Yöntem makalesi

Nörit büyüme ölçümü için yeni bir yarı otomatik yazılımın standardizasyonu

DOI:

10.3791/67163

⸱

9 Ağustos 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, University of Turin, 2Department of Neuroscience Rita Levi-Montalcini, University of Turin, 3University School for Advanced Studies IUSS Pavia

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nörit büyüme testleri, rejeneratif nöronal süreçler hakkında nicel bir değer sağlar. Bu yarı otomatik yazılımın avantajı, bir maske oluşturarak hücre gövdelerini ve nöritleri ayrı ayrı bölümlere ayırması ve nörit uzunluğu, dal noktası sayısı, hücre-gövde küme alanı ve hücre kümesi sayısı gibi çeşitli parametreleri ölçmesidir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etkili canlı görüntüleme teknikleri, nörit büyümesini gerçek zamanlı olarak ölçmek için nöronal morfolojiyi değerlendirmek için çok önemlidir. Nörit büyümesinin doğru ölçümü, sinirbilim araştırma alanında yıllar boyunca uzun süredir devam eden bir zorluk olmuştur. Bu parametre, ayrışmış kültürler ve organotipik kültürlerden hücre hatlarına kadar çok sayıda in vitro deney düzeneğinde bir köşe taşı görevi görür. Nörit uzunluğunu ölçerek, farklı deney gruplarında spesifik bir tedavinin işe yarayıp yaramadığını veya aksonal rejenerasyonun geliştirilip geliştirilmediğini belirlemek mümkündür. Bu çalışmada amaç, Incucyte Neurotrack nörit büyüme analiz yazılımının sağlamlığını ve doğruluğunu ortaya koymaktır. Bu yarı otomatik yazılım, faz kontrast görüntülerinde nörit uzunluğunun ölçülmesinde yaygın olarak kullanılan metodolojilere göre çeşitli avantajlar sunan hızlandırılmış bir mikroskopi sisteminde mevcuttur. Algoritma, her görüntüdeki birkaç parametreyi maskeler ve ölçer ve nörit uzunluğu, dal noktaları, hücre-gövde kümeleri ve hücre-gövde küme alanları dahil olmak üzere nöronal hücre ölçümlerini döndürür. İlk olarak, yazılımın sağlamlığını ve doğruluğunu, değerlerini bir Fiji eklentisi olan manuel NeuronJ'ninkilerle ilişkilendirerek doğruladık. İkinci olarak, hem faz kontrast görüntüleri hem de immünositokimya görüntüleri üzerinde çalışabilen algoritmayı kullandık. Spesifik nöronal belirteçler kullanarak, in vitro kültürlerde duyusal nöronlar üzerinde floresan bazlı nörit büyüme analizinin fizibilitesini doğruladık. Ek olarak, bu yazılım, tek tek hücrelerden karmaşık nöronal ağlara kadar çeşitli tohumlama koşullarında nörit uzunluğunu ölçebilir. Sonuç olarak, yazılım, nörit büyüme tahlilleri için yenilikçi ve zaman açısından etkin bir platform sağlayarak daha hızlı ve daha güvenilir miktar tayinlerinin önünü açar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siyatik sinirlerde aksonal rejenerasyonuölçmek mümkündür 1. Ek olarak, in vitro çalışmalar, hem sağlıklı hem de yaralı nöronlarda aksonal filizlenmeden aksonal dejenerasyona kadar çeşitli aşamalarını anlamak için aksonal büyümenin 2,3 izlenmesinin fizibilitesini göstermiştir. Bu süreçleri takip ederek aksonal polarite, başlatma, kararlılık ve dallanma gibi parametreleri ölçmek mümkündür. Son parametre nöropatik ağrı algısını anlamak için çok önemlidir 4,5,6. Benzer şekilde, aksonal dejenerasyon in vivo7 veya in vitro 8,9 izlenebilir. Nörit büyümesi sırasında, aktin ve mikrotübül hücre iskeleti ağları, hücrenin ihtiyaçlarına göre stabilize olur veya değişir10. Aktin hücre iskeleti, aksonal büyüme konisinin oluşumuna izin vermek için yeniden düzenlenir ve mikrotübüller, büyüyen nörit11'i stabilize etmek için demetler halinde yeniden hizalanır. Merkezi ve periferik nöronların nörit büyümesini in vitro olarak incelemek için üç ortak parametre ölçülür: toplam aksonal uzunluk, maksimum mesafe ve dal noktaları. Bu parametreler, tedaviye (yani nörotrofinler, bileşikler, inhibitörler, retinoik asit, siRNA, shRNA) veya genetiği değiştirilmiş hayvanlardanöronal büyüme yanıtını incelemek için kullanılır 12,13,14. Nöronların daha uzun nöritlere ve/veya daha fazla dallanmaya sahip olup olmadığını değerlendirmek için, bu üç parametre bir nöronun morfolojisini değerlendirmemize izin verir. Nörit uzunluğu ölçümü, çeşitli in vitro deney düzeneklerinde en çok ilgi gören parametredir. Dorsal kök gangliyonlarından esas olarak iki tip kültür gerçekleştirilir: dissosiyasyon in vitro kültür veya tüm DRG eksplantlarının organotipik kültürü. Her iki durumda da, nörit uzunluğu, deneyin sonucunu değerlendirmek için altın bir parametredir. Motor nöron benzeri bir hücre hattında (NSC-34), retinoik asit15,16 tarafından indüklenen farklılaşmadan sonra aksonal büyüme ve dallanma ölçülür. Aslında, nörit büyümesini ölçerek, belirli bir tedavinin işe yarayıp yaramadığını17, büyüme hızının18 veya bir yaralanma prosedüründen sonra rejenerasyon kapasitesinin19 olup olmadığını belirlemek mümkündür.

Nörit büyümesinin doğru bir şekilde nasıl değerlendirileceği, araştırma alanında yıllar boyunca önemli sayıda zorluk ortaya çıkarmıştır. Bununla birlikte, nörit uzunluğu ölçümlerinin standardizasyonu yoktur. İn vitro hücre kültürleri için en çok kullanılan yöntemlerden bazıları, örneğin, Fiji18,20 veya MetaMorph21,23 üzerindeki manuel NeuronJ eklentisi ve yarı otomatik Neurolucida 23,24'tür. Manuel metodolojilerin yanı sıra, Fiji25'teki NeuriteTracer eklentisi, HCA Vision yazılımı 26,27 veya WIS-NeuroMath 2,28 gibi otomatik yöntemler de vardır. Diğer daha az doğru metodolojiler, nöronların genel boyutunun ölçülmesine dayanır. Bu yöntemler, hücre gövdesinden en uzun akson29'un ucuna kadar olan vektör mesafesinin ölçümünü veya Sholl analizini30 içerir. Bununla birlikte, bu ölçüm yöntemleri çok düşük yoğunluklu kültürler veya tek nöronlar için uygundur. Ayrıca, tüm bu metodolojiler esas olarak lekeli nöronlar veya genetik olarak kodlanmış floroforları (yani GFP, Venüs, mCherry) ifade eden nöronlar üzerinde kullanılır. Nöronun tipi ve hücre kültürünün yoğunluğu, ölçüm metodolojisi seçimini derinden etkiler. Örneğin, DRG nöronları gibi çok karmaşık ve karmaşık morfolojilere sahip nöronları manuel olarak segmentlere ayırmak kolayca imkansız bir görev haline gelebilir. Kıvrımlı nöronları segmentlere ayırmak zaten bir zorluksa, sinir ağları son derece karmaşık organizasyonları nedeniyle manuel yaklaşımlar için tamamen erişilemez.

Bir yandan, manuel segmentasyon çok hassastır çünkü insan gözü ve zekası ile gerçekleştirilir; Öte yandan, gerçekten zaman alıcıdır. Manuel yöntemlerin gerektirdiği yüksek zaman harcaması ana dezavantajdır. Bu nedenle, analiz için sadece birkaç nöron elde edilir, bu da onu zaman açısından daha az doğru ve maliyetli hale getirir. Otomatik ya da yarı otomatik yaklaşımlar ise harcanan zamanı kısmen azaltıyor. Bununla birlikte, bazı dezavantajları da vardır. Otomatik yöntemlerin düzgün çalışması için eğitilmesi gerekir ve yazılım kullanıcıyla yeterince etkileşimli değilse, segmentasyon yanlış olabilir.

Nörit büyüme ölçümü dışında, dal noktalarının sayısı da değerli bir bilgidir. Manuel segmentasyon ile dallanma noktalarının sayısı hesaplanabilirken, bu bir vektör mesafesi ile mümkün değildir. Otomatik yöntemlerde genellikle dallanma noktalarının sayısı sağlanırken, Sholl analizinde matematiksel bir formülle hesaplanması gerekir.

Bu yöntem belgesinde, bu yarı otomatik yazılımın toplam aksonal uzunluğu ve diğer parametreleri ölçmedeki işlevselliğini ve etkinliğini açıklamayı amaçlıyoruz. Makine, görüntülerin belirli zaman noktalarında otomatik olarak alınmasına veya canlı hücreler için fizyolojik bir ortamın korunmasına izin vererek uzun vadeli çalışmalar (günler, haftalar, aylar) yapılmasına olanak tanır. Faz kontrastlı hızlandırılmış görüntüleme kullanılarak nörit büyümesinin ölçülmesi, nörit kinetiğinin ve büyümesinin sürekli izlenmesini sağlama avantajına sahiptir. Ek olarak, ölü hücreleri hedef alan spesifik boyaların ortama eklenmesi yoluyla hücre ölümünü izlemek de mümkündür 31,32,33. Yazılım 2012 yılında piyasaya sürülmesine rağmen, nörit büyümesinin doğru bir şekilde ölçülmesi için bu metodolojiyi tekrarlanabilir ve tarafsız bir şekilde standartlaştıran ilk biziz. Ancak, yazılımın makinenin satın alınmasına dahil olmadığını unutmamak önemlidir. Bu ek masrafa rağmen, kullanımı toplam aksonal uzunluk ve diğer parametrelerin ölçülmesinde önemli avantajlar sunmakta ve böylece sinirbilim alanındaki araştırmalara katkıda bulunmaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Makinedeki geminin taranması

NOT: Algılama, yerleşik Basler Ace 1920-155 μm kamera tarafından gerçekleştirilir.

  1. Cihaza Bağlan'a tıklayarak ve Zamanlama - Al'ı seçerek programı açın. Ardından + işaretine tıklayın.
  2. Sırasıyla Programa Göre Tara veya Şimdi Bir Kez Tara seçeneğini belirleyerek teknenin tekrar tekrar mı yoksa yalnızca 1x mi taranacağını belirtin.
  3. Taranacak yepyeni bir gemi oluşturmak için Yeni'yi seçin. Yeni bir gemi eklenmezse, aşağıda açıklanan seçeneklerden birini kullanarak yeni bir tarama oluşturun.
    1. Mevcut programdan bir gemi kopyalayarak yeni bir gemi oluşturmak için Akımı Kopyala'yı seçin. Daha önce taranmış bir tekneyi kopyalayarak yeni bir tekne oluşturmak için Öncekini Kopyala'yı seçin.
    2. Ek taramalar için daha önce taranmış bir damarı geri yüklemek için Tarama Ekle'yi seçin.
  4. Tahlil ve uygulamaya göre tarama türünü seçin. Analiz için Standart'ı seçin.
  5. Tarama ayarlarını belirtin. Hücreden Hücreye seçeneklerinden birini seçin, Yok, Hücreye Yapışık veya Hücreye Yapışmayan Hücreye ve Kullanılan floresan moleküllerine bağlı olarak görüntü kanallarını belirtin. Yetişkin ve embriyonik duyusal nöron kültürleri için Yok seçeneğini belirleyin. Hücre satırları için Yok veya Hücre Hücre Yapışık seçeneklerini belirleyin.
  6. Mikroskop objektifini seçin (4x, 10x, 20x). Birincil kültürlerde daha yüksek büyütme (20x) ile elde edilirken, hücre hatlarında 10x yeterlidir.
  7. Sağlanan seçeneklerden taranacak gemi türünü seçin. Çekmecenin sanal haritasında konumunu seçerek teknenin çekmecedeki konumunu belirtin.
  8. Taranacak kuyucukları seçerek görüntü alımı için tarama modelini belirtin. Kuyu başına istediğiniz görüntü sayısını seçin. Tarama süresinin tahmini bir göstergesi görünecektir.
  9. Adını yazarak gemi hakkında bilgi verin ve + işaretine tıklayarak plaka haritasını belirtin.
  10. Sonrakine tıkla. Analiz Türü'nü seçin ve İleri'ye tıklayın. Seçilen seçeneklerin bir özet ekranı görünecektir. Doğruysa, Şimdi Tara'ya tıklayın ve tarama başlayacaktır.

2. Faz kontrast görüntü analizi için kurulum

NOT: Neurotrack analizi yalnızca makine tarafından daha önce alınan görüntüler üzerinde gerçekleştirilebilir.

  1. Analiz etmek için Taranan Tekneyi seçin. Analizi Başlat'ı seçin. Yeni Analiz Tanımı Oluştur'u seçin.
  2. Neurotrack'i seçin. Görüntü Kanalları'nı seçin. Analizi gerçekleştirmek için temsili bir görüntü kümesi seçin. Algoritmayı eğitmek için her kuyu için tüm görüntüleri seçin.
  3. Aşağıdaki parametreleri ayarlayarak Analiz Tanımı ayarlarını iyileştirin.
    NOT: Varsayılan olarak, nöritler macenta olarak bölümlere ayrılırken, hücre gövdeleri sarı renktedir. Renkleri istediğiniz gibi değiştirmek mümkündür.
    1. Hücre-gövde kümesi segmentasyonu için, aşağıdakileri aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
      1. Segmentasyon modu: Görüntülerin segmentasyonu, hücre gövdelerini arka plandan ve nöritlerden ayırt etmek için yapılır. Parlaklık ve Doku arasında seçim yapın. Birincil kültürler ve hücre çizgileri için Parlaklık modunu seçin.
      2. Segmentasyon ayarı: Segmentasyon hassasiyetini daha fazla arka plana veya daha fazla hücreye doğru ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın. 0 (Arka Plan) ile 2 (Hücreler) arasında değişir. Sarı maskenin boyutunu arttırır veya azaltır. Kaydırıcıyı 0'a (Arka Plan) doğru hareket ettirin, böylece sarı maskenin boyutu kademeli olarak azalacak ve macenta maske için yer bırakacaktır. Kaydırıcı 2'ye (Hücreler) doğru hareket ettirilirse bunun tersi gerçekleşir.
    2. Temizleme için, aşağıdakileri aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
      1. Delik Doldurma (μm2): Hücre gövdesi maskesindeki kullanıcı tarafından belirtilen alandan daha küçük olan herhangi bir deliği çıkarmak için bunu ayarlayın.
      2. Boyutu (piksel) ayarla: Sarı maskeyi belirtilen piksel sayısı kadar artırın (pozitifse) veya küçültün (negatifse). -10 ile +10 arasında değişir. Ölü hücreler ve hücresel kalıntılar gibi yüksek kontrastlı nesnelere sarı segmentasyon eklemek veya kaldırmak için bunu ayarlayın.
      3. Minimum hücre genişliği (μm): Hücre gövdelerinin nörit olarak kabul edileceği boyutu tanımlamak için bir değer seçin.
    3. Hücre gövdesi küme filtreleri için, aşağıdakileri aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
      1. Alan (μm2): Hücre gövdesi alanının minimum ve maksimum değerini ayarlayın. Ayarlanan değerlerin üstündeki ve altındaki değerler hücre gövdesi olarak kabul edilmeyecektir.
    4. Nörit parametreleri için aşağıdakileri aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
      1. Filtreleme: Küçük damar kusurlarının ve döküntülerin maskelenmesini azaltır. Hiçbiri, Daha İyi ve En İyi seçenekleri arasından seçim yapın. Yalnızca çok temiz kültürler ve kaplar için Yok'u seçin. Çok ince nöritlerin algılanmasını kaybetme pahasına daha hızlı işleme için Daha İyi'yi seçin. Kalın veya yüksek kontrastlı nöritlere sahip hücreler için yeterli olabilir; Ayrıca, birçok kusuru veya kalıntısı olan gemiler için de faydalı olabilir. Daha uzun işlem süresi için En İyi'yi seçin, ancak çok ince nöritlerin algılanmasını sağlamak için en hassas filtre ayarıdır.
      2. Nörit hassasiyeti: Algılama hassasiyetini ayarlamak için kullanın. Daha ince nöritleri tespit etmek için hassasiyeti artırın. 0,25 (Daha Az) ile 0,75 (Daha Fazla) arasında değişir.
        NOT: Yazılımın nöritleri tanıma hassasiyetini artırır veya azaltır. Kaydırıcı 0,25'e (Daha Az) doğru hareket ettirilirse, yazılım nöritleri tanıma konusunda daha katı olacaktır. Bunun yerine, kaydırıcı 0,75'e (Daha Fazla) doğru hareket ettirilirse, yazılım bu algılamada daha az katı olacaktır ve bu nedenle daha fazla kusur (yani hücre kalıntısı, kir) nörit olarak kabul edilecektir.
      3. Nörit genişliği (μm): Algılamayı nöronların boyutuna göre ayarlamak için kullanın. 1, 2 veya 4 olabilir. Artırarak, daha ince nöritler dikkate alınmayacaktır. Birincil yetişkin duyusal nöron kültürleri için 1'e ve hücre hatları ve embriyonik duyusal nöron kültürleri için 2'ye ayarlayın.
  4. Segmentlere ayrılmış görüntüyü görselleştirmek için Geçerli Önizleme'yi tıklatın. Her görüntü için aşağıdaki ölçümler sağlanacaktır: Nörit Uzunluğu (mm/mm2), Nörit Dal Noktaları (mm2 başına), Hücre-Gövde Kümeleri (mm2 başına) ve Hücre-Gövde Küme Alanı (mm2/mm2).
  5. Seçilen tüm görüntüler için 2.3 ve 2.4 adımlarını tekrarlayın. Sonrakine tıkla.
  6. Analiz etmek için Tarama süresini ve kuyusunu seçin. Bir Tanım Adı ve gerekirse Analiz Notları atayın. Sonraki > Son'a tıklayın.

3. İmmünositokimya (ICC) görüntü analizi için kurulum

  1. 2.1'den 2.4'e kadar gösterilen aynı adımları izleyin. Nöritler ve çekirdekler için Görüntü Kanalları'nı seçin. Görüntü Kümesi'ni seçin; Algoritmayı eğitmek için her kuyu için tüm görüntüler'i seçin.
  2. Aşağıdaki parametreleri aşağıda açıklandığı gibi ayarlayarak Analiz Tanımı ayarlarını iyileştirin.
    NOT: Varsayılan olarak, nöritler mavi renkte bölümlere ayrılırken, hücre gövdeleri mor renktedir. Bununla birlikte, renkler istenildiği gibi değiştirilebilir.
    1. Hücre-gövde kümesi segmentasyonu: Görüntüyü ilgilenilen nesnelere bölmek için bunu kullanın. Görüntüdeki her pikselde arka plan parlaklığını tahmin edin. Arka plan bulunduktan sonra, aşağıdaki seçeneklerden birini gerçekleştirin.
      1. Arka planda çıkarma yok: Orijinal resmi değiştirmeden bölümlere ayırmak için bunu kullanın. Uyarlanabilir veya Sabit Eşik arasında seçim yapın. Uyarlanabilir: arka plan nesneleri bulmak için kullanılır, ancak açıkça çıkarılmaz; bu seçenek ile Eşik Ayarını (GCU) ayarlamak mümkündür. Sabit Eşik: bu eşikten daha parlak olan nesneler orijinal görüntüde algılanır; bu seçenekle Eşiği (GCU) ayarlamak mümkündür.
      2. Arka plan çıkarma: Üst Şapka dönüşümü kullanarak görüntüden arka planı çıkarmak için bu seçeneği kullanın, sonra buna bir eşik uygulayın. Bu seçenekle, Yarıçap ve Eşik'i ayarlayın. Yarıçap: bu yarıçapın bir diski kullanılır; Disk, görüntüdeki herhangi bir nesneye tam olarak sığmayacak kadar büyük olmalıdır. Eşik: Bu eşikten daha parlak olan nesneler, arka plan çıkarılan görüntüde algılanır.
    2. Temizleme: Bunu gerçekleştirmek için aşağıdaki seçeneği kullanın.
      1. Delik doldurma (μm2): Hücre gövdesi maskesinde belirtilen alandan daha küçük olan delikleri çıkarmak için bunu kullanın.
      2. Boyutu (piksel) ayarla: Mor maskeyi belirtilen piksel sayısı kadar artırmak (pozitifse) veya küçültmek (negatifse) için bunu kullanın. Aralık -10 ila +10'dur. Ölü hücreler ve hücresel kalıntılar gibi yüksek kontrastlı nesnelere mor ekler veya çıkarır.
      3. Minimum hücre genişliği (μm): Hücre gövdelerinin nörit olarak kabul edileceği boyutu tanımlamak için bunu kullanın.
    3. Hücre gövdesi küme filtreleri: Filtreleri uygulamak için aşağıdaki seçeneği kullanın.
      1. Alan (μm2): Hücre gövdesi alanının minimum ve maksimum değerini ayarlayın. Ayarlanan değerlerin üstündeki ve altındaki değerler hücre gövdesi olarak kabul edilmeyecektir.
    4. Nörit parametreleri: Bunları ayarlamak için aşağıdaki seçeneği kullanın.
      1. Nörit kaba hassasiyeti: Nörit parlaklığını ayarlamak için bunu kullanın. Nöritlerin floresan yoğunluğu düşükse hassasiyet arttırılmalıdır. 0 (Az) ile 10 (Fazla) arasında değişir. Daha az parlak nöritleri tanımak için yazılımın hassasiyetini artırır veya azaltır. Optimal değerler 7 ile 10 arasındadır; 10 olarak ayarlanırsa, nörit ölçümünde arka planın da dikkate alınma olasılığının çok yüksek olduğunu unutmayın.
      2. Nörit ince hassasiyeti: Algılama hassasiyetini ayarlamak için bunu kullanın. Daha ince nöritleri tespit etmek için hassasiyet arttırılmalıdır. 0,25 (Daha Az) ile 0,75 (Daha Fazla) arasında değişir. İnce ve daha az parlak nöritleri tanımak için yazılımın hassasiyetini artırır veya azaltır. Kaydırıcı 0,25 (Daha Az) konumuna doğru hareket ettirilirse, yazılım soluk nöritleri dikkate almayacaktır. Bunun yerine, kaydırıcı 0,75 (Daha) değerine doğru hareket ettirilirse, yazılım çok soluk (neredeyse arka plan) nöritleri de algılayacaktır.
      3. Nörit genişliği (μm): Algılamayı nöronların boyutuna göre ayarlamak için bunu kullanın. 1, 2 veya 4 olabilir. Artırarak, daha ince nöritler dikkate alınmayacaktır. Birincil yetişkin duyusal nöron kültürleri için 1'e, hücre hatları ve embriyonik duyusal nöron kültürleri için 2'ye ayarlayın.

4. Veri dışa aktarma

  1. Analizi açın. Grafik metrikleri'ne tıklayın.
  2. İlgilendiğiniz Metriği, Zaman Noktalarını ve Kuyuları seçin.
  3. Tümü, Hiçbiri, Sütunlar, Satırlar ve Plaka Haritası Çoğaltmaları arasından gruplandırma seçeneğini belirleyin.
  4. Verileri Dışa Aktar'a tıklayın ve hedef klasörü ve gerekirse diğer seçenekleri seçin. Bir .txt dosyası oluşturulacaktır.
    NOT: Makine, her kuyu için seçilen metriğin tek bir ortalama değerini sağlayacaktır. Tek görüntü değerlerini almak için analiz sırasında manuel açıklama gereklidir.

5. Görüntü dışa aktarma

  1. Gemiyi açın. Tıklamak Görüntüleri ve filmleri dışa aktar.
  2. Görüntüler için dışa aktarma türünü seçin.
    1. Görüntüleri görüntülendiği gibi dışa aktarmak için Görüntülendiği Gibi'yi seçin. İleri'ye tıklayın ve dışa aktarılacak İlgilenilen Görüntüler'i seçin. Sonrakine tıkla.
      1. Tek Bir Film veya Görüntü Dizisi ile ilgilendiğiniz zaman noktaları arasındaki Sekans Türü'nü seçin. Sonrakine tıkla.
      2. Dışa aktarma seçeneklerini gerektiği gibi ayarlayın ve İleri'ye tıklayın. Çıktı klasörünü, dosya biçimini ve dosyanın adını ayarlayın, ardından Dışa Aktar'ı tıklayın.
    2. Görüntüleri ham formatta dışa aktarmak için Saklandığı Gibi'yi seçin. Görüntü Türü'nü seçin.
      1. İlgilendiğiniz Zaman Noktalarını ve Kuyuları seçin. Sonrakine tıkla. Çıktı klasörünü, dosya biçimini ve dosyanın adını ayarlayın, ardından Dışa Aktar'ı tıklayın.
  3. Segmentasyon maskeleri ile görüntü dışa aktarma
    1. Analizi açın. Görüntü katmanları simgesine tıklayın. İstediğiniz kanal maskelerini seçin (faz nörit ve faz hücre-gövde kümesi). Adım 5.2'yi izleyin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nörit büyümesi ölçüm algoritması, hem sinir ağlarında hem de tek nöronlarda nöritleri sağlam bir şekilde tespit etme yeteneğine sahiptir. Hücre gövdeleri, hücresel kalıntılar, ölü hücreler, doku eksplantları ve gölgeler gibi yüksek kontrastlı nesneleri segmentlere ayıran sarı bir maske oluşturur. Ek olarak, çeşitli kalınlıklardaki nöritlerde macenta bir maske belirir. Nörit uzunluk değerleri mm/mm2 cinsinden verilmiştir, bu da aksonal uzunluğun görüntünün 0,282739mm2 olan ve her tarama koşulu için sabit olan alanına bölündüğünü gösterir. Bu nedenle, nörit uzunluğunun mm cinsinden saf değerlerini elde etmek için, yazılım tarafından sağlanan sayıların görüntünün alanı ile çarpılması gerekir.

Yarı otomatik ve manuel yöntem
Kullanılan yazılım, toplam aksonal uzunluğu ölçmek için yarı otomatik bir metodolojidir. Yazılımın doğruluğunu değerlendirmek için, NeuronJ eklentisi ile de manuel yöntemi kullanarak aynı nöronlar üzerinde ölçümler yaptık. Şekil 1'de gösterildiği gibi, nöronlar üzerindeki segmentasyon maskesi iki yöntem arasında oldukça benzerdir (Şekil 1A).

Ek olarak, korelasyonlarını incelemek için elde edilen değerler üzerinde istatistiksel analizler yaptık. Spearman korelasyon analizi, 0.8526'lık yüksek bir r katsayısı verdi, bu nedenle algoritmanın doğruluğu ve kesinliği hakkında güçlü kanıtlar sağladı (Şekil 1B). Otomatik ölçüm, temizliğine, yoğunluğuna ve saflığına bağlı olarak yüksek standartlarda kültür kalitesi gerektirir. Yarı otomatik segmentasyon ile elde edilen sonuçlar tekrarlanabilir ve bireysel yargıdan etkilenmez. Tarafsız tekrarlanabilirlik, manuel metodolojiler için bir sorundur.

Bazen farklı nedenlere bağlı olarak yarı otomatik segmentasyon hataları ortaya çıkabilir. Faz kontrast görüntülerinde, kültürdeki kir, yarı otomatik segmentasyon ile nörit olarak tespit edilebilir. Ayrıca, farklı hücre tiplerinin varlığı segmentasyon sürecini bozabilir. İnsan gözü ile yapıldığı için manuel segmentasyon ile bu tür sorunlar ortaya çıkmaz. Bununla birlikte, bu tür sorunlar ortaya çıkarsa, immünositokimya görüntüleri kontrol olarak kullanılarak üstesinden gelinebilir.

Nöritlerin segmentasyonu
Yetişkin DRG nöron primer kültürleri için, güvenilir bir faz analizi için en uygun başlangıç noktası, nöronların iyi ve temiz kültürde düzgün bir şekilde kaplanmasıdır. Tohumlama sırasında hatalar meydana gelirse ve hücreler Şekil 2A-B'de gösterildiği gibi tek bir noktada yoğunlaşırsa, değerler gerçekliğin yakın bir yansımasından çok bir tahmin olacaktır. Bu gibi durumlarda, sarı maske hücreler arasındaki nöritlerin çoğunu kaplayacak (Şekil 2A-B), böylece nörit uzunluğunun kaybına neden olacaktır. Ayrıca, yazılım nöritlerin tanınmasında önemli ölçüde önyargılı olacaktır ve nörit olmayan nesneler üzerinde macenta bir maskenin görünmesi çok muhtemeldir (Şekil 2D). Optimal bir görüntüde, 20x büyütmede 15'e kadar nöron olmalıdır.

Şekil 3A-B'de gösterildiği gibi nöronlar doğru bir şekilde kaplandığında ve kültür temiz olduğunda, segmentasyon kaydırıcısının arka plana doğru ayarlanması önerilir (0,5 - 0,7; Şekil 3C). Bu, macenta olması gereken dallanma noktaları gibi görüntüdeki yüksek kontrastlı nesnelerde görünecek sarı bileşenin azaltılmasına yardımcı olur. Ayrıca, nöritler kalınsa, 0.4 ile 0.5 arasında bir nörit duyarlılığı çoğunu kapsamak için yeterli olmalıdır (Şekil 3C-D).

Ortaya çıkabilecek diğer bir yaygın durum, Şekil 4A-B'de gösterildiği gibi birçok hücre kalıntısı ve ölü hücre içeren kirli bir kültürdür. Bu gibi durumlarda, birçok yüksek kontrastlı nesne vardır. Bu nedenle, segmentasyon kaydırıcısını hücreye doğru ayarlayarak veya boyut ayarlama parametresini (+1, +2 vb.) artırarak sarı maskenin boyutunu artırmanız önerilir; Şekil 4C). Bununla birlikte, yazılımın nörit olmayan nesneleri yanlış bir şekilde nörit olarak tanımlamasını önlemek için nörit hassasiyetini biraz azaltmak da faydalı olacaktır. (Şekil 4C-D).

Bazen, nöritler, Şekil 5A-B'de gösterildiği gibi çok ince ve soluk görünebilir ve bu da yazılımın bunları doğru bir şekilde segmentlere ayırması için zorluklar doğurur (Şekil 5D). Bu durumda, nörit duyarlılığının en az 0,6'ya çıkarılması tavsiye edilir (Şekil 5C). Bununla birlikte, hassasiyet ne kadar yüksek olursa, yazılımın nörit olmayan nesneleri yanlış bir şekilde işaretleme olasılığının o kadar yüksek olduğunu unutmayın (Şekil 5D). Duyarlılık yanlılığının çok fazla artmasını önlemek için bazı önlemler alınabilir, örneğin segmentasyon kaydırıcısını hücrelere doğru ayarlayarak. Bununla birlikte, nöritler yazılım tarafından tespit edilemeyecek kadar inceyse, nörit uzunluk değerleri ne olursa olsun önyargılı olacaktır.

İmmünositokimya görüntüleri söz konusu olduğunda, asıl sorun arka planda yatmaktadır. Yukarıda belirtilen kuralların geçerli olduğu tohumlama koşullarının yanı sıra, birincil önyargı kaynağı floresanın kendisidir. Yazılım, çok parlak nöritleri etkili bir şekilde tanırken, daha ince, daha az yoğun nöritler geride kalır (Şekil 6A-B). Nörit uzunluğunun kaybını önlemek için, nörit ince hassasiyeti 0,75'e kadar arttırılabilir (Şekil 6C). Bununla birlikte, arka plandaki nöritleri dikkate alarak aşırı algılama yanlılığını önlemek için nörit kaba hassasiyetinin en az 8-9'a düşürülmesi şiddetle tavsiye edilir (Şekil 6C-D). İkincisi azaltılmazsa, tüm arka plan Şekil 7'de gösterildiği gibi bölümlere ayrılacaktır.

Floresan alımıyla ilgili yaygın bir sorun, ışığın saçılmasıdır. Genellikle, immünositokimya görüntüleri, görüntüde analizin kalitesini ve hassasiyetini önemli ölçüde etkileyen el fenerleri sunar (Şekil 8A-B). Böyle bir durumda, analizi iyileştirmek için pek bir şey yapılamaz ve değerler daha çok bir tahmin olacaktır. Işık saçılımı, nörit tanımaya müdahale eder, böylece yalnızca çok parlak nöritler tespit edilir (Şekil 8C-D). İmmünositokimya görüntülerindeki bir diğer konu da boyamanın kalitesidir. Sıklıkla, insan hataları nedeniyle, aksonlar kırılabilir (Şekil 9A) ve yıkama sırasında hücre gövdeleri yırtılabilir (Şekil 9B). Bu hatalar, nörit uzunluk değerleri hassasiyet ve doğruluğu kaybettiği için kritik bir sorun teşkil eder. Sonuç olarak, biyolojik verilerin yorumlanması değişmekte ve yanlış sonuçlara yol açmaktadır.

Embriyonik kültürler için durum farklıdır. Bu tür bir kültürde, glial hücrelerin varlığı baskındır. Sonuç olarak, yazılım glial hücrelerin astarlarını da tespit ettiği için hatalar önemli ölçüde artar (Şekil 10A-B). Bu sorunu en aza indirmek için, segmentasyon kaydırıcısı hücrelere doğru, tipik olarak 1.7-2 değerleri civarında hareket ettirilmelidir (Şekil 10C-D). Bu yaklaşım, glial hücrelerin çoğunun sarı maske ile kaplanmasını ve bu nedenle nörit uzunluğu ölçümünde dikkate alınmamasını sağlar. Bir başka yararlı ipucu, kültürdeki embriyonik nöronlar tipik olarak kalın nöritlerle bipolar veya unipolar şekiller sergilediğinden, nörit genişliğini 2'de tutmaktır (Şekil 10C-D). Bu önlem, genellikle çok ince olan glial hücrelerin astarlarının çoğunu filtreler. Son olarak, nörit hassasiyetini çok fazla artırmamaya dikkat edin; Aksi takdirde, nörit genişliği parametresi tarafından filtrelenenler, nörit uzunluğu ölçümüne tekrar dahil edilecektir.

Glial hücre bileşeninin baskın olduğu embriyonik kültürler söz konusu olduğunda, immünositokimya daha iyi bir seçenek olabilir. Nöronları spesifik olarak boyayarak, glia boyanmayacağından glia'nın segmentasyonu sorunu çözülür ve bu da analizi çok daha kolay ve daha doğru hale getirir (Şekil 11).

Son olarak, yazılım, büyüme durumlarını değerlendirmek için hücre hatlarının ve/veya iPSC'lerin farklılaşma programını değerlendirmek için de kullanılabilir. Böylece, benzer parametrelerin ve önlemlerin uygulanması farklı hedefler için kullanılabilir.

Farklılaşma süreci ile ilgili olarak, yazılımın sağlamlığı, motonöron benzeri hücrelere olgunlaşma sırasında NSC-34 hücre hattında (fare nöroblastom hücreleri ve fare embriyolarının omuriliğinden türetilen motonöronlar tarafından oluşturulan hibrit hücre hattı) kanıtlanmıştır. DRG primer kültürlerine gelince, iyi analiz için en uygun başlangıç noktası tek tip hücre tohumlamasıdır. Farklılaşmamış ve farklılaşmış hücreler, retinoik asit tedavisi üzerine, tüm kültür periyodu boyunca veya Şekil 12'de gösterildiği gibi, son zaman noktasında edinimler kullanılarak takip edilebilir.

Gerçekten de, nörit uzunluğuna ek olarak, algoritma aynı zamanda dallanma noktası parametresini de sağlar. Ancak, dallanma noktası parametresinin dallanma noktalarının tam sayısını temsil etmediğine dikkat etmek önemlidir; daha ziyade, mm/mm2 olarak ifade edildiği gibi görüntüdeki dallanma yoğunluğunu gösterir. Bu ölçüm, kültürdeki döküntülerden ve tohumlama konsantrasyonundan önemli ölçüde etkilenir. Bu nedenle, görüntüdeki nöronların yoğunluğu ve kültürün temizliği, güvenilir değerler elde etmek için çok önemli faktörlerdir. Kültür, sarı maske tarafından filtrelenmemiş çok sayıda hücre kalıntısı sunuyorsa, bunlar nörit uzunluğuna ve dal noktası ölçümüne dahil edilecektir.

Sonuç olarak, görüntüdeki nöron sayısı nörit uzunluğu ve dal noktası ölçümlerini etkilediğinden, hücre sayısı için bu değerlerin normalleştirilmesi önerilir.

Hücre gövdelerinin segmentasyonu
Sistem tarafından sağlanan tüm parametreler arasında hücre-gövde kümesi ve hücre-gövde kümesi alanı vardır. Ancak, bu iki parametrenin hücre sayımı için değer olarak kullanılması güvenilir değildir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, yazılım, kuyudaki orta hareketin neden olduğu gölgeler de dahil olmak üzere yüksek kontrastlı nesneleri sarı maskede bölümlere ayırır. Ek olarak, ölü hücreleri ve hücresel kalıntıları da segmentlere ayırır (Şekil 4). Büyüyen nöronların güvenilir bir hücre sayımını elde etmek için, Fiji'deki Hücre Sayacı aracı (Şekil 13) gibi manuel bir yöntem kullanılabilir.

Kültür tipine göre sıralanmış önerilen analiz parametrelerinin bir özeti, faz görüntüleri için Tablo 1'de ve immünositokimya görüntüleri için Tablo 2'de verilmiştir. Ayrıca, belirli sorunları çözmek için önerilen analiz parametrelerinin bir özeti Tablo 3'te verilmiştir.

figure-results-1
Şekil 1: Manuel ve yarı otomatik nörit segmentasyonu arasındaki korelasyon analizi. (A) Solda, Fiji'deki NeuronJ eklentisi ile bölümlere ayrılmış bir nöronun temsili bir faz görüntüsü. Sağ tarafta, bir nöronun temsili bir faz görüntüsü, yarı otomatik yazılımla bölümlere ayrılmıştır. (B) 20 nöron üzerinde çalıştırılan basit bir doğrusal regresyon hem manuel hem de yarı otomatik yöntemlerle analiz edildi. Spearman korelasyon katsayısı r = 0.8526, p**** < 0.0001. Görüntüler tohumlamadan 48 saat sonra elde edildi. Büyütme 20x. Ölçek çubuğu, 50 μm. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Erişkin duyusal nöron kültüründe tohumlama hatası. (A) Tohumlama hatasının temsili faz görüntüsü. (B) Temsilci otomatik olarak bölümlere ayrılmış görüntü. Sarı maske hücre gövdelerini segmentlere ayırır, macenta maske segmentleri nöritlerdir. (C) Açıklayıcı nörit büyüme analizi tanım parametreleri. (D) Üst panel: hücre gövdelerinin kümelenmesi nedeniyle hücre gövdesi segmentasyonu (sarı maske) hatasını yakınlaştırın. Alt panel: hücresel kalıntı nedeniyle nörit segmentasyonu (macenta maskesi) hatasını yakınlaştırın. Görüntüler tohumlamadan 48 saat sonra elde edildi. Büyütme 20x. Ölçek çubuğu, 50 μm. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Nörit büyüme analizi için ideal yetişkin duyusal nöron kültürü. (A) Nörit büyüme analizi için ideal bir tohumlama koşulunun temsili faz görüntüsü. (B) Temsilci otomatik olarak bölümlere ayrılmış görüntü. Sarı maske hücre gövdelerini segmentlere ayırır, macenta maske segmentleri nöritlerdir. (C) Açıklayıcı nörit büyüme analizi tanım parametreleri. (D) Hücre gövdesi segmentasyonunu (sarı maske) ve nörit segmentasyonunu (macenta maske) yakınlaştırın. Görüntüler tohumlamadan 48 saat sonra elde edildi. Büyütme 20x. Ölçek çubuğu, 50 μm. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Yetişkin duyusal nöron kültüründe nörit büyüme analizinde rahatsız edici unsurlar. (A) Ortam hareketlerinden kaynaklanan hücresel döküntü ve gölgelerin temsili faz görüntüsü. (B) Temsilci otomatik olarak bölümlere ayrılmış görüntü. Sarı maske hücre gövdelerini segmentlere ayırır, macenta maske segmentleri nöritlerdir. (C) Açıklayıcı nörit büyüme analizi tanım parametreleri. (D) Hücre kalıntıları ve hareketli ortamın gölgeleri nedeniyle hücre gövdesi segmentasyonu (sarı maske) ve nörit segmentasyonu (macenta maske) hatasını yakınlaştırın. Görüntüler tohumlamadan 48 saat sonra elde edildi. Büyütme 20x. Ölçek çubuğu, 50 μm. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Yetişkin duyusal nöron kültüründe nörit büyüme analizinde ince nöritler. (A) Çok ince nöritlerle karakterize edilen nöronların temsili faz görüntüsü. (B) Temsilci otomatik olarak bölümlere ayrılmış görüntü. Sarı maske hücre gövdelerini segmentlere ayırır, macenta maske segmentleri nöritlerdir. (C) Açıklayıcı nörit büyüme analizi tanım parametreleri. (D) Üst panel: nörit segmentasyonunun (macenta maskesi) algılama sınırları nedeniyle nörit uzunluğu kaybını yakınlaştırın. Alt panel: yabancı cisimlerde nörit segmentasyonu (macenta maskesi) hatasını yakınlaştırın. Görüntüler tohumlamadan 48 saat sonra elde edildi. Büyütme 20x. Ölçek çubuğu, 50 μm. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Yetişkin duyusal nöron kültüründe nörit büyüme analizinde nöritlerin parlaklığı. (A) Çok parlak ve kalın nöritlerle karakterize edilen nöronların temsili immünositokimya görüntüsü (nöronal belirteç Tuj1). (B) Temsilci otomatik olarak bölümlere ayrılmış görüntü. Mor maske hücre gövdelerini segmentlere ayırır, mavi maske segmentleri nöritlerdir. (C) Açıklayıcı nörit büyüme analizi tanım parametreleri. (D) Üst panel: nöritlerin kalınlığı nedeniyle hücre gövdesi segmentasyon hatasını (mor maske) yakınlaştırın. Alt panel: kalın nöritlerin yoğun floresan parlaklığı nedeniyle nörit uzunluğu kaybını yakınlaştırın. Görüntüler tohumlamadan 48 saat sonra elde edildi. Büyütme 20x. Ölçek çubuğu, 50 μm. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Yetişkin duyusal nöron kültüründe nörit büyüme analizinde arka plan floresansı. (A) Yüksek arka plan floresan gürültüsünün temsili immünositokimya görüntüsü (nöronal belirteç Tuj1). (B) Temsilci otomatik olarak bölümlere ayrılmış görüntü. Mor maske hücre gövdelerini segmentlere ayırır, mavi maske segmentleri nöritlerdir. (C) Açıklayıcı nörit büyüme analizi tanım parametreleri. (D) Arka plan floresansının paraziti nedeniyle nörit segmentasyon hatasını (mavi maske) yakınlaştırın. Görüntüler tohumlamadan 48 saat sonra elde edildi. Büyütme 20x. Ölçek çubuğu, 50 μm. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Yetişkin duyusal nöron kültürünün nörit büyümesi analizinde ışık saçılımı. (A) Işık saçılımının temsili immünositokimya görüntüsü (nöronal belirteç Tuj1). (B) Temsilci otomatik olarak bölümlere ayrılmış görüntü. Mor maske hücre gövdelerini segmentlere ayırır, mavi maske segmentleri nöritlerdir. (C) Açıklayıcı nörit büyüme analizi tanım parametreleri. (D) Üst panel: ışık saçılımının girişiminden dolayı nörit uzunluğu kaybını yakınlaştırın. Alt panel: hücre gövdesi segmentasyon hatasını yakınlaştırın (mor maske). Görüntüler tohumlamadan 48 saat sonra elde edildi. Büyütme 20x. Ölçek çubuğu, 50 μm. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: Yetişkin duyusal nöron kültürünün nörit büyüme analizine müdahale eden boyama prosedürünün kaliteyi etkileyen hataları. (A) Solda, yetişkin duyusal nöronların temsili bir faz görüntüsü. Sağda, boyama prosedüründe yıkamaya bağlı olarak kırılan nöritlerin temsili bir immünositokimya görüntüsü (nöronal belirteç Tuj1). (B) Solda, yetişkin duyusal nöronların temsili bir faz görüntüsü. Sağda, boyama prosedürünün yıkanması nedeniyle hücre gövdesinin çıkarılmasının temsili bir immünositokimya görüntüsü (nöronal belirteç Tuj1). Görüntüler tohumlamadan 48 saat sonra elde edildi. Büyütme 20x. Ölçek çubuğu, 50 μm. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10
Şekil 10: Nörit büyüme analizi için ideal embriyonik (E13.5) duyusal nöron kültürü. (A) Embriyonik duyusal nöron kültüründe nörit büyümesi analizi için ideal bir tohumlama koşulunun temsili faz görüntüsü. (B) Temsilci otomatik olarak bölümlere ayrılmış görüntü. Sarı maske hücre gövdelerini segmentlere ayırır, macenta maske segmentleri nöritlerdir. (C) Açıklayıcı nörit büyüme analizi tanım parametreleri. (D) Hücre gövdesi segmentasyonunu (sarı maske) ve nörit segmentasyonunu (macenta maske) yakınlaştırın. Görüntüler tohumlamadan 24 saat sonra elde edildi. Büyütme 20x. Ölçek çubuğu, 50 μm. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-11
Şekil 11: Nörit büyüme analizi için ideal embriyonik (E13.5) duyusal nöron kültürü. (A) Nörit büyüme analizi için ideal bir embriyonik duyusal nöron kültürünün temsili immünositokimya görüntüsü (nöronal belirteç Tuj1). (B) Temsilci otomatik olarak bölümlere ayrılmış görüntü. Mor maske hücre gövdelerini segmentlere ayırır, mavi maske segmentleri nöritlerdir. (C) Açıklayıcı nörit büyüme analizi tanım parametreleri. (D) Hücre gövdesi segmentasyonunu (mor maske) ve nörit segmentasyonunu (mavi maske) yakınlaştırın. Görüntüler tohumlamadan 24 saat sonra elde edildi. Büyütme 20x. Ölçek çubuğu, 50 μm. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-12
Şekil 12: Diferansiye NSC-34 hücreleri, diferansiye olmayan kontrollere kıyasla artmış nörit ve dallanmaya sahiptir. NSC-34 hücrelerinin temsili görüntüleri. Üst panel: farklılaşmamış NSC-34 hücreleri (kontrol). Alt panel: 96 saatlik retinoik asit tedavisinden sonra farklılaşmış NSC-34 hücreleri. Her iki panelin sol tarafında, faz kontrastlı görüntüler, her iki panelin sağ tarafında, otomatik olarak bölümlere ayrılmış görüntüler (sarı soma, macenta nöritler). Görüntüler tohumlamadan 96 saat sonra elde edildi. Büyütme 10x. Ölçek çubuğu, 50 μm. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-13
Şekil 13: Fiji'deki Hücre Sayacı aracı. Nörit büyümesi analizi için ideal bir tohumlama koşulunun faz görüntüsü üzerinde gerçekleştirilen manuel hücre sayımı. Büyütme 20x. Figür BioRender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kültür türüErişkin DRG kültürü (Faz)Embriyonik DRG kültürü (Faz)NSC-34 (Aşama)
Büyütme20 katı20 katı10 katı
Segmentasyon ModuParlaklıkParlaklıkParlaklık
Segmentasyon Ayarı0.5 - 0.71.7 - 21
Boyutu Ayarla (piksel)0, +1, +20, +10
SüzmeEn iyiEn iyiEn iyi
Nörit Duyarlılığı0.4 - 0.50.25 - 0.40.3 - 0.5
Nörit Genişliği122

Tablo 1: Faz kontrast görüntülerinde yetişkin duyusal nöron kültürleri, embriyonik (E13.5) duyusal nöron kültürleri ve NSC-34 kültürleri için önerilen analiz tanımı parametrelerinin özeti.

Kültür türüYetişkin DRG kültürü (ICC)Embriyonik DRG kültürü (ICC)
Büyütme20 katı20 katı
Segmentasyon ModuParlaklıkParlaklık
Segmentasyon Ayarı0.5 - 0.71.7 - 2
Boyutu Ayarla (piksel)0, +1, +20, +1
SüzmeEn iyiEn iyi
Nörit Kaba Hassasiyeti8 - 98 - 9
Nörit İnce Hassasiyeti0,75'e kadar0.5 - 0.75
Nörit Genişliği12

Tablo 2: İmmünositokimya görüntülerinde yetişkin duyusal nöron kültürleri, embriyonik (E13.5) duyusal nöron kültürleri ve NSC-34 kültürleri için önerilen analiz tanımlama parametrelerinin özeti.

SORUNÖNERİ
Kirli kültürSegmentasyon kaydırıcısını hücrelere doğru ayarlayın
Boyut parametresini ayarla (+1,+2...)
Nörit hassasiyetini biraz azaltın
Soluk/ince nöritlerNörit hassasiyetini artırın (en az 0,6)
Segmentasyon kaydırıcısını hücrelere doğru ayarlayın.
ICC'de ince nöritlerİnce nörit hassasiyetini artırın (0,75'e kadar)
Nörit kaba hassasiyetini azaltın (en az 8-9'a kadar)
Glial hücrelerSegmentasyon kaydırıcısını hücrelere doğru ayarlayın (1.7-2)
Nörit genişliği 2'de

Tablo 3: Farklı kültür türlerindeki belirli sorunları çözmek için önerilen analiz tanımı parametrelerinin özeti.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronların sağlıklı, yaralı ve hastalıklı koşullarda nasıl büyüdüğünü doğru bir şekilde ölçmek, sinirbilim alanındaki birçok deney düzeneğinde kritik bir parametredir. İster tüm DRG eksplantlarının organotipik kültürleri ile ister ayrışmış kültürlerle çalışılıyor olsun, aksonal büyümenin doğru bir şekilde ölçülmesi son 20 yılda önemli bir zorluk olmuştur. Nörit büyümesinin güvenilir ve doğru bir şekilde ölçülmesi olmadan, NSC-34 hücreleri34 için retinoik asit (4 gün boyunca) veya embriyonik DRG nöronları 14,35 için nörotrofinler (1-2 gün boyunca) gibi spesifik bir tedavinin etkili olup olmadığını değerlendirmek imkansızdır. Nöronlar tipik olarak sağlıklı olduklarında sürekli büyüme gösterirler; Bununla birlikte, yaralanmayı takiben aksonal büyüme hızı12,13 artar. Aksonal büyümeyi ölçerken zamanlama çok önemlidir; Bu nedenle, bir deneye başlamadan önce, hücrelerin büyüme hızı plato eğrisine göre sabitlenmesi için en uygun zamanı belirlemek için bir deneme testi yapmak önemlidir.

Yöntemin seçimi, manuel veya otomatik, zaman harcaması ve doğruluk açısından bir dönüm noktasıdır. En yaygın manuel yöntemlerden bazıları NeuronJ18,20 ve Metamorph (Visitron)2,22,28'dir. Manuel yöntemler, kullanıcıların nöritleri manuel olarak izlemesini gerektirir, bu da son derece zaman alıcıdır ve tek hücreli görüntüler gerektirir. Nöritlerin manuel segmentasyonu ile sinir ağlarına tamamen erişilemez. Tipik olarak, bu metodolojiler yalnızca en uzun aksonu ölçer veya vektör mesafe ölçümünü kullanır, böylece dal noktalarının sayısı ve toplam aksonal uzunluk gibi önemli bilgileri kaybeder. Zaten tek hücreli koşullarla sınırlı olan Sholl analizi30 tarafından bir miktar iyileşme sağlanmaktadır. Tek hücreli analiz, hücrelerin tohumlanmasından başlayarak çeşitli zorluklar sunar. Nöronların çok düşük bir konsantrasyonda kaplanması gerekir, bu her hücre tipi için en uygun büyüme koşulu olmayabilir. Başka bir sorun da görüntü elde etmekten kaynaklanmaktadır. Genellikle, konfokal mikroskop, eğitimli kullanıcılar ve floresan nöronlar gerektiren ve ne zaman ne de maliyet açısından verimli olan görüntüleme için kullanılır. Konfokal mikroskop ile yüksek çözünürlüklü görüntüler elde edilir, ancak her deneyden çok az nöron görüntülenir. Yeterli sayıda nörona ulaşmak için daha fazla biyolojik kopya gerektiğinden, bu bir sınırlamayı temsil eder.

NeuroMath 2,28 gibi bazı otomatik metodolojiler, otomatik bir şekilde gerçekleştirilen zaman alıcı nörit segmentasyonu sorununu çözer.

Bununla birlikte, zaman kısıtlamaları nedeniyle, bu nörit büyümesi ölçüm modülü, hızlandırılmış mikroskopi makinesinde görüntü alırken daha hızlı sonuçlar sağlar. İkincisi, bu yazılımla birlikte, hem öğrenciler hem de baş araştırmacılar için zaman ve maliyet verimliliğini önemli ölçüde artırır.

Toplama makinesi, kuyu çapına bağlı olarak değişken sayıda görüntü elde ederek kuyunun eksiksiz bir haritasının oluşturulmasına izin verir. Bu, aynı anda birden fazla nöron görüntülendiği için önemli bir avantajı temsil eder. Bununla birlikte, yalnızca 20x büyütmeye ulaşmak, görüntüleri yazılımla analiz etmek için yeterli ve uygundur. Gücü, bir dizi görüntü üzerinde eğitim alma ve toplam aksonal uzunluğun yarı otomatik bir ölçümünü gerçekleştirme yeteneğine dayanır. Ek olarak, yazılım hem tek nöronlar hem de nöronal ağlar üzerinde çalışabilir. Yazılım, nöritleri ve hücre gövdelerini iki farklı maske ile segmentlere ayırabilir. Sarı maske, görüntüdeki hücre gövdeleri, hücre kalıntıları ve gölgeler gibi tüm yüksek kontrastlı nesneleri bölümlere ayırır. Bunun yerine eflatun bir maske, nöritleri segmentlere ayırır. Yazılımın hassasiyeti ve doğruluğu, aynı nöronların hem yazılım hem de NeuronJ ile segmentasyonu ile kanıtlandı. İstatistiksel analiz açısından bakıldığında, nörit uzunluklarının değerleri, yüksek bir Spearman korelasyon katsayısı ile güzel bir şekilde ilişkilidir.

Yöntemin güvenilirliğini değerlendirdikten sonra, çeşitli test koşullarının analizine geçtik. Optimal bir analiz için bazı önlemler gereklidir. İlk olarak, nöronların yüksek hücre konsantrasyonuna sahip lekelerden kaçınarak kuyuya düzgün bir şekilde tohumlanması gerekir. Nöronların kümelenmesi, yazılımın nöritlerin tespitinde hassasiyetini kaybetmesine neden olur. Analizin doğruluğunu ve kesinliğini etkileyen bir diğer değişken de kültürün temizliğidir. Az sayıda hücresel kalıntı ve ölü hücre içeren temiz bir kültür tercih edilir. Bununla birlikte, yazılım, nörit duyarlılığının modülasyonu ve hücre gövdesi segmentasyon maskesi ile bu tür sorunları telafi edebilir. Daha önce de belirtildiği gibi, sarı maske, ortamın kuyu içindeki hareketinden kaynaklanan gölgelerin de bulunduğu yüksek kontrastlı nesneleri bölümlere ayırır. Gölgeler nöritleri kaplayabilir ve böylece nörit uzunluğunun kaybına neden olabilir. Bununla birlikte, böyle bir sorun, görüntü alımından önce ortamın yerleşmesine izin verilerek kolayca çözülür.

Algoritma, hem faz kontrast görüntüleri hem de immünositokimya görüntüleri üzerinde nörit uzunluğu ölçümü gerçekleştirebilir. Floresan söz konusu olduğunda, güvenilir bir analiz elde etmek için başka önlemler alınmalıdır. İlk olarak, boyamanın kalitesi analizin sonucunu derinden etkiler. Yıkama sırasında nöritler kırılır veya segmentlere ayrılırsa ve hücre gövdeleri yırtılırsa, analiz gücünü ve güvenilirliğini kaybeder. Ek olarak, floresanın kendisi analiz için potansiyel olarak rahatsız edici bir unsuru temsil eder. Odaklama makine tarafından otomatik olarak gerçekleştirildiğinden, objektif artefaktlar, hücre gövdeleri veya kalın nöritler gibi çok parlak nesnelere odaklanır. Sonuç olarak, daha ince ve daha az parlak nöritler geride kalır ve bu da kullanıcının nörit uzunluğunu düzgün bir şekilde ölçmesini zorlaştırır.

Sonuç olarak, faz görüntülerinin analizi, immünositokimya görüntülerinin analizine kıyasla daha sağlam temellere dayanabilir. Yazılım, tek hücreli veya nöronal ağlarda en karmaşık ve ayrıntılı olanlardan en basitlerine kadar birçok farklı nöronal morfoloji üzerinde çalışabilir. Bu nedenle, çeşitli gelişim aşamalarındaki merkezi veya periferik sinir sisteminden gelen nöronların birincil kültürlerinden, iPSC'den türetilmiş nöronlara ve NSC-34 gibi hücre hatlarına kadar birçok farklı araştırma alanında kullanılabilir.

Yazılımın önemli potansiyeline rağmen, bazı sınırlamalar not edilebilir. İlk olarak, hücre gövdesi segmentasyonunun hassasiyeti yetersizdir. Sonuç olarak, hücre gövdesi kümesi ve hücre gövdesi kümesi alanı gibi parametreler hücre sayımı için güvenilir bir şekilde kullanılamaz. İkinci olarak, optimal nörit segmentasyonu için gerekli önlemlere ek olarak, yeterince kalın olmayan aksonlar nörit uzunluğu ölçümünden çıkarılabilir ve bu da veri kaybına neden olabilir.

Dal noktası parametresi her iki segmentasyon türüyle de ilgili sorunlarla karşılaşır. Kültürdeki dal noktalarında lokalize olan gölgeler, ölü hücreler veya kalıntılar, hücre gövdesi segmentasyonu tarafından kaplandıkça onları gizler. Ayrıca, ince nöritler söz konusu olduğunda, dallanma noktası parametresinin güvenilirliği yine ciddi şekilde tehlikeye girer.

Ayrıca, görüntü alımı sırasındaki otomatik odaklama bazen yetersiz kalabiliyor. Makinenin maksimum büyütme oranı 20x ile sınırlıdır, bu da nöritler gibi ince yapılarda daha ince ayrıntıları veya floresanı gözlemlemek için yetersiz olabilir. Ek olarak, makine homojen plastik yüzeylerle en iyi performansı gösterir. Kuyuya bir cam lamel yerleştirilirse, cam üzerindeki odak başarısız olabilir ve bu da kısmen bulanık görüntülere neden olabilir. Bununla birlikte, bu yazılım sadece nöronlar için değil, aynı zamanda mantar büyümesi gibi tamamen farklı araştırma alanları için de geçerlidir36.

Her şey göz önüne alındığında, bu nörit büyüme ölçüm modülünün nöritleri hızlı, tarafsız ve verimli bir şekilde ölçmek için güvenilir bir araç olduğuna inanıyoruz.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, araştırmanın potansiyel olarak çıkar çatışması yaratabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmaksızın yürütüldüğünü beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eleştirel yorumları için Alessandro Vercelli'ye ve yardım için Sartorius'un teknik desteğine teşekkür etmek istiyoruz. Bu konulardaki araştırmamız Rita-Levi Montalcini Grant 2021 (MIUR, İtalya) tarafından cömertçe desteklenmiştir. Bu araştırma, Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca MIUR projesi Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 tarafından Sinirbilim Bölümü Rita Levi Montalcini'ye finanse edilmiştir. DMR'nin araştırması, Sürdürülebilir Kalkınma ve İklim Değişikliği alanında İtalyan ulusal üniversiteler arası doktora kursu sırasında ve bu kursun desteğiyle yürütülmüştür (bağlantı: www.phd-sdc.it).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kollajenaz AMerck / Roche10103586001
Dispase II (nötr proteaz, derece II)Merck / Roche4942078001
Dulbecco'nun modifiye kartal ortamıMerck / SigmaD5796
Fetal bovin serumu Merck / SigmaF7524
Jambonun F-12 Besin Karışımı (1X)ThermoFisher Scientific21765029
Jambonun F12'si, L-GlutaminEurocloneile ECM0135L
Hanks'in Dengeli Tuz ÇözeltisiEurocloneECM0507L
HBSS (10X), kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısı yokThermoFisher Scientific14185045
HyClone Karakterli Fetal Sığır Serumu (ABD)CytivaSH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analiz Yazılımı Sartorius9600-0010
L-15 Orta (Leibovitz)Millipore/SigmaL5520
Laminin Fare Proteini, DoğalThermoFisher Scientific23017015
L-SisteinMerck / SigmaC7352
Leibovitz'in L-15 Medium, L-glutaminEurocloneECB0020L
fare NGF 2.5S (%>95)Alomone LabsN-100
Nörobazal Ortam [-] GlutaminThermoFisher Scientific21103049
NSC-34CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Kanada)CLU140
Papaya lateksSigmaP4762
Penisilin-Streptomisin (5.000 U/mL) pabinalinden (5.000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070063
Percoll ( Yoğunluk 1.130 g / mL)Cytiva17089101
Poli-D-Lizin Çözeltisi (1mg / mL)EMD Millipore/MerckA-003-E
Poli-L-Lizin Çözeltisi (% 0-01)SigmaP4832
Rekombinant İnsan NT-3PeproTech450-03
Retinoik AsitMerck / SigmaR2625
Tripsin-EDTA çözeltisiSigmaT3924
ve beta; -Tubulin III (Tuj1) antikoruMerck / SigmaT8660

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
  2. Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improved long-distance axon regeneration in sprouty2 deficient mice. Dev Neurobiol. 75, 217-231 (2015).
  3. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. J Cell Biol. 218, 1871-1890 (2019).
  4. Marvaldi, L., et al. Importin α3 regulates chronic pain pathways in peripheral sensory neurons. Science. 369, 842-846 (2020).
  5. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606, 137-145 (2022).
  6. Testa, L., Dotta, S., Vercelli, A., Marvaldi, L. Communicating pain: emerging axonal signaling in peripheral neuropathic pain. Front Neuroanat. 18, (2024).
  7. Thongrong, S., et al. Sprouty2 and -4 hypomorphism promotes neuronal survival and astrocytosis in a mouse model of kainic acid induced neuronal damage. Hippocampus. 26, 658-667 (2016).
  8. Yaron, A., Schuldiner, O. Common and divergent mechanisms in developmental neuronal remodeling and dying back neurodegeneration. Curr Biol. 26, R628-R639 (2016).
  9. Maor-Nof, M., et al. Axonal degeneration is regulated by a transcriptional program that coordinates expression of pro- and anti-degenerative factors. Neuron. 92, 991-1006 (2016).
  10. Bromberg, K. D. Regulation of neurite outgrowth by Gi/o signaling pathways. Front Biosci. 13, 4544-4557 (2008).
  11. Girouard, M. P., et al. Collapsin response mediator protein 4 (CRMP4) facilitates wallerian degeneration and axon regeneration following Sciatic nerve injury. eNeuro. 7, (2020).
  12. van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).
  13. Wang, X., et al. Driving axon regeneration by orchestrating neuronal and non-neuronal innate immune responses via the IFNγ-cGAS-STING axis. Neuron. 111, 236-255 (2023).
  14. Kaselis, A., Treinys, R., Vosyliūtė, R., Šatkauskas, S. DRG axon elongation and growth cone collapse rate induced by Sema3A are differently dependent on NGF concentration. Cell Mol Neurobiol. 34, 289-296 (2014).
  15. Maier, O., et al. Differentiated NSC-34 motoneuron-like cells as experimental model for cholinergic neurodegeneration. Neurochem Int. 62, 1029-1038 (2013).
  16. Nango, H., et al. Highly efficient conversion of motor neuron-like NSC-34 cells into functional motor neurons by Prostaglandin E2. Cells. 9, 1741(2020).
  17. Kim, H., Caspar, W. T., Shah, S. B., Hsieh, A. H. Effects of proinflammatory cytokines on axonal outgrowth from adult rat lumbar dorsal root ganglia using a novel three-dimensional culture system. Spine J. 15, 1823-1831 (2015).
  18. Frey, E., et al. An in vitro assay to study induction of the regenerative state in sensory neurons. Exp Neurol. 263, 350-363 (2015).
  19. Zhang, Z., et al. Cerebellar injury and impaired function in a rabbit model of maternal inflammation induced neonatal brain injury. Neurobiol Learn Mem. 165, 106901(2019).
  20. Pemberton, K., Mersman, B., Xu, F. Using ImageJ to assess neurite outgrowth in mammalian cell cultures: Research data quantification exercises in undergraduate neuroscience lab. J Undergrad Neurosci Educ. 16, A186-A194 (2018).
  21. Marvaldi, L., Hausott, B., Auer, M., Leban, J., Klimaschewski, L. A Novel DRAK inhibitor, SC82510, promotes axon branching of adult sensory neurons in vitro. Neurochem Res. 39, 403-407 (2014).
  22. Quarta, S., et al. Peripheral nerve regeneration and NGF-dependent neurite outgrowth of adult sensory neurons converge on STAT3 phosphorylation downstream of neuropoietic cytokine receptor gp130. J Neurosci. 34, 13222-13233 (2014).
  23. Woitke, F., et al. Adult hippocampal neurogenesis poststroke: More new granule cells but aberrant morphology and impaired spatial memory. PLoS One. 12, e0183463(2017).
  24. Xiao, X., et al. Automated dendritic spine detection using convolutional neural networks on maximum intensity projected microscopic volumes. J Neurosci Meth. 309, 25-34 (2018).
  25. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Meth. 168, 134-139 (2008).
  26. Wang, D., et al. HCA-Vision: Automated neurite outgrowth analysis. SLAS Disc. 15, 1165-1170 (2010).
  27. Whitlon, D. S., et al. Novel high content screen detects compounds that promote neurite regeneration from cochlear spiral ganglion neurons. Sci Rep. 5, 15960(2015).
  28. Rishal, I., et al. WIS-neuromath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Dev Neurobiol. 73, 247-256 (2013).
  29. Smith, D. S., Pate Skene, J. H. A Transcription-dependent switch controls competence of adult neurons for distinct modes of axon growth. J Neurosci. 17, 646-658 (1997).
  30. Gardiner, N. J., et al. Preconditioning injury-induced neurite outgrowth of adult rat sensory neurons on fibronectin is mediated by mobilisation of axonal α5 integrin. Mol Cell Neurosci. 35, 249-260 (2007).
  31. Hauck, J. S., et al. Heat shock factor 1 directly regulates transsulfuration pathway to promote prostate cancer proliferation and survival. Commun Biol. 7, 9(2024).
  32. Zhu, Y., et al. Loss of WIPI4 in neurodegeneration causes autophagy-independent ferroptosis. Nat Cell Biol. 26, 542-551 (2024).
  33. Reggiani, F., et al. BET inhibitors drive Natural Killer activation in non-small cell lung cancer via BRD4 and SMAD3. Nat Commun. 15, 2567(2024).
  34. Ackerman, H. D., Gerhard, G. S. Bile acids induce neurite outgrowth in NSC-34 cells via TGR5 and a distinct transcriptional profile. Pharmaceuticals. 16, 174(2023).
  35. Tuttle, R., Matthew, W. D. Neurotrophins affect the pattern of DRG neurite growth in a bioassay that presents a choice of CNS and PNS substrates. Development. 121, 1301-1309 (1995).
  36. Wurster, S., et al. Live monitoring and analysis of fungal growth, viability, and mycelial morphology using the IncuCyte NeuroTrack processing module. mBio. 10 (3), e00673-e00719 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

N rit DallanmasN ronal MorfolojiZaman Atlamal MikroskopiFaz Kontrast G r nt lememm nositokimya G r nt leriDuyu N ron K lt rleriAksonal RejenerasyonN ropatik A r

İlgili makaleler