Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Miyozin-7a'nın MultiBac Sistem Tabanlı Saflaştırılması ve Biyofiziksel Karakterizasyonu

1.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67135

⸱

23 Ağustos 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, School of Medicine, West Virginia University, 2Microscope Imaging Facility, West Virginia University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, MultiBac Baculovirus sistemini kullanarak insan miyozin-7a holoenziminin rekombinant olarak üretilmesi ve özel bir in vitro filament kayma testi kullanılarak motilitesinin incelenmesi prosedürlerini detaylandırır.

Özet

Miyozin-7a, işitsel ve görsel süreçler için hayati önem taşıyan aktin bazlı bir motor proteindir. Miyozin-7a'daki mutasyonlar, insanlarda sağır-körlüğün en yaygın ve şiddetli şekli olan Usher sendromu tip 1'e yol açar. Miyozin-7a'nın, fotoreseptör ve koklear tüy hücrelerinin yapısal-fonksiyonel bütünlüğü için gerekli olan diğer Usher proteinleri ile bir transmembran adezyon kompleksi oluşturduğu varsayılmaktadır. Bununla birlikte, saf, bozulmamış protein elde etmedeki zorluklar nedeniyle, insan miyozin-7a'nın kesin fonksiyonel mekanizmaları, sınırlı yapısal ve biyomekanik çalışmaların mevcut olmasıyla belirsizliğini korumaktadır. Son çalışmalar, memeli miyozin-7a'nın ağır zincir ve üç tip hafif zincirden oluşan multimerik bir motor kompleksi olduğunu göstermiştir: düzenleyici hafif zincir (RLC), kalmodulin ve kalmodulin benzeri protein 4 (CALML4). Kalmodulin'den farklı olarak, CALML4 kalsiyum iyonlarına bağlanmaz. Hem kalsiyuma duyarlı hem de duyarsız kalmodulinler, mekanik özelliklerinin uygun şekilde ince ayarlanması için memeli miyozin-7a için kritik öneme sahiptir. Burada, MultiBac Baculovirus protein ekspresyon sistemini kullanarak rekombinant insan miyozin-7a holoenzimi üretmek için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. Bu, biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonuna izin veren miligram miktarlarda yüksek saflıkta tam uzunlukta protein verir. Ayrıca, özel in vitro motilite testleri ve floresan mikroskobu kullanarak mekanik ve hareketli özelliklerini değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Bozulmamış insan miyozin-7a proteininin mevcudiyeti, burada açıklanan ayrıntılı fonksiyonel karakterizasyon protokolü ile birlikte, miyozin-7a'nın görme ve işitmedeki moleküler yönlerine ilişkin daha fazla araştırmanın yolunu açmaktadır.

Giriş

Miyozinler, çok sayıda hücresel süreci yürütmek için aktin ile etkileşime giren moleküler motor proteinlerdir 1,2,3,4. İnsanlar, kas kasılması 6 ve duyusal süreçler7 gibi çok çeşitli fizyolojik işlevlerde yer alan 12 sınıfa ve 39 miyozin genine5 sahiptir. Her miyozin molekülü, ağır bir zincir ve hafif zincirlerden oluşan multimerik bir komplekstir. Ağır zincir baş, boyun ve kuyruk bölgelerine ayrılmıştır. Kafa, ATP hidrolizinden ve aktin filamentleri2 üzerinde kuvvet oluşturmaktan sorumlu olan aktin ve nükleotid bağlama bölgeleri içerir. Boyun, belirli bir hafif zincir setinin bağlandığı birkaç α sarmal IQ motifinden oluşur. Birlikte, motorun konformasyonel değişikliklerini büyük hareketlere dönüştürmek için bir kaldıraç kolu görevi görürler 8,9,10. Kuyruk, sınıfa özgü alt alanlar içerir ve miyozinin motor aktivitesini ayarlamada ve hücresel bağlanma ortaklarıylaetkileşimlere aracılık etmede düzenleyici bir rol oynar 2,11.

Sınıf-7 miyozinlerinin bir üyesi olan insan miyozin-7a, işitsel ve görsel süreçler için gereklidir12,13. İnsan miyozin-7a'nın IQ motifleri, düzenleyici hafif zincir (RLC), kalmodulin ve kalmodulin benzeri protein 4 (CALML4) dahil olmak üzere benzersiz bir hafif zincir kombinasyonu ile ilişkilidir14,15,16. Kaldıraç kolunu stabilize etmenin yanı sıra, bu hafif zincirler, memeli izoformu14'e özgü gibi görünen bir özellik olan kalsiyum sinyaline yanıt olarak miyozin-7a'nın mekanik özelliklerini düzenler.

Miyozin-7a ağır zincirini (MYO7A / USH1B) kodlayan gendeki kusurlar, insanlarda kombine görme ve işitme kaybının en şiddetli şekli olan Usher sendromu tip 1'den sorumludur17. Ek olarak, hafif zincir geni CALML4, tip 1 Usher sendromunun15,18 başka bir varyantı olan USH1H için nedensel aleli içerecek şekilde haritalanan aday genler arasındadır. Retinada miyozin-7a, retina pigment epitelinde ve fotoreseptör hücrelerindeeksprese edilir 13. Retina pigment epitelindeki (RPE)19 melanozomların lokalizasyonunda ve RPE hücreleri20 tarafından fotoreseptör dış segment disklerinin fagositozunda rol oynamıştır. İç kulakta, miyozin-7a esas olarak stereocilia'da bulunur, burada saç demetlerinin oluşturulmasında ve mekano-elektrik iletim sürecinin 12,21,22 geçirilmesinde kritik bir rol oynar.

Miyozin-7a'nın duyusal hücrelerdeki önemi iyi bilinmesine rağmen, moleküler düzeydeki fonksiyonel mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Bilgideki bu boşluk, kısmen, bozulmamış proteinin, özellikle de memeli izoformunun saflaştırılmasındaki zorluklardan kaynaklanmaktadır. Son zamanlarda, tam insan miyozin-7a holoenzim14'ü rekombinant olarak eksprese etmek için MultiBac sistemi kullanılarak önemli ilerleme kaydedilmiştir. Bu ilerleme, bu motor proteinin yapısal ve biyofiziksel karakterizasyonlarını mümkün kılmış, insan miyozin-7a'nın memeli işitsel işlevleri için özel olarak uyarlanmış birkaç benzersiz özelliğinin keşfedilmesine yol açmıştır14,23.

MultiBac sistemi, ökaryotik multimerik komplekslerin24,25 ekspresyonu için özel olarak tasarlanmış gelişmiş bir bakulovirüs/böcek hücresi platformudur. Bu sistemin önemli bir özelliği, her biri kompleksin bir alt birimini kodlayan çoklu gen ekspresyon kasetlerini tek bir MultiBac bakulovirüsü içinde barındırma yeteneğidir. Çok genli ekspresyon kasetlerinin montajı, çarpma modülü adı verilen bir modül aracılığıyla kolaylaştırılır: bir hedef arama endonükleaz (HE) bölgesi ve çoklu klonlama bölgelerini (MCS) çevreleyen eşleşen tasarlanmış bir BstXI bölgesi. Bu modül, HE ve BstXI kısıtlama bölgelerinin ligasyonları üzerine elimine edildiği gerçeğinden yararlanarak, kısıtlama/ligasyon yoluyla tek bir ifade kasetinin yinelemeli montajını sağlar. Bu yazıda, insan miyozin-7a ağır zinciri, RLC, kalmodulin ve CALML4'ün her biri, pACEBac1 vektörü (Şekil 1A) içindeki çarpma modülüne klonlanır ve bunlar daha sonra yinelemeli işlem yoluyla çok genli bir ekspresyon kasetine birleştirilir (Şekil 1B). Miyozin-7a multigen kaseti, mini-Tn7 elementinin pACEBac1 vektöründen genomdaki mini-attTn7 hedef bölgesine transpozisyonu yoluyla bakuloviral genoma (bacmid) entegre edilir (Şekil 1C). Bacmid saflaştırma, bakulovirüs üretimi ve amplifikasyon prosedürlerini takiben (Şekil 1D, E), rekombinant miyozin-7a MultiBac bakulovirüsü hazırlanır ve büyük ölçekli protein üretimi için kullanılabilir (Şekil 1F). Ek olarak, miyozin-7a hafif zincirleri E. coli'de ayrı olarak üretilebilir ve bölünebilir bir His6-SUMO etiketi 26,27,28 kullanılarak saflaştırılabilir. Saflaştırılmış hafif zincirler, bağlanma dinamiklerini ve miyozin-7a'nın düzenlenmesini incelemek için faydalıdır.

Saflaştırılmış miyozin-7a proteini, bu motor proteinin yapısal-fonksiyonel düzenlemesi hakkında bilgi edinmek için yapısal, biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalara tabi tutulabilir. Ek olarak, aktin ağı ve diğer bağlayıcı proteinler29 ile etkileşimleri, çeşitli in vitro sulandırma yaklaşımları kullanılarak incelenebilir. Bu analizlerden elde edilen bulgular, bu miyozinin biyofiziksel özelliklerini bilgilendirecek ve miyozin-7a'nın hücre iskeleti değişikliklerini nasıl yönlendirdiğine ve nihayetinde duyusal hücrelerin benzersiz morfolojisini ve işlevini nasıl şekillendirdiğine dair mekanik bir anlayışa yol açacaktır. Bu yazıda, memeli miyozin-7a için özel olarak uyarlanmış aktin filament kayma testi için bir iş akışını detaylandırıyoruz. Aktin filament kayma testi, bir lamel yüzeyi30,31,32 üzerinde hareketsiz hale getirilmiş çok sayıda miyozin motoru tarafından itilen floresan aktin filamentlerinin hareketini kantitatif olarak inceleyen sağlam bir in vitro motilite testidir. Bu testin avantajları arasında kurulum basitliği, minimum ekipman gereksinimleri (dijital kamera ile donatılmış geniş alanlı bir floresan mikroskobu) ve yüksek tekrarlanabilirlik yer alır. Ek olarak, aktin filamentlerinin hareketi, hareketsizleştirilmiş miyozin motorlarından oluşan bir küme tarafından yönlendirildiğinden, bu test, miyozin-7a14,33 gibi monomerik miyozinlerin motilitesini incelemek için özellikle yararlıdır. Protokoller, deneysel prosedürlerden görüntüleme analizine kadar, memeli miyozin-7a'nın benzersiz hareketli özelliklerine özel olarak uyarlanmış çeşitli modifikasyonları içerir. Bozulmamış miyozin-7a proteininin mevcudiyeti ve burada özetlenen fonksiyonel karakterizasyon protokolü ile bu makale, miyozin-7a'nın hem fizyolojik hem de patolojik süreçlerdeki moleküler rollerine ilişkin daha fazla araştırma için zemin hazırlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Burada, bozulmamış insan miyozin-7a holoenzimini sentezlemek ve motilitesini in vitro olarak karakterize etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol üç bölüme ayrılmıştır: ilk olarak, MultiBac bakulovirüs protein ekspresyon sistemini kullanarak insan miyozin-7a'nın eksprese edilmesi; İkincisi, miyozin-7a hafif zincirlerinin E.coli His6-SUMO sistemi kullanılarak ayrı ayrı saflaştırılması; ve son olarak, aktin-filament kayma testini kullanarak insan miyozin-7A'nın motilitesini incelemek.

1. MultiBac sistem tabanlı miyozin-7a kompleksi üretimi

  1. İnsan miyozin-7a kompleksini eksprese etmek için bakulovirüs multigen kaseti oluşturma (16 gün)
    NOT: Miyozin-7a alt birimlerinin cDNA'larını pACEBac1 vektörlerine eklemek için bir klonlama döngüsü (4 gün) ve miyozin-7a kompleksini eksprese etmek için gerekli tüm çarpma modüllerinin adım adım ligasyonunu tamamlamak için üç klonlama döngüsü gerektirir, bu da toplam 16 gün ile sonuçlanır.
    1. Miyozin-7a ağır zincir (HC), kalmodulin, CALML4 ve RLC'yi kodlayan cDNA'ları, üreticinin protokollerini takip eden ticari bir kit kullanarak pACEBac1 vektörlerine klonlayın (bkz. Şekil 1A). Saflaştırmaya yardımcı olmak için miyozin-7a HC'nin C-terminaline bir FLAG etiketi yerleştirilir.
      NOT: Memeli miyozin-7a, N-terminali23'te sadece 11 amino asitlik bir segment ile farklılık gösteren iki ekleme izoformu olarak üretilir. Bu kısa N-terminal uzantısı, miyozin-7a14'ün ATPaz aktivitesinin düzenlenmesinde kritik bir rol oynar. Bir N-terminal etiketi eklemenin, bu N-terminal uzantısı tarafından normal düzenlemeyi bozabileceği ve motorun enzimatik aktivitesini ve hareketliliğini önemli ölçüde azaltabileceğigösterilmiştir 14. Bu nedenle, proteinin doğal düzenlemesini bozmamak için bir C-terminal FLAG etiketi kullanılır.
    2. Aşağıda açıklandığı gibi homing endonükleaz/BstXI çarpımını kullanarak miyozin-7a holoenzimi için çok genli ekspresyon kasetini oluşturun (Şekil 1B).
      NOT: Hedef endonükleaz I-CeuI, BstXI sindirimi tarafından oluşturulan uçlarla uyumlu yapışkan uçlar üretir. Ligasyon üzerine, her iki enzim tarafından kesilemeyen bir hedef endonükleaz / BstXI hibrit kısıtlama bölgesi oluşturulur. Daha fazla çarpma modülünü entegre etmek için aynı prosedür tekrarlanabilir. Kesici uç veya vektör yapılarında I-CeuI ve BstXI için birden fazla kısıtlama bölgesi mevcutsa, I-CeuI ve BstXI kesme bölgelerinin benzersiz olmasını sağlamak için bu ek bölgeler bölgeye yönelik mutajenez ile ortadan kaldırılmalıdır.
    3. Kesici uç hazırlığı: Kesici uç yapısını (örn., pACEBac-M7a HC) hedef endonükleaz I-CeuI ile sindirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve ardından doğrusallaştırılmış plazmidi bir PCR Saflaştırma Kiti kullanarak saflaştırın (bkz. Malzeme Tablosu). Ayrıca, doğrusallaştırılmış plazmiti BstXI ile sindirin (bkz. Malzeme Tablosu), gen ekspresyon kasetini içeren parçayı jel elektroforezi kullanarak ayırın ve bir Jel Ekstraksiyon Kiti kullanarak saflaştırın (bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: I-CeuI ve BstXI, %100 aktivite elde etmek için üreticinin protokollerine göre farklı tampon koşulları gerektirir. Ek olarak, I-CeuI ile tam bir kesim minimum 3 saat gerektirirken, BstXI sadece 15 dakikalık inkübasyon süresi gerektirir. Bu nedenle sindirimin sırayla yapılması gerekir.
    4. Vektör hazırlama: Vektör yapısını (örneğin, pACEBac-CaM) BstXI sindirimi yoluyla doğrusallaştırın. Alkalin Fosfataz, vektör plazmitinin kendi kendine bağlanmasını önlemek için vektör preparatına dahil edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu). Sindirim ürününü elektroforez ile elde edin ve bir Jel Ekstraksiyon Kiti ile saflaştırın.
    5. Ligasyon: I-CeuI/BstXI ile muamele edilmiş eki ve BstXI ile muamele edilmiş vektörü T4 DNA Ligaz ile bağlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Oda sıcaklığında (20 °C -25 °C) 10 dakika boyunca, ek DNA'nın vektör DNA'ya kütlece 1:1 oranıyla ligasyon reaksiyonları gerçekleştirin ve her ligasyon reaksiyonunda toplam kütleyi 100 ng'ye yakın tutun.
    6. Transformasyon ve plazmit analizi: Üreticinin tavsiyelerine uyarak ligasyon karışımlarını DH5α hücrelerine dönüştürün ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve pozitif kolonileri gentamisin direnci açısından tarayın. Ticari bir kit kullanarak plazmitleri saflaştırın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve spesifik kısıtlama sindirim modellerine ve eklerin DNA dizilimine dayalı olarak doğru klonları (örneğin, hem M7a HC hem de CaM içeren plazmitler) doğrulayın.
    7. Çoklu gen ekspresyon kasetlerinin entegrasyonu: Diğer miyozin-7a alt birimlerini eksprese eden ek gen kasetlerini entegre etmek için 1.1.2'den 1.1.6'ya kadar olan adımları tekrarlayın.
  2. Rekombinant bacmid DNA üretimi ve saflaştırılması (4 gün; Şekil 1C).
    NOT: Gün 1 - Bakteri dönüşümü ve dönüştürülmüş kolonilerin büyümesi. 2-3. Günler - Büyüyen koloniler ve başarılı dönüşüm için tarama. 3. Gün - Gece boyunca aşılamaya başlayarak pozitif kolonilerin seçilmesi ve çizgilenmesi. 4. Gün - Bacmid DNA'sının saflaştırılması.
    1. Üreticinin tavsiyelerine uyarak DH10Bac yetkin hücrelerini ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 ng sıralı pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM plazmidi ile dönüştürün.
    2. 50 μg/mL kanamisin, 7 μg/mL gentamisin, 10 μg/mL tetrasiklin, 100 μg/mL halojenli indolil-β-galaktozit ve 40 μg/mL IPTG içeren bir agar plakası üzerine 20-200 μL hücre plakalayın ve negatif klonlarda koyu mavi rengin gelişmesine izin vermek için plakayı 37 ° C'de 48 saat inkübe edin.
      NOT: Halojenli indolil-β-galaktozit, LacZ'yi eksprese etmeye devam eden kolonileri boyar (transpozisyonun başarısız olduğunu gösterir), transpozisyonun başarılı olduğu beyaz kolonilerin seçilmesini sağlar.
    3. İzole edilmiş bir beyaz koloniyi dikkatlice seçin ve hücreleri gece boyunca 50 μg/mL kanamisin, 7 μg/mL gentamisin ve 37 °C'de 10 μg/mL tetrasiklin içeren 10 μg/mL tetrasiklin içinde 225 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda büyütün.
    4. E coli'yi peletlemek için kültürü 10 dakika boyunca 2.465 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti Kitten 300 μL Tampon P1 içinde yeniden süspanse edin.
      NOT: Burada Miniprep kitinden tamponlar kullanılsa da, bacmid ürününü saflaştırma protokolü, kit ile birlikte verilen protokolden farklıdır.
    5. Kitten 300 μL Tampon P2 ekleyin. Tüpleri birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve ardından oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
    6. Kitten 300 μL N3 tamponu ekleyin ve lizis reaksiyonunu durdurmak için ters çevirerek karıştırın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17.885 x g'da santrifüjleyin.
    7. Süpernatanı temiz bir steril tüpe aktarın ve santrifüjlemeyi 10 dakika daha tekrarlayın.
    8. 800 μL süpernatanı başka bir steril 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 600 μL soğuk izopropanol ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız), titiz ters çevirme ile karıştırın. Daha sonra 4 °C'de 20 dakika boyunca 17.885 x g'da santrifüjleyin.
    9. Süpernatanı atın ve küçük, beyaz peleti bulun. Peleti 800 μL soğuk %70 etanol ile yıkayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 17.885 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Peleti rahatsız etmemek için tüp duvarı boyunca dikkatlice etanol ekleyin.
    10. Süpernatanı atın ve etanol yıkamayı bir kez tekrarlayın. Peleti oda sıcaklığında 5 dakika havayla kurutun. Gerekirse fazla sıvıyı dikkatlice aspire edin.
    11. Peleti Kitten 20 μL EB tamponu ile çözün. Tüpü hafifçe vurarak veya pipetleyerek hafifçe karıştırarak peletin tamamen çözüldüğünden emin olun. Bir spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu belirleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
    12. Bacmid konsantrasyonunu yaklaşık 1 μg/μL'de yapmak için tampon hacmini gerektiği gibi ayarlayın. P0 virüsü üretimine hazır olana kadar bacmid DNA'yı 4 °C'de saklayın.
      NOT: Saflaştırılmış bakmid 4 °C'de tutulabilir ve birkaç ay boyunca etkili kalır. 1 yaşına kadar olan bacmid ürünleri ile başarılı transfeksiyonlar gördük. Alternatif olarak, bacmid alikode edilebilir ve -20 ° C'de saklanabilir. Transfeksiyon verimliliğini azalttığı için çoklu donma/çözülme döngülerinden kaçınılmalıdır.
  3. Rekombinant bakulovirüs üretmek için Sf9 böcek hücrelerini bacmid ile transfekte edin (6 gün; Şekil 1D)
    NOT: 1. Gün - Bacmid DNA ile hücrelerin transfeksiyonu. 2-6. Günler - Hücrelerin büyümesini ve ifadesini gözlemleyin. 6. Gün - P0 virüsünün toplanması.
    1. Kültür ortamındaki Sf9 hücrelerini (Malzeme Tablosuna bakınız) 0.33 x 10 6 hücre / mL konsantrasyonda6 oyuklu bir plakaya oyuk başına 3 mL ile ekleyin. Hücrelerin plakanın dibine yapışmasını sağlamak için plakayı oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
    2. Her kuyucuk için, steril bir mikrosantrifüj tüpünde 10 μL katyonik lipid transfeksiyon reaktifini (Malzeme Tablosuna bakınız) 250 μL geliştirilmiş Minimal Esansiyel Ortam (MEM) ortamı (Malzeme Tablosuna bakınız) ile birleştirerek bir transfeksiyon karışımı hazırlayın. Ters çevirerek karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    3. Transfeksiyon karışımına 1 μg (adım 1.2.12'de belirlenen konsantrasyona göre) seyreltilmemiş miyozin-7a bacmid ekleyin. Ters çevirerek karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    4. Tüm DNA-lipit karışımını damla damla kuyucuklara eşit olarak dağıtın. Negatif kontrol olarak transfekte edilmemiş hücreler için bir kuyu bırakın.
    5. 6 oyuklu plakayı filmle kapatın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 6 gün boyunca 27 ° C'de inkübe edin. Bu süre boyunca büyümeyi ve ayrılmayı gözlemleyin. Yapı üzerinde bir floresan etiketi varsa, floresan gelişimini kontrol edin (Şekil 2).
    6. Transfekte edilen hücreler geç evre enfeksiyon belirtileri gösterdiğinde, virüsü içeren ortamı enfekte olmuş kuyulardan 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca 805 x g'da santrifüjleyin.
    7. Süpernatanı temiz bir 15 mL konik tüpe aktarın, alüminyum folyoya sarın ve 4 °C'de saklayın. Bu ürün artık P0 virüsüdür ve deneyimlerimize göre dört aya kadar etkili bir şekilde saklanabilir ve kullanılabilir.
  4. Bakulovirüs stoğunu çoğaltın (3-5 gün; Şekil 1E)
    1. 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde Sf9 hücre kültürü ortamında 2 x 106 hücre / mL konsantrasyonda 100 mL (veya istenen hacimde) Sf9 hücresi hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Sf9 hücre süspansiyon kültürüne 1: 100 oranında (v/v) P0 virüs stoğu ekleyin ve 135 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda 27 °C'de inkübe edin.
    3. Hücreler ~% 90 hücre ölümüne ulaşana kadar her 24 saatte bir büyümeyi izleyin. Bu aralığa geldikten sonra, hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin ve P1 virüsünü içeren süpernatantı toplayın.
    4. Süpernatanı 0.22 μm vakum filtrasyonu kullanarak filtreleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Filtrelenmiş ürünü karanlıkta tutun ve 4 °C'de saklayın. Bu ürün artık P1 virüsüdür.
      NOT: 4 °C'de uzun süreli depolama ile virüs titresi azalır. 4 aydan daha uzun süredir depolanmışsa taze virüs stoğu yapmayı düşünün veya34 ifadesinde kullanmadan önce virüs stoğunu titre edin.
  5. Protein Ekspresyonu (Hücre peletinin ekspresyonunun başlaması ile toplanması arasında 60-72 saat; Şekil 1E)
    1. 2 x 106 hücre / mL konsantrasyonda log faz büyüyen Sf9 hücreleri hazırlayın ve 12 mL virüs ila 300 mL hücre süspansiyonu oranında P1 virüsü ekleyin.
      NOT: Protein verimi yaklaşık 1 mg/L'dir. Bu protein ekspresyonu için minimum 1,5 L hücre süspansiyonu kullanılması tavsiye edilir.
    2. Hücreleri 27 ° C'de 135 rpm'de yaklaşık 60 saat boyunca bir orbital çalkalayıcıda kültürleyin.
      NOT: Küçük numuneler farklı zaman noktalarında toplanabilir ve protein ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için SDS jelleri kullanılarak analiz edilebilir. Ek olarak, proteinler floresan etiketlerle kaynaştırılırsa, ekspresyon seviyeleri floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirilebilir. Hücreler, hücre ölümünün başlamasından en geç sonra toplanmalıdır.
    3. Hücreleri peletlemek için hücre süspansiyonunu 3.735 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Peletler daha fazla kullanılana kadar -80 °C'de saklanabilir veya uzun süreli depolama için saklanabilir. Hücre peletlerini genellikle haftalar içinde kullanırız, ancak dondurulduktan birkaç ay sonra aktif proteini geri kazanmış oluruz.
  6. Protein saflaştırması (2 gün; Şekil 1F)
    NOT: Gün 1 - FLAG afinite kromatografisi kullanılarak protein ekstraksiyonu ve saflaştırılması. 2. Gün - Gece diyalizinden sonra numuneleri alın ve dondurun. Aşağıda açıklanan protokol, miyozin-7a'yı 1.5 L hücreli peletlerden saflaştırmak içindir.
    1. 10 mM MOPS (pH 7.2), 500 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 μg/mL leupeptin ve 100 μg/mL fenilmetilsülfonil florür (PMSF) içeren Ana Tampon hazırlayın. 0,22 μm gözenek boyutlu bir filtre ile filtreleyin ve tamponu 4 °C'de saklayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: PMSF sulu çözeltilerde kararsızdır. PMSF stok çözeltisini %100 etanol içinde 1 M olarak hazırlayın ve -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
    2. Ana Tamponu 3 EDTA içermeyen proteaz inhibitör tableti, 2 mM ATP ve 0.1 mM ditiyotreitol (DTT; Malzeme Tablosuna bakınız) ile destekleyerek 75 mL Ekstraksiyon Tamponu hazırlayın.
    3. Hala donmuş durumdayken pelete 75 mL Ekstraksiyon Tamponu ekleyin. Peletleri Ekstraksiyon Tamponunda çözülene kadar buz üzerinde bırakın. Çözülme sürecini hızlandırmak için peleti parçalamak için serolojik bir pipet kullanın.
    4. 1/2 inç (13 mm) uç kullanarak, yeniden süspansiyonu buz üzerinde 10 dakika boyunca %50 genlikte, 5 saniye açık, 5 saniye kapalı olarak sonikleştirin.
    5. Toplam lizatı 33.746 x g'da 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında, 3 mL Anti-FLAG afinite reçinesinin %50'sini bulamacın 3 mL'sini 40 mL PBS ile yıkayarak 1,5 mL FLAG reçinesi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Reçineyi 4 °C'de 2 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyerek peletleyin. Reçineyi bozmadan PBS'yi dikkatlice çıkarın.
    6. Lizat santrifüjünden süpernatanı yıkanmış reçineye ekleyin ve 1 saat boyunca 4 ° C'de sürekli rotasyonla inkübe edin.
    7. Reçineyi 800 x g'da 4°C'de 2 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Reçineyi rahatsız etmeden, süpernatanı çıkarın.
    8. Reçineyi 40 mL Ana Tampon içinde yeniden süspanse edin ve 800 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin. Reçineyi rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın. Yıkamayı 1 kez tekrarlayın.
    9. Yıkanmış reçineyi iki polipropilen spin kolonuna aktarın (bkz . Malzeme Tablosu). Her sütunu 1 kez 2 mL Master Buffer ile yıkayın. Kolonu 1,400 °C'de 2 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyerek Ana Tamponu çıkarın. Reçine altta paketlenecektir.
    10. Ana Tampona 100 μg/mL FLAG-peptid ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek bir Elüsyon Tamponu hazırlayın.
    11. Her sütundaki paketlenmiş reçineye 300 μL Elüsyon Tamponu ekleyin ve reçinenin Elüsyon Tamponu tarafından tamamen hidratlandığından emin olmak için pipetleme ile hafifçe karıştırın. Reçinenin Elüsyon Tamponu ile buz üzerinde 10 dakika inkübe etmesine izin verin.
    12. Sütunları 1,400 x g'da 2 °C'de 4 dakika santrifüjleyin. Akışı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde tutun. Bu ilk fraksiyondur.
    13. 1.6.11-1.6.12 adımlarını, her sütundan 4 kesir toplanacak şekilde tekrarlayın.
    14. Bağıl konsantrasyonlarını belirlemek için elüsyon fraksiyonları ile SDS-PAGE jel elektroforezi35 gerçekleştirin. Jel çalışırken, 500 mM NaCl, 10 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA ve 1 mM DTT içeren bir Diyaliz Tamponu hazırlayın.
    15. En konsantre fraksiyonları birleştirin. Numuneyi 10K MWCO diyaliz kasetine aktarın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve gece boyunca 4 °C'de diyalize girin. Yaklaşık 500 μL protein için 1 L diyaliz tamponu kullanın. Diyaliz tamponunda en az üç değişiklik yapın.
      NOT: Spin kolonu ve santrifüjleme elüsyon yöntemi, proteinlerin yüksek konsantrasyonlarda (0.5-1 mg / mL) ayrıştırılmasına izin verir. Daha fazla konsantre adımlar genellikle gerekli değildir. Bununla birlikte, daha konsantre proteinler isteniyorsa, numuneleri 100.000 MWCO konsantre tüplerine yükleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.400 x g'da santrifüjleyin. İstenilen protein çözeltisi hacmi elde edilene kadar bu işlemi tekrarlayın.
    16. Ertesi gün, numuneyi diyaliz kasetinden dikkatlice boşaltın. PCR tüpü başına 15 μL ekleyin ve tüpleri hızlı dondurma için bir sıvı nitrojen kabına bırakın. Donmuş proteinler ileride kullanılmak üzere -80 °C'de saklanabilir (Şekil 3A).
      NOT: Bu yöntemi kullanarak miyozin-7a'nın verimi genellikle 0.5 ila 1 mg / L arasındadır.

2. RLC ve CALML4 hafif zincirlerinin E. coli His6-SUMO sistemi kullanılarak saflaştırılması (7 gün)

NOT: 1-4. Günler - Plazmitlerin klonlanması ve saflaştırılması. 5. Gün - Bakteriyel dönüşüm. 6-7. Günler - Nihai proteinlerin saflaştırılması, alikotlanması ve dondurulması.

  1. RLC ve CALML4'ü kodlayan cDNA'ları, saflaştırmaya yardımcı olmak için SUMO'dan önce bir His6 dizisi içeren bir pET-SUMO vektörüne klonlayın. Gerektiğinde, His6-SUMO alanı, bir SENP2 proteazı26,36 kullanılarak füzyon proteininden ayrılabilir.
  2. Her hafif zincir proteini için, BL21 E. coli yetkin hücreleri (Malzeme Tablosuna bakınız) plazmit ile dönüştürün ve dönüştürülmüş hücrelerle gece boyunca 5 mL'lik bir sıvı kültür başlatın.
  3. Ertesi gün, 5 mL gece boyunca kültürü 50 μg / mL kanamisin içeren 1 L Luria-Bertani (LB) suyuna aşılayın. Optik yoğunluk (OD) 0,6 - 1,0'a ulaşana kadar 270 rpm'de sürekli çalkalama ile kültürün 37 ° C'de büyümesine izin verin.
    NOT: OD değeri, 0,2'ye ulaştığında yaklaşık her 20 dakikada bir ikiye katlanır. OD'yi sık sık izleyin.
  4. Kültüre 250 μM izopropil b-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ekleyerek protein ekspresyonunu başlatın. 37 ° C'de 3-5 saat veya gece boyunca 16 ° C'de 270 rpm'de sürekli çalkalama ile inkübe edin.
  5. Hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4.347 x g'da santrifüjleyerek E. coli'yi peletleyin. Süpernatanı atın.
  6. 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 5 mM İmidazol ve% 10 gliserol, pH 7.4 içeren Yeniden Süspansiyon Tamponu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Buz üzerinde tutun.
  7. Peletleri 15-25 mL Yeniden Süspansiyon Tamponu içinde yeniden süspanse edin ve süspansiyonu temiz bir behere aktarın, toplam hacmi 35 mL'ye ayarlayın. Sırasıyla 1 μg / mL ve 2 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyon için 1: 1000 (v / v) oranında süspansiyona DNaz ve RNaz ekleyin. Süspansiyona bir EDTA içermeyen proteaz inhibitör tableti, 4 mM 2-merkaptoetanol ve %1 Triton X ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). 20 dakika buz üzerinde tutun.
  8. Pelet süspansiyonunu buzlu suda 1 s açık ve 1 s kapalı% 100 genlikte toplam 1 dakika boyunca sonikleştirin. Homojenize lizatı 4 °C'de 2 saat sürekli dönüşle bırakın.
    NOT: Triton X'in eklenmesi, sonikasyon için hazırlanırken hücrelerin parçalanmasına yardımcı olur.
  9. Lizatları 26.900 x g'da 4 ° C'de 45 dakika santrifüjleyin. Bu gerçekleşirken, kobalt reçinesini hazırlamaya başlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). 1 L E. coli kültürü için 500 μL kobalt reçinesi kullanın. Reçineyi 2 kez ultra saf su ile ve bir kez Süspansiyon Tamponu ile 4,347 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyerek yıkayın.
  10. Lizat santrifüjlemenin ardından, süpernatanı yıkanmış reçine ile birleştirin ve 4 °C'de 30 dakika boyunca hafifçe sallayın.
  11. Lizat-reçine süspansiyonunu 4,347 x g'da 2 ° C'de 4 dakika santrifüjleyin. Reçine tüpün dibinde paketlenecektir. Reçineyi rahatsız etmeden, süpernatanı çıkarın.
  12. Reçineyi 4,347 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyerek Yeniden Süspansiyon Tamponu ile yıkayın. Süpernatanı çıkarın. Süpernatan renksiz olana kadar yıkamaları tekrarlayın.
  13. 50 mM Tris HCl, 300 mM NaCl, 5 mM İmidazol, %10 gliserol, 4 mM 2-merkaptoetanol ve 0.25 μM SENP2 proteaz içeren Elüsyon Tamponu hazırlayın (bkz. Buz üzerinde tutun.
  14. Reçineyi 1 mL Yeniden Süspansiyon Tamponu içinde yeniden süspanse edin ve sürekli rotasyonla gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  15. Ertesi gün, reçineyi peletlemek için 2 dakika boyunca 4.347 x g'da santrifüjleyin. Parçalanmış hafif zincir proteinini ve proteazı içeren süpernatanı toplayın.
  16. Reçineye 1 mL Elüsyon Tamponu ekleyin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı toplayın.
  17. Proteazı hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) ile çıkarın. Kısaca, 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, %10 gliserol ve 5 mM DTT (pH 7.4) içeren bir tampon ile boyut dışlama sütununu ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. 10.000 MWCO'luk bir konsantre tüp kullanarak süpernatanı 500 μL'ye konsantre edin. Konsantre numuneyi bir şırınga kullanarak otomatik bir kromatografi sistemine bağlı bir kolona yükleyin, 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, %10 gliserol ve 5 mM DTT (pH 7.4) içeren bir tamponla akın. Toplanan fraksiyonları bir ultraviyole spektrofotometri kullanarak izleyin. Hafif zincirlere karşılık gelen bir moleküler ağırlığa sahip protein fraksiyonlarını toplayın.
    NOT: Proteazın içine bir saflaştırma etiketi (örneğin, GST etiketi) tasarlanmışsa, proteaz afinite kromatografisi ile de çıkarılabilir.
  18. Her bir fraksiyondaki hafif zincir proteinlerinin saflığını ve nispi konsantrasyonlarını belirlemek için elüsyon fraksiyonları ile bir SDS-PAGE jeli çalıştırın. İstenen fraksiyonlar, herhangi bir görünür proteaz bandı olmayan konsantre hafif zincir proteinleri içeren fraksiyonlardır. İstenen protein fraksiyonlarını birleştirin ve bunları 10.000 MWCO'luk bir konsantre tüp35 kullanarak konsantre edin.
  19. Protein alikotlarını sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve uzun süreli depolama için hemen -80 ° C'ye aktarın (Şekil 3B).
    NOT: E. coli His6-SUMO sistemi kullanılarak RLC ve CALML4 verimi yaklaşık 1-2 mg / L'dir.

3. Miyozin-7a'ya özel aktin filament kayma testi (3 saat)

NOT: Bu bölümde kullanılan yöntemler, diğer miyozinler31 için tarif edilenlere benzer, ana modifikasyonlar, miyozinin yüksek iyonik kuvvete sahip tamponda inkübasyonu ve uygulanması ve çerçeveden çerçeveye yer değiştirmelerin doğru ölçümünü elde etmek için gereken uzun aralıktır.

  1. Gece boyunca 4 ° C'de polimerizasyon tamponunda (50 mM KCl, 25 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7.0)) küresel aktini (G-aktin) polimerize ederek 20 μM filamentli aktin (F-aktin) hazırlayın. 1.2x molar fazla rodamin-phalloidin ekleyerek F-aktini etiketleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Alüminyum folyo ile örtün ve en az 2 saat buz üzerinde inkübe edin.
    NOT: G-aktin ticari satıcılardan satın alınabilir (Malzeme Tablosuna bakınız) veya tavşan kası aseton tozundan31,37 saflaştırılabilir. Etiketli F-aktin, bu konsantrasyonda 4 ° C'de 2 aya kadar saklanabilir.
  2. Daha önce açıklandığı gibi bir akış odası hazırlayın31. Kısaca, temizlenmiş ve nitroselülozla muamele edilmiş bir mikroskop lamı üzerine 2-3 mm aralıklarla iki şerit çift taraflı bant yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Lamel nitroselüloz tarafı aşağı bakacak şekilde şeritlerin üzerine yerleştirin ve yaklaşık 10 μL hacimli bir akış odası oluşturun (Şekil 4).
  3. Aktin filament kayma testinin yapılması
    1. Akış odasına, 500 mM NaCl Motilite Tamponunda (500 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA (pH 7.4)) 0.2 mg / mL saflaştırılmış insan miyozin-7a proteini içeren bir oda hacmi ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe etmeye bırakın.
      NOT: Miyozin-7a'nın yüksek bir tuz tamponuna eklenmesi çok önemlidir, çünkü bu, otoinhibe durumu hafifletir ve miyozin-7a'nın aktive edilmiş konformasyonda yüzeye yapışmasına izin verir.
    2. Akış odasını 150 mM NaCl Motilite Tamponunda (150 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7.4)) 150 mM NaCl Motilite Tamponunda 1 mg / mL BSA'lık üç odacıklı hacimlerle yıkayın (Malzeme Tablosuna bakın) fazla sıvıyı emmek için çıkışta temiz bir mendil kullanarak sıvıyı çekin. 3. yıkamadan sonra 1 dakika inkübe edin.
    3. 150 mM NaCl Motilite Tamponunda 10 nM rodamin phalloidin etiketli F-aktin'in bir oda hacmini akış odasından akıtın. Aktin filamentlerinin yüzeye bağlanmasını 100x objektifli bir floresan mikroskop altında izleyin. Aktin filamentlerinin yoğunluğu optimal olmalıdır (Şekil 5A), görüş alanında izleme için yeterli filament sağlanmalı, ancak birden fazla filamentin üst üste binmesini önleyecek kadar seyrek olmalıdır, bu da izlemeyi zorlaştırır.
    4. Bağlanmamış aktin filamentlerini ve fazla rodamin-falloidini çıkarmak için akış odasını üç odacıklı hacimlerde 150 mM NaCl Motilite Tamponu ile yıkayın.
    5. Son tamponun bir oda hacmini ekleyerek motiliteyi başlatın (200 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 50 mM DTT, 2 mM ATP, 2.5 mg/ml glikoz, 100 μg/mL glikoz oksidaz, 2 μM RLC, 2 μM CaM, 2 μM CALML4).
    6. Rodamin phalloidin etiketli aktini görselleştirmek için 561 nm uyarma kullanarak görüntüleri bir floresan mikroskobunda kaydedin. Slaytta istenen aktin yoğunluğuna sahip bir alan bulun (Şekil 5A) ve 30 dakika boyunca her 30 saniyede bir görüntü yakalayın.
      NOT: Memeli miyozin-7a'nın hızı yaklaşık 5 nm/s'dir. Çekim kare hızını ayarlarken, doğru izlemeye izin vermek için filamentlerin kareler arasındaki yer değiştirmelerinin yeterince uzun (birden fazla piksel) olduğundan emin olmak önemlidir. Kareler arasındaki alt piksel hareketleri, hızın fazla tahmin edilmesine neden olabilir. 30 s'lik kare hızı, aktin filamentlerinin çerçeveler arasında yaklaşık 150 nm hareket etmesine izin verir, bu da mikroskopta ikiden fazla piksele karşılık gelir. Bununla birlikte, kullanılan mikroskopta önemli bir yer değiştirmenin gözlenebileceğine dikkat edilmelidir. Varsa, analiz için aynı anda birkaç görüş alanı toplamak için çok konumlu kayıt kullanılabilir.
  4. FAST programını (Mac'te kurulu) kullanarak aktin filamentlerinin hareketini analiz etme38.
    NOT: Burada kullanılan FAST programı, filament hareketini ölçmek için kullanılan birçok seçenekten yalnızca biridir. Otomatik, hızlı ve ücretli yazılım gerektirmediği için HIZLI kullanmayı tercih ettik. Diğer seçenekler arasında FIESTA gibi MATLAB tabanlı algoritmalar, MTrack2 ve Manuel İzleme gibi ImageJ/FIJI tabanlı yöntemler ve Philament39 gibi Python tabanlı yöntemler bulunur.
    1. FAST programını (github.com/NeilBillington/FASTrack3 indirin ve kurun - python3 uyumlu sürüm için ek bir modül ile. nd2 dosya dönüştürme. Not: Orijinal python2 sürümü github.com/turalaksel/FASTrack) adresinde bulunabilir.
    2. Yalnızca düzgün hareket eden filamentleri korumak için33 tolerans değerini kullanarak FAST programını 38'de açıklandığı gibi çalıştırın.
      NOT: Görüntüler, sahneyle ilgili mekanik sorunlara veya aynı anda birkaç dizinin toplanmasına sürüklenme içeriyorsa, önce filmler sabitlenmelidir. Bunun için, aşağıdaki adresten indirebileceğiniz FIJI eklentisi Image Sabitleyiciyi öneriyoruz - (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).
    3. Önce -xmax ve -ymax değerlerini ayarlayarak yeni oluşturulan .tif görüntülerini analiz etmek için FAST programını kullanın. Bunlar, program tarafından dağılım grafiği çıktısı için parametreleri ayarlar ve en uzun filament uzunluğunu (nm cinsinden) ve maksimum filament hızını (nm/s cinsinden) temsil eder. Tüm verilerin yakalandığından emin olmak için bu örnekte -xmax için 20.000 nm ve -ymax için 20 nm/s kullandık (Şekil 5D).
    4. Elde edilen görüntünün piksel boyutunu ayarlamak için -px kullanın, burada 65 nm olacaktır ve analize dahil edilmek üzere bir filament için gereken minimum hızı (nm/s cinsinden) ayarlamak için -minv kullanın. Bu örnekteki miyozin-7a'nın düşük hızı için 0.1 nm/s kullanın.
    5. Filamentlerin bağlanması için çerçeveler arasında izin verilen maksimum mesafeyi ayarlamak için -maxd kullanın. Bu, çerçeveler arasında ayrı filamentlerin bağlanmasını önlemek için ayarlanmıştır ve bu örnekte varsayılan 2000 nm'yi kullanıyoruz.
    6. Filament hızlarındaki dalgalanmalara karşı toleransı ayarlamak için kullanın-pt ve yalnızca yumuşak hareketlere sahip filamentleri dahil edin. Bu örnekte %33'lük bir tolerans eşiği kullanılmaktadır. Bu, hız ortalamasının %33'ünden daha büyük bir hız standart sapmasına sahip filamentlerin daha fazla analizden çıkarılacağı anlamına gelir.
    7. Son olarak, analiz için .tif yığınlarını içeren klasörü belirtmek için -d kullanın. Verilen parametreler ve değerlerle tüm komut dizisi şöyle olacaktır: fast -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [filmleri içeren klasör adı].
      NOT: FAST programı, diğer programlarda analiz ve görselleştirme için çıkarılabilen ilişkili ham verileriyle birlikte dağılım grafikleri (Şekil 5D) çıkaracaktır (Şekil 5C). Ayrıca, izlemenin beklendiği gibi çalıştığını doğrulamak için kullanılması gereken, izlenen filamentlerin yollarının bir grafiğini de çıkaracaktır (Şekil 5B). Grafiklerin ve diğer olası veri görselleştirmelerinin örnekleri aşağıda yer almaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Saflaştırılmış miyozin-7a kompleksi ve hafif zincir proteinleri, Şekil 3'te gösterildiği gibi SDS-PAGE jel elektroforezi ile değerlendirilebilir. 200 kDa markörün üzerindeki bant, miyozin-7a ağır zincirine (255 kDa) karşılık gelir. 22 ve 14 kDa belirteçleri arasında yukarıdan aşağıya geçiş yapan üç bant sırasıyla RLC (20 kDa), kalmodulin ve CALML4'tür. Kalmodulin ve CALML4, yaklaşık 17 kDa'lık benzer bir moleküler ağırlığa sahipken, iki protein% 16'lık bir Tris-Glisin jeli kullanılarak ayrıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, böcek hücrelerinden rekombinant insan miyozin-7a proteininin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Sf9 / bakulovirüs sistemi çeşitli miyozinler40,41,42,43 üretmek için kullanılmış olsa da, ancak son zamanlarda memeli miyozin-7a, MultiBac bakulovirüs sistemi14 kullanılarak başarılı bir şekilde saflaştırılmıştır. Memel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

West Virginia Üniversitesi'ndeki Mikroskopi Görüntüleme Tesisi ve Görsel İşlev ve Morfoloji Çekirdeği'ne tartışma ve görüntü analizi konusunda yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma, West Virginia Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden RL'ye görev süresi başlangıç fonları tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma aynı zamanda Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS), Görsel Bilimler Biyomedikal Araştırma Mükemmeliyet Merkezi (Vs-CoBRE) (P20GM144230) ve NIGMS Batı Virginia Biyomedikal Araştırma Mükemmeliyet Ağı (WV-INBRE) (P20GM103434) tarafından da desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.7 mL mikrosantrifüj tüpleriVWR87003-294
1X FLAG PeptidGenScriptN/AÖzel peptit sentezi
22x22mm No. 1.5 lamellerVWR48366-227
250 mL Konik Santrifüj TüpleriNunc376814
250 mL Bacalı Erlenmyer Çalkalayıcı ŞişesiIntelixBioDBJ-SF250VP
2-MerkaptoetanolVWRM131
75x25x1 mm Vistavision mikroskop slaytlarıVWR16004-42
Aktin Proteini (%>99 Saf)Hücre İskeletiAKL99
Amicon Ultra-0.5 Santrifüj Filtre ÜnitesiMillipore SigmaUFC510024
Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre ÜnitesiMillipore SigmaUFC801024
ANTI-FLAG M2 Afinite JeliMillipore SigmaA2220
ATPMillipore SigmaA7699
ATPMillipore SigmaA7699
Bio-Spin Tek Kullanımlık Kromatografi KolonuBio-Rad732-6008
BL21 Yetkili E. coliNew England BiolabsC2530H
Bluo-GalThermo Fisher
Sığır Serumu AlbüminMillipore Sigma5470
BstXI EnzimNew England BiolabsR0113S
CalmodulinMillipore Sigma208694
KatalazMillipore SigmaC40
Şampiyonu pET-SUMO İfade SistemiThermo FisherK30001
cOmplete, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü KokteylRoche Teşhis5056489001
Cutsmart TamponuNew England BiolabsB6004S
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DNase I, SpectrumChemical Fisher Scientific18-610-304
Çift Taraflı BantOfis Deposu909955
EGTA, Moleküler Biyoloji SınıfıMillipore Sigma324626-25GM
EGTA, Moleküler Biyoloji SınıfıMillipore Sigma324626-25GM
EtanolThermo FisherBP2818
ExpiFectamine Sf Transfeksiyon ReaktifiGibcoA38915
HIZLI programhttp://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements; 
Balıkçı markası  Model 505 Sonik AyırıcıFisher ScientificFB505110
Gentamisin Reaktif ÇözeltisiGibco15710-064Damıtılmış suda 10 mg / mL
GlikozMillipore SigmaG5767
Glikoz OksidazMillipore SigmaG2133
GliserolInvitrogen15514-011
HisPur Kobalt ReçinesiThermo Fisher89966
I-CeuI EnzimNew England BiolabsR0699S
Görüntü Sabitleyici Eklentisihttps://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
İmidazolMilliporeSigma I2399
In-Fusion Snap Assembly Master MixTaKaRa638948
IPTGThermo Fisher15529019
İzopropanolFisher ScientificA451SK
KanamisinFisher ScientificAAJ67354AD
Büyük Orifis Pipet UçlarıFisher Scientific02-707-1341-200uL
LB Agar, Hazır TozTermo FisherJ75851-A1
Leupeptin Proteaz İnhibitörüThermo Fisher78435
Magnezyum klorürThermo FisherJ61014.=E1M
Magnezyum klorürThermo FisherJ61014.=E1M
Maksimum Verimlilik DH10Bac Yetkin HücrelerGibco10361012
Mikrosantrifüj Tüpleri, 1.7mLVWR87003-294
Mikrosantrifüj Tüpleri, 1.7 mLVWR87003-294
Mikrosantrifüj Tüpleri, 1.7 mLVWR87003-294
MikroskopNikonModeli: 100X TIRF objektifli H-TIRF sistemli Eclipse Ti
s LB Et SuyuCorning46-050-CM
MOPSMillipore SigmaM3183
MOPSMillipore SigmaM3183
NanoDrop One/OneC Mikro Hacimli UV-Vis SpektrofotometreThermo FisherND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Mikro Hacimli UV-Vis SpektrofotometreThermo FisherND-ONE-W
NEB 5-alfa Yetkili E.coli (Yüksek Verimlilik)New England BiolabsC2987H
NEBuffer r3.1New England BiolabsB6003S
NIS ElemanlarıNikon
NIS ElemanlarıNikon
NitroselülozLADD Araştırma Endüstrileri53152
Opti-MEM I Azaltılmış Serum OrtaGibco31985070
pACEBac1 VektörCenevre Biyoteknoloji
ParafilmMillipore SigmaP7793
PMSFMillipore Sigma78830
PureLink RNase A (20 mg / mL)Invitrogen12091021
QIAprep Spin Miniprep Kiti (250)QIAGEN27106
QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti (50)QIAGEN28704
QIAquick PCR Saflaştırma Kiti (50)QIAGEN28104
Hızlı CIPNew England BiolabsM0525S
Rhodamine phalloidinInvitrogenR415
SOC Ortaİnvitrojen15544034
SENP2 proteazPMID:17591783Laboratuvarda
saflaştırılırSf9 hücreleriThermo Fisher11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Serum İçermeyen Ortam KompleGibco12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Diyaliz Kaseti, 10K MWCO, 3 mLThermo FisherA52971
Sodyum klorürMillipore SigmaS7653
Sodyum klorürMillipore SigmaS7653
Stericup Hızlı Açılan Vakumlu Tek Kullanımlık Filtrasyon SistemiMillipore SigmaS2GPU01RE
Superdex 75 Artış 10/300 GLCytiva29148721
T4 DNA LigazNew England BiolabsM0202S
T4 DNA Ligaz Tamponu - 10mM ATP ile 10XNew England BiolabsB0202A
Tetrasiklin HidroklorürMilipore SigmaT7660-5G
TrisMillipore Sigma10708976001
Triton XAmerikan Biyoanalitik9002-93-1
15519028 Mikroskop Kamerası ORCA-Fusion BT Mikroskop Lazer Ünitesi Andor iXon Ultra Miller'

Kaynaklar

  1. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. J Cell Sci. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  2. Sellers, J. R. Myosins: a diverse superfamily. Biochim Biophys Acta. 1496 (1), 3-22 (2000).
  3. Titus, M. A. Myosin-driven intracellular transport. Cold Spring Harb Perspect Biol. 10 (3), a021972(2018).
  4. Quintanilla, M. A., Hammer, J. A., Beach, J. R. Non-muscle myosin 2 at a glance. J Cell Sci. 136 (5), jcs.260890(2023).
  5. Peckham, M. Coiled coils and SAH domains in cytoskeletal molecular motors. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1142-1148 (2011).
  6. Batters, C., Veigel, C., Homsher, E., Sellers, J. R. To understand muscle you must take it apart. Front Physiol. 5, 90(2014).
  7. Friedman, T. B., Sellers, J. R., Avraham, K. B. Unconventional myosins and the genetics of hearing loss. Am J Med Genet. 89 (3), 147-157 (1999).
  8. Geeves, M. A., Holmes, K. C. The molecular mechanism of muscle contraction. Adv Protein Chem. 71, 161-193 (2005).
  9. Batters, C., Veigel, C. Mechanics and activation of unconventional myosins. Traffic. 17 (8), 860-871 (2016).
  10. Houdusse, A., Sweeney, H. L. How myosin generates force on actin filaments. Trends Biochem Sci. 41 (12), 989-997 (2016).
  11. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biol. 8 (9), R196(2007).
  12. Moreland, Z. G., Bird, J. E. Myosin motors in sensory hair bundle assembly. Curr Opin Cell Biol. 79, 102132(2022).
  13. Williams, D. S., Lopes, V. S. The many different cellular functions of MYO7A in the retina. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1207-1210 (2011).
  14. Hollo, A., et al. Molecular regulatory mechanism of human myosin-7a. J Biol Chem. 299 (10), 105243(2023).
  15. Choi, M. S., et al. The small EF-hand protein CALML4 functions as a critical myosin light chain within the intermicrovillar adhesion complex. J Biol Chem. 295 (28), 9281-9296 (2020).
  16. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nat Commun. 7, 10833(2016).
  17. Whatley, M., et al. Usher syndrome: Genetics and molecular links of hearing loss and directions for therapy. Front Genet. 11, 565216(2020).
  18. Ahmed, Z. M., et al. USH1H, a novel locus for type I Usher syndrome, maps to chromosome 15q22-23. Clin Genet. 75 (1), 86-91 (2009).
  19. Liu, X., Ondek, B., Williams, D. S. Mutant myosin VIIa causes defective melanosome distribution in the RPE of shaker-1 mice. Nat Genet. 19 (2), 117-118 (1998).
  20. Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
  21. Houdusse, A., Titus, M. A. The many roles of myosins in filopodia, microvilli and stereocilia. Curr Biol. 31 (10), R586-R602 (2021).
  22. Schwander, M., Kachar, B., Muller, U. Review series: The cell biology of hearing. J Cell Biol. 190 (1), 9-20 (2010).
  23. Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066(2020).
  24. Fitzgerald, D. J., et al. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
  25. Sari, D., et al. The MultiBac baculovirus/insect cell expression vector system for producing complex protein biologics. Adv Exp Med Biol. 896, 199-215 (2016).
  26. Courtney, K. C., et al. Synaptotagmin-7 outperforms synaptotagmin-1 to promote the formation of large, stable fusion pores via robust membrane penetration. Nat Commun. 14 (1), 7761(2023).
  27. Courtney, K. C., et al. The complexin C-terminal amphipathic helix stabilizes the fusion pore open state by sculpting membranes. Nat Struct Mol Biol. 29 (2), 97-107 (2022).
  28. Courtney, K. C., et al. Synaptotagmin 1 oligomerization via the juxtamembrane linker regulates spontaneous and evoked neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (48), e2113859118(2021).
  29. Yu, I. M., et al. Myosin 7 and its adaptors link cadherins to actin. Nat Commun. 8, 15864(2017).
  30. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  31. Sellers, J. R. In vitro motility assay to study translocation of actin by myosin. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, 13.2(2001).
  32. Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-specific adaptations of in vitro fluorescence microscopy-based motility assays. J Vis Exp. (168), e62180(2021).
  33. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  34. Jorio, H., Tran, R., Kamen, A. Stability of serum-free and purified baculovirus stocks under various storage conditions. Biotechnol Prog. 22 (1), 319-325 (2006).
  35. JoVE Science Education Database. Separating protein with SDS-PAGE. Basic methods in cellular and molecular biology. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  36. Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. J Biol Chem. 282 (36), 26217-26224 (2007).
  37. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods Enzymol. 85 Pt B, 164-181 (1982).
  38. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Rep. 11 (6), 910-920 (2015).
  39. Bowser, R. M., Farman, G. P., Gregorio, C. C. Philament: A filament tracking program to quickly and accurately analyze in vitro motility assays. Biophys Rep. 4 (1), 100147(2024).
  40. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  41. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. J Biol Chem. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  42. Billington, N., et al. Myosin 18A coassembles with nonmuscle myosin 2 to form mixed bipolar filaments. Curr Biol. 25 (7), 942-948 (2015).
  43. Lu, W., et al. Competition between kinesin-1 and myosin-V defines Drosophila posterior determination. Elife. 9, 54216(2020).
  44. Liu, R., et al. A binding protein regulates myosin-7a dimerization and actin bundle assembly. Nat Commun. 12 (1), 563(2021).
  45. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Myosin light chains: Teaching old dogs new tricks. Bioarchitecture. 4 (6), 169-188 (2014).
  46. Belyaev, A. S., Hails, R. S., Roy, P. High-level expression of five foreign genes by a single recombinant baculovirus. Gene. 156 (2), 229-233 (1995).
  47. Li, J., et al. Ca(2+)-induced rigidity change of the myosin VIIa IQ motif-single alpha helix lever arm extension. Structure. 25 (4), 579-591.e4 (2017).
  48. Persson, M., Bengtsson, E., ten Siethoff, L., Mansson, A. Nonlinear cross-bridge elasticity and post-power-stroke events in fast skeletal muscle actomyosin. Biophys J. 105 (8), 1871-1881 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Miyozin-7a SaflaştırılmasıAktin Tabanlı MotorUsher SendromuProtein EkspresyonuIn Vitro MotiliteFloresan MikroskobuMotor Protein Kompleksi
İnsan Miyozin-7a'nın MultiBac Sistem Tabanlı Saflaştırılması ve Biyofiziksel Karakterizasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.