Yöntem makalesi

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

1.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67141

⸱

12 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Florida Institute of Technology

Bu makalede

Özet

Burada, model nematod C. elegans'ın germ hattında eksprese edilen genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum raportörü kullanarak döllenme ve erken embriyogenez sırasında kalsiyumu görselleştirmek için protokoller ve araçlar sunuyoruz.

Özet

Kalsiyum, oositten embriyoya geçiş (OET) ve erken embriyogenez sırasında önemli bir sinyal molekülüdür. Hermafroditik nematod Caenorhabditis elegans, şeffaf olduğu ve 20 ° C'de her ~ 23 dakikada bir olgun oosit üreten düzenli bir gonada sahip olduğu için OET çalışması için birkaç benzersiz avantaj sağlar. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörü jGCaMP7'leri, canlı bir organizma içindeki döllenme anını floresan olarak gösterecek şekilde değiştirdik. Bu raportöre C. elegans'ta Döllenme Sırasında Kalsiyum için "CaFE" adını verdik. CaFE raporlayıcısı, tek kopya halinde güvenli bir liman lokusuna tasarlandı, fizyoloji veya doğurganlık üzerinde önemli bir etkisi olmadı ve döllenme üzerine sağlam bir sinyal üretti. Burada, CaFE raportörünü OET ve embriyogenezi diseksiyon için in vivo bir araç olarak kullanmak için bir dizi protokol sunulmaktadır. Solucanları senkronize etmek, RNAi yıkımının etkilerini incelemek, görüntüleme için solucanları monte etmek ve oositlerde ve embriyolarda kalsiyumu görselleştirmek için yöntemler içeriyoruz. Ek olarak, bu tür analizlere yardımcı olmak için ek solucan suşlarının oluşturulmasını sunuyoruz. CaFE raportörünün döllenme zamanlamasını görselleştirmek için faydasını göstererek, ipp-5'in RNAi tarafından hedeflendiğinde çift yumurtlamanın meydana geldiğini ve yalnızca ilk oositin hemen döllenmeye uğradığını bildiriyoruz. Ayrıca, erken embriyogenez sırasında tek hücreli kalsiyum geçişlerinin keşfi burada rapor edilmiştir ve bu da CaFE raportörünün erken gelişime devam ettiğini göstermektedir. Daha da önemlisi, solucanlardaki CaFE muhabiri, ders tabanlı lisans araştırması (CURE) laboratuvar sınıflarına dahil etmek için kullanılacak kadar basittir. CaFE raporlayıcısı, sıralı gonad ve solucanlarda RNAi'nin kolaylığı ile birleştiğinde, iç döllenmeyi ve erken embriyogenezi düzenlemek için gereken hücre-hücre dinamiklerinin araştırılmasını kolaylaştırır.

Giriş

Döllenme, yeni bir yaşam döngüsünün başlangıcını işaret eder, ancak döllenme anını kesin olarak tanımlamak zordur. Döllenmenin korunmuş bir özelliği, sperm füzyonundan hemen sonra oosit boyunca bir kalsiyum dalgasıdır1. Kalsiyum dalgasının doğası, frekans ve hız açısından türler arasında farklılık gösterse de, hemen hemen tüm organizmalar döllenmeden sonra hücre içi kalsiyumda geçici bir artış gösterir. Kalsiyum dalgası, polispermi, yumurta aktivasyonu ve diğer önemli hücresel olaylara karşı bir blokta kritik bir rol oynar2. Kalsiyum dalgası sperm füzyon bölgesinde başladığından, kalsiyum döllenme için bir belirteç görevi görür3.

Caenorhabditis elegans , erken gelişimi incelemek için ideal bir model organizmadır. Solucanlar, genetik olarak izlenebilir şeffaf hermafroditlerdir4. Döllenme çalışması için en önemlisi, C. elegans yetişkinleri kesin olarak düzenlenmiş bir gonad5 kullanarak sürekli olarak oosit üretirler. Aslında, oositler üretilen tek yeni hücrelerdir, çünkü somayetişkinlikte post-mitotik 6. Şekil 1 , gelişmekte olan oositlerin 2 simetrik U şeklinde tüpünden oluşan gonadı vurgulamaktadır. Spermatekaya (sperm için depolama organı) en yakın oosit -1 oosit olarak adlandırılır. Solucan gonadının bu montaj hattı tasarımı, genç yetişkinlerde20 ° C'de her ~ 23 dakikada bir spermatekaya olgun bir oosit yumurtlar 7. Yeni döllenmiş embriyo daha sonra tek bir vulvadan atılmadan önce ortak bir uterusa hareket eder.

C. elegans'ta döllenme sırasında kalsiyumu görselleştirmek için önceki teknikler, kalsiyuma duyarlı boyalarınmikroenjeksiyonuna dayanıyordu 3,8. Sperm-yumurta füzyonu üzerindeki kalsiyum dalgasını daha kolay görüntülemek için, jGCaMP7'lere dayalı genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum indikatörü, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) kullanılarak güvenli bir liman lokusuna tek kopya halinde yerleştirildi7,9. Muhabir, C. elegans'ta Döllenme Sırasında Kalsiyum için CaFE olarak adlandırıldı. Muhabir, fizyoloji veya doğurganlıkta önemli bir kusur göstermez.

Burada, C. elegans'ın oositleri ve embriyolarındaki kalsiyum dalgasının CaFE raportörü kullanılarak görselleştirilmesi için protokoller sunulmuştur. RNA interferansı (RNAi) ve mCherry gonad belirteçleri gibi solucan topluluğunda bulunan sayısız araçla birleştiğinde, CaFE raportörü iç döllenme olaylarının düzenlenmesi, özellikle döllenme yeterliliği ve döllenme zamanlaması ile ilgili araştırmaları kolaylaştırır. Ek olarak, CaFE raportörü erken gelişime devam eder ve embriyogenezi araştırmak için benzersiz bir araçtır.

Protokol

1. C. elegans bakımı

  1. Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakasının hazırlanması
    1. 3 g sodyum klorür (NaCl), 2.5 g Bacto-Peptone, 20 g Agar ve 1 L deiyonize suyu 4 L'lik bir şişede birleştirin (bkz. Otoklavlamadan önce şişenin üstünü alüminyum folyo ile örtün.
    2. Sıvı sterilizasyon döngüsü ayarlarını kullanarak sterilize etmek için otoklav. 30 dakika boyunca 121 ° C'ye ayarlanmış bir sterilizasyon döngüsü önerilir.
    3. Karışımın ~ 50 ° C'ye, oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 20 dakikaya soğumasına izin verin.
    4. 25 mL steril 1 M KH2PO4 (suda çözülmüş, pH = 6), 1 mL steril 1 M CaCl2 (suda çözülmüş), 1 mL steril 1 MMgMgS4 (suda çözülmüş) ve 1 mL 5 mg / mL kolesterol (% 100 etanol içinde çözülmüş), her eklemeden sonra hafifçe döndürün (bkz.
    5. Steril bir teknik kullanarak, daha kolay dökmek için karışımın bir kısmını 300 mL'lik steril bir behere aktarın. Plakanın altını kaplayacak şekilde ılık ortamı dökün.
      NOT: 60 mm x 15 mm steril Petri plakalarında plaka başına yaklaşık 10 mL ( Malzeme Tablosuna bakınız) 100 plaka üretecektir. Alternatif olarak, 35 mm x 10 mm steril Petri kapları kullanılabilir, burada plaka başına ~ 4 mL ~ 250 plaka üretecektir.
    6. Bakteri ile tohumlamadan önce NGM plakalarının en az 1 gün RT'de kurumasını bekleyin. Plakaları ileride kullanmak üzere 4 °C'de baş aşağı saklayın.
  2. OP50 bakteriyel çim hazırlama
    1. 5 L'lik bir şişede 5 g maya özü, 10 g Bacto-Tryptone, 5 g NaCl ve 1 L deiyonize suyu birleştirerek Luria Suyu (LB) yapın (Malzeme Tablosuna bakınız). Bir karıştırma plakası ve karıştırma çubuğu kullanarak eriyene kadar karıştırın.
    2. LB'yi şişelere ve sıvı sterilizasyon döngüsü ayarlarını kullanarak otoklava koyun. 30 dakika boyunca 121 ° C'ye ayarlanmış bir sterilizasyon döngüsü önerilir. Vidalı kapaklı bir kap kullanıyorsanız, otoklav döngüsü sırasında uygun havalandırma için vidalı kapağı çeyrek tur gevşetin.
    3. Kullanmadan önce et suyunun RT'ye soğumasını bekleyin.
    4. Steril teknik kullanarak, 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine 50 mL LB'yi OP50 bakteri ile aşılayın ve gece boyunca 37 °C'de çalkalama ile büyütün.
    5. Steril teknik kullanarak, 300 μL doymuş kültürü 60 mm x 15 mm'lik bir NGM plakasının merkezine aktarın. 35 mm x 10 mm plakalar için 100 μL doymuş kültür önerilir.
    6. OP50 bakteri lekesi artık sıvı olmayana kadar plakaların RT'de 1-3 gün kurumasına izin verin. Kullanmadan önce plakaların kuru olduğundan ve kirlenmediğinden emin olun. Plakaları ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın. Plakaları baş aşağı saklamak, plaka yüzeyindeki yoğuşmayı azaltır.
  3. Solucan toplama yapımı
    1. Gümüş bileziği solucan toplama sapının başına doğru gevşetin ( Malzeme Tablosuna bakın) dört bölümün ayrılması için hafifçe sökerek.
    2. Makas kullanarak 1,5 inç (başparmağın uzunluğu kadar) platin tel kesin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve dört bölümün ortasına yerleştirin; Saptan yaklaşık bir inç dışarı çıkacaktır.
    3. Bileziği sıkarken teli merkezde tutun; Dört bölüm ortada bir araya gelecek ve platin teli yerinde tutacaktır.
    4. Bir çift düz burunlu pense kullanarak teli dikkatlice şekillendirin. Bir gökkuşağı veya yay şekli, toplama için en iyi sonucu verme eğilimindedir.
    5. Düz burunlu pense ile tekrar tekrar sıkıştırarak telin ucunda yaklaşık 2-3 mm'lik bir "ayak" oluşturun. Solucanları toplamak için bu "ayağı" kullanın ve "ayağı" plakanın yüzeyine düz tutun.
      NOT: Çok sert sıkıştırmak platin teli kesecektir. Solucanların veya plakaların delinmesini önlemek için düz burunlu pense (veya eşdeğeri) kullanarak keskin kenarlar oluşturmaktan kaçının.
  4. Solucan işleme
    1. Solucan kazmasını bir kaleme benzer şekilde tutun ve teli parlak turuncu olana kadar% 95 etanol lambasının alevine yerleştirerek "ayağı" sterilize edin.
    2. Bir diseksiyon dürbününün tablasına bir OP50 tohumlu plaka yerleştirin ve kapağı çıkarın. Kazmanın "ayağını" bakteri çiminin bir alanına hafifçe dokundurun ve bakterileri tabanda toplamak için hafif bir kaydırma hareketi kullanın. Kazmaya yapışan bakteriler ("goo" olarak adlandırılır) solucanları toplamak için bir yapıştırıcı görevi görür.
    3. Bir solucan plakasını diseksiyon dürbünü aşamasına getirin ve kazmanın diğer yüzeylere temas etmesini önlerken kapağı çıkarın. Almak için penanın "ayağını" bir solucanın üzerine hızlı ve nazikçe dokundurun. Bu teknik, birden fazla solucanın aynı anda plakalar arasında hareket ettirilmesini sağlar.
    4. Solucanları aktarmak için penanın "ayağına" yeni bir plakanın tohumlanmamış kısmına hafifçe dokunun; Tipik olarak, bu, Bölüm 1.4.2'de bakterinin alındığı plakanın aynısıdır.
    5. Kontaminasyonu önlemek için kazmayı her bir plaka ve/veya solucan türü arasında sterilize edin ve sterilize ettikten sonra penanın soğumasını bekleyin.
      NOT: Bir solucanın sıcak penasına dokunmak hayvanı strese sokar veya öldürür. Solucan toplama, solucan transferi için "yapışkan" almak üzere bakteri çimine dokunduktan sonra soğur.
  5. Solucanları 20 ° C'de OP50 Escherichia coli bakterileri (adım 1.2) ile tohumlanmış NGM plakalarında (adım 1.1) tutun. Fizyolojiyi değiştirebilecek açlıktan kaçınmak için birkaç yetişkini bir solucan penası (adım 1.3-1.4) kullanarak birkaç yetişkini taze plakalara (60 mm x 15 mm) aktararak solucanları haftada 2-3 kez pasaj solucanları.
    NOT: C. elegans suşları ve OP50 bakterileri, Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden (CGC) temin edilebilir.

2. C. elegans gelişimsel senkronizasyon

  1. Zamanlanmış bir yumurtlama kullanarak solucanları yaşla senkronize edin (burada açıklanmıştır). Bir sınıf veya başka bir amaç için çok sayıda solucana ihtiyaç duyulursa, Golden ve ark.10'da açıklandığı gibi ağartıcı senkronizasyonu gerçekleştirin.
  2. Yetişkin solucanları bir platin tel çekme kullanarak yeni bir tohumlanmış OP50 plakasına aktarın (bölüm 1'de açıklanmıştır). Solucan sayısı deneysel ihtiyaç tarafından belirlenir. 1. Gün: solucanlar saatte yaklaşık 3 yumurta bırakır. Bu nedenle, 10 solucan 1 saatte yaklaşık 30 yumurta üretecektir. Tercihen, yetişkinliğin ilk gününde (1. gün) solucan kullanın.
  3. Yaklaşık 1 saat sonra, yetişkin solucanları plakadan çıkarın ve sadece yumurtaları bırakın.
    NOT: Yanlışlıkla geride bir solucan bırakmak yaygın bir hatadır. Kalan solucanlar yumurta bırakmaya ve senkronizasyonu bozmaya devam edecektir. Solucanlar, 20 ° C'de kuluçkaya yatırıldıklarında yumurtlandıktan yaklaşık 72 saat sonra 1. gün yetişkinlerine olgunlaşır.

3. Görüntüleme için solucanların montajı

  1. Döllenme olaylarını görüntülerken, görselleştirme fırsatlarını en üst düzeye çıkarmak için 1. gün yetişkinlerini kullanın.
    NOT: 1. Gün yetişkinlerinde, her ~ 23 dakikada bir oosit döllenir. Bununla birlikte, yumurtlama yaşla birlikte yavaşlar ve tipik bir hermafrodit 4. günden sonra yumurtlamayı bırakır.
  2. 100 mL suda 3 g agarozu karıştırarak suda% 3'lük bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Agaroz çözeltisini bir mikrodalga kullanarak agaroz tamamen eriyene kadar ısıtın. Katılaşmış bir çözeltiyi yeniden kullanmak için, tamamen eriyene kadar ısıtın. Birkaç kullanımdan sonra yeni bir çözüm oluşturun.
  3. Slaydın uzun ekseni boyunca tek bir laboratuvar bandı tabakasına sahip diğer iki mikroskop lamının arasına görüntüleme için boş bir mikroskop lamı yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Bant, agaroz ped için bir ara parça oluşturarak eşit dağılım ve düzgün bir genişlik sağlar. Üç süraydın, uzun kenarları birbirine değecek şekilde arka arkaya olduğundan emin olun: boş bir mikroskop lamını çevreleyen bantlı iki slayt.
    1. Isıtılmış% 3 agaroz çözeltisini (~ 100-150 μL) 1 mL'lik bir pipet kullanarak bantlanmış slaytlar arasındaki mikroskop lamının ortasına bırakın.
    2. Yeni bir mikroskop lamını agaroz damlacığının üzerine hızlı bir şekilde yerleştirin, yeni slaytın agaroz damlacığı ile slayta dik olduğundan ve bitişik bantlanmış slaytlar boyunca durduğundan emin olun.
    3. Slaytları yavaşça ayırın. Pedi yırtmaktan kaçının.
    4. Agaroz pedlerini her görüntüleme gününde taze olarak hazırlayın. Görüntülemeye hazırlanırken birden fazla ped yapmanız önerilir, ancak aynı anda birden fazla pedi açığa çıkarmaktan kaçının. Açıkta kalan pedler hızla kurur.
  4. 20 μL'lik bir pipet kullanarak, solucanları felç etmek için agaroz pedinin ortasına M9 tamponunda küçük bir damla (~ 7 μL) 1 mM levamisol ekleyin. 1 mM çalışma solüsyonunu yapmak için filtreyle sterilize edilmiş 100 mM stok levamisol çözeltisi kullanın.
    1. M9 tamponu yapmak için 6gNa2HPO4, 3 g KH2PO4, 0.5 g NaCl, 1 g NH4 Cl ve 1 L deiyonize suyu uygun bir kapta birleştirin (bkz.
    2. Sıvı sterilizasyon döngüsü ayarlarını kullanarak çözeltiyi otoklavlayın ve kullanmadan önce çözeltinin RT'ye soğumasını bekleyin. Vidalı kapaklı bir kap kullanıyorsanız, uygun havalandırma için vidalı kapağı yaklaşık çeyrek tur gevşetin. 30 dakika boyunca 121 ° C'ye ayarlanmış bir sterilizasyon döngüsü önerilir.
  5. En az 5 senkronize solucan seçin ve tüm solucanları aktarmak için "ayağınıza" levamisol damlacığına hafifçe dokunun. Slayt başına en az 5 solucan kullanın, çünkü vücudun yönü bağırsağın germ hattını gizlemesine ve oositteki kalsiyum dalgasının görüntülenmesini engellemesine neden olabilir.
    NOT: Solucanların hızlı bir şekilde aktarıldığından emin olun, çünkü agaroz ped üzerinde 5 dakikadan daha uzun süre bekletilirse levamisol buharlaşacaktır.
  6. Agaroz pedini bir lamel ile dikkatlice örtün. Solucanların yerini kontrol edin, çünkü lamel solucanların ilk yerleşimden dağılmasına neden olabilir. Mikroskop slaytını, solucan suşunun adı gibi uygun ayrıntılarla etiketleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Levamizole uzun süre maruz kalmak toksik olduğundan, solucanları monte ettikten sonra görüntülemenin mümkün olan en kısa sürede yapıldığından emin olun.

4. C. elegans'ta döllenme sırasında kalsiyumun görüntülenmesi  

  1. Tercih ettiğiniz mikroskopta 4x gibi düşük güçlü bir objektif kullanarak solucanları bulun. Parlak alan aydınlatması kullanın.
  2. Oositlerdeki kalsiyum dalgasını net bir şekilde görselleştirmek için en az 20x hava hedefi kullanın. 40x veya daha yüksek bir daldırma hedefi kullanın.
  3. Kullanılan sisteme bağlı olarak, uyarma yoğunluğu tipik olarak sabit bir değerdir. Floresan raportörlerin en iyi şekilde görselleştirilmesi için kazancı veya pozlama süresini ayarlayın.
    NOT: Sürekli yüksek yoğunluklu ışık numuneye zarar verir ve solucan sağlığına zararlıdır. İstenirse, sürekli GFP aydınlatmasını önlemek için bir gübreleme olayını beklerken lazeri kapatın. Bölüm 4.8 - 4.9'daki bir gübreleme olayının ayırt edici özelliklerine bakın.
  4. 488 nm GFP kanalının, CaFE raportör sinyalinin kolayca görülebileceği bir lazer gücüne ayarlandığından emin olun.
    1. Nikon ECLIPSE Ti2 lazer tarama konfokali için, CaFE raportörünü GFP kanalı için 0'luk bir lazer gücünde ve 75'lik bir kazançta tespit edin. Nikon ECLIPSE Ti2 lazer tarama konfokal için iğne deliği boyutu 30 μm'dir.
    2. Zyla kamerayı kullanarak konfokal Andor Dragonfly eğirme diski için, CaFE raportörünü GFP kanalı için 0'luk bir lazer gücünde tespit edin. Andor Dragonfly eğirme diski konfokal için iğne deliği boyutu 40 μm'dir.
    3. İncelenen her numune için lazer ayarlarını ve maruz kalma süresini ayarlayın.
  5. EAG28 (CaFE; PH-mCherry) veya EAG25 (CaFE; H2B-mCherry) suşu, kırmızı kanalın, GFP kanalına ek olarak mCherry sinyalinin kolayca görülebildiği bir lazer gücüne ayarlandığından emin olun.
    1. Nikon ECLIPSE Ti2 lazer tarama konfokali için, mCherry raportörünü RFP kanalı için 15 lazer gücünde ve 130 kazançta tespit edin.
    2. Zyla kamerayı kullanarak konfokal Andor Dragonfly eğirme diski için, mCherry muhabirini RFP kanalı için 0'luk bir lazer gücünde tespit edin.
    3. İncelenen her numune için lazer ayarlarını ve maruz kalma süresini ayarlayın.
  6. Kare hızını veya saniyedeki kare sayısını (fps) sistemin izin verdiği kadar hızlı ayarlayın.
    NOT: CaFE raportörü tipik olarak Nikon ECLIPSE Ti2 lazer tarama konfokal için yaklaşık 1 fps'de ve Zyla kamera ile Andor Dragonfly eğirme diski konfokal için 10 fps'de gözlemlenir.
  7. Zaman atlamalı veya zaman serisi protokolünü seçin ve istediğiniz ayarlara ayarlayın. Tekrarlar seçeneği '1' olarak ayarlanmış olarak 30 dakika veya daha kısa bir süre için hızlandırılmış görüntüler elde edin.
    NOT: Gübreleme olayı zaman aralığı tamamlanmadan önce gerçekleşirse, dosya boyutunu korumak için videoyu durdurun.
  8. Slayttaki solucanları bulun ve proksimal gonadın göründüğü bir solucan seçin. Bağırsak ve gonad, solucanın içinde birbirlerinin etrafında döner. Bu nedenle, bir gonad kolu genellikle bağırsak tarafından gizlenir ve döllenmenin görselleştirilmesini engeller. -1 oosit gizlenmişse, görselleştirme için başka bir solucan seçin. Seçilen solucanın görünür bir gonad koluna sahip olma olasılığını artırmak için, slayt başına en az 5 solucan monte edin. Döllenmeyi görselleştirmek için erken Gün 1 yetişkinlerini kullanın.
  9. Bir döllenme olayının yakın olup olmadığını belirlemek için solucanın gonad kollarındaki her -1 oositi inceleyin.
    NOT: Döllenmeden önce, mayotik olgunlaşma sırasında, -1 oositteki çekirdek oositin arkasına göç edecek ve nükleer zarf çözülecektir. Bu olaylar, CaFE raportörü kullanılarak hem Nomarksi hem de GFP kanallarında görülebilir ve bu tür olaylar, yumurtlamanın önümüzdeki ~ 10 dakika içinde gerçekleşeceğini gösterir.
  10. Nükleer zarf parçalanmasından sonra, en proksimal olan -1 oositin hücre iskeleti yeniden düzenlenecek, yuvarlak bir görünüm alacak ve -2 oositten ayrılacaktır. Bu noktada, yumurtlama hemen gerçekleşecektir. Bu olaylar gözlemlenirse videoyu hemen kaydetmeye başlayın. Geniş alan ayarında video çekin.
    NOT: Çekirdeğin hareketi veya oositin yuvarlanması 20 dakika sonra görünmüyorsa, bir yumurtlama olayının meydana gelmesi olası değildir. Farklı bir solucana odaklanın ve/veya yeni bir slayt hazırlayın.

5. C. elegans gübrelemesinde kalsiyum geçişlerinin kantitasyonu

  1. Nikon NIS Elements (burada açıklanmıştır) gibi mikroskop sistem yazılımını kullanarak döllenme videolarından kalsiyum geçişlerini ölçün. ImageJ/FIJI, görüntü analizi için de uygundur11.
  2. Döllenme videolarının floresansındaki değişimi ölçmek için aşağıdaki sinyal değerlerini kullanın: 0 zamanındaki sinyal, ilgilenilen çerçeveden gelen sinyal ve temel sinyal.
  3. -1 oositte meydana gelen ilk floresan patlamasını yakalayan zamanı ve kareyi belirleyin. Bu kareyi zaman 0 olarak tanımlayın.
  4. İlgilenilen çerçeveden sinyali almak için, ilgilenilen bölgeyi (ROI) aşağıdaki alanları kapsayacak şekilde çizin: döllenmeden önceki -1 oosit, spermateka ve rahimde yeni döllenmiş oosit. ROI'de görüntülenen sinyal F1 olarak adlandırılır.
    NOT: ROI'nin oosit tarafından trafiğe açılan tüm alanı kapsadığından emin olun. Yatırım getirisi, analiz edilen hızlandırılmış kaydın her karesinde aynı olmalıdır.
  5. Her karedeki arka plan sinyalini hesaplamak için adım 5.4'te tanımlanan ROI ile aynı boyutları kullanarak görüntünün floresan içermeyen boş bir alanını tanımlayın. Her kareden arka plan sinyalini çıkarın.
  6. Temel sinyali (F0) elde etmek için, çerçeveyi 15 zamanından önce en az 0 kare olarak bulun. Adım 5.4'teki ile aynı ROI'yi kullanarak, 0 zamanına kadar her karedeki sinyali not edin. Temel sinyali hesaplamak için başlangıç karesinden 0 zamanına kadar sinyallerin ortalamasını alın (arka plan çıkarma ile).
  7. Aşağıdaki formülü kullanarak floresanstaki (ΔF) değişikliği hesaplayın: figure-protocol-1. F1 , her karede arka plan sinyali olmadan ROI'deki sinyal olarak tanımlanır. F0, bölüm 5.6'da hesaplandığı gibi, 0 zamanından önceki ≥15 karenin ortalama temel floresan sinyalidir.
  8. 2 kare arasındaki floresan değişimini çıkararak ve zamana bölerek kareler arasındaki değişim oranını belirleyin.

6. C. elegans'ta RNAi

  1. RNAi plakalarını hazırlayın
    1. Plakaları adım 1.1'e göre hazırlayın ve adım 6.1.4'te RNAi yoluyla gen yıkımına izin vermek için aşağıdaki ek reaktifleri ekleyin.
    2. Ortamda 1 mM IPTG'lik bir nihai konsantrasyon için 1 mL 1 M steril filtreli izopropil β-d-1-tiyokalaktoptiranosid (IPTG) (deiyonize suda çözülmüş) ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
    3. Ortamda 100 μg/mL ampisilin'lik bir nihai konsantrasyon için 1 mL 100 mg / mL steril filtrelenmiş ampisilin (deiyonize suda çözülmüş) ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Alternatif olarak, 40 μg / mL karbenisilin12 kullanın.
    4. Plakaları 1.1.4 - 1.1.5 adımlarında açıklandığı gibi karıştırmak ve dökmek için nazikçe ama iyice döndürün.
  2. RNAi doymuş kültürün hazırlanması
    1. İhtiyaç duyulan tohumlanmış RNAi plakalarının sayısını 60 mm x 15 mm plakalar kullanıldığında 300 μL veya 35 mm x 10 mm plakalar kullanıldığında 100 μL ile çarparak doymuş kültür miktarını hesaplayın.
    2. Steril bir teknik kullanarak, doymuş olana kadar gece boyunca 37 ° C'de 100 μg / mL ampisilin içeren LB'de (adım 1.2.1-1.2.3'te açıklanmıştır) istenen RNAi bakterilerini büyütün. RNAi'nin çalıştığını doğrulamak için negatif kontrol olarak L4440 boş vektörünü içeren bir bakteri suşu ve RNAi pozitif kontrol (örneğin, yumurta-5) içeren bir bakteri suşu ekleyin. Ek olarak, stok LB'de kontaminasyon olmadığını doğrulamak için yalnızca LB içeren bir "boş" koşul ekleyin.
    3. dsRNA ekspresyonunun indüksiyonu için doymuş gece kültürüne 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona steril filtrelenmiş IPTG ekleyin ve tohumlamadan önce 37 ° C'de en az 2 saat 30 dakika inkübe edin. Alternatif olarak, IPTG ile indüklemeden önce doymuş gece kültürünü log fazından geri seyreltin.
      NOT: IPTG, optimum dsRNA ekspresyonu için hem plakalara hem de doymuş kültüre dahil edilmiştir.
    4. Steril teknik kullanarak, indüklenen kültürün 300 μL'sini 60 mm x 15 mm'lik bir RNAi plakasının (katılaşmış) merkezine aktarın. Alternatif olarak, 35 mm x 10 mm'lik bir plaka için 100 μL doymuş kültür kullanın.
    5. RNAi bakteri lekesi artık sıvı olmayana kadar plakaların 1-3 gün RT'de kurumasına izin verin. Kullanmadan önce plakaların kuru olduğundan ve kirlenmediğinden emin olun. Plakaları ileride kullanmak üzere 4 °C'de baş aşağı saklayın.
      NOT: RNAi etkinliği zamanla azaldığından, optimum yıkım için mümkün olan en kısa sürede RNAi plakalarını kullanın. >1 aylıksa atın.
  3. Bölüm 2'de açıklandığı gibi, solucanları RNAi plakalarına senkronize edin.
    1. Gelişimsel gecikmeler için yumurta yumurtlama senkronizasyonundan 1-2 gün sonra solucanları kontrol edin.
    2. Bazı RNAi, yıkım yumurtlamada başladığında gelişimsel kusurlara neden olabilir. Gerekirse, solucanları L3 gibi daha sonraki bir aşamada RNAi plakalarına yerleştirin.
  4. Bölüm 3 ve 4'te açıklandığı gibi, solucanları monte edin ve GFP floresansını tespit etmek için donatılmış herhangi bir mikroskop sistemini kullanarak görüntülemeye hazırlanın.

7. C. elegans'ta erken embriyogenez sırasında kalsiyumun görüntülenmesi

  1. Solucanları bölüm 2'de açıklandığı gibi senkronize edin. CaFE raporlayıcısını ve plazma zarı sınırını vurgulayan bir pleckstrin-homoloji alanı-mCherry işaretleyicisini birleştiren EAG28 suşunu kullanın. Alternatif olarak, döllenmiş embriyoları ex utero görselleştirmek için, embriyoları serbest bırakmak için steril bir şırınga iğnesi kullanarak rahim boyunca solucanı nazikçe kesin.
  2. Solucanları veya embriyoları bölüm 3'te açıklandığı gibi görüntüleme için hazırlayın ve görüntüleme parametrelerini ayarlamak için bölüm 4'te açıklanan talimatların aynısını izleyin.
  3. Embriyoları veya bırakılmış bir yumurtayı görselleştirmek için ilgilenilen alanı solucanın rahmi üzerinde ortalayın.
    1. Rahimdeki embriyolar için, uterusun bağırsağın arkasında olmadığından, uterusun kalabalık olmadığından ve embriyodaki tek tek hücrelerin odak düzleminde net olduğundan emin olun.
    2. Ex utero yumurtalar için, hücrelerin aşamalarının solucan yaşam döngüsünün virgül aşamasını geçmediğinden emin olun.
  4. Zaman atlamalı veya zaman serisi protokolünü seçin ve istediğiniz ayarlara ayarlayın.
    1. Embriyo kalsiyum geçişlerinin en iyi şekilde görselleştirilmesi için, uzun süreli filmler için zaman ayarlarını artırın. Lazere sürekli maruz kalmanın embriyoya uzun süre zarar vereceğini unutmayın.
  5. İstenilen hücre aşamasındaki embriyolardaki hücrelere odaklanarak videolar veya görüntüler yakalayın.
  6. Görüntüleme için 40x veya daha büyük bir daldırma hedefi kullanın, ancak geçici akımlar 20x hava hedefi kullanılarak kolayca algılanabilir.

Sonuçlar

Bu yazıda özetlenen protokoller kullanılarak, döllenme ve embriyogenezde kalsiyum sinyalizasyonunun dinamik paternleri C. elegans'ta gözlenmiştir.

CaFE raportörünü içeren solucanlarda tipik bir döllenme dizisi Şekil 2'de gösterilmektedir. Analizi kolaylaştırmak için, CaFE raportörünü bir pleckstrin homoloji alanı (PH-mCherry) transgeni13 ile birleştiren EAG28 suşu kullanıldı. PH-mCherry markörü plazma zarına lokalize olur ve özellikle gonad kolundaki hücre sınırlarının daha kolay görselleştirilmesini sağlar. EAG28 suşu, CaFE raportörünü içeren EAG16 suşunun, OD70 PH-mCherry raportör suşu13 ile çaprazlanmasıyla oluşturuldu. C. elegans'ta yumurtlama ve döllenme aynı anda gerçekleşir. Döllenme zamanı 0, yumurtlayan oositte bir floresan sinyalinin tespit edildiği ilk çerçeve olarak kabul edilir (Şekil 2). Oositin ön kenarı, sperm7 için depolama organı olan spermatheca'ya girer girmez sperm füzyon bölgesinde parlak bir floresan patlaması meydana gelir. Sinyal, yumurtlama tamamlanmadan önce görünür. Kalsiyum dalgası iki fazlıdır, hızlı bir başlangıç patlaması ve ardından giriş noktasından karşı kutba doğru bir floresan dalgası gelir. Oositin tamamı <30 s'de floresan hale gelir.

CaFE raportörünün tek bir kopya halinde olduğunu ve bu nedenle sinyalin diğer transgenler kadar parlak olmadığını unutmayın. Yumurtlama sırasında Z-stack hızlandırılmış çekim, dönen bir disk konfokal mevcut ve optimize edilmiş olmadıkça önerilmez. Z yığını görüntüleri, gonad morfolojisindeki 3B değişiklikleri yakalamak için bir filmden önce veya sonra elde edilebilir. Buradaki görüntüler konfokal bir mikroskopla çekilmiş olsa da, geçici olaylar, konfokalden daha yaygın ve uygun fiyatlı olan geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak da gözlemlenmiştir. Lazer taramalı bir konfokal kullanarak, kare hızı yaklaşık 1 fps'dir. Dönen bir disk konfokal kullanarak, kare hızı 10 fps veya daha hızlıdır. CaFE raportörünün arka plan sinyali, gonad kolundaki olgunlaşan oositleri aydınlatmak için yeterlidir. Döllenme üzerine, GFP sinyal yoğunluğunda tipik olarak 1,5-2 kat artış gözlenir.

Kantitasyon için çeşitli alternatif yöntemler mevcuttur. Örneğin, Oxford Instruments (Andor Dragonfly eğirme diski konfokal mikroskobu ile aynı ana şirket) tarafından oluşturulan Imaris görüntü analiz yazılımı, daha büyük bir yatırım getirisi yerine her karedeki sinyali yalnızca geçiş yapan oositten ölçme yeteneğine sahiptir. Ancak, Imaris yazılımı ücretsiz değildir. Ek olarak, oositteki kalsiyum dalgalarını ölçmek için ayrıntılı bir görüntü analizi stratejisi Takayama, Fujita ve Onami tarafından mükemmel bir şekilde ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve ücretsiz olarak kullanılabilen ImageJ'yi kullanır14. Alternatif olarak, tek bir oosit boyunca floresan sinyal dalgasını göstermek için kullanılan kimografiler, burada açıklanandan daha kapsamlı görüntü manipülasyonu gerektirir, ancak Takayama ve Onami3'te açıklanmıştır.

C. elegans'ın belirgin bir avantajı, endojen RNAi'yi tetiklemek için dsRNA eksprese eden solucan bakterilerini besleyerek hemen hemen her genin ekspresyonunu yıkma yeteneğidir15,16. Optimal dsRNA ekspresyonu için, hem RNAi plakaları hem de doymuş RNAi kültürü IPTG içerir. DsRNA, ilgilenilen genin yan promotörlerle ifade edilmesiyle üretilir. Burada, 16.256 bakteri suşu kullanarak solucan genomunun çoğunu hedefleyen Ahringer kütüphanesini kullandık17. Alternatif olarak, Vidal laboratuvarı tarafından Gateway sistemi kullanılarak ~11.000 RNAi klonundan oluşan bir ORFeome oluşturuldu ve Horizon Discovery18 aracılığıyla satın alınabilir.

CaFE raportörünün RNAi ile kombinasyon halinde faydasını göstermek için erken yumurtlamayı inceledik. İpp-5'teki kısmi bir delesyon, hem -1 oosit hem de -2 oositin aynı yumurtlama19 sırasında spermatekaya girdiği bir çift yumurtlama olayına neden olur. IPP-5, IP3'e etki eden ve IP3 ikinci haberci seviyelerini etkili bir şekilde azaltan bir fosfatazdır. IPP-5'in RNAi yıkımının, mutanta benzer bir çift yumurtlama fenotipini ortaya çıkardığını bulduk.

IPP-5 RNAi yıkımının neden olduğu çift yumurtlama sırasında CaFE raportörünün analizi, OET'in yeni yönlerini ortaya çıkardı. İlk olarak, spermatekaya girişte hemen önce -1 oositte bir kalsiyum sinyali gözlendi, ancak sondaki -2 oositte gözlenmedi (Şekil 3). 2 oosit yumurtlanmasına rağmen, -1 oosit hala uygun olgunlaşma belirtileri, özellikle de nükleer zarfın parçalanması (NEBD) gösteren tek oosittir. Bu veriler, -2 oositin sperm varlığında olmasına rağmen, henüz düzgün bir şekilde olgunlaşmadığı için döllenmeye yetkin olmadığını göstermektedir. İkincisi, -2 oosit, tipik olarak oosit uterus için spermatekadan çıktığında gecikmiş bir kalsiyum dalgası sergiler. Oosit olgunlaşması normalde yumurtlama için bir ön koşul olmasına rağmen, bu veriler oositin olgunlaşmasının ve döllenme yetkinliğinin yumurtlamadan sonra da gerçekleşebileceğini düşündürmektedir. IPP-5 yıkımı sırasında gecikmiş kalsiyum dalgasının görselleştirilmesi, CaFE raportörünün gübreleme yeterliliğini ve zamanlamasını sorgulamak için avantajlarını vurgular.

Ayrıca, CaFE raportörünün yumurtlayan yumurtalarda tespit edilebilir olduğunu ve C. elegans'ta erken embriyogenez sırasında tek hücreli kalsiyum geçişlerini ortaya çıkardığını keşfettik. Senkronize Gün 1 yetişkin EAG28'den (CaFE; PH-mCherry) solucanları, Zyla kamerası kullanılarak Andor Dragonfly eğirme diski konfokal olarak bölüm 1-5'teki protokoller kullanılarak görüntülendi (Şekil 4). Kalsiyum geçişleri tek hücrelerle sınırlıdır ve tamamlanması döllenme kalsiyum dalgasından daha az zaman alır (~ 9 s, n = 11). Bununla birlikte, embriyogenez sırasındaki kalsiyum dalgası bifazik görünmemektedir. 8 hücreli aşamadan önce kalsiyum geçişleri gözlenmedi. Özellikle, kalsiyum, insanlar ve Xenopus20,21,22 dahil olmak üzere diğer birçok organizmada görüldüğü gibi, C. elegans'ta bölünme karıklığına lokalize olmaz. Tek hücreli kalsiyum geçişleri, gastrulasyondan iyi bir şekilde sonra (döllenmeden ~ 200 dakika sonra) ve bırakılan yumurtalarda gözlendi. Tek bir embriyo, zaman içinde, ancak farklı hücrelerde ve tipik olarak bir seferde bir hücrede birden fazla kalsiyum geçişi gösterir. Lazer stimülasyonuna sürekli maruz kalmanın embriyolara zarar vereceğini unutmayın. Daha düşük LED/lazer gücü veya süreksiz maruz kalma önerilir. Bununla birlikte, kalsiyum dalgaları ~ 9 s'de nispeten kısa olduğundan, LED / lazer stimülasyon olayları arasında 2 s'den daha yavaş olmasını önermiyoruz.

figure-results-1
Resim 1: C. elegans gonad kolu. EAG25 solucan suşundan bir gonad kolunun görüntüsü, CaFE raportörü GFP'yi (yeşil) ve germ hattındaki çekirdekleri vurgulayan histon 2B-mCherry işaretleyicisini (kırmızı) gösteriyor. Proksimal oosit, spermin depolandığı spermatekadan hemen önce -1 ile gösterilir (ok). Spermatekaya en yakın ancak rahim içinde yer alan embriyo en yeni çıkan embriyodur. Görüntü, Nikon ECLIPSE Ti2 lazer taramalı konfokal kullanılarak çekilmiştir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Döllenme sırasında kalsiyum dalgasının görselleştirilmesi. EAG28 solucan suşunda döllenme sırasında hücre içi kalsiyumu yansıtan floresan zaman serisi görüntüleri. EAG28 suşu, hem CaFE raportörünü (yeşil) hem de plazma zarlarını vurgulayan bir pleckstrin-homoloji alanı-mCherry füzyonunu (sarı) içerir. 0 zamanı, oositteki floresan sinyalinde net bir artışı gösteren ilk kareyi gösterir. Zaman 24.4 s, tüm oosit floresansını gösteren ilk kareyi yansıtır. Zaman serisi görüntüleri, bir Zyla kamera ile Andor Dragonfly eğirme diski konfokal kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Bir ipp-5 RNAi ile indüklenen çift yumurtlama olayı sırasında kalsiyum dalgaları. ipp-5 RNAi'ye maruz kalan bir EAG16 suşunda (GFP yeşilinde CaFE) -1 oosit ve -2 oositin sıralı kalsiyum dalgalarının hızlandırılmış görüntüleri. -40.0 s çerçevesi, -1 oosit (-1), -2 oosit (-2), spermateka (*) ve +1 embriyo (+1) için etiketler içerir. Zaman 0 s, -1 oositin kalsiyum dalgasının floresansındaki ilk artışı gösterir. Zaman 4.5 s, -1 oositte karşı kutba doğru yayılan kalsiyum dalgasını gösterir. Zaman 70.5 s, başlangıç GFP sinyalinde -2 oosit ile birlikte -1 oositte tüm hücre floresansını gösterir; Her iki oosit de spermatheca'da bulunur. Döllenmiş -1 oosit ve döllenmemiş -2 oosit 158.3 s'de uterusa girer. 219.3 s'de, -2 oosit geç bir floresan kalsiyum dalgası gösterir. Görüntüler, bir Zyla kamera ile Andor Dragonfly eğirme diski konfokal kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu = 30 μM Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Erken embriyogenezde tek hücreli kalsiyum geçişleri. (A) Embriyolar utero ve (B) ex utero (yumurtlayan yumurta) embriyogenez sırasında tek bir hücrede floresan sinyali gösterdi. Görüntüler, bir Zyla kamera ile Andor Dragonfly eğirme diski konfokal kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Sağlam bir protokole sahip basit bir araç, zor bilimsel soruların üstesinden gelmek için güçlü bir kombinasyondur. Burada, döllenme için kolayca tespit edilebilir bir vekil olarak kalsiyumun görselleştirilmesi için yöntemler CaFE raportörü kullanılarak sunulmaktadır. Aynı raportör erken embriyogenezde de devam eder ve aynı zamanda kalsiyum geçişlerinin gelişime daha fazla görselleştirilmesine izin verir. Kalsiyum sinyali, özellikle gelişimsel biyoloji için hücresel fonksiyondaki büyük değişimleri sınırlayan kritik bir ikinci haberci olarak hizmet eder. Oositte, kalsiyum dalgasının ilk patlama aşaması sadece döllenme zamanını değil, aynı zamanda sperm füzyon bölgesinide işaretler 3. C. elegans'ta, AP ekseni ayrıca sperm füzyon bölgesi23 tarafından da belirlenir. Bu nedenle, oositlerde ve embriyolarda kalsiyumu görselleştirme yeteneği, hücre ve gelişim biyolojisinin merkezinde yer alan karmaşık soruların araştırılmasına izin verir.

Burada CaFE raportörü ile açıklanan yöntem, nematoda yeni başlayanlar için yeterince basit olmalıdır. C. elegans oositlerindeki kalsiyum dalgalarını tespit etmek için önceki yöntemler boya enjeksiyonunadayanıyordu 3,8,14. Bu çalışmalar önemli ve aydınlatıcı olsa da, boya enjeksiyonu emek yoğundur ve enjeksiyon ekipmanı her laboratuvarda mevcut değildir.

Burada sunulan protokoller sağlıklı solucanlar için optimize edilmiştir. Başarı şansını en üst düzeye çıkarmak için, solucan ortamında veya solucanların beslendiği bakteri çimlerinde kontaminasyon olmadığından emin olun. Solucanları yumurtlamayı ve döllenmeyi etkileyeceği için sıcaklık gibi stres koşullarına maruz bırakmayın. Ek olarak, etkinlik zamanla azaldıkça RNAi etkinliği için kontroller her deneye dahil edilmelidir. Embriyo oluşturan yumurta-5 gibi RNAi etkinliği için pozitif bir kontrol kullanın, ancak yumurta kabuğu oluşumu tehlikeye girdiği için canlı bir döl yoktur24. Ayrıca, görüntü yakalama parametreleri her mikroskopi sistemi için optimize edilmelidir. Spesifikasyonlarımız burada referans olarak yer almaktadır, ancak sapmalar beklenebilir. Bu sistem, sitoplazmik kalsiyumu döllenme için bir vekil olarak kolayca tespit etse de, mutlaka iyi niyetli bir sperm-oosit füzyon olayını temsil etmez.

Solucan topluluğu içinde serbestçe dağıtılan çok çeşitli araçlar ve mutantlar, CaFE muhabirinin faydasını artırır. Raportör solucan genomuna entegre edilmiştir ve diğer mutant veya raportör C. elegans suşlarına kolayca çaprazlanır25. Burada bildirilen, çekirdekleri görselleştirmek için bir histon H2B-mCherry markörü ile CaFE raportörünü ifade eden EAG25'in oluşturulmasıdır (Şekil 1) ve EAG28'i hem CaFE raportörü hem de hücre çevresini vurgulayan bir pleckstrin-homoloji alanı-mCherry markörü ile ifade eder (Şekil 2)13,26. Her iki suş da germ hattındaki hücrelerin görselleştirilmesine ve embriyogenez sırasında yardımcı olur. Ayrıca, RNAi'nin tesisi
C. elegans, CaFE raportörü ile birlikte kullanıldığında, gübreleme yeterliliği hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarmıştır. Şekil 3'te ipp-5 RNAi knockdown ile indüklenen çift yumurtlamada gösterildiği gibi, sperm ve yumurtlanmış bir oosit varlığı bir döllenme olayını uyarmak için yetersizdir.

Bu sonuçlar, oositin döllenmesine izin veren başka bir sinyalin veya bir inhibitörün yokluğunun var olması gerektiğini göstermektedir. Erken yumurtlanan oosit, oosit uterusa girdiğinde gecikmiş bir kalsiyum geçici gösterir. Bu geç kalsiyum dalgası, erken yumurtlanan -2 oositin zamanla döllenme yetkinliği geliştirebileceğini düşündürmektedir. Özellikle hücre-hücre sinyalizasyonu ve regülasyonu ile ilgili olarak döllenme zamanlaması ile ilgili çalışmaların, CaFE raportörünün kullanılmasıyla destekleneceğini tahmin ediyoruz. Ek olarak, CaFE raportörü embriyogenez boyunca devam eder ve tek hücreli kalsiyum geçişlerini görüntüler. Bu embriyonik kalsiyum sinyali, zebra balığı gelişiminin ilk 24 saati içinde de rapor edildi27. Kalsiyum geçişlerinin rolü bilinmemektedir, ancak varlığı, gelişim sırasında henüz keşfedilmemiş bir hücre sinyalleme olayını düşündürmektedir. Özellikle, yeni döllenmiş zigotlarda kalsiyum geçişleri gözlenmemiştir. Bu nedenle, kalsiyum, Xenopus ve insanlar da dahil olmak üzere diğer birçok organizmada belgelendiği gibi bölünme oluğuna lokalize olmaz 20,21,22.

Daha da önemlisi, CaFE muhabiri, minimum eğitime sahip lisans öğrencileri tarafından kullanılabilecek kadar kolaydır. Biyoloji öğrencileri için burada açıklanan suşlar ve protokollerle 1 kredilik bir CURE (ders tabanlı lisans araştırma deneyimi) laboratuvarı tasarladık ve yürüttük. Bir dönem boyunca, sınıf haftada bir kez 3 saat veya haftada iki kez 1 saat 30 dakika boyunca bir araya geldi. Öğrencilere kendi başlarına veya 2 kişilik gruplar halinde çalışma seçeneği verildi. Her öğrenci / çift, küratörlüğünde bir listeden çalışmak için farklı bir gen seçti. EAG28 suşunda seçtikleri gene karşı RNAi gerçekleştirdiler ve solucanları doğurganlık, döllenme ve / veya gonad morfolojisi üzerindeki etkiler açısından incelediler. Elde ettikleri sonuçlara ve birincil literatürü kullanarak yaptıkları arka plan okumalarına dayanarak, öğrenciler sonraki deneylerde test edebilecekleri hipotezler geliştirdiler. Bu yinelemeli tasarım, öğrenci katılımını artırmak için kritik öneme sahipti28. Öğrenciler gerçek bir araştırma deneyimi elde ettiler ve model organizmalar, genetik ekranlar ve floresan mikroskobu konusunda beceriler kazandılar. CaFE muhabirinin kullanım kolaylığı göz önüne alındığında, araştırma deneyimi olmayan öğrenciler başarılı olabildiler. Daha sonra, öğrenciler ezici bir çoğunlukla geleneksel laboratuvar sınıfları yerine CURE formatını tercih ettiklerini ifade ettiler ve birçok öğrenci araştırmaya devam etme arzusunu dile getirdi. Birlikte ele alındığında, bu araçlar ve protokoller hem eğitime hem de erken gelişim süreçlerine yönelik araştırmalara yardımcı olur.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir rakip veya finansal çıkar beyan etmezler.

Teşekkürler

KSKG, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü'nden (R15HD111986) bir hibe ile finanse edildi. Bazı suşlar, NIH Araştırma Altyapısı Programları Ofisi (P40 OD4010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlandı. WormBase'e teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgarFisher ScientificDF0140-07-42 kg; Toz, pullardan daha kolay çözünür
AgaroseMidSciBE-A125500 g
Alkol lambasıFisher ScientificS13475%95 etanol ile kullanın
Amonyum klorür (NH4Cl)Fisher ScientificAAA1500030250 g
AmpisilinFisher ScientificBP1760-55 g
AMSCO 400 Serisi Küçük Buharlı SterilizatörSteris Sağlık HizmetleriN/A
Bacto-peptoneFisher ScientificBP1420-500500 g
Bacto-triptonFisher ScientificDF0123-17-3500 g
Kalsiyum klorür (CaCl2)Fisher ScientificC69-500500 g
KolesterolThermo ScientificA11470.1850 g
Dragonfly 200 eğirme diski konfokalOxford Instruments AndorN/ALeica mikroskobu ile kullanılır
Fisherbrand Superfrost Sitojenik Mikroskop SlaytlarıFisher Scientific22-035-900Paket başına 144 slayt
Düz Burunlu Pense, Pürüzsüz ÇeneHome Depot305530604Pensenin düz çeneli olduğundan emin olun
İzopropil β- d-1-tiyokalaktopiranosit ( IPTG)Fisher ScientificBP1755-1010 g; dioksan içermeyen
Laboratuvar bandıFisher Scientific15-901-10RMikroskop slaytlarını bantlamak için 0,5 inç bant kullanılır
LevamizolFisher ScientificAC18787010010 g
Magnezyum sülfat (MgSO4)Fisher ScientificM63-500500 g
Mikroskop kapak camıFisher Scientific125410161 oz paket
Nikon ECLIPSE Ti2 lazer tarama konfokalNikonN/A
Nikon NIS Elements yazılımıNikonN/AKonfokal
OP50 Escherichia coliCaenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)OP50
Platin TelTriTechPT-9010
Potasyum fosfat dibazik (K2HPO4)Fisher ScientificP288-500500 g
Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)Fisher ScientificAA1159436500 g
Sodyum klorür (NaCl)Fisher ScientificS271-500500 g
Sodyum fosfat dibazik heptahidrat (Na2HPO4)Fisher ScientificS471-33 kg
Stereo mikroskopLeicaKL300 LED
Steril Petri çanak (35 mm x 10 mm)CellTreat229638Kutu başına 960 Petri kabı
Steril Petri kabı (60 mm x 15 mm)CellTreat229665Kutu başına 500 Petri kabı
Suş EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1uCaenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)EAG16Kim Guisbert Lab
Suş EAG25 spn-4p::jGCaMP7s:: PASTA-1U; ujIs113 II.Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)EAG25Kim Guisbert Lab
Suşu EAG28 tarafından oluşturuldu spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)EAG28Kim Guisbert Lab
Suşu tarafından oluşturuldu JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p:: his-24::mKiraz::let-858 3'UTR + unc-119(+)]Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)JIM113Oluşturan E. Preston - Murray Lab
Suşu OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)OD70Oluşturan Audhya/Oegema - Greenstein Lab
Tritech Solucan Çekme KoluTriTechTWPH1
Maya özüIBI ScientificIB49160500 g

Kaynaklar

  1. Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. Modulators of calcium signalling at fertilization. Open Biol. 10 (7), 200118(2020).
  2. McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs. Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).
  3. Takayama, J., Onami, S. The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte. Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).
  4. Yamamoto, I., Kosinski, M. E., Greenstein, D. Start me up: Cell signaling and the journey from oocyte to embryo in C. elegans. Dev Dyn. 235 (3), 571-585 (2006).
  5. Hubbard, E. J. A., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: A test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218 (1), 2-22 (2000).
  6. Korta, D. Z., Hubbard, E. J. A. Soma-germline interactions that influence germline proliferation in Caenorhabditis elegans. Dev Dyn. 239 (5), 1449-1459 (2010).
  7. Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator. Biol Open. 12 (9), 059832(2023).
  8. Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. Calcium dynamics during fertilization in C. elegans. BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).
  9. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  10. Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (161), e61030(2020).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Kamath, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  13. Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans. Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).
  14. Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans. Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).
  15. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  16. Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. RNA Interference in Caenorhabditis elegans. Curr Protoc Mol Biol. 109, 1-30 (2015).
  17. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  18. Reboul, J., et al. elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet. 34 (1), 35-41 (2003).
  19. Bui, Y. K., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans inositol 5-phosphatase homolog negatively regulates inositol 1,4,5-triphosphate signaling in ovulation. Mol Biol Cell. 13 (5), 1641-1651 (2002).
  20. Muto, A., Kume, S., Inoue, T., Okano, H., Mikoshiba, K. Calcium waves along the cleavage furrows in cleavage-stage Xenopus embryos and its inhibition by heparin. J Cell Biol. 135 (1), 181-190 (1996).
  21. Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease. Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).
  22. Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development. Biomolecules. 14 (1), 138(2024).
  23. Goldstein, B., Hird, S. N. Specification of the anteroposterior axis in Caenorhabditis elegans. Development. 122 (5), 1467-1474 (1996).
  24. Johnston, W. L., Dennis, J. W. The eggshell in the C. elegans oocyte-to-embryo transition. Genesis. 50 (4), 333-349 (2012).
  25. Stevenson, Z. C., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Jamison, B., Phillips, P. C. Rapid self-selecting and clone-free integration of transgenes into engineered CRISPR safe harbor locations in Caenorhabditis elegans. G3. 10 (10), Bethesda. 3775-3782 (2020).
  26. Zacharias, A. L., Walton, T., Preston, E., Murray, J. I. Quantitative differences in nuclear β-catenin and TCF pattern embryonic cells in C. elegans. PLoS Genet. 11 (10), e1005585(2015).
  27. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during zebrafish embryonic development. BioEssays. 22 (2), 113-123 (2000).
  28. Wiseman, E., Carroll, D. J., Fowler, S. R., Guisbert, E. Iteration in an inquiry-based undergraduate laboratory strengthens student engagement and incorporation of scientific skills. J Scholarsh Teach Learn. 20 (2), 99-112 (2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

C Elegans D llenmesiOositden EmbriyoyaGenetik Kodlu ndikat rKalsiyum G r nt lemeErken EmbriyogenezRNAi ile SusturmaFloresan ReporterSolucan SenkronizasyonuAgaroz Ped Montaj

İlgili makaleler