Mikrobiyolojik Numuneler için Bergmeyer Glikoz Miktar Tayini

Summary

Bergmeyer glikoz miktar tayini, esas olarak glikoz miktarını doğru ve hassas bir şekilde ölçen klinik testler için kullanılan spektrofotometrik bir enzimatik tekniktir. Burada, mikrobiyolojik numuneler için bu yöntemin kullanılması için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Glikoz konsantrasyonu, hücresel metabolizmanın önemli bir göstergesidir ve toplam metabolizma hızını, glikoz metabolizmasındaki bir sapmayı ve bazı durumlarda hücrelerin glikoz metabolizmasını enerjik metabolizmaya nasıl bağladığını gösterebilir. Ek olarak, hücre içi ve hücre dışı glukoz seviyeleri hücresel metabolik durumun göstergesidir. Bergmeyer glikoz miktar tayini gibi enzimatik teknikler, genellikle mikrobiyolojide kullanılan dinitrosalisilik asit veya floresan yöntemleri gibi diğer tekniklerden daha doğru ve hassastır. Esas olarak klinik alanda kullanılmasına rağmen, Bergmeyer glikoz miktar tayini herhangi bir hücreye de uygulanabilir, ancak bakteri, mantar, maya veya diğer mikroorganizmalar için ayrıntılı olarak rapor edilmemiştir.

Burada, enzimatik Bergmeyer glikoz miktar tayini yöntemini kullanarak bakteri ve maya örneklerinden glikozun miktarını belirlemek için bir metodoloji sunuyoruz. Prosedür, glikoz oksidaz, peroksidaz ve o-dianisidin dihidroklorür enzimlerinin 37 ° C'de 20 dakika inkübe edilmesini ve ardından sülfürik asit ilavesini içeriyordu. Absorbans daha sonra 545 nm'de ölçülür. Bu tekniğin yüksek glikoz konsantrasyonlarının (60 g/L'nin üzerinde) ölçülmesinde zorluklar yaratmasına rağmen, seyreltme faktörleri kullanılarak 50 g/L'nin altındaki konsantrasyonları ölçmenin mümkün olduğunu vurgulamak önemlidir. Bu enzimatik yaklaşım, mikrobiyoloji ve diğer bilimsel alanlarda araştırma ve analizler için değerlidir. Yöntemin hassasiyeti ve hassasiyeti, mikrobiyolojik numunelerdeki düşük glikoz konsantrasyonlarının bile tespit edilmesine yardımcı olur.

Introduction

Glikoz, bakteriler, mayalar ve mantarlar dahil olmak üzere çok sayıda mikroorganizma için birincil enerji ve karbon kaynağı olarak hizmet eder. Bu mikroorganizmalar, hücre dışı zar üzerinde bulunan taşıyıcılar yoluyla glikozu alır ve burada piruvat^1'e dönüştürülmek üzere glikoliz metabolik yolu içinde bir dizi biyokimyasal reaksiyona girer. Glikoz gibi indirgeyici şekerlerin miktarının belirlenmesi için çeşitli teknikler vardır. Örneğin, Benedict'in reaktifi², 3,5-dinitrosalisilik asit (DNS)^3,4, antrona yöntemi⁵ veya fenol-sülfürik asit⁶ yöntemi kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntemler, numunede bulunan fruktoz ve maltoz gibi, sinyale katkıda bulunabilecek ve belirli bir şekerin doğru miktar tayinini zorlaştırabilecek herhangi bir indirgeyici şekeri tespit eder.

Ek olarak, sıkı sıcaklık kontrolü ve tehlikeli maddelerin işlenmesini gerektirirler, bu da süreci karmaşıklaştırabilir ve doğruluğu etkileyebilir. Bu yöntemler ayrıca numunede bulunan diğer bileşiklerden kaynaklanan parazitlere maruz kalabilir ve bu da doğru glikoz miktar tayinini zorlaştırır. Tersine, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), daha yüksek işletme maliyetlerine rağmen, glikoz ve diğer indirgeyici şekerler arasında ayrım yapılmasına izin veren daha kesin bir alternatif sunar. Bu zıt yöntemler, doğru ve uygun maliyetli glikoz miktar tayin tekniklerinin geliştirilmesine yönelik devam eden ihtiyacı vurgulamaktadır⁷.

Glikoz oksidaz-peroksidaz-sülfürik asit (GOX-H_2S04) yöntemi, glikoz oksidaz (GOD) ve peroksidaz (POD) olmak üzere iki enzim kullanır. GOD, β-D-glikoz^8'in oksidasyonu için çok seçici olan bir oksidoredüktaz enzimidir. Bu kompleks, glikoz oksijen varlığında meydana gelen reaksiyon sırasında bir katalizör görevi görür ve glukonik asit ve hidrojen peroksit (_H2O2) üretir. H₂O₂, POD ile etkileşime girdiğinde, oksidasyonuna ve H₂O₂ salınımına neden olan ve glukonik asidin tekrar glikoza dönüştürülmesini önleyen bir kromojenik oksijen alıcısı olan o-dianisidin vasıtasıyla tespit edilir (bkz. Şekil 1). Elde edilen renk, enzimatik reaksiyonu da durduran sülfürik asit (_H2S04) ilavesiyle stabilize edilir, böylece^{reaksiyon devam ederse} oluşabilecek olası girişimden kaçınılır.

Şekil 1: Hidrojen peroksit (_H2O2) ve glukonik asit üretmek için glikoz ile reaksiyona giren glikoz oksidaz enzimini kullanan glikoz miktar tayini yöntemine genel bakış. Daha sonra, peroksidaz enzimi, O-dianisidin dihidroklorür varlığında_H2O2ile reaksiyona girer. Son adımda, enzimatik reaksiyonu durdurmak için sülfürik asit (H_2S04) eklenir ve 529 nm'de ölçülen pembe bir renk elde edilir. Kısaltmalar: POD = peroksidaz; TANRI = glikoz oksidaz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

GOX-H_2S04 enzimatik yöntemi, çoğu klinik ilgi alanı olan biyolojik numunelerdeki glikoz konsantrasyonunu ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bununla birlikte, az sayıda çalışma, tüketimini değerlendirmek için bir büyüme ortamındaki glikoz miktarının ölçülmesine izin veren bir tekniği araştırmıştır. Bu nedenle, mevcut protokolde, mikrobiyolojik sıvı numunelerde glikoz oksidaz, peroksidaz, o-dianisidin dihidroklorür ve H_2S04'ün enzimatik reaksiyonu yoluyla glikozun miktarını belirleme metodolojisi sunulmaktadır, bu da Bergmeyer⁹ tarafından yapılan işin bir modifikasyonu olarak ortaya çıkan, P (h/h) H_2S04 ve daha düşük miktarlarda reaktif kullanılarak.

Protocol

1. Çözelti hazırlama

1. 100 mL 0.1 M fosfat tamponu hazırlayın. 1.28 g potasyum dihidrojen fosfat (KH₂PO₄) ve 0.1304 g dipotasyum fosfat (K₂HPO₄) tartın ve bunları bir cam behere ekleyin. Şimdi 70 mL deiyonize su (H₂Odi) ekleyin ve 1 M hidroklorik asit (HCl) veya potasyum hidroksit (KOH) kullanarak pH'ı 5.5'e ayarlayın. Çözeltiyi hacimsel bir şişeye aktarın ve son hacmi 100 mL'ye ayarlayın. Daha sonra çözeltiyi kehribar rengi bir kaba aktarın ve çözeltiyi 4-8 °C'de 3 aya kadar saklayın.
   DİKKAT: O-dianisidin dihidroklorür potansiyel olarak kanserojen olduğundan, cilt temasını ve olası kontaminasyonu önlemek için hazırlama işlemi boyunca nitril eldiven giyin.
2. % 1'lik bir o-dianisidin dihidroklorür çözeltisi hazırlayın. 0.01 g o-dianisidin dihidroklorür tartın ve 2.0 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. 1.000 mL'lik bir mikropipet kullanarak, bileşiği çözmek için 1.0 mL H₂Odi ekleyin, ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Kabı alüminyum folyoya sararak çözeltiyi ışıktan koruyun ve stabiliteyi korumak için -20 °C'de saklayın.
   NOT: Analitik terazide ölçüm sırasında tüpün desteklenmesini kolaylaştırmak için ek destek olarak 10 mL'lik bir beher kullanılabilir. Bu, tüpün stabilize edilmesine yardımcı olur ve terazide elde edilen sonuçları değiştirebilecek yer değiştirme veya devrilme riskini en aza indirerek doğru ölçüm sağlar.
3. 100 mL'lik hacimsel bir şişede, 10 mL fosfat tampon çözeltisi ve ardından 1 mL% 1 v / v o-dianisidin dihidroklorür çözeltisi ekleyin. Ardından,% 0.01 o-dianisidin tampon karışımının nihai konsantrasyonunu elde etmek için son hacmi fosfat tamponu ile 100 mL'ye ayarlayın. Çözeltiyi kehribar bir şişeye aktarın ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarın. Solüsyonu 4-8 ° C'de 3-4 aya kadar saklayın.
   NOT: Soğutma, deneysel ölçümlerin bütünlüğünü tehlikeye atabilecek ayrışmayı önlemek için gereklidir. O-dianisidin-tampon karışımının bozulmasını önlemek için, 13 mL'lik küçük bir kısım (12 numune için yeterli), kullanıma kadar buz üzerinde 14 mL'lik bir plastik tüpe yerleştirilebilir.
4. % 50 H_2S04 çözeltisi hazırlayın. 30 mL H₂Odi içeren 100 mL hacimsel bir şişeyi bir buz banyosuna yerleştirin ve 10 dakika soğumaya bırakın. Daha sonra, çözeltiyi homojenize etmek için dikkatlice çalkalayarak şişenin duvarlarından 51 mL H_2S04 (% 98 v / v) yavaşça dökün. Reaksiyon ekzotermik olduğundan (ısı üretir) karışımın soğumasını bekleyin. Son hacmi H₂Odi ile 100 mL'ye ayarlayın ve çözeltiyi bir cam kehribar şişeye aktarın.
   NOT: Çeker ocak kullanın ve tüm güvenlik protokollerine uyun, uygun koruyucu ekipman giydiğinizden emin olun. Oluşabilecek olası dökülmeleri nötralize etmek için 50 mL @ kalsiyum karbonat solüsyonu hazırlayın.
5. 0.04 g sodyum asetatı bir beherde 5 mL_H2Odi içinde çözerek 50 mM sodyum asetat çözeltisi hazırlayın. Buzlu asetik asit kullanarak pH'ı 5.1'e ayarlayın. Son olarak, H₂Odi ile ses seviyesini 10 mL'ye ayarlayın.

2. Enzimlerin hazırlanması

1. 2.0 mL'lik steril bir mikrotüpte, 0.01 g glikoz oksidaz ağırlığında ve 10 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1 mL 50 mM sodyum asetat, pH 5.0 ile karıştırın. Tüpü alüminyum folyo ile örtün ve -20 °C'de saklayın.
   NOT: Çözelti -20 °C'de 2 aya kadar saklanabilir.
2. Eq (1) kullanarak her bir plastik küvette (toplam hacmi 1.5 mL olan) istenen enzim aktivitesini elde etmek için gereken enzim çözeltisi V₂ hacmini hesaplayın: V₁C₁ = V₂C₂, burada V₁ 1.500 μL, C₁ 28.5 U enzim aktivitesi ve C₂ (enzim çözeltisinin konsantrasyonu) 12.970 U / mL'dir (1 mL'de 10 mg enzim [129.000 birim / g] H₂Odi'nin).
   V₂ = (1.500 μL × 28.5 U)/12.970 U = 3.29 μL (1)
   NOT: Daha doğru pipetleme için değer 3,3 μL'ye yuvarlanabilir.
3. Yeni bir 2 mL mikrotüpte, 0.0031 g peroksidaz enzimi tartın ve 3.1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1 mL fosfat tamponu, pH 5.5 ekleyin. Mikrotüpün üzerini alüminyum folyo ile kapatın ve -20 °C'de saklayın.
4. Eq (1) kullanarak küvet başına istenen enzim aktivitesini elde etmek için gereken peroksidaz çözeltisinin hacmini hesaplayın. Toplam 1.500 μL'lik bir küvet hacmi ve 1.25 U'luk bir hedef enzim aktivitesi ile başlayın. Ardından, 1.551 U konsantrasyonu göz önüne alındığında, enzim çözeltisinin gerekli hacmini belirleyin.
   V₂ = (1.500 μL × 1.25 U)/1.551 U = 1.208 μL
   NOT: Daha doğru pipetleme için değer 1,20 μL'ye yuvarlanmıştır.

3. Glikoz standardı

1. Hacimsel bir şişede 10 mL_H2Odi'ye 0.01 g D-glikoz ekleyerek 1 g / L D-glikoz standardı hazırlayın. Konsantrasyonu 0.5 g / L'ye seyreltmek için, 500 μL stok çözeltisini alın ve 1 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için 500 μL H₂Odi ile karıştırın.
   NOT: Bu seyreltme işlemi, doğru standart çözeltiler oluşturmak için gereklidir.

4. Standart eğri hazırlama

1. Yeni bir 2 mL mikrotüp kullanarak, Tablo 1'de belirtilen tamponu ve glikoz hacimlerini ekleyin.
2. Kuru termobanyoyu 37 °C'ye ayarlayın. Sıcaklık stabil olduğunda, tüm tüplere 3.3 μL glikoz oksidaz ekleyin ve ardından her tüpe 1.2 μL peroksidaz ekleyin. Tüpleri 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
3. İnkübasyondan sonra, her bir mikrotüpe hemen 750 μL% 50 H_2S04 ( v / v) ekleyin ve karışımı 2 dakika buz banyosunda soğumaya bırakın. Bu, 1.500 μL'lik bir nihai hacim ile sonuçlanır. Son olarak, çözeltiyi plastik bir küvete aktarın ve emiciliği 529 nm'de ölçün.

Tablo 1: GOX-H₂SO₄ yöntemi için glikoz kalibrasyon eğrisi. Kısaltmalar: TANRI = glikoz oksidaz; POD = peroksidaz; H_2S04 = sülfürik asit. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

5. Mikrobiyolojik numunelerin test edilmesi

1. Numuneyi, sıcaklık, çalkalama hızı ve inkübasyon süresi dahil olmak üzere belirli koşullar altında sıvı bir kültür ortamında bakteri veya maya yetiştirerek elde edin. Kültür, istenen optik yoğunluğa (OD) veya hücre konsantrasyonuna ulaştığında, daha sonraki işlemler için kültürü toplayın.
   NOT: Pseudomonas reptilivora 300 rpm ve 28 °C'lik sabit bir çalkalama hızında kültürlenirken, Debaryomyces hansenii bir orbital çalkalayıcıda 30 ° C'de 200 rpm'lik bir çalkalama hızı ile kültürlendi. D. hansenii'nin özel durumunda, lipaz üretimi için bir indükleyici olarak yenilebilir kanola yağı da kullanılmıştır.
2. Çalışma alanını p alkol solüsyonu veya biyogüvenlik protokollerine göre uygun bir temizlik maddesi ile temizleyin. Asepsiyi sağlamak için bir brülör yakın.
3. 100 μL kültür ortamını steril uçlar kullanarak 1.5 mL veya 2 mL'lik bir mikro tüpe aktarın.
4. Numuneleri 7,500 × g'da 4 °C'de 7 dakika veya sıcaklık kontrolü olmadan 7 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, çözelti içinde glikoz içeren süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti atın.
5. 1 ila 20 g / L arasında değişen glikoz konsantrasyonları için 0.5 μL süpernatan kullanın, daha sonra 749.5 μL o-dianisidin tamponu, 3.3 μL GOD ve ardından 1.2 μL POD ile karıştırın. Mikrotüpleri adım 4.2'de detaylandırıldığı gibi 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin ve hemen 750 μL% 50 H_2S04 ekleyin ve 2 dakika buz banyosunda soğumaya bırakın.
   1. 20 g / L'nin üzerindeki konsantrasyonlar için, devam etmeden önce steril H₂Odi ile 1: 1 seyreltme yapın.
   2. Süpernatan numuneler daha önce -80 °C veya -20 °C'de dondurulmuşsa, kullanmadan önce oda sıcaklığında çözdürün ve 30 saniye vorteksleyin. Seyreltme gerekiyorsa, steril H₂Odi kullanın.
   3. Glikoz konsantrasyonları 30 g / L'nin üzerinde olan numuneler için, steril H₂Odi ile 1: 1 seyreltme gerçekleştirin, bu da 2'lik bir seyreltme faktörü ile sonuçlanır.
6. Bir elektronik tablo programında Eq (2) kullanarak her numunedeki toplam glikoz konsantrasyonunu hesaplayın.
   (2)
   Nerede:
   x = glikoz konsantrasyonu (g/L) δ = Son reaksiyon hacmi (0.0015 L)
   y = absorbans M.S. = kullanılan numune miktarı*
   NOT: b ve m değerleri, yöntem için kalibrasyon eğrisinin eğilim çizgisini modelleyen denklemden alınmıştır (y = mx + b). *M.S. değeri, karşılık gelen seyreltmede oranı elde etmek için kullanılan numune miktarına dayanmalıdır (yani, süpernatanttan 0,5 μL alırsanız, MS = 0,0000005 L = 0,5 × ^10-6 L); bir seyreltme faktörü (DF) kullanılıyorsa, elde edilen absorbansı DF ile çarpın.
   Örneğin, 0.5'lik bir absorbans elde edilirse ve 2'lik bir DF kullanılırsa, sonuç 1.0 olacaktır. Bu nedenle, y = 1.0 ve bu değer daha önce açıklandığı gibi Eşitlik (2) içine girilmelidir.

6. Analitik doğrulama

1. Ulusal Metroloji Merkezi ve Meksika Akreditasyon Kurumu¹⁰ (CENAM-ema) tarafından belirlenenlere göre GOX-H₂SO₄ yönteminin analitik doğrulama parametrelerini hesaplayın.
   1. Hassasiyeti, varyasyon katsayısının yüzdesi olarak veya %CV = (S/x) × 100 olarak hesaplayın, burada x , örneklem grubu ortalaması ve S , %≤10'luk bir kabul değeri ile standart sapmadır.
   2. Standart eğriyi 0,995'in üzerindeki doğrusal model R^2'ye uydurarak doğrusallığı belirleyin.
   3. Şu denklemi kullanarak niceleme sınırını (LOQ) hesaplayın: LOQ = yB + 10sB, burada yB, hedef sinyale eşdeğer bir sinyal üreten analit konsantrasyonunu temsil eder ve 10sB, boşluğun standart sapmasının 10 katını gösterir
   4. Bu denklemi kullanarak sistematik hatayı hesaplayın: Eğim = x - m, burada x = deneysel konsantrasyonun ortalaması ve m teorik konsantrasyondur.
   5. Doğruluğu, gerçek bir değer ile teorik bir değer arasındaki uyum derecesi olarak belirleyin.
      Kurtarma% = (CR/CV) × 100
      Burada CR, deneysel konsantrasyonun ortalamasıdır ve CV, teorik konsantrasyonun varyasyon katsayısıdır.

7. Diğer indirgeyici şekerlerin müdahalesi

1. Dört indirgeyici şekeri ayrı ayrı değerlendirin: 0.5 g / L'lik bir stok çözeltisinden glikoz, fruktoz, galaktoz ve ksiloz. Ek olarak, trehalozu negatif kontrol olarak kullanın. Tüm numuneler için protokolü takip edin ve absorbansı 545 ve 529 nm'de ölçün.

Results

GOX-H_2S04'ün spektrofotometrik analizi, 529 nm'de (λmax) tek bir maksimum absorbans ortaya çıkardı (Şekil 2A) ve 545 nm'de ek absorbans değerleri gözlendi. Farklı glikoz konsantrasyonlarındaki absorbans değerlerini analiz ederek, λ529 nm için 0.9977 ve λ545 nm için 0.9967 R²'lik bir doğrusallık (R²) elde ettik (Şekil 2B). Doğrusallık, belirli bir aralık içinde, numunelerdeki glikoz konsantrasyonu ile doğru orantılı sonuçlar sağlama yete...

Discussion

Glikoz birçok mikroorganizma için birincil enerji kaynağı olarak hizmet ettiğinden, kültür ortamındaki glikozun miktarının belirlenmesi, mikrobiyal büyümeyi ve metabolik aktiviteyi anlamak için gereklidir. Bu çalışmada, bakteri veya maya fermantasyonlarındaki mikrobiyal süreçleri optimize etmeyi amaçlayan, kültür ortamındaki glikoz seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek için GOX-H_2S04 yöntemini kullandık. Bulgularımız Yuen ve McNeill^11'in bulg...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL mikrotüp	Eppendorf	-
2.0 mL mikrotüp	Eppendorf	-
CaCO3< / sub>	Meyer	471-34-1	Kalsiyum Karbonat
D-Glikoz	Meyer	50-99-7	D-Glikoz
Kuru Banyo	FisherScientific	11-718-4	Seri 911NO251. Blok GxDxY mm/inç: 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5
Glikoz oksidaz	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Enzim tozu
H < sub > 2 < / sub >O	-		Deiyonize su
H < sub > 2 < / sub > SO< sub > 4 < / sub >	Meyer	7664-93-9	Sülfürik asit
HCl	Meyer	7647-01-0	Hidrokloridrik asit ve nbsp;
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Dipotasyum fosfat
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Monopotasyum fosfat
KOH Meyer		1310-58-3	Potasyum hidroksit
Lambda 35	PerkinElmer-Spektrofotometre
Mikrotüp santrifüj	-	-
o-Dianisidin dihidroklorür	Sigma Aldrich	D3252	Kromojenik
Peroksidaz	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzim tozu
pH-metre	Hanna ve nbsp;	1131	Hanna 1170
Sodyum asetat	Meyer	127-09-3	Meyer
Tartı spatulaları	-	-	-