogüvenlik seviyesi L2 olan bir laboratuvarda ele alınmalıdır. Bu laboratuvar için gerekli tüm KKD, çift eldiven de dahil olmak üzere giyilmelidir. Kirlenmiş malzeme, otoklavlanmış bir çöp kutusuna atılmadan önce virüsit dezenfektan ile dekontamine edilir.

  1. Tohum 24 oyuklu bir plakada HEK293T. 500 μL% 10 DMEM'de 50.000 hücre / kuyu ekleyin.
    NOT: Virüs başına 6 kuyucuk kullanın ve transdüksiyonsuz hücreler için bir kuyu tutun.
  2. Transdüksiyonu gerçekleştirin. Farklı kuyucuklara ekleyin: 2 μL, 4 μL, 8 μL, 16 μL, 32 μL ve 64 μL seyreltilmiş virüs adım 1.13'ten. Nazikçe homojenize edin.
  3. Ortamı 24 saat sonra 500 μL% 10 DMEM ekleyerek değiştirin.
  4. Transdüksiyondan sonraki 4. günde, hücreleri akış sitometrisi için hazırlayın.
    1. PBS,% 2 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin-streptomisin (P / S), 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 1 / 2.000 4 ",6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile FACS tamponu hazırlayın.
    2. Süpernatanı çıkarın ve her bir oyuğa doğrudan EDTA ile 500 μL FACS tamponu ekleyin.
    3. Hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın.
  5. Hücreleri 40 μm'lik bir süzgeçten geçirin ve FACS tüplerine aktarın.
  6. Akış sitometrisi ile EGFP hücrelerinin yüzdesini belirleyin.
  7. Aşağıdaki kapıları ayarlayın:
    1. Ölü hücreleri dışlamak için DAPI'ye karşı yan saçılmayı (SSC-A) ayarlayın.
    2. Hücre agregalarını dışlamak ve tek hücreleri seçmek için SSC yüksekliğini (SSC-H) SSC alanına (SSC-A) karşı ayarlayın.
    3. Hücreleri geçit etmek ve boyuta göre kalıntıları temizlemek için SSC-A'ya karşı ileri saçılma alanı (FSC-A) ayarlayın.
    4. GFP + hücrelerini seçmek için SSC-A'ya karşı yeşil floresan proteini (GFP) ayarlayın.
  8. Virüsü titre.
    1. Her koşul için partikül konsantrasyonunu (partikül sayısı/mL) hesaplayın:
    2. EGFP hücreleri x Seyreltme faktörü virüsü (200) x Tohumlanan hücre sayısı x1000)/ virüs hacmi.
      NOT: Örneğin, hücreler 1/200 oranında seyreltilmiş 64 μL virüs ile tedavi edildi. Akış sitometrisi analizinin ardından, hücrelerin %54'ü EGFP + idi. Bu koşullarda, titre (% 54 x 200 x 50 000 x 1000) / 64 = 8.44 x 107 partikül / mL olacaktır.

3. Göbek kordonu kanından izole edilen CD34 + hücrelerinin dönüştürülmesi

NOT: Bu kısım steril koşullar altında gerçekleştirilir. Burada, CD34+ UCB hücreleri (saflık %>85), bir eGFP raportörünü barındıran bir shRNA (kontrol) ile dönüştürülür. Deney üç teknik kopya ile gerçekleştirilmiştir. Oran, numune sayısına göre ayarlanmalıdır.

1. Gün

  1. Aşağıdaki ortamı ve arabelleği hazırlayın:
    1. Buz çözme ortamı hazırlayın: %1 P/S ve 10 μg/mL DNAse ile desteklenmiş FBS
    2. FACS tamponu hazırlayın: %1 P/S ve %2 FBS (± 10 μg/mL DNAse) ile desteklenmiş PBS)
    3. 150 ng/mL SCF, 150 ng/mL FLT-3, 10 ng/mL IL-6, 25 ng/mL G-CSF, 20 ng/mL TPO ve %1 HEPES ekleyerek stimülasyon ortamı (kök hücre ortamında) hazırlayın.
  2. 100.000 CD34+ UCB hücresini 37 °C'deki su banyosunda 30 saniye daldırarak çözdürün. Her şişeye damla damla 1 mL buz çözme ortamı ekleyin ve ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe yeniden süspanse edin.
  3. Hücre süspansiyonunu toplam 5 mL buz çözme ortamında damla damla nazikçe aktarın.
    NOT: Hücre kaybını önlemek için, ucu ve şişeyi yıkamak için sonunda kullanılacak olan 2 mL'lik bir buz çözme ortamı alikotunu bir kenara koyun.
  4. RT'de 320 x g'de 8 dakika santrifüjleyin. Hücreleri 10 mL FACS tamponu + DNAse içinde yıkayın.
  5. RT'de 320 x g'da 8 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini 2 mL stimülasyon ortamında (yıkama ucu ve stimülasyon ortamı ile tüp) yeniden süspanse edin.
  6. 5 μL hücre süspansiyonu ve 5 μL tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın.
    NOT: Toplam minimum 75.000 hücre hedefleyin (25.000 hücre/durum).
  7. 2 mL hücre süspansiyonunu 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve 37 ° C'de ≥4-6 saat inkübe edin.
    NOT: Bu adımda tüm hücreler (75.000-100.000) tek bir kuyuya ekilir.
  8. Hücreleri FACS tüplerinde toplayın ve 1 mL kök hücre ortamı ile doldurun. RT'de 320 x g'de 8 dakika santrifüjleyin.
  9. Virüsü çözün ve gerekli hacmi 30'luk bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) stimülasyon ortamına ekleyin.
  10. Virüs içeren ortamdaki peletlenmiş hücreleri 100 μL virüs başına 100.000 hücrede 96 oyuklu bir plakanın 1 oyuğuna yeniden süspanse edin. Boş kuyucuklara PBS ekleyin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.

2. Gün

  1. 150 ng/mL SCF, 150 ng/mL FLT3-L ve 20 ng/mL TPO ekleyerek genleşme ortamını (kök hücre ortamında) hazırlayın.
  2. 96 oyuklu plaka kuyusundan tam hacimli hücre süspansiyonunu 1 mL kök hücre ortamı ile FACS tüplerine ekleyin. Kuyuyu ve ucu kök hücre ortamı ile yıkayın, bu da FACS tüpündeki hücre süspansiyonuna 2 mL kök hücre ortamının eklenmesine neden olur.
  3. RT'de 320 x g'de 8 dakika santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı atın ve hücreleri 2 mL genleşme ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 24 oyuklu bir plaka kuyucuğuna ekleyin (toplam 2 mL elde etmek için kuyuyu ve ucu yıkayın). Hücreleri 37 ° C'de 4 gün boyunca inkübe edin.
    NOT: Hücre sıralama daha sonra 7. günde gerçekleştirilir.

4. CD34 + EGFP + Hücre sıralama ve eritroid farklılaşması

NOT: Bu kısım steril koşullar altında gerçekleştirilir.

  1. Aşağıdaki ortamı ve arabelleği hazırlayın.
    NOT: Sitokin içeren ortamlar taze olarak hazırlanmalıdır:
    1. PBS'yi %1 P/S ve %2 FBS ile destekleyerek FACS tamponunu hazırlayın.
    2. 150 ng/mL SCF, 150 ng/mL FLT3-L ve 20 ng/mL TPO ekleyerek genleşme ortamı (kök hücre ortamında) hazırlayın.
    3. 25 ng/mL SCF, 3 U/mL EPO ve 50 ng/mL IGF1 ekleyerek eritrosit farklılaşma ortamını (kök hücre ortamında) hazırlayın.
    4. 50 ng / mL SCF, 6 U / mL EPO ve 100 ng / mL IGF1 ekleyerek 2x Eritrosit farklılaşma ortamı (kök hücre ortamında) hazırlayın.
  2. Hücrelerin tam hacmini ayrı bir FACS tüpüne ekleyin (kuyuyu yıkayın ve işlem sırasında kök hücre ortamı ile ucu kullanın). RT'de 320 x g'de 8 dakika santrifüjleyin. Peletlenmiş hücreleri 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  3. 5 μL CD34 Ab / tüp ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
  4. Hücreleri DAPI (FACS tamponunda 1/2000 seyreltme) ile 1 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve RT'de 320 x g'da 8 dakika santrifüjleyin.
  5. DAPI ile 200 μL FACS tamponundaki hücreleri yeniden süspanse edin (FACS tamponunda 1/2000 seyreltme) ve sıralamadan önce hücreleri 40 μM'lik bir süzgeçten süzün.
  6. Boncukları kontrol için hazırlayın:
    1. 100 μL PBS'de 1 damla boncuğa 0.5 μL CD34 antikoru (Ab) ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
    2. 1 mL PBS ekleyin. RT'de 320 x g'de 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
  7. GFP kontrolü için lösemik hücre hatları hazırlayın.
    NOT: Mevcut herhangi bir GFP+ hücre hattını kontrol olarak kullanın; Bunun yerine boncuklar kullanılabilir.
    1. FACS tüpüne GFP hücreleri (100.000 hücreli 2 FACS tüpü) ve GFP + (100.000 hücreli 1 FACS tüpü) ekleyin.
      NOT: Toplam 3 tüp.
    2. Hücreleri 1 mL FACS tamponunda yıkayın. RT'de 320 x g'de 8 dakika santrifüjleyin.
    3. 500 μL FACS tamponunda (lekesiz) 100.000 GFP hücresini, DAPI ile 500 μL FACS tamponunda 100.000 GFP hücresini (FACS tamponunda 1/2000 seyreltme) (DAPI lekeli) ve 500 μL FACS tamponunda (GFP + hücreleri) 100.000 GFP + hücresini yeniden süspanse edin.
      NOT: Akış sitometresinde geçit ve kompanzasyon ayarları için kontrol tüpleri kullanılacaktır. Kullanılan hücreler %100 GFP ise, tüpe GFP- hücreleri eklenebilir (50.000 GFP- hücresi ve 50.000 GFP+ hücresi).
    4. Sıralamadan önce hücreleri 40 μm'lik bir süzgeçten süzün.
  8. Aşağıdaki kapıları ayarlayın:
    1. Ölü hücreleri dışlamak için DAPI'ye karşı yan saçılmayı (SSC-A) ayarlayın.
    2. Hücre toplamlarını dışlamak ve tek hücreleri seçmek için SSC yüksekliğini SSC alanına karşı (SSC-A) ayarlayın.
    3. Boyuta bağlı olarak kalıntıları temizlemek için SSC-A'ya karşı ileri saçılma alanı (FSC-A) ayarlayın.
    4. GFP + hücrelerini seçmek için GFP'yi SSC-A'ya karşı ayarlayın.
    5. CD34+ hücrelerini seçmek için CD34'ü (PerCP-Cy5.5) SSC-A'ya karşı ayarlayın.
  9. Tüpün duvarlarını FBS ile kaplamak için hücre toplamadan önce toplama FACS tüpünü çevirin.
  10. Kök hücre ortamındaki hücreleri toplayın.
    NOT: 75.000-80.000 hücre hedefleyin (25.000 hücre x 3)
  11. RT'de 320 x g'de 8 dakika santrifüjleyin ve hücreleri 3 mL eritroid farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin.
  12. 24 oyuklu bir plakanın 3 oyuğunda oyuk başına 1 mL'yi yeniden askıya alın ve ardından dağıtın. Tüm dış kuyuları PBS ile doldurun.
  13. Her gün yarı yarıya besiyeri tüketin ve bunu 2x eritrosit farklılaşma ortamı ile değiştirin.
    1. Ortamı yenilemek için, hücrelerin plakanın altına yerleştirildiğinden emin olun. Plakayı nazikçe eğin ve 500 μL ortam çıkarın.
    2. 2x sitokin eritroid farklılaşma ortamı ile 500 μL ekleyerek yenileyin.
    3. Hücreleri 6. günde 12 oyuklu bir plakaya aktarın ve 2 mL'lik bir son hacim elde etmek için 1 mL ortam ekleyin.

5. 6. günden 14. güne kadar haftada iki kez akış sitometrisi ile eritroid farklılaşmasının analiz edilmesi

  1. Aşağıdaki ortamı ve arabelleği hazırlayın.
    1. PBS'yi %1 P/S ve %2 FBS ile destekleyerek FACS tamponu hazırlayın
    2. 25 ng/mL SCF, 3 U/mL EPO ve 50 ng/mL IGF1 ekleyerek eritrosit farklılaşma ortamını (kök hücre ortamında) hazırlayın.
  2. 12 oyuklu plakanın her bir oyuğundan 200 μL hücre toplayın ve bunları 250 μL 2x eritroid farklılaşma ortamı ile değiştirin. Her tüpe 1 mL FACS tamponu ekleyin.
  3. RT'de 320 x g'de 8 dakika santrifüjleyin. Peletlenmiş hücreleri 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  4. 1 μL CD71 Ab (1/100), 1 μL CD34 Ab (1/100) ve 1 μL CD235a Ab (1/100) ekleyin ve karanlıkta 4 °C'de 20 dakika inkübe edin.
  5. DAPI ile 1 mL FACS tamponundaki hücreleri yeniden süspanse edin (FACS tamponunda 1/2000 seyreltme). RT'de 320 x g'de 8 dakika santrifüjleyin.
  6. DAPI ile 200 μL FACS tamponundaki hücreleri yeniden süspanse edin (FACS tamponunda 1/2000 seyreltme).
  7. Boncukları kontrol için hazırlayın:
    1. 100 μL PBS'de iki tüpe 1 damla dengeleme boncuğu ekleyin ve daha sonra tek leke kontrolleri yapmak için her tüpe 0.55 μL tek bir antikor ekleyin (biri CD34 için, biri CD71 için ve biri CD235a için).
      NOT: Her iki kontrol için de 1 damla yeterlidir.
    2. Karanlıkta 4 °C'de 20 dakika inkübe edin. 1 mL PBS ekleyin.
    3. RT'de 320 x g'de 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
  8. Kontrol için bir lösemik hücre hattı hazırlayın.
    NOT: K562 hücreleri, CD71 işaretleyicisini ifade eder ve FACS'ı ayarlamak için pozitif bir kontrol olarak kullanılabilir.
    1. FACS tüpüne GFP hücreleri (100.000 hücreli 2 FACS tüpü) ve GFP + (100.000 hücreli 1 FACS tüpü) hücreleri ekleyin.
    2. Hücreleri 1 mL FACS tamponunda yıkayın. RT'de 320 x g'de 8 dakika santrifüjleyin.
    3. FACS tamponunda 100.000 GFP hücresi (boyanmamış), DAPI ile FACS tamponunda 100.000 GFP hücresi (FACS tamponunda 1/2000 seyreltme) (DAPI lekeli) ve FACS tamponunda 100.000 GFP + hücresi (GFP + hücreleri) yeniden askıya alın.
  9. Aşağıdaki kapıları ayarlayın:
    1. Ölü hücreleri dışlamak için DAPI'ye karşı yan saçılmayı (SSC-A) ayarlayın.
    2. Hücre toplamlarını dışlamak ve tek hücreleri seçmek için SSC yüksekliğini SSC alanına karşı (SSC-A) ayarlayın.
    3. Boyuta bağlı olarak kalıntıları temizlemek için SSC-A'ya karşı ileri saçılma alanı (FSC-A) ayarlayın.
    4. CD235a'yı (APC-Cy7) CD71'e (PE) karşı ayarlayın.
    5. SSC-A'ya karşı CD34'ü (PerCP-Cy5.5) ayarlayın.
  10. Hücrelerin doğru yere oturması için voltajları ayarlamak için boyanmamış GFP hücrelerinden ve tam lekeli hücrelerden oluşan bir örnek çalıştırın.
  11. Boncukları, GFP + hücrelerini ve DAPI lekeli hücreleri çalıştırın. Sitometre ayarlarını telafi edin ve telafi edin.
  12. Örnekleri çalıştırın ve olayları kaydedin.

6. Giemsa boyaması ile eritroid farklılaşmasının analizi

  1. 5 slayt boyama kavanozu hazırlayın:
    1. May-Grünwald'ın eozin-metilen mavisi çözeltisi 1:1 stok ve PBS ile bir slayt boyama kavanozu hazırlayın.
    2. 2,5 mL Giemsa stoğu + 50 mL PBS içeren bir slayt boyama kavanozu hazırlayın.
    3. Damıtılmış su ile bir slayt boyama kavanozu hazırlayın.
    4. PBS ile bir slayt boyama kavanozu hazırlayın.
    5. Buzlu soğuk metanol ile bir slayt boyama kavanozu hazırlayın.
  2. Optimum boyama için 100.000 hücre toplayın, 1 mL PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 300 x g santrifüjleyin.
  3. Ortamı atın ve 150 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
  4. Slaytları, filtre kağıdını ve konik adaptörü bir sitosantrifüje hazırlayın ve hücre preparatını yavaşça konik adaptöre bırakın.
  5. 3 dakika boyunca 800 x g'da döndürün. Slaytları çıkarın ve 15 dakika boyunca buzda metanol sürgülü kavanoza koyun.
  6. Slaytları 5 dakika May-Grünwald solüsyonuna daldırın ve uygun lekelenmeyi sağlamak için ara sıra çalkalayın.
  7. Ardından, slaytları leke çıkmayana kadar PBS kavanozuna daldırın.
  8. Slaytları 20 dakika boyunca Giemsa solüsyonuna daldırın ve uygun lekelenmeyi sağlamak için ara sıra çalkalayın.
  9. Leke akmayana kadar slaytları PBS ile dikkatlice daldırın.
  10. Slaytların 3 dakika daha PBS'de kalmasına izin verin.
  11. Slaytları hızlı bir şekilde damıtılmış suya batırın ve RT'de havayla kurutun.
  12. Hücrelerin her noktasına bir damla sentetik reçine ekleyin ve yavaşça üstüne bir lamel ekleyin.
  13. Slaytları RT'de 1 saat kurumaya bırakın ve kurumasını önlemek için lamel oje ile kapatın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Göbek kordonu kanı veya kemik iliğinden alınan CD34+ hücreleri öncelikle çözülür, uyarılır ve GFP eksprese eden bir shRNA ile transdüksiyona tabi tutulur (Şekil 1A). CD34+GFP+ hücreleri, Şekil 1B'de gösterilen geçit stratejisine göre, transdüksiyondan 4 gün sonra sıralanır. Temsili sonuçlar, transdüksiyon ve FACS sıralamasından sonra CD34 + hücrelerinin olgunlaşmasını gösterdi. Hücreler (1) CD71/CD235a

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, erişkin kemik iliğinden (BM) veya göbek kordonu kanından (UCB) izole edilen CD34+ hematopoietik kök hücrelerin (HSPC'ler) eritroid farklılaşmasını indüklemek için etkili ve güvenilir bir yöntem tanımladık. Bu boru hattı, eritroid farklılaşma süreci sırasında ilgilenilen herhangi bir genin işlevini araştırmak için birincil hücrelerin düzenlenmesini/değiştirilmesini içerir. Bu yöntem, sağlıklı CD34+ HSPC'lerde ve akut miyeloid lösemi ve miyelodisplastik sendro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

C.P., S.B. ve K.RP. HARP programı, Barts Charity (G-002167), Kay Kendall Lösemi fonu (KKL1149) ve Tıp Bilimleri Akademisi (SBF004\1099) tarafından desteklenmiştir. MGG boyama ve mikroskopi alımı için Dr. Pantelitsa Protopapa'ya teşekkür ederiz. Ayrıca Londra Queen Mary Üniversitesi, Barts Kanser Enstitüsü'nün akış sitometrisi ve mikroskopi tesislerini de kabul ediyoruz. Bu el yazmasında kullanılan göbek kordonu kanı ünitelerini bize sağladığı için Birleşik Krallık Hayır Kurumu Anthony Nolan'a teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2x HEPESMerck51558
BoncukTermo Bilimsel01-2222-42
CD235a APC Cy7Biyoefsane349115
CD34 PerCP Cy5.5 antikoruBD Biosciences347222
CD71 PE antikoruBiyoefsane334106
DAPIMerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
DPX montaj ortamı VWR1.00579.0500
FACSAria Füzyon BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
JelatinMerckG1393
Giemsa çözeltisiAbcamab150670
HEPESMerckH0887-100mL
İnsan EPOPeproTech100-64
İnsan Flt-3 ligandıPeproTech300-19
İnsan G-CSFPeproTech300-23
İnsan IGF1PeproTech100-11
İnsan IL-6PeproTech200-06
İnsan SCFPeproTech300-07
İnsan TPOPeproTechAF-300-18
LSRFortessa Hücre Analiz CihazıBD BiosciencesNA
May-Grunwald Çözüm Generon26250-01
Pannoramic 250 Yüksek Verimli Tarayıcı 3DHISTECHNA
Penisilin / StreptomisinThermo Scientific15140-122
Shandon Cytospin 3 Thermo ScientificNA
Kök Hücre Orta OrtaKök Hücre Teknolojileri9655

Kaynaklar

  1. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).
  2. Cazzola, M. Ineffective erythropoiesis and its treatment. Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).
  3. Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. The pathological consequences of anaemia. Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).
  4. Safiri, S., et al. Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019. J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).
  5. Bondu, S., et al. A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome. Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).
  6. Elvarsdottir, E. M., et al. A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes. Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).
  7. Yip, B. H., et al. Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts. Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).
  8. Clough, C. A., et al. Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome. Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).
  9. Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).
  10. Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development. Blood. 69 (1), 255-263 (1987).
  11. Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens. Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).
  12. Berastegui, N., et al. The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes. Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).
  13. Mian, S. A., et al. Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia. Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).
  14. Armes, H., et al. Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment. Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).
  15. Hug, N., et al. A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation. RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Eritroid DiferansiyasyonHematopoetik K k H crelerEx Vivo EritropoezIn Vitro EritropoezAk SitometrisiCD34 AntikoruEritroid SoyEritroid Diferansiyasyon MedyumuAnnexin V Boyama
İnsan Eritropoezinin Etkinliğini Değerlendirmek için Kapsamlı Bir Boru Hattı İn Vitro ve Ex Vivo
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.