Rapamisin ile Düzenlenmiş Tirozin Fosfatazların Geliştirilmesi ve Uygulanması

Summary

Bu protokol, rapamisin tarafından düzenlenen fosfatazların tasarımını, oluşturulmasını ve uygulanmasını açıklar. Bu yöntem, canlı hücrelerde fosfataz aktivasyonunun yüksek özgüllüğü ve sıkı zamansal kontrolünü sağlar.

Abstract

Tirozin fosfatazlar, kritik fizyolojik fonksiyonları düzenleyen önemli bir enzim ailesidir. Genellikle insan hastalıklarında düzensizdirler ve bu da onları biyolojik çalışmaların ana hedefleri haline getirir. Fosfataz aktivitesinin düzenlenmesini sağlayan araçlar, işlevlerinin diseksiyonunda etkilidir. Yapısal olarak aktif veya baskın negatif mutantların aşırı ekspresyonu veya siRNA kullanılarak aşağı regülasyon gibi geleneksel yaklaşımlar zamansal kontrolden yoksundur. Fosfataz inhibitörleri genellikle zayıf özgüllüğe sahiptir ve araştırmacıların yalnızca fosfatazın inhibisyonundan hangi süreçlerin etkilendiğini belirlemelerine izin verir.

Fosfataz aktivasyonunun sıkı zamansal kontrolünü sağlayan bir fosfataz katalitik alanının allosterik regülasyonuna izin veren kemogenetik bir yaklaşım olan Rapamisin tarafından düzenlenen (RapR) sistemi geliştirdik. RapR sistemi, fosfatazdaki bir allosterik bölgeye yerleştirilmiş bir iFKBP alanından oluşur. RapR alanının içsel yapısal dinamikleri, katalitik alanı bozarak enzimin inaktivasyonuna yol açar. Rapamisin ilavesi, iFKBP ile iFKBP'yi stabilize eden ve fosfatazın katalitik alanına aktiviteyi geri kazandıran birlikte eksprese edilen bir FRB proteini arasında bir kompleks oluşumuna aracılık eder.

Bu sistem, canlı hücrelerde fosfataz aktivasyonunun yüksek özgüllüğünü ve sıkı zamansal kontrolünü sağlar. Bu sistemin benzersiz yetenekleri, geçici olayların tanımlanmasını ve bir fosfatazın akış aşağısındaki bireysel sinyal yollarının sorgulanmasını sağlar. Bu protokol, bir RapR-fosfatazın geliştirilmesi, biyokimyasal karakterizasyonu ve aşağı akış sinyalizasyonu ve hücre morfodinamiğinin düzenlenmesi üzerindeki etkilerinin analizi için yönergeleri açıklar. Ayrıca, bir protein mühendisliği stratejisinin, fosfataz aktivitesini analiz eden in vitro tahlillerin ve hücre morfolojisindeki değişiklikleri tanımlayan canlı hücre görüntüleme deneylerinin ayrıntılı bir tanımını sağlar.

Introduction

Protein tirozin fosfatazlar, çok sayıda hücre sinyalleme olayında yer alan kritik bir protein ailesidir. Hücre proliferasyonunun, göçünün ve apoptozun düzenlenmesinde kilit bir rol oynadıkları gösterilmiştir ^1,2,3. Sonuç olarak, protein tirozin fosfatazların düzensizliği çeşitli zayıflatıcı hastalıklara ve bozukluklara yol açar 4,5,6,7. Tirozin fosfatazların fizyolojik fonksiyonunu ve bu patolojilerin gelişimindeki rollerini incelemek, fosfataz sinyallemesinin^{karmaşıklıklarını} araştırmak için gerekli araçların eksikliği nedeniyle tarihsel olarak engellenmiştir 8.

Geleneksel olarak fosfatazlar, istenen özgüllüğe sahip olmayan ve/veya aktivitelerinin zamansal kontrolünü sağlamayan yöntemler kullanılarak incelenir. Mevcut araçların bu kritik sınırlamaları, sinyal yollarındaki fosfatazların belirli rollerini incelemeyi zorlaştırmaktadır. Yapısal olarak aktif ve baskın negatif mutantların aşırı ekspresyonu veya fosfatazın ekspresyonunun aşağı regülasyonu özgüllük sağlar, ancak zamansal kontrolden yoksundur ve sıklıkla enzimin gerçek işlevini maskeleyecek telafi edici mekanizmaları tetikleyebilir.

Farmakolojik inhibitörler, fosfatazların zamansal regülasyonuna izin verir. Bununla birlikte, birçok fosfataz inhibitörü, tirozin fosfatazlar^9'daki aktif bölgenin iyi korunmuş bileşimi nedeniyle herkesin bildiği gibi spesifik değildir. Ek olarak, tasarım kısıtlamaları nedeniyle, katalitik bölgeyi hedefleyen inhibitörler zayıf hücre zarı geçirgenliği^{sergiler 10}. İnhibitörlerin bir başka sınırlaması, sadece fosfataz inaktivasyonunun¹¹ etkilerinin incelenmesine izin vermeleridir. Bu nedenle, fosfatazların spesifik, zamansal olarak düzenlenebilir aktivasyonunu sağlayan araçlara ihtiyaç vardır. Bu araçlar, araştırmacıların fosfataz aktivasyonunun doğrudan etkilerini tanımlamalarına ve bunları genellikle biyolojik uyaranlarla aktive edilen çoklu paralel sinyal kaskadlarından ayırmalarına olanak tanıyacaktır. Daha da önemlisi, aktivitenin sıkı zamansal kontrolü, bir fosfataz tarafından indüklenen geçici olayların tanımlanmasını sağlar ve akut ve uzun süreli fosfataz aktivitesinin etkilerini ayırır. Zamansal düzenlemenin mutasyon analizi ile birleştirilmesi, fosfatazın bireysel alanlarının belirli rollerinin ayrıntılı bir diseksiyonuna ve aşağı akış sinyalizasyonunun^{sorgulanmasına izin verecektir 12}.

Mevcut araçlarda istenen yeteneklerin eksikliğini gidermek için Karginov grubu, Rapamisin Düzenlenmiş (RapR) sistemini^geliştirdi 13,14,15. RapR sistemi, ilgilenilen proteinin (POI) allosterik regülasyonuna izin veren tasarlanmış bir anahtar alanı olan iFKBP'yi kullanır. iFKBP alanının, POI'nin katalitik bölgesine allosterik olarak bağlanmış bir konuma yerleştirilmesi, onu rapamisin tarafından regülasyona duyarlı hale getirir. Rapamisin yokluğunda, iFKBP, iFKBP'nin doğası gereği yüksek yapısal dinamikleri nedeniyle katalitik bölgeyi bozar ve böylece POI'yi etkisiz hale getirir. Rapamisin ilavesi, iFKBP'nin birlikte eksprese edilen protein FRB ile etkileşimini indükler (Şekil 1). Bu, anahtar alanının stabilizasyonuna neden olur ve bu da sonuç olarak POI'nin katalitik alanının yapısını ve işlevini geri yükler. Bu nedenle araç, POI'nin spesifik ve geçici olarak düzenlenebilir aktivasyonuna izin verir.

Şekil 1: RapR-Shp2 rapamisin tarafından düzenlenen sistemin şeması. RapR, rapamisin ilavesiyle ilgilenilen proteinin allosterik aktivasyonuna izin verir. Bu rakam Fauser ve ^ark.12'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: iFKBP = takılabilir FKBP12; FRB = FKBP-rapamisin bağlama alanı; R = rapamisin; Shp2 = Src homolojisi-2 alanı içeren protein tirozin fosfataz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

RapR aracı farklı protein ailelerine uygulanabilir. Protein kinazların yanı sıra fosfatazları^(fosfatazlar) düzenlemek için kullanılabilir ^12,14. Bu protokol, Shp2 fosfatazı kontrol etmek için RapR aracının uygulanmasına odaklanacaktır. Shp2, proliferasyon, migrasyon, immünomodülasyon ve farklılaşma^gibi sinyalleme süreçlerinde yer alan, her yerde eksprese edilen bir protein tirozin fosfatazdır 1,16,17,18. Shp2'nin düzensizliği bir dizi katı kanser, miyeloid lösemi ve gelişimsel bozukluklarla ilişkilendirilmiştir ^5,7. Bununla birlikte, Shp2, yukarıda açıklandığı gibi aynı araç eksikliklerinin kurbanı olmuştur. Bu sınırlamalarla mücadele etmek için, özel ve zamansal olarak düzenlenebilir bir Shp2 yapısı olan RapR-Shp2 geliştirildi ve karakterize edildi¹².

RapR-Shp2'nin geliştirilmesinden önce, Shp2'nin hücre göçünde rol oynadığı biliniyordu ^19,20,21. Bununla birlikte, bu süreçte yer alan sinyalizasyondaki özel rolü bilinmiyordu. Shp2'nin hangi zaman ölçeğinde hücrelerin göçünü düzenlediği ve aktivasyonunun farklı zaman noktalarında hangi spesifik morfodinamik değişiklikleri indüklediği de bilinmiyordu. Ayrıca, Shp2'nin akut ve uzun süreli aktivasyonunun farklı etkilere neden olup olmayacağı belirsizdi. RapR-Shp2 kullanılarak, Shp2'nin akut aktivasyonunun geçici hücre yayılmasına, çıkıntılarda artışa, hücre polarizasyonuna ve göçe neden olduğu bulundu. Farklı morfodinamik değişiklikleri düzenleyen Shp2'nin akış aşağısındaki spesifik yollar da tanımlanmıştır¹². Bu protokol, diğer RapR fosfatazlarının geliştirilmesine ve uygulanmasına rehberlik etmek için kullanılabilecek RapR-Shp2'nin tasarımı ve karakterizasyonu için ayrıntılar sağlar.

Protocol

1. RapR-fosfatazların Tasarımı

1. Planlama
   NOT: Örnek olarak RapR-Shp2'yi kullanan bu protokol, rapamisin tarafından düzenlenen bir tirozin fosfataz oluşturmak için önemli adımları detaylandırır. Açıklanan protokol Shp2 için optimize edilmiştir ve tek tek fosfatazların belirli özelliklerine uyması için ek modifikasyonlar gerekebilir.
   1. Shp2'nin katalitik aktivitesinin endojen mekanizmalar tarafından değil, tamamen rapamisin tarafından kontrol edilmesini sağlamak için, fosfatazı yapısal olarak aktif bir konformasyonda tutmak için fosfataza bir mutasyon ekleyin. Shp2 durumunda, D61A mutasyonunu tanıtın.
      NOT: Belirli bir PTPaz için aktive edici bir mutasyon tanıtılmazsa, RapR varyantı, endojen sinyaller ve rapamisin tarafından düzenlenen AND kapılı bir sistem olarak işlev görecektir.
   2. Daha önce tarif edildiği gibi seçimi yönlendirmek için kristal yapıyı kullanarak fosfatazın katalitik alanındaki iFKBP yerleştirme bölgelerini tanımlayın¹³. Bir yapı mevcut değilse, ekleme bölgelerini belirlemek için Shp2 fosfatazın katalitik alanı ile amino asit dizisi hizalaması yapın (Şekil 2A). Yerleştirme bölgesinin, yapısal olarak katalitik cebe bağlanmış, ancak iFKBP tarafından substrat bağlanmasının sterik olarak engellenmesini önlemek için cepten uzağa yerleştirilmiş esnek bir halka içinde bulunduğundan emin olun.
      NOT: Eklemeyle ilgili daha fazla ayrıntı Tartışma'da tartışılmıştır.
   3. Eklenen iFKBP etki alanı ile ilgilenilen fosfataz arasında kullanılacak bağlayıcı dizisinin türünü göz önünde bulundurun. En uygun bağlayıcı dizisinin seçilmesi, RapR aracının başarısı için son derece önemlidir ve Tartışma'da daha ayrıntılı olarak tartışılmaktadır (Şekil 2B).

Şekil 2: RapR-fosfataz tasarlanırken göz önünde bulundurulması gereken noktaların şeması. (A) Shp2 (mor), PTP1B (yeşil) ve PTP-PEST'in (pembe) korunan yerleştirme yerleri vurgulanarak hizalanması. (B) Shp2 ve iFKBP arasına bağlayıcı eklemenin temsili. (C) Shp2'nin fosfataz alanı, yerleştirme yerleri mavi ile gösterilen bej renktedir. Bu rakam Fauser ve ^ark.12'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: Shp2 = Src homolojisi-2 alanı içeren protein tirozin fosfataz; iFKBP = takılabilir FKBP12; PTP = protein tirozin fosfataz; RapR = Rapamisin tarafından düzenlenmiş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. RapR-fosfatazın oluşturulması

1. Modifiye bölgeye yönelik mutajenez kullanılarak iFKBP'nin ilgilenilen fosfataza yerleştirilmesi
   1. PCR aracılığıyla bir iFKBP kodlamalı "megaprimer" oluşturun.
      1. iFKPB'nin 5' veya 3' ucuna tavlanan 20-25 nükleotid, iFKPB'yi ilgilenilen fosfataza bağlayacak bir bağlayıcı dizisi ve yerleştirme bölgesine karşılık gelen 28-32 nükleotid içeren "megaprimer" sentezi için primerler tasarlayın (Şekil 3). Elde edilen ürünün, ilgilenilen fosfatazdaki yerleştirme bölgesinden önce ve sonra tavlanan parçalarla çevrili iFKPB'yi içerdiğini onaylayın.
      2. PCR (10 μL 5x polimeraz tamponu, 1 μL 50 ng/μL iFKBP içeren şablon DNA, 2 μL 10 mM dNTP, 0.5 μL 100 μM her "megaprimer" primerinin 100 μM stoğu [ileri ve geri], 35 μL su, 1 μL DNA polimeraz) yoluyla "megaprimer" içeren iFKBP'yi sentezleyin. PCR'yi çalıştırmadan önce bu PCR reaksiyonunu 2 ayrı 25 μL reaksiyona bölün. PCR döngüsünü DNA polimeraz üreticisinin tavsiyelerine veya aşağıdaki standart PCR döngüsüne göre çalıştırın: (i) 2 dakika boyunca 98 °C, (ii) 30 saniye boyunca 98 °C, (iii) 30 saniye boyunca 55-70 °C, (iv) 30 saniye boyunca 72 °C, (v) II-IV 25x adımlarını, (vi) 72 °C'de 2 dakika tekrarlayın.
      3. Agaroz jel elektroforezi kullanarak "megaprimer" i saflaştırın. Önceki adımdaki PCR içeriğini %1'lik bir agaroz jele yükleyin ve yaklaşık 30 dakika boyunca 120 V uygulayın. Jelde 400 nükleotid uzunluğundaki "megaprimer" i arayın, parçayı eksize edin ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın (bkz.
         NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
   2. Modifiye bölgeye yönelik mutajenez
      1. Şablon olarak ilgilenilen fosfatazın genini içeren bir plazmit kullanarak modifiye bölgeye yönelik mutajenez reaksiyonunu hazırlayın (5 μL 5x polimeraz tamponu, 2 μL 50 ng/μL şablon, 2 μL 10 mM dNTP, 10 μL ekstrakte edilmiş "megaprimer", 2.5 μL su, 2.5 μL DMSO, 1 μL DNA polimeraz).
         NOT: Reaksiyon karışımına DMSO ilavesi tavlama sıcaklığını²² düşürür.
      2. Aşağıdaki PCR döngüsünü çalıştırın: 98 ° C'de 3 dakika boyunca ilk denatürasyon adımı, ardından 30 saniye boyunca 98 ° C'de, 20 saniye boyunca 65 ° C'de, 20 saniye boyunca 60 ° C'de, 20 saniye boyunca 55 ° C, 20 saniye boyunca 50 ° C, 18 dakika boyunca 72 ° C'de 18 döngü ardışık inkübasyon adımı. Döngüyü gece boyunca çalıştırın (döngü süresi 7 saattir). Döngü tamamlandığında, PCR reaksiyonunu 4 °C'de saklayın.
         NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
      3. Döngü tamamlandıktan sonra, 1 μL DpnI enzimi ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
         NOT: DpnI , artık şablonu sindirerek yeni sentezlenen ürünün verimini artıracaktır.
      4. Sindirilmiş ürünü, üreticinin talimatlarını izleyerek DH5α yetkin hücrelere dönüştürün. Dönüşümü LB agar plakaları üzerine seçim için uygun antibiyotik (pcDNA RapR-Shp2 yapısı için karbenisilin) ile plakalayın. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Koloniler büyüdükten sonra, LB plakalarını 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
         NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
2. RapR-fosfataz içeren istenen DNA yapısının izolasyonu
   1. Bakteri kolonilerinin PCR taramasını yapın²³. Bir LB plakasında yetiştirilen tüm koloniler istenen plazmidi içermeyeceğinden, plazmit DNA'sının izolasyonundan önce tarama yaptığınızdan emin olun.
      NOT: Şablona tavlanacak ekran için ve iFKBP geninde astarlar kullanın. Ekran, Taq polimeraz mastermix kullanılarak yapılabilir (Malzeme Tablosuna bakınız).
   2. Pozitif koloniler tanımlandıktan sonra, bir pozitif koloniyi uygun antibiyotik dahil 3 mL LB suyuna aşılayın, inkübe edin ve gece boyunca 37 ° C'de çalkalayın.
   3. Üreticinin plazmit DNA ekstraksiyon kiti talimatlarını izleyerek sıvı kültürden plazmit DNA'yı çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız)
      NOT: İn vitro değerlendirmeye devam etmeden önce yeni oluşturulan RapR PTPase yapısının sıralanması önerilir.

Şekil 3: Astar tasarımının şeması ve modifiye edilmiş bölgeye yönelik mutajenez klonlama stratejisi. Adım 1, ilgilenilen fosfatazın yerleştirme bölgesine tavlanan "yapışkan uçlara" sahip "megaprimer" içeren iFKBP'nin sentezidir ve adım 2, "megaprimer" in ilgilenilen fosfataz içine yerleştirilmesidir. Bu rakam Karginov ve ^ark.13'ten değiştirilmiştir. Kısaltma: iFKBP = takılabilir FKBP12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. RapR-PTPaz'ın in vitro aktivite testi ile değerlendirilmesi

NOT: Bu protokol, tasarlanmış RapR-PTPase'nin aktivitesinin düzenlenmesini değerlendirmek için kullanılır. Aşağıda, bir substrat olarak fosforile N-terminal paxillin fragmanı kullanılarak immünopresipite edilmiş Shp2'nin analizi açıklanmaktadır. İlgilenilen belirli bir PTPaz için farklı bir substratın seçilmesi gerekebilir.

1. 1. Gün
   1. L-glutamin takviyesi (2 mM'lik nihai konsantrasyon) ve hacimce FBS ile desteklenmiş DMEM ortamında 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında 800.000 HEK293T hücre / kuyu plakası. Gece boyunca 37 °C ve %5 CO₂ inkübatöre koyun.
2. 2. Gün
   1. Hücreler ~% 60-80 birleştiğinde, bunları tercih edilen transfeksiyon naibi üreticisinin protokolüne göre transfekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
      1. Transfeksiyon protokolü örneği: 200 μL serumsuz DMEM ve 6 μL transfeksiyon reaktifine 1 μg plazmit DNA (pcDNA-mCherry-FRB ve pcDNA-flag-RapR-Shp2, her biri) ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücrelerin oyuğu başına 100 μL transfeksiyon karışımı ekleyin. Yapısal olarak aktif ve baskın negatif Shp2 yapıları ile transfekte edilmiş örnekleri kontrol olarak dahil edin. Gece boyunca 37 °C ve% 5 CO₂ inkübatörde inkübe edin.
3. 3. Gün
   1. Protein-G Sefarozun Hazırlanması
      NOT: Sepharose'u kullanmadan önce kesilmiş pipet uçlarını hazırlayın. Sepharoz'un ele alındığı her adımda kesik uçlar kullanılmalıdır. Sefarozun pipetlemeden önce her adımda tamamen yeniden süspanse edilmesi gerekir.
      1. Uygun miktarda Protein-G Sefarozu tekrar askıya alın ve 1.5 mL'lik bir tüpe alın. 6 oyuklu bir plakadaki her kuyucuk için 10 μL Protein-G Sefaroz kullanın. Tam 6 oyuklu bir plaka için 60 μL Separoz kullanın.
      2. Sefarozu 1 mL Lizis Tamponu ile yıkayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). 2.000 × g'da 1 dakika mikrosantrifüj edin ve Lizis Tamponunu dikkatlice çıkarın. 2x tekrarlayın.
      3. Sefarozu 380 μL lizis tamponunda yeniden süspanse edin. BSA'yı 1 mg / mL nihai konsantrasyona ve antikora ekleyin (her IP örneği için 0.5 μL, anti-Flag Antikoru [Malzeme Tablosuna bakınız]). 4 ° C'de 1.5 saat boyunca bir döndürücü üzerinde ters çevirin.
         NOT: Kullanılan her antikor için optimal antikor miktarı deneysel olarak belirlenmelidir.
   2. Hücreleri immünopresipitasyon için hazırlayın.
      1. 1 μM'lik bir nihai konsantrasyona uygun miktarda rapamisin (etanol içinde 1 mM stok çözeltisi) ekleyin veya numunelere aynı hacimde etanol (negatif kontrol) ekleyin. 37 °C ve% 5 CO₂ inkübatörde 1 saat inkübe edin.
      2. Hücrelerin bulunduğu 6 oyuklu plakayı buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri 3 mL soğuk PBS ile nazikçe yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 300 μL Lizis Tamponu ekleyin (aktive edilmiş fosfataz numunesi için 1 μM rapamisin veya negatif kontrol numunesinde eşdeğer hacimde etanol ile) ve bir hücre kazıyıcı ile kazıyın. Numuneleri 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve 4 ° C'de 1.000 × g'da 10 dakika boyunca mikrosantrifüje aktarın.
      3. İfade seviyelerini kontrol etmek için süpernatanın 20 μL'sini yeni bir 1.5 mL'lik tüpe aktarın. Ekspresyonu kontrol etmek için kullanılacak her tüpe %5 β-merkaptoetanol içeren 20 μL 2x Laemmli tamponu ekleyin ve 95-100 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Adım 3.3.3.3'te immünopresipitasyon için kalan süpernatanı kullanın.
   3. RapR-SHP2'nin İmmünopresipitasyonu
      1. Protein-G Sefarozu adım 3.3.1.3'ten yıkayın. 1 mL Lizis Tamponu ile. Her seferinde 4 ° C'de 2.000 × g'da 1 dakika mikrosantrifüj edin ve Lizis Tamponunu dikkatlice aspire edin. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
      2. Kesilmiş uçları kullanarak, Sefarozu Lizis Tamponunda yeniden süspanse edin (numune başına 50 μL, bu nedenle 6 oyuklu bir plaka için 300 μL Lysis Tamponunda yeniden süspanse edin). Her numune için 50 μL süspanse Sefaroz karışımını 1,5 mL'lik ayrı bir yeni tüpe pipetleyin.
         NOT: Sefarozun hacminden dolayı kalan Lizis Tampon çözeltisinde yeniden süspanse edilmiş Sefaroz olacaktır.
      3. Adım 3.3.2.3'ten hazırlanan hücrelerden kalan süpernatanı her bir Sepharose tüpüne ekleyin. 4 °C'de 1,5–2 saat döndürün.
   4. Fosfataz aktivite deneyi
      NOT: Shp2 substratı, daha önce tarif edilen kinaz reaksiyon protokolü^12'yi takiben yapısal olarak aktif Src kinaz kullanılarak saflaştırılmış N-terminal paxillin fragmanının fosforile edilmesiyle hazırlanmalıdır.
      1. Adım 3.3.3.3'ün sonuna doğru, fosfo-paxillin solüsyonunu hazırlayın. Numune başına, 40 μL toplam İmidazol Tamponuna fosfo-paxillin solüsyonu (3 μg/mL nihai konsantrasyon) ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Aktive edilmiş RapR-Shp2 numuneleri için fosfo-paksilin çözeltisinin alikotuna 1 μM'lik nihai konsantrasyona rapamisin ve aktive edilmemiş numuneler için çözeltiye eşdeğer hacimde etanol ekleyin.
      2. Isıtma çalkalayıcıyı 32 °C'ye ayarlayın.
         NOT: Diğer fosfatazlar, optimum aktivite için farklı bir sıcaklığa ihtiyaç duyabilir.
      3. Sepharose'u adım 3.3.3.3 2x'teki örneklerle 0.5 mL Lizis Tamponu ile yıkayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Numuneleri 2 kez 0,5 mL Yıkama Tamponu ile yıkayın. Her tampon, aktive edilmiş numuneler için 1 μM'de rapamisin veya aktive edilmemiş numuneler için eşdeğer bir hacimde etanol içermelidir. Son yıkamadan sonra mümkün olduğunca fazla tamponu çıkarın.
         NOT: Bu adıma ulaşıldığında, Sefarozun hiçbirinin aspire edilmediğinden emin olmak için son tampon miktarlarını yavaş ve dikkatli bir şekilde çıkarmak için bir pipet kullanmak faydalı olabilir. Artık herhangi bir tampon, fosfo-paxillin konsantrasyonunu etkileyecek ve yanlış okumaya yol açacaktır.
      4. Hazırlanan fosfo-paksilin İmidazol Tampon karışımından 40 μL'yi rapamisin ile veya rapamisin olmadan (numuneye bağlı) her numuneye ekleyin. Karıştırmak için çok nazikçe hafifçe vurun ve hemen ısıtma çalkalayıcıya yerleştirin ve 32 °C'de 40 dakika inkübe edin. Numunenin inkübasyon süresi boyunca tamamen çalkalandığından emin olmak için ısıtma çalkalayıcıyı minimum 1,000 rpm'ye ayarlayın.
      5. Her numuneye 40 μL 2x Laemmli Tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun. Numuneleri 95–100 °C'de 5 dakika inkübe edin. Örnekleri soğutun.
      6. Her numuneden 15 μL yükleyin (adım 3.3.2.3'teki lizat numuneleri dahil.)% 4-15 gradyanlı bir SDS-poliakrilamid jel üzerine ve PVDF membranları kullanarak standart bir western blot protokolü çalıştırın.
      7. RapR-Shp2 yapısını tespit etmek için bir anti-Flag antikoru, mCherry-FRB'yi tespit etmek için anti-mCherry ve paxillin fosforilasyonunu tespit etmek için anti-pY118 veya anti-pY31 paxillin kullanarak lekeleyin.
         NOT: Ortaya çıkan batı lekeleri Şekil 4'e benzer görünmelidir.

4. Canlı hücrelerde RapR-Shp2 aktivitesinin analizi

NOT: Bu protokol, RapR-Shp2'nin endojen substratları fosforile etme ve aşağı akış sinyalizasyonunu indükleme yeteneğini belirlemek için kullanılır. Diğer RapR-PTPazlar, spesifik substratlarının ve yollarının analizini gerektirecektir.

1. 1. Gün
   1. % 10 FBS ve L-glutamin (2 mM'lik nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş DMEM ortamında 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında 198.000 A431 hücresi / kuyucuğu. Gece boyunca 37 °C ve %5 CO₂ inkübatöre koyun.
2. 2. Gün
   1. RapR-Shp2 ve FRB'yi eksprese eden adenoviral yapılara sahip hücreleri, adenovirüsü doğrudan tabakta bulunan ortama ekleyerek enfekte edin. Adenovirüsü gece boyunca 37 °C ve% 5 CO₂ inkübatörde hücreler üzerinde bırakın. FRB ile enfekte olmuş hücreleri sadece negatif kontrol olarak kullanın.
      NOT: Adenovirüs miktarlarının, titreye bağlı olarak duruma göre belirlenmesi gerekecektir.
3. 3. Gün
   1. Deneyden önce 4 saat boyunca% 0.5 FBS ile DMEM'de inkübe ederek A431 hücrelerini aç bırakın.
   2. Hücrelere 2-4 saat boyunca 1 μM'lik bir nihai konsantrasyona veya aynı hacimde etanole (negatif kontrol) rapamisin ekleyin.
      NOT: İnkübasyon diğer fosfatazlar için farklı olabilir.
   3. Hücrelerin bulunduğu 6 oyuklu plakayı buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri 3 mL soğuk PBS ile nazikçe yıkayın. PBS'yi aspire edin, 300 μL Lizis Tamponu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve bir hücre kazıyıcı ile kuvvetlice kazıyın. Numuneleri 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve 4 ° C'de 2.000 × g'da 5 dakika boyunca mikrosantrifüjleyin.
   4. Her numunenin 250 μL'sini 1,5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın. % 5 β-merkaptoetanol ile 250 μL 2x Laemmli tamponu ekleyin ve 95-100 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
   5. Her numuneden 25 μL'yi %4-15 gradyanlı bir SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve PVDF membranları kullanarak standart bir western blot protokolü çalıştırın.
   6. Anti-pY992 EGFR ve anti-pY783 PLCγ antikorları kullanarak EGFR ve PLCy'nin RapR-Shp2 aracılı defosforilasyonunu değerlendirin. pT202/pY204 kalıntıları üzerindeki fosforilasyonunu değerlendirerek MAP kinaz Erk1/2'nin aşağı akış aktivasyonunu değerlendirin.
      NOT: Ortaya çıkan batı lekeleri Şekil 5'e benzer görünmelidir.

5. HeLa hücrelerinde RapR-Shp2 aktivasyonunun neden olduğu morfodinamik değişikliklerin canlı hücre görüntüleme kullanılarak analiz edilmesi

NOT: Bu protokol, RapR-Shp2 aktivasyonunun hücre çıkıntılarının oluşumu, hücre yayılması ve göçü üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılır.

1. 1. Gün
   1. 700.000 HeLa hücresini 35 mm'lik bir hücre kültürü kabına yerleştirin ve 37 °C ve %5_CO2 inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin tabağa yapışmasına izin verin (~ 2-3 saat).
   2. Hücreleri, tercih edilen transfeksiyon reaktifi üreticisinin protokolüne göre transfekte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
      1. Örnek transfeksiyon protokolü: 100 μL serumsuz DMEM ve 6 μL transfeksiyon reaktifine 0.5 μg DNA (pcDNA-mCherry-FRB ve pcDNA-Venus-RapR-Shp2 plazmitleri) ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Transfeksiyon karışımını hücrelere ekleyin ve gece boyunca 37 °C ve% 5 CO₂ inkübatörde inkübe edin. pcDNA-mCherry-FRB ile transfekte edilmiş hücreleri sadece negatif kontrol olarak kullanın.
   3. 37 ° C'de 1 saat inkübe ederek canlı görüntüleme # 1.5 25 mm yuvarlak cam lamel fibronektin (5 mg / L) ile kaplayın.
2. 2. Gün
   1. Kaplanmış cam lamel PBS ile yıkayın.
   2. Görüntülemeden 4 saat önce 0 birleşme elde etmek için transfekte edilmiş HeLa hücrelerini% 10 FBS ve L-glutamin (2 mM'lik nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş DMEM ortamında kaplanmış cam lamel üzerine yerleştirin.
   3. Kaplamadan iki saat sonra, plakadaki ortamı 2 saat boyunca önceden ısıtılmış serumsuz Leibovitz L-15 ortamına yavaşça geçirin.
   4. Hücreleri, üreticinin protokolüne göre CellMask Deep Red plazma zarı boyası ile boyayın.
   5. Lameli temiz bir görüntüleme hücresi bölmesine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). 1 mL önceden ısıtılmış L-15 ortamı ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için 1 mL önceden ısıtılmış mineral yağ ile kaplayın. Görüntüleme yapılana kadar odayı 37 °C'de tutun.
   6. Hücreleri 37 °C'de ısıtılmış bir aşama kullanarak görüntüleyin.
      1. RapR yapısının görüntülenmesi için uygun kanalları ve epifloresan görüntüleme için CellMask'i seçin. Bu protokolü takip etmek için, referans verilen 40x objektifi (Malzeme Tablosuna bakın) ve aşağıdaki filtre setlerini kullanın: Venus-RapR-Shp2 görüntüleme için 514/10 uyarma ve 540/21 emisyon filtreleri, mCherry-FRB görüntüleme için 561/10 uyarma ve 595/40 emisyon filtreleri ve CellMask Deep Red görüntüleme için 640/20 uyarma ve 655LP emisyon filtreleri. Tüm floresan kanalları için çok bantlı bir polikroik ayna kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).
      2. 4–4,5 saat boyunca her 2 dakikada bir görüntü yakalayın.
         NOT: Daha hızlı morfodinamik değişiklikler daha sık edinim gerektirecektir.
      3. 1 saatlik görüntülemeden sonra, RapR-Shp2'yi uyarmak için 1 μM'lik bir son konsantrasyona rapamisin ekleyin.

6. Görüntü analizi

NOT: Bu protokol, aşağıdakilere dayalı olarak hücre maskelerinin oluşturulmasını açıklayacaktır. Canlı görüntüleme deneylerinden toplanan TIF yığın dosyaları. Daha sonra, maskeleri analiz etmek için ImageJ'de bir Makronun nasıl oluşturulacağını açıklayacak, bu da daha sonra zaman içindeki değişiklikler için analiz edilen bir hücre alanı elektronik tablosuyla sonuçlanacaktır. Son olarak, hücre çıkıntılı ve geri çekilmeli aktivite Metamorph kullanılarak analiz edilecektir.

1. CellGeo yazılım paketi^24'ten MovThresh işlevini kullanarak CellMask görüntülerinin ikili bir maskesini oluşturun.
2. MovThresh klasörünü görüntü analizi klasörüne kopyalayın.
3. CellMask veya diğer membran işaretleyici kanal görüntülerini MovThresh klasörüne kopyalayın.
   1. Tek bir konumda birden fazla hücre görüntülendiyse, MatLab'da maskeyi oluşturmadan önce yalnızca tek bir hücre içeren dosyalar oluşturmak için görüntüleri kırpın.
4. Dizinin MatLab'daki MovThresh klasörüne doğru şekilde ayarlandığından emin olun.
5. MovThresh'i çalıştırın.
6. Görüntü yığınlarını teker teker içe aktarın.
7. Düzgünleştirilmiş Eğri'yi seçin ve ardından Yeniden Eşik'i çalıştırın.
8. Maskeler etiketli yeni bir klasöre Mask_Image Numarası olarak kaydedin.
9. Tüm görüntü yığınları Maskelere dönüştürüldükten sonra, görüntü yığınlarını ImageJ yazılımında açın²⁵.
   1. ImageJ'de hücre alanı analizi
      1. ImageJ'deki tüm Maske görüntü yığınlarını açın.
      2. Set Ölçümlerini Alan olarak ayarlayın.
      3. Eklentiler | Makrolar | Kayıt.
      4. İşlem | İkili | İkili Yap.
         1. Varsayılan seçeneği belirleyin.
            NOT: Makroyu kaydederken fazladan bir şeye tıklamayın. Ek adımlar dahil edilirse, 6.9.1.3 adımından yeniden başlatmanız önerilir.
      5. Analiz Et | Parçacıkları analiz edin.
         1. Özet dışındaki tüm kutuların işaretini kaldırın.
      6. Kaydı bitirin ve tıklayın Oluşturmak Makroyu yap.
      7. Seçtikten sonra her görüntü yığını için Çalıştır'a basın ve her görüntü yığını için sonuç tablosunu kaydedin. Varsayılan seçenek bir csv dosyası olarak kaydedilir.
      8. Makroyu kaydedin ve gelecekteki analizler için yeniden kullanın (isteğe bağlı).
   2. Elektronik tabloda alan verilerini işleme
      1. Analiz edilen her hücre için, rapamisin ile aktivasyondan önce alınan görüntülerden hücrenin alanını ortalama.
      2. Tüm alan değerlerini, rapamisin ilavesinden önceki hücrenin ortalama alanına bölün.
   3. 9. 1. 
            
      13. 
          
          
          
      15. 
          

Results

Şekil 4, paxillin bazlı fosfataz aktivite testinden beklenebilecek sonuçları göstermektedir. Bu deneyde, yapısal olarak aktif ve baskın negatif Shp2 fosfataz aktivitesi, okuma olarak fosfo-paxillin kullanılarak aktif ve inaktif RapR-Shp2 aktivitesi ile karşılaştırıldı. Shp2 yapıları immünopresipite edildi ve protokolde tarif edildiği gibi aktivite testine tabi tutuldu. Yapısal olarak aktif Shp2 ve aktif RapR-Shp2 için fosfo-paxillin okumaları benzerdi, bu da aktif RapR-Shp2'nin RapR alanının tanıtılmasından olumsuz etkilenmediğini ve aktive edildiğinde tam aktiviteyi koruduğunu gösterdi. Baskın negatif Shp2 ve aktif olmayan RapR-Shp2 de benzerdi, bu da RapR-Shp2 yapısının aktif olmadığında aktiviteye sahip olmadığını gösteriyor. Bu, bir RapR-fosfatazın başarılı tasarımını gösterir. Bu test için kullanılan fosfo-substrat, ilgilenilen fosfataza bağlı olarak farklılık gösterebilir.

Şekil 5, Şekil 4'e benzer şekilde, yapısal olarak aktif, baskın negatif ve aktif ve aktif olmayan RapR-Shp2'yi karşılaştırır. Bu deney, yapıların immünopresipitasyonu olmadan gerçekleştirildi. Bunun yerine, hücreler içindeki RapR-Shp2 yapısının aşağı akış sinyalleme etkilerini karakterize etmek için tasarlanmıştır. Burada, Shp2 yapıları HEK293T hücrelerde ifade edildi. Aşağı akış efektörü ERK1/2'nin, yapısal olarak aktif numunede olduğu gibi, RapR-Shp2 aktivasyonuna yanıt olarak fosforilasyonda arttığı gösterilmiştir. Etkin olmayan RapR-Shp2 bu değişikliğe neden olmadı. Bu, Shp2'nin aşağı akış sinyalizasyonunun, RapR alanının dahil edilmesiyle korunduğunu gösterir. Benzer şekilde, bilinen fosfo-substratlar EGFR ve PLCγ, A431 hücrelerinde RapR-Shp2 aktivasyonuna yanıt olarak defosforile edildi.

Son olarak, Şekil 6 , HeLa hücrelerinin morfodinamiği üzerindeki RapR-Shp2 aktivasyonunun sonuçlarını sunmaktadır. RapR-Shp2 aktive edildikten sonra, hücreler hücre alanının yanı sıra çıkıntılı aktivitede de bir artış gösterdi. Bu, RapR-Shp2 aktivasyonunun HeLa hücrelerinde morfodinamik değişiklikleri indüklemek için yeterli olduğunu ve araştırmacıların bu etkiden sorumlu spesifik aşağı akış sinyal yollarını araştırmasına izin verebileceğini gösterir.

Şekil 4: Paxillin bazlı aktivite testinden elde edilen sonuçlar: Yapısal olarak aktif, baskın negatif ve RapR-Shp2 immünopresipite edildi ve belirtilen protokol kullanılarak aktivite testine tabi tutuldu. Hem CA hem de RapR-Shp2'deki pY31 paxillin seviyeleri benzerdi, bu da RapR-Shp2 yapısının bir kez aktive edildiğinde CA Shp2'ye kıyasla benzer aktiviteye sahip olduğunu gösterdi. Aktive edilmemiş RapR-Shp2 numunesi, DN numunesine benzer bir aktiviteye sahip değildi, bu da "sızdıran" olmadığını gösteriyordu. Bu rakam Fauser ve ^ark.12'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: RapR = Rapamisin tarafından düzenlenmiş; Shp2 = Src homoloji-2 alanı içeren protein tirozin fosfataz; DN = baskın negatif; CA = yapısal olarak aktif; FRB = FKBP-rapamisin bağlayıcı alan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Tam hücre lizat testinden elde edilen sonuçlar: Yapısal olarak aktif, baskın negatif ve RapR-Shp2 HEK293T hücrelerde eksprese edildi ve tüm hücre lizat protokolü tamamlandı. Aktif olmadığında, RapR-Shp2, DN Shp2 örneğine benzer şekilde fosforilasyon yoluyla ERK1/2'yi aktive etmedi. Bu, RapR-Shp2'nin etkin olmadığında etkinliği olmadığını gösterir. Aktive edildikten sonra, ERK1/2 fosforilasyon seviyesi, CA Shp2 numunesininkine benzerdi, bu da Shp2'nin başarılı aktivasyonunu ve aşağı akış sinyalizasyonunu gösterir. Benzer şekilde, RapR-Shp2'yi eksprese eden A431 hücreleri, her ikisi de Shp2'nin bilinen substratları olan hem EGFR hem de PLCy'nin fosforilasyonunda azalma gösterdi. Bu rakam Fauser ve ^ark.12'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: RapR = Rapamisin tarafından düzenlenmiş; Shp2 = Src homoloji-2 alanı içeren protein tirozin fosfataz; DN = baskın negatif; CA = yapısal olarak aktif; ERK = hücre dışı sinyal regüle kinaz; GAPDH = gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz; EGFR = epidermal büyüme faktörü reseptörü; PLCγ = fosfolipaz C gama; FRB = FKBP-rapamisin bağlayıcı alan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Canlı görüntülemeye dayalı hücre alanı ve çıkıntılı aktivite veri analizi: HeLa hücreleri RapR-Shp2 ile transfekte edildi ve belirtilen canlı görüntüleme protokolüne tabi tutuldu. Veriler, veri analiz protokolünde belirtildiği şekilde analiz edilmiştir. Aktive edildikten sonra (dikey gri çizgi ile gösterilir), HeLa hücreleri hem hücre çıkıntılı aktivitesinde hem de hücre alanında artışlar gösterdi. Sadece FRB'yi ifade eden negatif örneklerde bu aktivite mevcut değildi. Bu, RapR-Shp2 aktivasyonunun HeLa hücreleri içinde hızlı morfodinamik değişikliklere neden olduğunu ve hücre yayılmasını ve çıkıntısını teşvik ettiğini gösterir. Bu rakam Fauser ve ^ark.12'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokol, kemogenetik olarak kontrol edilen fosfatazların geliştirilmesi, karakterizasyonu ve uygulanması için ayrıntılı adımlar sağlar. RapR-Shp2 aracı, Shp2 katalitik alanına yerleştirilmiş rapamisin tarafından düzenlenen bir anahtara dayanır. Bu aletin gücü, fosfataz aktivitesinin özgüllüğü ve sıkı zamansal kontrolüdür. Araç, diğer fosfatazlara uygulanabilir ve daha önce açıklanan RapR-TAP teknolojisi ile kombinasyon halinde, bireysel aşağı akış sinyal yollarının²⁶ yeniden yapılandırılmasına izin verir. RapR yaklaşımının benzersiz yetenekleri, araştırmacıların Shp2'nin aktivasyonu ile indüklenen geçici olayları tanımlamasına ve bireysel morfodinamik süreçleri düzenleyen belirli aşağı akış sinyal yollarını incelemesine izin verdi.

Bir RapR fosfatazın tasarımını etkileyen birkaç kritik faktör vardır. İlgilenilen fosfatazın katalitik alanının iyi çözülmüş bir kristal yapısı, iFKBP için yerleştirme yerinin seçimine rehberlik etmede çok yardımcı olur. Bununla birlikte, tirozin fosfatazlar arasındaki yüksek yapısal benzerlik nedeniyle, katalitik alanların amino asit dizilerinin hizalanması, Shp2'nin PTP1B ve PTPPest'e hizalanmasıyla gösterildiği gibi yerleştirme bölgesinin tanımlanması için yeterli bilgi sağlayabilir (Şekil 2). RapR-Shp2 için, β iplikçik boyunca kritik katalitik WPD döngüsüne bağlı bölgede bulunan Val406, en uygun yerleştirme bölgesi olarak seçildi. Aynı yerleştirme bölgesi, PTP1B ve PTP-PEST¹² için gösterildiği gibi diğer PTPazların başarılı bir şekilde düzenlenmesine neden olabilir (Şekil 2A).

İlgilenilen fosfataz çok alanlı bir protein ise, alanların organizasyonu hakkında yapısal bilgi, PTPaz'ın diğer işlevlerine müdahale edilmesini önlemeye yardımcı olacaktır. Optimal RapR-PTPase tasarımını etkileyen bir diğer faktör, yerleştirilen iFKBP ile kaç amino asidin değiştirilmesi gerektiğidir. PTPaz'daki daha büyük ve daha esnek yerleştirme halkaları, iFKBP ile katalitik aktivitenin sıkı bir şekilde düzenlenmesini sağlamak için ek kısaltma gerektirebilir. Benzer şekilde, iFKBP'yi PTPase'ye bağlayan bağlayıcıların uzunluğu ve bileşimi, düzenlemenin verimliliğini etkileyecektir. Tek bir Gly kalıntısından oluşan kısa bağlayıcılar, daha sıkı bir düzenleme sağlayacaktır, ancak iFKBP rapamisin ve FRB'ye bağlı olsa bile kalıcı yapısal bozulmaya neden olurlarsa enzimin maksimum aktivitesini azaltabilirler. Orta uzunluktaki Gly-Ser-Gly bağlayıcılar daha fazla esneklik sağlar, ancak bazı PTPazlar için yeterince sert olmayabilir. Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly'den oluşan uzun bağlayıcılar, PTPaz regülasyonunu etkileyebilecek istenmeyen ikincil yapıların oluşumunu önlemeye yardımcı olacaktır. RapR-Shp2, her üç tür bağlayıcı ile test edilmiştir; bir Gly-Ser-Gly bağlayıcısının en optimal olduğu bulundu.

RapR araçlarının başarılı bir şekilde geliştirilmesini belirleyen kritik bir husus, sağlam bir fosfataz testinin oluşturulması ve uygun kontrollerin varlığıdır. RapR-fosfataz aktivitesinin, POI'nin baskın-negatif ve yapısal olarak aktif versiyonlarının aktivitesi ile karşılaştırılması, RapR-yapısının sızıntısının ve aktivasyonun derecesinin bir değerlendirmesini sağlar. Ayrıca, yapısal olarak aktif fosfataz tarafından defosforilasyon eksikliği veya baskın negatif mutant tarafından indirgenmiş fosforilasyon, uygun olmayan reaksiyon koşullarını gösterecektir.

Fosfataz tahlili için, reaksiyon koşulları her PTPaz için optimizasyon gerektirecektir. Sıcaklığın, reaksiyon süresinin ve tampon koşullarının ayarlanması, ilgilenilen PTPaz'a bağlı olacaktır. Sefaroza bağlı PTPaz ve substratının yeterli şekilde karıştırılmasını sağlamak için numunelerin kuvvetli bir şekilde çalkalanması kritik öneme sahiptir. Son olarak, tarif edilen fosfataz testi, ilgilenilen belirli PTPaz için optimal değilse, o zaman bir substrat olarak p-nitrofenil fosfat kullanan bir fosfataz reaksiyonu, alternatif bir test olarak kullanılabilir²⁷.

Canlı hücre görüntüleme deneylerinde, bir numune hazırlanırken birkaç kriter dikkate alınmalıdır. Ana hatlarıyla belirtilen protokol, CO 2 konsantrasyonuna duyarlı olmayan HEPES tamponuna dayalı_L-15 ortamını kullanır. Bikarbonat bazlı bir ortamın kullanılması isteniyorsa, numunenin pH'ını korumak için HEPES takviyesi yapılmalı veya CO₂ takviyesi yapan bir çevresel görüntüleme odası kullanılmalıdır. Protokol, buharlaşmayı önlemek ve rapamisin ilavesini basitleştirmek için numunenin üzerine bir mineral yağ tabakası uygulanmasını önerir. Çevresel görüntüleme odası veya kapalı bir oda kullanan diğer kurulumlar kullanılabilir, ancak rapamisin ilavesi daha zor olabilir. Görüntüleme sırasında hücrelere rapamisin eklerken, sahnenin kaymadığından ve hücrelerin rahatsız edilmediğinden emin olun. Görüntüleme işlemi sırasında numunenin herhangi bir ek hareketi, veri toplamayı engelleyecektir. Özellikle uzun süreli görüntüleme için fototoksisiteyi azaltmak için aydınlatma yoğunluğu ve maruz kalma süresi düşük tutulmalıdır. Hücrelerin yeterli transfeksiyon verimliliği de kritik öneme sahiptir. FRB'nin RapR-Shp2 DNA'sına 1:1 oranı yeterli ifade sağlar, ancak yeni yapılar için bu oranın ayarlanması gerekecektir. Verimli aktivasyonu sağlamak için FRB, RapR fosfatazdan daha yüksek bir seviyede ifade edilmelidir.

RapR tabanlı araçların bir sınırlaması, hızlı bir şekilde devre dışı bırakılamamasıdır. Ortamın değiştirilmesi hücre dışı rapamisini uzaklaştırır, ancak rapamisinin RapR yapısına çok sıkı bağlanması nedeniyle RapR yapılarının devre dışı bırakılması saatler alabilir. PTPaz'ın aktif bir bölge inhibitörünün eklenmesiyle hızlı inaktivasyon sağlanabilir. Bununla birlikte, inhibitörün potansiyel hedef dışı etkileri, sonuçların yorumlanmasını zorlaştırabilir. Ayrıca, bir PTPase inhibitörü ile kombinasyon halinde bile, RapR yaklaşımı döngüsel aktivasyon / inaktivasyon deneyleri için kullanılamaz. RapR sisteminin bir diğer sınırlaması da mekansal kontrol eksikliğidir. RapR yapıları küresel olarak ifade edilir ve bu nedenle hücrenin her yerinde aktive edilir. Potansiyel bir çözüm, hücre^28,29'da lokal olarak UV ışığına yakın salınabilen kafesli rapamisin uygulamasıdır. Ayrıca, RapR aracı, belirli bir protein kompleksinde veya belirli bir hücre altı yerde ilgilenilen fosfatazın aktivasyonunu sağlamak için modifiye edilebilir. FRB'ye bir bağlanma ortağı veya bir hücre altı etiketi ekleyerek, RapR-PTPase, hücredeki spesifik proteine veya konuma hedeflenecektir. Son olarak, rapamisin, mTOR inhibisyonu yoluyla iyi karakterize edilmiş bir immünosupresördür ve hücresel sinyallemeyi etkileyebilir ve potansiyel olarak ilgilenilen PTPazın sinyalizasyonunu bozabilir. Bu endişenin üstesinden gelmek için, immünosupresif olmayan rapamisin analogları (iRap ve AP21967) iyi bir alternatiftir. Her iki bileşiğin de RapR yapılarını^{düzenlediği gösterilmiştir 14}.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
# 1.5 Cam Lameller 25 mm Yuvarlak	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tüpler	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Tampon			5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL gliserol, 52.5 mL %20 SDS, 0.5 g bromofenol mavisi, son pH 6.8
%4-20 Mini-PROTEAN TGX Prekast Jel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Tampon	Thermo Scientific	F538L
A431 Hücreler	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Hücre Odası	invitrojen	A7816
Benchmark Fetal Sığır Serumu (FBS)	İkizler Biyo-ürünler	100-106	Isı İnaktive Üçlü 0.1 ve mikro; m steril filtreli
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plazma membran boyası	invitrogen	c10046
Koloni Ekranı MasterMix	Genesee	42-138
DH5a yetkin hücreler	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Merdiveni	GoldBio	D010-500
dNTP'ler	NEB	N04475
DpnI Enzim	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland Reaktifleri
EGTA	Acros	409910250
Sığır plazmasından Fibronektin	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfeksiyon Reaktifi	Promega	E2692	transfeksiyon reaktifi
Jel ekstraksiyon Kiti	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Jel Ekstraksiyon Kiti
Jel Yeşil Nükleik Asit Lekesi	GoldBio	G-740-500
Jel Yükleme Boyası Mor 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Hücreleri	ATCC	CRL-11268
HeLa Hücreleri	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ İşleme Yazılımı	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
İmidazol Tamponu			25 mM İmidazol pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lizis Tamponu			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, %1 NP40 CellGeo
MATLAB		MathWorks N/A	R 2022b güncellemesi kullanıldı
Metamorf Mikroskobu Otomasyonu ve Görüntü Analiz Yazılımı	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Yağ	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Geni Seçim	96-308
Mini-PROTEAN TGX Prekast Jeller 12 kuyulu	Bio-Rad	4561085
Moleküler Biyoloji Sınıfı Su	Corning	46-000-CV
Çok Bantlı Polikroik Ayna	Chroma Teknolojisi	89903BS
NaCl	Fisher Kimyasal	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objektif	Olympus	N/A
PBS, Ca ve Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tüpleri	labForce	1149Z65	0.2 mL 8 Şeritli Tüpler ve Kapaklar, Sert Şerit Ayrı Ayrı Takılan Kubbe Kapakları
Phusion Plus DNA Polimeraz	Thermo Scientific	F630S
Primerler	IDT
Protein-G Sefaroz	Millipore	16-266
PVDF Membranlar	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF / Filtre Kağıdı Sandviçler
Rapamisin	Fisher	AAJ62473MF
% 0.25 Tripsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodyum	Corning	25-053-CI
Tris-Asetat-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	elektroforez için
Yıkama Tamponu			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA,% 1 NP40
ve beta;-Merkaptoetanol	Fisher Kimyasal	O3446I-100
antikorlar< / güçlü >
Anti-EGFR Antikor	Hücre Sinyali	2232
Anti-ERK 1/2 Antikor	Hücre Sinyali	9102
Anti-Bayrak Antikoru	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antikor	invitrojen	AM4300
Anti-GFP Antikoru	Clontech	632380
Anti-mCherry Antikoru	invitrojen	M11217
Anti-paxillin Antikoru Thermo	Fischer	BDB612405
Anti-fosfo-EGFR Y992 Antikor	Hücre Sinyali	2235
Anti-fosfo-ERK 1/2 T202 / Y204 Antikor	Hücre Sinyalizasyonu	9101
Anti-fosfo-paksilin Y31 Antikoru	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-fosfo-PLC ve gama; Y783 Antikor	Hücre Sinyalizasyonu	14008
Anti-PLC ve gama; Antikor	Hücre Sinyali	5690