Method Article

Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

DOI:

10.3791/67139

⸱

August 9th, 2024

 , 
1Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research, University of Texas Southwestern Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, küçük moleküllerin ilgilenilen proteinlere bağlanmasını araştırmak için kullanılan yüksek verimli, floresan tabanlı bir teknik olan termal kayma testini sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bilinmeyen işlevlere sahip proteinlerin biyolojik önemini tanımlamak, hücresel süreçlerin anlaşılmasında önemli bir engel teşkil etmektedir. Biyoinformatik ve yapısal tahminler bilinmeyen proteinlerin çalışmasına katkıda bulunmuş olsa da, in vitro deneysel doğrulamalar genellikle biyokimyasal aktivite için gerekli olan optimal koşullar ve kofaktörler tarafından engellenir. Kofaktör bağlanması sadece bazı enzimlerin aktivitesi için gerekli değildir, aynı zamanda proteinin termal stabilitesini de artırabilir. Bu fenomenin pratik bir uygulaması, proteinin erime sıcaklığındaki değişikliklerle ölçülen termal stabilitedeki değişikliğin, ligand bağlanmasını araştırmak için kullanılmasında yatmaktadır.

Termal kayma testi (TSA), farklı ligandların ilgilenilen proteine bağlanmasını analiz etmek veya X-ışını kristalografisi gibi deneyler yapmak için stabilize edici bir koşul bulmak için kullanılabilir. Burada, metal ve nükleotid bağlanmasını test etmek için basit ve yüksek verimli bir yöntem için psödokinaz, Selenoprotein O (SelO) kullanan TSA için bir protokol açıklayacağız. Kanonik kinazların aksine, SelO, protein AMPilasyonu olarak bilinen posttranslasyonel bir modifikasyonda AMP'nin proteinlerin hidroksil yan zincirlerine transferini katalize etmek için ATP'yi ters çevrilmiş bir oryantasyonda bağlar. Erime sıcaklıklarındaki değişimden yararlanarak, SelO fonksiyonunun altında yatan moleküler etkileşimler hakkında önemli bilgiler sağlıyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan proteomunun çoğu zayıf bir şekilde karakterize edilmiştir. Dunham ve Kustatscher ve arkadaşları tarafından tanımlanan "sokak lambası etkisi", kapsamlı bir şekilde araştırılmış proteinlerin daha fazla dikkat çektiği ve az çalışılmış proteinlerin göz ardı edildiği fenomeni ifade eder 1,2. Bu etkiye katkıda bulunan faktörler arasında bazı proteinlerin biyolojik önemi ve hastalık ilgisi yer alır. Ayrıca, temel bilgileri sunan önceki araştırmaların yanı sıra fonksiyonel analiz için araçların mevcudiyeti, çok çalışılmış proteinler 1,2 üzerindeki araştırmaları daha da teşvik eder. Az Çalışılmış Proteinler Girişimi, Yapısal Genomik Konsorsiyumu ve Enzim Fonksiyonu Girişimi gibi projeler, yapısal ve fonksiyonel proteomik 2,3,4 kullanarak az çalışılmış proteinleri karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Az çalışılmış proteinlerin moleküler işlevlerini tanımlamaya yönelik tamamlayıcı bir yaklaşım, regülasyon ve substrat özgüllüğü hakkında değerli bilgiler elde etmek için bu proteinlerin küçük moleküllerle etkileşimlerini incelemektir.

Küçük moleküllerin bağlanması, bir proteinin5 termal stabilitesini artırabilir. Ligandın neden olduğu konformasyon stabilizasyonu olarak bilinen bu fenomen, genellikle bir proteinin erime sıcaklığında bir artışa neden olur ve ligand bağlanmasınınölçülebilir bir göstergesini sağlar 6. Bir proteinin termal stabilitesi, Termoflor veya Termal Kayma Testi (TSA) olarak da bilinen Diferansiyel Taramalı Florimetri (DSF) kullanılarak ölçülebilir7,8,9,10. TSA'da, bir protein numunesi, çevreye duyarlı bir boya6 varlığında artan sıcaklıklara tabi tutulur. Protein açıldıkça ve denatüre oldukça, boya proteinin açıkta kalan hidrofobik bölgelerine bağlanır ve floresan yayar. Dışsal floresan boyalar veya çevreye duyarlı boyalar, içsel floresanstan yoksundur ve bunun yerine hedef molekülleri 9,11,12 ile etkileşime girdiklerinde floresan yanarlar. En yaygın olarak kullanılan boya olan SYPRO Orange, gelişmiş stabilite ve minimum arka plan floresansı 8,9,12 gibi çeşitli avantajlar sunar. Özellikle, SYPRO Orange, sırasıyla 470 nm ve 570 nm civarında uyarma ve emisyon dalga boyları göz önüne alındığında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) sistemleriyle uyumludur. Bu benzersiz özellik, RT-PCR sistemlerinde yaygın olarak kullanılan floresan algılama sistemleriyle uyumlu yüksek verimli, doğru ve hassas ölçümlere olanak tanır8.

TSA, potansiyel kofaktörler veya ilaçlarla protein etkileşimlerini araştırmak ve kristalografi için stabilize edici koşulları belirlemek için çok yönlü bir araçtır. Diğer tarama yöntemlerine göre avantajlarından bazıları, göreceli kurulum basitliği ve 96 veya 384 oyuklu plakalar 13,14,15 ile yüksek verimidir. Bu tekniğin geliştirilmesi, ilaç keşif çalışmaları için dönüştürücü olmuş, kolaylık sağlamış ve iyonlar, ligandlar ve ilaçlar gibi çeşitli katkı maddelerinin incelenmesini sağlamıştır 6,16. Ayrıca, TSA'nın uyarlanabilirliği, bilim adamlarını, tarama tahlillerinin yanı sıra bağlanma afinitelerinin ölçümünü kolaylaştırarak, faydasını genişletmeye teşvik etmiştir17,18. TSA, kristalleşme için ilgilenilen proteinin stabilizasyonunu destekleyen koşulları belirlemek için yapısal biyoloji çalışmalarında etkili bir araçtır19. Bu nedenle, esnekliği ve göreceli kolaylığı, TSA'yı proteinleri karakterize etmede bir köşe taşı tekniği olarak konumlandırmıştır. Burada, örnek olarak metallerin ve nükleotidin az çalışılmış psödokinaz olan Selenoprotein O'ya (SelO) bağlanmasını analiz etmek için TSA'yı kullanacağız.

Kinazlar, ilaç keşfinde en çok hedeflenen protein ailelerinden biridir20. İnsan kinazların yaklaşık% 10'unun inaktif olduğu ve kataliz için gerekli olan temel katalitik kalıntılardan yoksun oldukları için psödokinazlar olarak adlandırıldığı tahmin edilmektedir21,22. Selenoprotein O (SelO), katalitik HRD motifi23'te korunmuş aspartattan yoksun, evrimsel olarak korunmuş bir psödokinazdır. Ökaryotlarda SelO mitokondriye lokalize olur ve hücreleri oksidatif stresten korur24,25. Yapısal ve biyokimyasal analizler, SelO'nun adenozin monofosfatı (AMP) ATP'den protein substratlarına AMPylation25 olarak bilinen bir posttranslasyonel modifikasyonda aktardığını göstermektedir. Son çalışmalar, AMPilasyonu katalize eden enzimlerin UTP gibi alternatif nükleotidleri in vitro 26,27 bağlayabileceğini göstermektedir. Özellikle, çalışmalar, Salmonella typhimurium'dan elde edilen SelO homologunun, manganez bağımlı bir şekilde protein UMPilasyonunu veya UMP transferini katalize ettiğini göstermiştir28. Bu ilgi çekici gözlemler göz önüne alındığında, SelO'nun ATP ve UTP'ye bağlanmasını magnezyum ve manganez varlığında test ediyoruz ve TSA'nın uygulamalarının temsili bir örneği olarak hizmet ediyoruz. Aşağıdaki protokol, diğer proteinlerin ve ilgili katkı maddelerinin etkileşimlerini optimize etmek ve incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Deney düzeneği

  1. Açıklanan protokolü gerçekleştirmek için RT-PCR cihazı gibi floresansı algılayabilen bir termal döngüleyici kullanın. Bu protokolde açıklandığı gibi SYPRO Orange kullanılıyorsa, 470 nm civarında uyarma ve 570 nm civarında emisyon algılamaya izin veren bir tarama modu kullanın. Termodöngüleyiciyi, numuneyi 20 °C'de 2 dakika tutacak ve ardından sıcaklıkta 0,5 °C/1 dk'lık bir sıcaklık artışı ile 95 °C'ye kadar programlayın; floresan yoğunluğunu her 1 °C'de bir ölçün.
    NOT: S'yi döndürmek için döngünün sonunda isteğe bağlı bir adım öneririz.ampbloğu 20 °C'ye getirin (Şekil 1).
  2. Her reaksiyon dört bileşen içerir: Tampon, ilgilenilen protein, katkı maddesi ve ekstrinsik floresan boya. Deneyi, sonuçların yorumlanmasını etkileyebilecek herhangi bir arka plan floresansını belirlemek için protein yok, boya yok, katkı maddesi içermeyen protein ve tek başına katkı maddeleri gibi kontrolleri içerecek şekilde tasarlayın. Varsa, ilgilenilen proteini bağladığı ve stabilize ettiği bilinen bir katkı maddesi gibi pozitif bir kontrol ekleyin.
  3. Test için saflaştırılmış protein kullanın. Bu örneği takip etmek için, daha önce tarif edildiği gibi ifade edilen ve saflaştırılan E. coli SelO'yu kullanın25,29. Kısaca Rosetta DE3 hücrelerinde His-sumo etiketli SelO'yu (E. coli SelO ppSumo) eksprese edin ve Ni2+-NTA afinitesi kullanarak saflaştırın. Ulp proteaz kullanarak His-sumo etiketini ayırın ve jel filtrasyon kromatografisi ile SelO'yu daha da saflaştırın.
  4. SYPRO Orange'ın floresansı, ilgilenilen protein ile etkileşimine bağlı olacaktır. Bu etkileşimler proteinden proteine değişeceğinden, floresan sinyalinin gürültüsüne maksimum sinyali elde etmek için protein ve boya konsantrasyonunu optimize edin.
    NOT: SYPRO Orange, deterjanlar11,30 gibi bazı proteinler ve katkı maddeleri ile uyumlu değildir. 12'de listelenen ek ekstrinsik boyalar gerektiğinde taranabilir.

2. Optimal boya konsantrasyonunun belirlenmesi (Şekil 2A)

  1. DMSO'da 5.000x'te sağlanan stok çözeltisinden 50x, 40x, 30x, 20x ve 10x SYPRO Orange'ın 20 μL dilüsyonlarını hazırlayın.
  2. TSA tamponunda seyreltilmiş 8 μL 6.25 μM proteini, 384 oyuklu bir PCR plakasının altı ayrı kuyucuğuna dağıtın.
    NOT: Örneğimizde, seyreltmeleri gerçekleştirmek için aşağıdaki TSA tamponunu kullandık: 10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl ve 1 mM DTT. Sonuçların güvenilirliğini artırmak için örnekler üç kopya halinde çalıştırılabilir.
  3. Her kuyucuğa 1 μL TSA tamponu ekleyin.
    NOT: Bu tampon hacmi, boya ve protein konsantrasyonunun optimizasyonundan sonra küçük moleküllerin eklenmesiyle değiştirilecektir.
  4. Her bir oyuğa SYPRO Orange boya çözeltisinin her seri seyreltmesinden 1 μL ekleyin. Boya kontrolü için son kuyucuğa 1 μL boyasız tampon ekleyin.
  5. Plakayı optik olarak şeffaf yapışkan film ile kaplayın.
  6. Plakayı, bir PCR plaka adaptörü ile donatılmış bir santrifüjde 1,000 × g'da 1 dakika boyunca kısaca döndürün.
  7. Plakayı bir RT-PCR makinesine yerleştirin ve adım 1.1'de açıklanan termosiklasyon protokolünü başlatın.

3. Optimal protein konsantrasyonunun belirlenmesi (Şekil 2B)

  1. TSA tamponu (10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl ve 1 mM DTT) kullanarak 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM ve 1.56 μM proteinden oluşan 20 μL seri seyreltme hazırlayın.
  2. Proteinin 8 μL seri seyreltmesini 384 oyuklu bir plakanın beş ayrı kuyusuna dağıtın.
  3. Tamponu sadece 6. maddede dağıtınve protein kontrolü yok.
  4. Her kuyucuğa 1 μL TSA tamponu ekleyin.
    NOT: Bu tampon hacmi, boya ve protein konsantrasyonunun optimizasyonundan sonra küçük moleküllerin eklenmesiyle değiştirilecektir.
  5. Her oyuğa her 50x SYPRO Orange boya çözeltisinden 1 μL ekleyin.
  6. Plakayı optik olarak şeffaf yapışkan film ile kaplayın.
  7. Plakayı, bir PCR plaka adaptörü ile donatılmış bir santrifüjde 1,000 × g'da 1 dakika boyunca kısaca döndürün.
  8. Plakayı bir RT-PCR makinesine yerleştirin ve adım 1.1'de açıklanan termosiklasyon protokolünü başlatın.

4. Bir TSA deneyi oluşturma (Şekil 3A)

NOT: Protein ve SYPRO Turuncu boya konsantrasyonlarının optimizasyonundan sonra, bağlanmayı analiz etmek için istenen küçük moleküllerin eklenmesiyle test yapılabilir.

  1. Yinelemeleri ve yeterli denetimleri göz önünde bulundurarak koşul sayısını tanımlayın.
    NOT: Örneğin, SelO'nun sekiz koşula bağlanmasını üç kopya halinde test edeceğiz. Kontroller dahil (katkı maddesi yok, protein yok ve boya yok), 11 reaksiyonumuz x 3 (üçlü) = 33 toplam reaksiyonumuz var.
  2. SelO için gözlemlenen optimal protein ve boya konsantrasyonuna bağlı olarak, her reaksiyonun toplam 10 μL reaksiyon hacmi için 8 μL 6.25 μM protein, 1 μL katkı maddesi ve 1 μL 50x SYPRO Turuncu boya içerdiğinden emin olun. Bu nedenle, kullanılan nihai konsantrasyon 5 μM protein ve 5x SYPRO Turuncu boyadır.
  3. TSA tamponu kullanarak 288 μL 6.25 μM protein çözeltisi hazırlayın. Bu protein çalışma çözeltisi hacmi 36 reaksiyona karşılık gelir (pipetlemedeki varyasyonlar için ek %10 ile 33 reaksiyon).
  4. 8 μL 6.25 μM proteini 384 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına dağıtın. Tamponu sadece protein kontrolü için dağıtın.
  5. Son 1x'i elde etmek için 10x konsantrasyonda 1 μL küçük moleküller ekleyin. Bu örneği takip etmek için, 2 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1 μL 20 mM MgCl2 ekleyin. Tamponu yalnızca katkı maddesi kontrolü için dağıtın.
  6. Her oyuğa her 50x SYPRO Orange boya çözeltisinden 1 μL ekleyin.
  7. Plakayı optik olarak şeffaf yapışkan film ile kaplayın.
  8. Plakayı, bir PCR plaka adaptörü ile donatılmış bir santrifüjde 1,000 × g'da 1 dakika boyunca kısaca döndürün.
  9. Plakayı bir RT-PCR makinesine yerleştirin ve adım 1.1'de açıklanan termosiklasyon protokolünü başlatın.

5. Veri analizi

  1. Sıcaklığa (°C) göre bağıl floresan birimleri (RFU) için RT-PCR makinesinden verileri dışa aktarın.
  2. Her erime eğrisi için ölçülen en yüksek yoğunluğa kadar veri noktalarını çıkarmak ve çizmek için tercih ettiğiniz yazılımı kullanın. Daha da önemlisi, protein ve boya yok kontrollerinin, floresanda sıcaklığa bağlı artışlar olmadan düşük arka plan floresansı sergilediğini doğrulayın (Şekil 3A, B ve Ek Tablo S1). MoltenProt31 veya DSFWorld32 gibi ücretsiz olarak erişilebilen yazılımları kullanarak veri analizi gerçekleştirin.
  3. Veriler için Boltzmann Sigmoidal Fit kullanarak erime sıcaklığını belirleyin. Erime sıcaklığı (Tm), %50 denatürasyon veya yarı maksimum yoğunluğun gözlendiği sıcaklık olarak tanımlanır (Şekil 3C).
  4. Erime eğrisindeki bir termal kayma, stabilize edici veya kararsızlaştırıcı katkı maddelerini önerebilir. Erime sıcaklığındaki (Tm) değişimi hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın: T m = Tm katkı maddesi- Tm tamponu. Pozitif bir değer, stabilize edici bir durumu veya etkileşimli bir katkı maddesini tanımlar; negatif bir değer, istikrarsızlaştırıcı bir durumu tanımlar (Şekil 3D).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotik SelO, bir N-terminal mitokondriyal hedefleme dizisi, kinaz benzeri bir alan ve protein23'ün C-terminalinde yüksek oranda korunmuş bir selenosisteinden oluşur. Bu mitokondriyal yerleşik enzim, bakterilerden insanlara kadar korunan bir psödokinaz alanını kodlar23. Pseudomonas syringae'den elde edilen SelO homologunun yapısal analizi, kanonik kinazlara kıyasla ATP'nin ters bir oryantasyonda bağlanmasını kolaylaştıran aktif bölgede amino asit değişikliklerini ortaya çıkardı25. Buna göre, SelO, hücreleri oksidatif hasardan ve hücre ölümünden korumak için antioksidan sinyallemede yer alan çoklu proteinlerin fosforilasyonu yerine AMilasyonunu katalizeeder 25. AMPilasyona ek olarak, bazı prokaryotik ve ökaryotik AMTILAZLARIN UMPilasyonukatalize ettiği gösterilmiştir 27,28.

İki değerlikli katyonların varlığında ATP ve UTP nükleotidlerinin SelO'ya bağlanmasını incelemek için TSA'da saflaştırılmış rekombinant E. coli SelO kullandık. Kanonik kinazlara benzer şekilde SelO, aspartatın aktif bölgedeki nükleotidi koordine etmek için metal iyonunu bağladığı DFG motifini barındırır. İlk olarak, TSA'da sağlam floresan ölçümleri için protein ve boya konsantrasyonunu optimize ettik ve 5 μM ila 10 μM E. coli SelO'nun 5x SYPRO Orange ile optimal olduğunu belirledik (Şekil 2). Ayrıca, protein içermeyenin yanı sıra boya içermeyen kontrollerin, sıcaklık artışına yanıt vermeyen düşük floresan sinyaline sahip olduğunu gösterdik. ATP-Mg2+ ve ATP-Mn2+ varlığında E. coli SelO'nun termal stabilitesinde sırasıyla +4 °C ve +12 °C artışlar tespit ettik (Şekil 3). Bununla birlikte, UTP ile inkübasyon sırasında termal stabilitede bir kayma gözlemlemedik, bu da E. coli SelO'nun UTP'ye saptanabilir bağlanma göstermeyebileceğini gösteriyor.

figure-results-1
Şekil 1: Termodöngüleyici kurulumu. FRET kanalını kullanarak SYPRO Orange floresansını ölçerken numune sıcaklığını +0,5 °C/dk artırmak için kullanılan termodöngüleyici programına bir örnek. Öneri ayrıca protokolün başında ve sonunda bir ortam sıcaklığı inkübasyonunu da içerir. Kısaltma: FRET = Förster rezonans enerji transferi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Protein ve boya konsantrasyonlarının optimizasyonu. (A) 5 μM Escherichia coli SelO kullanılarak SYPRO Turuncu boya konsantrasyonunun optimize edilmesinin temsili sonuçları. (B) 5x SYPRO Turuncu boya kullanılarak E. coli SelO konsantrasyonunun optimize edilmesinin temsili sonuçları. Termal denatürasyon eğrisi, sıcaklığa (x ekseni) göre bağıl floresan birimlerini (y ekseni) gösterir. Sonuçlar, üçlü kuyucuklardan elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder (n = 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Nükleotid ve iki değerlikli katyonların varlığında SelO'nun termal denatürasyon eğrileri ve ΔTm analizleri.(A) RT-PCR makinesinden dışa aktarılan numunelerin (200 μM ATP veya UTP varlığında 5 μM Escherichia coli SelO ve 2 mM iki değerlikli katyon, 5x SYPRO Orange) termal denatürasyon eğrilerinin ham verileri ve çizildi. SelO ATP-Mg, SelO, ATP ve MgCl2 içeren numuneleri temsil eder, SelO ATP-Mn, SelO, ATP ve MnCl2 içeren numuneleri temsil eder, SelO UTP-Mg, SelO, UTP ve MgCl2 içeren numuneleri temsil eder, SelO UTP-Mn, SelO, UTP ve MnCl2 içeren numuneleri temsil eder. Boya ve protein içermeyen kontrollerin düşük floresan sergilediğini unutmayın. Sonuçlar, üçlü kuyucuklardan elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder (n = 3). (B) En yüksek yoğunluğa çizilen ve Boltzmann sigmoidal denklemine uyan termal denatürasyon eğrileri. SelO'nun termal denatürasyonu UTP'den etkilenmese de, ATP (mor eğriler) varlığında termal denatürasyonda belirgin bir kayma gözlemledik. Sonuçlar, üçlü kuyucuklardan elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder (n = 3). (C) Şekil 3B'de temsil edilen verilerin Boltzmann sigmoidal uyumundan türetilen Tm değerlerini gösteren histogram. Sonuçlar, üçlü kuyucuklardan elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder (n = 3). SelO 39.2 °C ± 0.085, SelO ATP-Mg 43.3 °C ± 0.133, SelO ATP-Mn 50.9 °C ± 0.085, SelO UTP-MG 39.1 °C ± 0.056, SelO UTP-Mn 39.9 °C ± 0.087. (D) Erime sıcaklığındaki değişimi gösteren histogram ΔTm (Tm katkı maddesi - Tm tamponu). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1: Metallerin ve nükleotidlerin varlığında SelO'nun TSA'sı için örnek veriler. RT-PCR makinesinden dışa aktarılan ham verilerin elektronik tablosu ve protokol adımları 5.1 ve 5.2'de açıklandığı gibi maksimum RFU yoğunluğundan sonraki değerleri silmek için işlenen veriler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Termal Kayma Testi (TSA), kofaktörler ve inhibitörler dahil olmak üzere protein-ligand etkileşimlerini taramak için etkili bir yöntem olarak hizmet eder. Bu protokolde, psödokinaz SelO'nun nükleotidlere ve iki değerlikli katyonlara bağlanmasını ölçmek için TSA'yı kullandık. Bulgularımız, SelO'nun ATP ve Mg2 + / Mn2 + varlığında artan termal stabilite sergilediğini göstermektedir. Bu gözlem, E. coli, S. cerevisiae ve H. sapiens'ten SelO homologlarının, AMP'nin ATP'den protein substratlarının25,29 hidroksil yan zincirine transferini katalize ettiğini gösteren önceki raporlarla uyumludur. TSA, nükleotid bağlanması hakkında değerli bilgiler sağlasa da, in vivo substratı tanımlayamayabilir. Sadece substrat değil, diğer moleküller de bir proteinin termal stabilitesini etkileyebilir. Bir substratı doğru bir şekilde tanımlamak için, hücresel konsantrasyon ve bağlanma afinitesi gibi faktörler dikkate alınmalıdır. Bununla birlikte, TSA, termal stabilizasyonu bir okuma olarak kullanarak, küçük moleküllerin bağlanması gibi çok çeşitli koşulları taramak için mükemmel bir araçtır.

TSA'nın faydası, proteinlerin aktif veya düzenleyici bölgelerine küçük molekül bağlanmasının analiz edilmesindeki uygulamasının ötesine uzanır. TSA, proteini kristalografi deneylerine daha elverişli hale getiren stabilize edici koşullar sağlayarak proteinlerin biyofiziksel karakterizasyonuna önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Özellikle, TSA, PCR plakaları ve RT-PCR makineleri gibi yaygın olarak bulunan laboratuvar malzemelerini kullanarak basit kurulumu ve yüksek verim yetenekleri dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunar. Bu avantajlar, diğer tekniklerle mümkün olmayabilecek veya basit olmayabilecek çok sayıda koşulun test edilmesine izin verir. Birden fazla çalışma, protein kristalizasyonu için en uygun koşulları belirlemek için bir bileşik kütüphanesi ile rekombinant proteinlerin termal stabilitesini ölçmek için TSA'yı kullanmıştır19,33.

Erime eğrilerinin yanlış yorumlanmasını önlemek için uygun kontrollerin dahil edilmesi gereklidir, plakalardan veya katkı maddelerinden gelen otofloresan yaygın bir endişe kaynağıdır. TSA, otofloresan sergileyen veya SYPRO portakalının floresansını söndüren bileşikler için uygun olmayabilir. Potansiyel bir çözüm, 12'de açıklanan alternatif boyaları taramaktır. Burada özetlenen TSA protokolü, ilgilenilen diğer proteinler ve katkı maddeleri için kolayca uyarlanabilir. Katkı maddeleri, nükleotidler ve iki değerlikli katyonlarla olan protokolümüzde gösterildiği gibi, yalnızca suda çözünür bileşiklerle sınırlı değildir. Bunun yerine, katkı maddeleri, değişen pH, ligandlar veya DMSO8'de çözündürülen ilaçlar gibi çok çeşitli koşulları kapsayabilir. Ayrıca, ligandın protein ile ön inkübasyonu, boyadan kaynaklanan parazitleri ve artefaktları azaltarak daha tekrarlanabilir sonuçlar sağlayabilir. Lipitler ve deterjanlar gibi katkı maddeleri, SYPRO Orange ile etkileşimleri nedeniyle yüksek floresansa neden olabilir. Bir denatürasyon eğrisinin bir örneği, proteinin termal denatürasyonu üzerine floresanda önemli bir artış ile eşleştirilmiş düşük arka plan floresansını gösteren Şekil 3A'da gösterilmiştir. Optimum boya ve protein konsantrasyonu, replikalar arasında tutarlı bir floresan sinyalini korurken maksimum sinyal-gürültü oranını verecektir.

TSA, minimal bileşenleri ile basitlik avantajı sunar, böylece optimizasyon için değişken sayısını azaltır. Kritik adımlar, hem boyanın hem de proteinin optimal konsantrasyonlarının belirlenmesini içerir. TSA'nın saflaştırılmış, "iyi huylu" protein gerektirdiğine dikkat etmek önemlidir. Protein ve katkı maddesi, TSA'da kullanılan konsantrasyonlarda tamponda stabil olmalıdır. Topaklanmaya veya oligomerizasyona eğilimli proteinler veya koşullar, hatalı floresan okumalarına neden olabilir. Agrega edilmiş veya katlanmamış proteinler, denatürasyon üzerine sadece küçük bir artışla başlangıçta yüksek floresan gösterebilir. Proteinlerin oligomerizasyonu aynı zamanda çoklu geçiş durumlarına neden olabilir ve bu da analizikarmaşıklaştırır 10. Protein konsantrasyonu, agregasyonu önlemek için ince ayarlanabilir.

TSA, çok çeşitli tamponlar ve tuzlarla uyumludur ve protein ve katkı maddesi11 için stabilize edici koşulların optimizasyonuna izin verir. Protein ve katkı çözeltilerinin hacimleri, protein ve katkı maddesi konsantrasyonlarının sınırlamalarının üstesinden gelmek için ayarlanabilir. Örneğin, temsili sonuçlarda kullanılan 10x çözeltisi yerine 5x gibi daha düşük konsantrasyonlarda katkı maddesi kullanılabilir. Özellikle, testi gerçekleştirmek için gereken nispi protein ve katkı maddesi miktarı düşüktür, çünkü 384 oyuklu PCR plakaları toplam numunenin 10 μL'sine kadar düşük hacimleri barındırabilir.

TSA'nın güçlü yönleri göz önüne alındığında, psödokinazlar gibi az çalışılmış proteinleri araştırmak için idealdir. Psödoenzimler, yapısal olarak aktif enzimlere homolog olan katalitik olarak aktif olmayan proteinlerdir34. Son yapısal ve biyokimyasal çalışmalar, birkaç psödoenzimin aktif enzim olduğunu, çoğunun ise katalitik olmayan fonksiyonlara sahip olduğunu göstermiştir 35,36. Katalitik olarak inaktif olmalarına rağmen, psödoenzimler çeşitli hastalıklarda rol oynar ve iskele ve allosterik modülasyon dahil olmak üzere önemli roller oynarlar37. Bununla birlikte, birçok psödoenzimin etki mekanizması ve fonksiyonel önemi bilinmemektedir. Bazı psödoenzimlerin aktiviteleri, protein14'ün konformasyonel değişiklikleri ile ilişkili artan termal stabilite ile sonuçlanan ligand bağlanması ile düzenlenir. TSA'nın, fonksiyonel aktivite için en uygun ligandı belirlemek için ligandların psödoenzimlere bağlanmasını incelemek için değerli bir araç olduğunu öneriyoruz.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.S., W.W. Caruth, Jr. Biyomedikal Araştırma Burslusu, Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü (CPRIT) Araştırmacısı ve Charles ve Jane Pak Mineral Metabolizması Merkezi ve Klinik Araştırma Fakültesi Araştırmacısıdır. Bu çalışma NIH Grant K01DK123194 (A.S.), CPRIT Grant RR190106 (A.S.), Welch (I-2046-20200401) ve Welch (I-2046-20230405) tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Adenozin 5 & prime; - trifosfat disodyum tuzu hidratSigma AldrichA2383-10Gtemsili sonuçlar için kullanılır, ancak mikroplaka
taşıyıcı tertibatlı TSA Avanti J-15R'yiBeckman CoulterC19416
CFX Opus 384 Gerçek zamanlı PCR sistemiBio-Rad12011452
Sert Kabuklu 384 Kuyulu PCR Plakaları, ince duvarlı, etekli, şeffaf/beyazBio-RadHSP3805
Magnezyum KlorürSigma AldrichM8266-100Gtemsili sonuçlar için kullanılır ancak TSA
Manganez (II) klorür tetrahidratSigma AldrichM3634-500Gtemsili sonuçlar için kullanılır ancak performans için gerekli değildir TSA
Microseal 'B' PCR Plaka Sızdırmazlık Filmi, yapıştırıcı, optikBio-RadMSB1001
SYPRO Turuncu Protein Jel lekesiSigma AldrichS5692-500UL
Uridine 5 birinci sınıf; -trifosfat trisodyum tuzu hidratSigma AldrichU6625-100MGtemsili sonuçlar için kullanılır ancak TSA'yı ölçmek için gerekli değildir
, gerçekleştirmek için gerekli değildir

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dunham, I. Human genes: Time to follow the roads less traveled. PLoS Biol. 16 (9), e3000034(2018).
  2. Kustatscher, G., et al. An open invitation to the understudied proteins initiative. Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).
  3. Jones, M. M., et al. The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary. Rand Health Q. 4 (3), 19(2014).
  4. Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools. J Mol Biol. 435 (14), 168018(2023).
  5. Pace, C. N., Mcgrath, T. Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation. J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).
  6. Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
  7. Huynh, K., Partch, C. L. Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay. Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-28 (2015).
  8. Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
  9. Wu, T., et al. Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry. bioRxiv. , 10.1101/2023.01.23.525251 (2023).
  10. Wu, T., et al. Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments. STAR Protoc. 4 (4), 102688(2023).
  11. Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery. Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).
  12. Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization. Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).
  13. Lucet, I. S., Murphy, J. M. Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay. Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).
  14. Murphy, J. M., et al. A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties. Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).
  15. Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).
  16. Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).
  17. Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities. Sci Rep. 9 (1), 2650(2019).
  18. Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry. J Vis Exp. (91), e51809(2014).
  19. Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).
  20. Taujale, R., et al. Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome. Drug Discov Today. 29 (3), 103894(2024).
  21. Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome. Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).
  22. Kung, J. E., Jura, N. Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases. Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).
  23. Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life. PLoS One. 7 (2), e32138(2012).
  24. Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein. PLoS One. 9 (4), e95518(2014).
  25. Sreelatha, A., et al. Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase. Cell. 175 (3), 809-821 (2018).
  26. Frese, M., et al. The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279(2023).
  27. Mostert, D., et al. Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases. Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).
  28. Yang, Y., et al. The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation. Cell Rep. 32 (12), 108161(2020).
  29. Mukherjee, M., Sreelatha, A. Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog. Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).
  30. Kroeger, T., et al. Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay. PLoS One. 12 (5), e0177024(2017).
  31. Kotov, V., et al. In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot. Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).
  32. Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data. Protein Sci. 33 (6), e5022(2024).
  33. Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69, Pt 2 209-214 (2013).
  34. Ribeiro, A. J. M., et al. Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling. Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).
  35. Goldberg, T., Sreelatha, A. Emerging functions of pseudoenzymes. Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).
  36. Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases. IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).
  37. Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure. Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Thermal Shift AssaySelenoprotein OProtein AMPylationLigand BindingMelting TemperatureNucleotide BindingMetal BindingPseudokinase ActivityHigh Throughput ScreeningProtein Stability

Related Articles