Yöntem makalesi

Doku Mühendisliği İçin Nanofibriler Desenli Kollajen Üretimi

1.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67165

⸱

20 Eylül 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Aşağıdaki protokol, çok çeşitli doku mühendisliği uygulamalarına uygulanabilen nano ölçekli desenli fibrillere sahip kollajen hidrojellerin üretimi için kesme tabanlı bir ekstrüzyon yöntemi sunar.

Özet

Rejeneratif biyomalzemeler, hasarlı doku ve organların onarımına rehberlik etmek için hücre-materyal etkileşimlerini kolaylaştırmak üzere tasarlanmıştır. Bu materyaller, doğal dokunun biyofiziksel özelliklerini taklit etmek için tasarlanmıştır ve rejeneratif doku nişinin restorasyonuna katkıda bulunan hücresel fenotipik ve morfolojik rehberlik sağlar. Yaygın bir hücre dışı matris proteini olan kolajen, biyouyumluluğu ve diğer olumlu özellikleri nedeniyle bu rejeneratif biyomalzemelerin ortak bir bileşenidir. Bu çalışma, yönlendirilmiş fibril desenleme ile tasarlanmış nanofibriler kollajenin üretimi için yeni ve basit bir yöntemi tanımlamaktadır. Kayma gerilimi, sıcaklık ve pH'ın manipülasyonu sayesinde, kollajen fibrillogenezi ve hizalaması, özel ekipman gerektirmeden hassas bir şekilde kontrol edilir. Bu yaklaşım, anizotropik veya izotropik özellikler sergileyen dokuların doğal yapısını taklit eden nanofibriler kollajen biyomalzemelerinin oluşturulmasına izin verir. Kollajen nanofibril modellemedeki esneklik, yalnızca hücre davranışı üzerinde nano ölçekli modellemenin incelenmesini kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda desenli doku mühendisliği uygulamaları için çeşitli olanaklar sunar.

Giriş

Rejeneratif tıbbın amacı, tasarlanmış terapötiklerin uygulanması yoluyla doku yenilenmesini ve iyileşmesini arttırmaktır. Bir yaklaşım, doğal dokuların bileşimini ve yapısını yakından taklit eden biyomateryal yapıların imalatını içerir. Bu yapıları tasarlarken, kritik bir husus, hücre çoğalması, göçü ve farklılaşması için talimat ipuçları sağlayan ve sonuçta doku yenilenmesini sağlayan doğal altta yatan hücre dışı matristir (ECM) 1,2. Doğal ECM ağırlıklı olarak fibriller kollajen 3,4'ten oluşur. İskelet kası ve tendon gibi yüksek derecede organize dokularda, bu ECM'ler, doku boyunca kuvvet iletimini ve motor fonksiyonu desteklemenin anahtarı olan hizalanmış bir desen sergiler 5,6.

Kollajenin doku mühendisliği uygulamaları için bir biyomateryal olarak faydası, aynı zamanda iyi biyouyumluluk, biyolojik olarak parçalanabilirlik ve hücre afinitesi 7,8,9 gösterdiğinden, doğal dokulardaki yaygın prevalansının ötesine uzanır. Kollajen bazlı biyomalzemelerin geliştirilmesindeki son gelişmeler, spesifik doku rejenerasyonu için gerekli olan mekanik ve biyokimyasal ipuçlarını daha iyi yönlendirmek için biyofiziksel özelliklerin iyileştirilmesine odaklanmıştır. Asitte çözünen kollajen molekülleri, ılık sıcaklıklara ve nötr pH10,11'e maruz kaldıklarında nanofibriller halinde kendi kendine birleşebildiğinden, in vitro olarak fibriler bir yapıya sahip kollajen biyomalzemeleri oluşturmak nispeten basittir. Bununla birlikte, güdümlü manipülasyon olmadan, bu fibriller rastgele ağlar halinde oluşacak ve bu da onları anizotropik doku mühendisliği uygulamaları için uygun hale getirecektir. Hizalanmış fibriller üretebilen teknikler arasında elektroeğirme ve ıslak eğirme, diğer çözelti ekstrüzyon teknikleri12,13, dondurarak kurutma14, elektrokimyasal veya manyetik fabrikasyon15,16, kesme akışı biriktirme17, akış kaynaklı kristalizasyon18, jel ekstrüzyon19, gerinim kaynaklı hizalama20 ve sıvının manipülasyonu yoluyla kuvvet güdümlü hizalama yer alır Akış 21,22. Bununla birlikte, bu yöntemlerin birçoğu ya kollajen ile yüksek oranda uyumlu değildir, mikro ölçekte hizalama üretir ancak nano ölçekte değildir, hizalama ve stabiliteyi indüklemek için ek işlem sonrası adımlar gerektirir veya son derece özel ekipman ve reaktifler gerektirir, bu da yaygın olarak benimsenmelerini zorlaştırır.

Bu çalışma, şırınga pompaları veya elektrospinnerler gibi özel ekipmanlara ihtiyaç duymadan, hizalanmış veya rastgele yönlendirilmiş fibril desenleme ile nanofibriler kollajen üretimi için basit kesme tabanlı bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, kollajen fibrillogenezin pH bağımlılığından yararlanır. Nötralize edici bir tampon içinde asidik monomerik kollajene kesme kuvveti uygulanması, kesme yönü boyunca hizalanmış fibrillogenezi teşvik eder. Benzer şekilde, kollajen, rastgele desenlere sahip fibriller üreten kesme yokluğunda fibrillogeneze uğramaya indüklenebilir. Hizalanmış veya rastgele desenlenmiş nanofibriller kollajenden oluşan elde edilen 3D kollajen şeritleri, nano ölçekli modellemenin hücre davranışı üzerindeki etkilerini incelemek için araçlar olarak hizmet edebilir. Ek olarak, hem anizotropik hem de izotropik doku mühendisliği uygulamaları için çeşitli olanaklar sunarlar 23,24,25,26,27. Desenleme, ilgilenilen doğal dokunun yapısına uyacak şekilde özelleştirilebilir. Kollajen şeritleri ayrıca, çeşitli boyutlarda ve yaralanma şekillerinde nakledilen bir mühendislik terapötiği olarak hizmet etmek için çeşitli büyüklükte demetler halinde birleştirilebilir.

Protokol

1. Diyalize kollajen hazırlanması ( Şekil 1)

  1. Diyaliz tüpünü yaklaşık 3 inç uzunluğunda kesin. Aşağıdaki özelliklere sahip hortum kullanın: 32 mm düz genişlik, 20 mm şişirilmiş çap ve 4,8 nm gözenek boyutu.
  2. Diyaliz tüpünü ultra saf suda rehidre edin.
  3. Tüpün bir ucunu diyaliz tüpü klipsi ile klipsleyin.
  4. 5-6 mL sıçan kuyruğu kollajen tip I'i (konsantrasyon: 0.02 N asetik asitte 9-10 mg / mL) 18 G iğne ile donatılmış 10 mL'lik bir şırınga kullanarak tüpe aktarın. Kapatmak için borunun diğer ucunu klipsleyin.
  5. Bir cam kabın dibine 0,5-1 cm kalınlığında bir polietilen glikol (PEG) pulu tabakası yerleştirin ve ardından kollajen dolgulu diyaliz tüpünü PEG tabakasının üzerine yerleştirin.
    NOT: 13 inç x 9 inç x 2 inçlik bir cam tabak tipik olarak bir sıra 4-5 kollajen dolu tüpü barındırabilir. Çanak boyutu, ihtiyaç duyulan kolajen hacmine göre ayarlanabilir.
  6. Boruyu tamamen kaplamak için daha fazla PEG gevreği ekleyin ve tepsiyi 4 °C'lik bir buzdolabına koyun.
  7. Her 10-15 dakikada bir, ıslak PEG pullarını diyaliz tüpünün yüzeyinden çıkarın ve tüpü yeni bir kuru PEG tabakası ile yeniden örtün. Çanağı 4 °C buzdolabına geri koyun.
  8. Adım 1.7'yi iki kez daha tekrarlayın ve 30-35 dakika sonra ıslak PEG pullarını musluk suyu kullanarak durulayın.
  9. Tüpü ultra saf su kullanarak bir kez daha durulayın ve tüpü bir mendille kurulayın.
  10. Tüpün bir ucunu açın ve diyalize edilmiş kollajeni (son konsantrasyon: ~ 30 mg / mL) mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Bir mini santrifüj (2.000 x g, ≤30 s, oda sıcaklığında [RT]) kullanarak kollajendeki hava kabarcıklarını kısaca döndürün ve daha sonra kullanmak üzere 4 ° C'de saklayın.
  11. Kullanmadan bir gün önce, kolajeni şırıngalara yükleyin.
    1. 16 gauge bir iğne kullanarak, 1 mL'lik bir şırıngaya ~ 1 mL diyalize edilmiş kollajen çekin.
      NOT: Kollajen viskoz bir maddedir. Daha fazla kollajen çekmeden önce iğne başının kollajen ile önceden yüklenmesi gerekebilir. İğne başını çıkarın ve gerektiğinde büyük hava ceplerini dışarı atın
    2. İğneyi çıkarın ve şırınga kafasını parafilm ile sarın.
    3. Küçük hava kabarcıklarının patlamasına izin vermek için kollajen ile doldurulmuş şırıngayı gece boyunca 4 ° C'de dik olarak saklayın.

2. Cam yongalarının hazırlanması ( Şekil 1)

DİKKAT: Protokolün bu kısmı için göz koruması kullanın.

NOT: Hücre kültürü deneyleri için özel olarak kaplanmış hidrofobik cam slaytlar kullanılmaktadır. Yüzey kaplamasının çıkarılmasını önlemek için kızaklar kenarlardan tutulmalıdır. Cam kesme işlemini uygun bir kesme yüzeyinde gerçekleştirin.

  1. Kalıcı bir işaretleyici kullanarak cam çipin istenen boyutlarını ölçün ve işaretleyin
    1. 8 şeritli iskeleler oluşturuyorsanız, sürgünün uzun kenarı boyunca yaklaşık 1 cm'lik artışlarla işaretleyin. İstenen iskele boyutuna göre boyutları gerektiği gibi ayarlayın.
  2. Düz bir kenar (yani, 6 oyuklu bir plaka kenarı) kullanarak, camı çentiklemek için cam kesiciyi ilk ölçümün uzunluğu boyunca aşağı kaydırın.
  3. Slayt ya çentikli çizgi boyunca kendi kendine kırılacak ya da slaytı bir doku üzerine (hidrofobik tarafı aşağı) ters çevirecek ve çentikli bölgeye manuel olarak baskı uygulayacaktır.
  4. Hidrofobik cam sürgünün kaplanmış tarafını bir etanol işaretleyici kalem kullanarak işaretleyin.
  5. Kalan cam tozunu temizlemek için cam çipini ultra saf suda durulayın.
  6. Cam talaşlarını basınçlı hava için bir tezgah üstü nozul kullanarak veya çeker ocakta belirli bir açıyla istifleyerek kurutun.
  7. Gerekli sayıda fiş için gerektiği kadar tekrarlayın. Çipleri RT'de saklayın. En iyi hücre kültürü sonuçları için, 7 gün içinde hazırlanmış cipsleri kullanın.

3. 10x fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlanması

  1. Bir cam şişeyi 500 mL ultra saf su ile doldurun.
  2. Şişeye 10 PBS tablet ekleyin.
    NOT: Bu protokol, 1x PBS için tablet oranının 500 mL'de 1 tablet olduğunu varsayar. Farklı bir tablet boyutu veya markası kullanıyorsanız tablet sayısını gerektiği gibi ayarlayın.
  3. Şişeye bir karıştırma çubuğu ekleyin ve tabletler eriyene kadar bir karıştırma plakasına yerleştirin.
  4. Hidrojel üretim gününde, gerekli 10x PBS hacmini 50 mL konik tüplere aktarın.
  5. PBS dolgulu tüpleri, kollajen üretiminden önce en az 15 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.

4. Hizalanmış kollajen nanofibrillerin üretimi (Şekil 2)

  1. Buzdolabından bir kollajen şırıngası çıkarın ve künt 22 G'lik bir iğne takın.
  2. 4 oyuklu bir plakanın kapağına bir cam slayt yerleştirin.
  3. Slaytı suya daldırmak için yeterince ısıtılmış 37 °C 10x PBS (30-50 mL) ile örtün.
  4. Şırıngayı yaklaşık 30-45 ° 'lik bir açıyla tutarak, ~ 340 mm / s'lik bir hız ve ~ 3.2 mL / dak'lık bir akış hızı kullanarak ince kollajen şeritlerini cam çip üzerine manuel olarak sıkın.
    NOT: PBS'nin aşırı soğumamasını sağlamak için ısıtılmış PBS'yi ekledikten sonra 30-60 saniye içinde kollajen ekstrüzyonunu tamamlayın.
  5. Kollajenin fibrillogenezi tamamlaması için veya kollajen opak beyaz bir renge dönene kadar 1-2 dakika bekleyin.
  6. Kollajen şeritlerini uzunlamasına kesmek için forseps kullanın. Şeritlerin, çipin her iki ucunun altına 3-5 mm katlanabilecek kadar uzun olduğundan emin olun.
  7. Her seferinde bir tane, kollajen şeritlerini hazırlanmış bir cam çipin üzerine uzunlamasına (çentikli bölgeye paralel olarak) nazikçe örtün. Kenarları çipin altına sıkıştırın.
  8. İstenilen boyutlara ulaşılana kadar kollajen şeritlerini yerleştirmeye devam edin.
  9. Yeni oluşan kollajen hidrojeli 12 oyuklu bir plakanın iki kuyusuna yerleştirin. Bu, kurutma işlemi sırasında hava akışını sağlar ve kollajenin kuyruk uçlarının istenmeyen yüzeylere yapışmasını önler.
  10. Hidrojelleri 1-3 saat veya PBS tuz kristalleri hidrojel yüzeyinin %50-90'ını kaplayana kadar kurumaya bırakın.
    NOT: Kuruma süresi, hidrojel boyutuna ve fazla sıvının varlığına bağlı olarak değişecektir.
  11. Her bir hidrojeli yaklaşık 30-60 s veya tuz kristalleri çözülene kadar 1x PBS'ye daldırın.
  12. Fazla PBS'yi bir mendille nazikçe silin.
  13. Hidrojelleri tekrar kuyu plakasına yerleştirin ve gece boyunca çeker ocakta kurumaya bırakın.
  14. Kurutulmuş hidrojelleri yaklaşık 1 hafta RT'de saklayın.

5. Rastgele kollajen nanofibrillerin üretimi (Şekil 3)

  1. Buzdolabından bir kollajen şırıngası çıkarın ve künt 22 G'lik bir iğne takın.
  2. Kollajeni ~ 3.2 mL / dk'da kuru bir cam yonga üzerine sıkın. Hizalanmış kollajen hidrojellerine benzer boyutlar elde etmek için yeterli miktarda kollajen ekstrüde edin. Gerektiğinde hava kabarcığı birikimini önleyin.
  3. Cam çipinin kenarlarını sarmak için ek kolajen ekstrüde edin. Bu, kazara ayrılma riskini en aza indirir.
  4. Ekstrüde edilmiş kolajeni 50 mL'lik ısıtılmış 10x PBS tüpüne batırmak için forseps kullanın.
  5. Kollajenin fibrillogenezi tamamlaması için 45-60 s veya kollajen opak beyaz bir renge dönene kadar bekleyin.
  6. Fazla PBS'yi bir mendille nazikçe silin.
  7. Hidrojelleri durulamak ve kurutmak için 4.9-4.14 adımlarını tamamlayın

6. Sterilizasyon ve rehidrasyon

NOT: Bir biyogüvenlik kabininde aşağıdaki tüm adımları tamamlayın

  1. Kollajen hidrojelleri ve çevresindeki kuyucuk plakasını 15 dakika boyunca% 70 etanol içinde sterilize edin.
    1. Hem cam çipin alt tarafının hem de hidrojelin etanol ile temas halinde olduğundan emin olmak için forseps kullanarak hidrojelleri sterilizasyonun yarısında kısaca yükseltin.
  2. Etanolü çıkarın ve hidrojellerin 10 dakika havada kurumasını bekleyin.
  3. Artık etanolü çıkarmak ve hidrojelleri yeniden sulandırmak için hidrojelleri steril 1x PBS'de her biri 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Hidrojeller artık kullanıma hazırdır (hücre kültürü vb.). Hidrojeller, hemen kullanıma hazır değilse, son yıkama adımından sonra kısa bir süre PBS'de bırakılabilir.

Sonuçlar

Bu protokol, hizalanmış (Şekil 2) veya rastgele (Şekil 3) yönlendirilmiş nanofibrillerden oluşan kollajen hidrojellerin üretimi için basit bir kesme tabanlı ekstrüzyon tekniğini tanımlar. Nanofibril modelleme, şırınga hızı ve kollajen ekstrüzyon hızının birleşik modülasyonu yoluyla elde edilen kesme kuvvetlerinin hassas kontrolüne dayanır. Fibril hizalamasını indüklemek için optimal değerler daha önce 340 mm/s'lik bir şırınga hızı ve 3,2 mL/dk'lık bir kollajen ekstrüzyon hızı olarak belirlenmiştir28,29. Bu denge sadece hizalanmış nanofibril oluşumu için değil, aynı zamanda hidrojellerin makro ölçekte işlevselliğini sağlamak için de kritik öneme sahiptir. Bu oran yanlış hizalanırsa, beklendiği gibi desenli olmayan hidrojellerin yanı sıra çok ince (<0,5 mm çap), kalın (>1,5 mm çap) veya kullanım için dalgalı kollajen şeritleri içeren hidrojellerin üretilmesi riski vardır. Örneğin, bir şırınga hareketinin çok hızlı olması, ekstrüzyon hızının çok yavaş olmasıyla birleştiğinde, ince şeritlerle sonuçlanırken, ters oran, orandaki dengesizliğin derecesine bağlı olarak kalın veya dalgalı şeritler verir (Şekil 4A-D). Makroskopik özelliklerdeki bu farklılıklar, hücre birikimini ve lokal yapışmayı etkilemek için yeterli şeritten şeride değişkenlik yaratabilir.

Kollajen ekstrüzyonu ve montajını takiben, hidrojel üretimi, 1x PBS'de bir yıkama adımına tabi tutulmadan önce, genellikle 1 ila 3 saat süren bir ilk kurutma aşamasından geçer (Şekil 2 ve Şekil 3). Optimum topografik sonuçların elde edilmesi, yıkama adımının zamanlaması ve yoğunluğu arasında hassas bir dengeye dayanır. Yetersiz veya gecikmiş yıkama, fibriller üzerindeki PBS tuz kristallerinin izleri ile gösterilen bozulmuş lif topografyasına neden olur. Buna karşılık, fabrikasyon sonrası kollajenin aşırı veya erken yıkanması, topografik özellikleri kaplayan çözünmüş bir kollajen tabakası ile sonuçlanır (Şekil 4E,F).

Taramalı elektron mikroskobu (SEM), kollajen hidrojelleri içinde hizalanmış veya rastgele nanofibril oryantasyonunun varlığını doğrular. Hem hizalanmış hem de rastgele hidrojellerde, nanofibriller 30-50 nm29 arasında fibril çapları sergiler. Kalitatif olarak, hizalanmış hidrojellerin tek eksenli olarak hizalanmış nanofibriller içerdiği açıktır (Şekil 5). Bu hizalama daha önce, hizalama grafiğinin, yalnızca düşük frekanslı zirveler 28 sergileyen rastgele yönlendirilmiş hidrojellerle tezat oluşturan, hizalanmış hidrojeller için 180° aralıklı iki farklı tepe gösterdiği2B hızlı Fourier dönüşümü analizi kullanılarak ölçülmüştü.

Birincil fare iskelet kası miyoblastlarının parlak alan görüntüleri, kollajen fibrillerinin anizotropik nano-topografik rehberliğinin hücresel hizalamayı desteklediğini göstermektedir (Şekil 6). Bu nanodesenli kollajen hidrojellerin sadece miyoblastlarda26 değil, aynı zamanda endotel hücreleri23,24 gibi diğer hücre tiplerinde de hücresel hizalamayı indüklediği gösterilmiştir.

figure-results-1
Şekil 1: Ultra yüksek yoğunluklu kollajen ve kesilmiş cam lam hazırlamanın şematik gösterimi. (AF) Kollajen diyaliz süreci: (A) diyaliz tüpünün 3 inçlik şeritler halinde hazırlanması ve ilk klipsin sabitlenmesi, (B) yüksek yoğunluklu stok kollajenin tüpe yüklenmesi ve ikinci klipsin sabitlenmesi, (C) yüklü diyaliz tüpünün polietilen glikol (PEG) pulları ile kaplanması, (D) doymuş PEG pullarının çıkarılması, (E) PEG pullarının su ile durulanması ve (F) ultra yüksek yoğunluklu kollajenin mikrosantrifüj tüplerinde saklanması. (G-L) Cam slaytların kesilmesi işlemi: (G) çalışma için cam slaytların elde edilmesi, (H,I) elmas uçlu cam kesici ile cam slaytın puanlanması, (J) cam slaytın çizilmemiş taraftan kırılması, (K) kesilmiş camın su ile durulanması ve (L) cam slaytın kurutulması. BioRender kullanılarak yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Hizalanmış kollajen hidrojel üretim süreci. Adım 1: 10x PBS ısıtılmış tampona kesme altında kollajen ekstrüzyonu ve fibrillogenez indüksiyonu; Adım 2: Ekstrüde kollajenin kesilmiş cam slaytlara montajı; Adım 3: Hidrojelin boyutunu artırmak için ek ekstrüde kollajenin montajı; ve Adım 4: Kollajen hidrojellerin kurutulması. BioRender kullanılarak yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Rastgele kollajen hidrojel üretim süreci. Adım 1: Kesilmiş cam slaytlara kollajen ekstrüzyonu (tek şerit); Adım 2: Kollajenin sürekli ekstrüzyonu boyutu arttırır (çoklu şeritler); Adım 3: Fibrillogenezi başlatmak için ekstrüde kollajenin 10X PBS tamponuna daldırılması; ve Adım 4: Hidrojellerin kurutulması. BioRender kullanılarak yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Kollajen hidrojel üretim sürecindeki olası hata adımları. (AF) (A) optimal kalınlıkta kollajen şeritleri, (B) aşırı kalın kollajen şeritleri, (C) yetersiz kalın kollajen şeritleri, (D) dalgalı kollajen şeritleri ve (E,F) taramalı elektron mikroskobu kullanılarak gösterilen aşırı yıkanmış kollajen yüzeyleri örnekleri. Ölçek çubuğu = 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Hizalanmış ve rastgele kollajen hidrojellerin taramalı elektron mikroskobu görüntüleri. Görüntüler elektron mikroskobu kullanılarak çekildi. Işın koşulları, 25-100 pA akım aralığı ve 4-5 mm çalışma mesafesi ile 2 keV'ye ayarlandı. Görüntüler, 1 μs'lik bir bekleme süresiyle 6144 x 4096 piksel çözünürlükte tutarlı bir şekilde kaydedildi. Ölçek çubuğu = 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Hizalanmış ve rastgele kollajen hidrojeller üzerinde kültürlenen birincil fare miyoblastları. Miyoblastlar, görüntülemeden önce 3 gün boyunca hidrojeller üzerinde kültürlendi. Parlak alan görüntüleri, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak 10x büyütmede çekildi. Ok, hizalanmış nanofibril oryantasyonunu gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Protokolün kritik adımları üç ana bölüme ayrılabilir: 1) kollajen fibrillogenezi, 2) hidrojel montajı ve 3) yıkama. Kollajen fibrillogenez süreci, nötralize edici koşullar altında kendiliğinden gerçekleşir ve tek tek kollajen moleküllerinin daha büyük stabilize fibriler yapılara kendi kendine monte edilmesine dayanır10,11. Bu, 37 ° C'ye ısıtılan 10x PBS gibi nötralize edici tamponlu bir ortamın uygulanmasıyla elde edilir ve kollajenin fibrillere tam gelişimini sağlayan elektrostatik etkileşimlere rehberlik etmek için kritik öneme sahiptir. Nano ölçekli fibriller hizalama, fibrillogenez oluşumu ile eş zamanlı olarak kesme kuvvetlerinin uygulanmasıyla elde edilir. Kesme hızının yanı sıra kaymanın varlığı veya yokluğu, fibrillerin desenini belirleyecektir. İkincisi, hidrojel montajı, kollajenin kasılmasının ve dehidrasyonunun gerçekleştiği kurutma işlemi sırasında fiziksel ankrajlar sağlayarak malzemenin stabilitesini güçlendirmede önemli bir adımdır. Bu adım, amaçlanan kullanım in vitro hücre tohumlama içinse, kolajeni kontrolsüz kasılmayı önleyen sert bir substrata sabitlediği için özellikle kritiktir. Montaj işlemi, rastgele ve hizalanmış desenli hidrojeller arasında biraz farklıdır. Rastgele hidrojeller için uygun yapışma, yüzeye sabitlemek için fibrillogenezden önce montaj yüzeyinin (tipik olarak cam) kenarları boyunca ek kollajen birikimi gerektirir. Hizalanmış desenli hidrojeller, aynı ankraj amacına hizmet etmek için montaj yüzeyinin kenarlarına sarılır. Hizalanmış hidrojeller için önemli bir ek husus, kollajen şeridinin ilk yerleştirilmesinin hidrojelin şeklini ve homojenliğini belirlemesidir. Sonraki şerit yerleştirme, yerleştirmeden sonra hidrojele dokunmamaya özen gösterilerek, biriken kolajenin yüzey gerilimi tarafından yönlendirilir. Son olarak, hidrojelin topografik özelliklerini korumak için montaj sonrası uygun hidrojel kurutma ve yıkama hayati önem taşır. Yetersiz kurutma ve ardından 1x PBS veya su ile yıkama, çözünmüş veya kek benzeri bir kollajen tabakasına yol açabilir. Bunu önlemek için, hidrojellerin tamamen kurutulması esastır ve PBS kristallerinin oluşumu ve kollajen opaklığında bir artış ile görsel olarak doğrulanabilir.

Kollajen hidrojeller hem in vitro çalışmalar hem de in vivo 23,24,25,26,27 rejeneratif mühendislik uygulamaları için kullanılmıştır. Hidrojellerin steril olmayan koşullar altında üretildiğine ve herhangi bir hücre kültürü veya transplantasyondan önce sterilize edilmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Ultraviyole ışık gibi diğer sterilizasyon biçimleri, kollajen moleküllerinin 30 çapraz bağlanması ve bozulması yoluyla nanofibril desenini bozacağından, önerilen sterilizasyon şekli %70 etanoldür. Bununla birlikte, etanolün buharlaştırma ve yıkama aşamaları yoluyla uzaklaştırılması, hücre uyumluluğuna zararlı olabilecek artık etanolün en aza indirilmesi için önemlidir. Stok kollajenin partiden partiye değişkenliği, diyalize edilmiş, yüksek yoğunluklu kollajenin çalışma konsantrasyonunda değişkenliğe yol açabilir ve bu da fibrillogenez sürecini etkileyebilir. Uygulamaya bağlı olarak, hizalanmış anizotropik modelleme yerine rastgele izotropik modelleme tercih edilebilir; Bu nedenle, mevcut protokolde, Fibril organizasyonunu modüle etmek için her iki yaklaşımı da dahil ettik.

Bu protokolde açıklanan kesme tabanlı ekstrüzyon yönteminin bir sınırlaması, işlemin oldukça manuel ve kullanıcıya bağlı olmasıdır. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için her operatörü kalibre etmek için önemli eğitim ve uygulama gereklidir. Bu, hassasiyeti sağlamak için verimin düşük ve zaman alıcı olabileceği anlamına gelir. Bu sınırlamalardan bazıları, 3D baskı, elektrospinning ve yumuşak ve yüzey litografisi gibi yüksek düzeyde otomatikleştirilmiş, makine tabanlı üretim yöntemleri kullanılarak çözülebilir. Bununla birlikte, bu diğer yöntemlerden farklı olarak, bu tamamen manuel nanofibril üretim prosedürü özel ekipman gerektirmez ve erişilebilir ve ekonomiktir. 3D baskı metodolojileri ve maliyet etkinliğindeki gelişmeler gelişmeye devam ettikçe, bu protokolü 3D baskı teknolojisine uyarlama ve entegre etme potansiyeli vardır. Bu tür bir entegrasyon, henüz mümkün olmasa da, bu protokolün tutarlılığını ve verimini artırmaya devam edecektir.

İki farklı hidrojel topografyasının üretimi, kollajen fibrillerinin hücresel morfoloji, davranış ve doku rejenerasyonu üzerindeki nano-topografik rehberliğini araştırmak için eşsiz bir fırsat sunar. Farklı fibril topografyalarına verilen yanıtı gözlemleyerek, substrat nano ölçekli modellemenin hücre fenotipini nasıl etkilediğine dair içgörüler elde edebiliriz. Örneğin, önceki çalışmalar, endotel hücrelerinin hizalanmış nanofibrillerin üzerinde uzun bir morfoloji benimsediğinde, bir anti-enflamatuar fenotip sergilediklerini ve bozulmuş akış koşullarına karşı artan direnç sergilediklerini göstermektedir24. Bu bulgular sadece aterosklerotik lezyonların gelişimini daha iyi anlamamızı sağlamakla kalmayıp, aynı zamanda gelecekteki aterosprotektif baypas greftlerinin tasarımı için de umut vaat etmektedir. Bu kollajen hidrojeller, doku mühendisliği uygulamaları için kullanılabilir ve terapötik etkinliği artırmak için implantasyondan önce büyüme faktörleri veya hücrelerle zenginleştirilebilir 25,26,27. Karşılaştırmalı analiz, hizalanmış topografyalara sahip hidrojellerin, rastgele topografyalara sahip hidrojellere kıyasla üstün kas rejenerasyonu ve vaskülarizasyon sergilediğini26 ve bu hidrojellerin, bir fare yaralanma modelinde doku rejenerasyonunu arttırmak için miyojenik büyüme faktörleri ile yüklüyse hücresel olmayan bir "kullanıma hazır" formda kullanılabileceğini ortaya koymaktadır27. Şimdiye kadar birincil odak noktası, bu hidrojelleri kas yaralanmaları için potansiyel terapötikler olarak kullanmak olsa da, geniş bir rejeneratif ve doku mühendisliği uygulamaları yelpazesine uygulanabilirler.

Açıklamalar

Beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma kısmen Rejeneratif Rehabilitasyon Araştırma ve Eğitim İttifakı, MTF Biologics, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi Vakfı ve Collins Medical Trust'tan sağlanan fonlarla desteklenmiştir. K.M.H., Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu (DGE-1937961) ve Oregon Öğrencileri Öğrenme ve Deneyimleme Araştırmaları (OSLER) Bursu (5TL1TR2371-8) tarafından desteklenmiştir. K.H.N., NIH/NHLBI (R00HL136701) ve NIH/NIAMS (R01AR080150) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kollajen I, Yüksek Konsantrasyon, Sıçan KuyruğuCorningCB354249
Eclipse TE-2000-U mikroskobuNikonTE-2000-U Ters mikroskop
Ekstra Kalın Mikroskop SlaytlarıFisher Scientific22-267-005Kollajen ekstrüzyon yüzeyi için iyi çalışır
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/ATaramalı elektron mikroskobu
Cam Kesici Alet Seti 2mm-20mm Kalem Stili Yağ Besleme Karbür UcuAmazon/MOARMORB07Y1D243HCam kesici seçeneği
Hamilton Kel-F Hub Künt Uçlu İğneler (Luer Lock, 22 G)Fisher Scientific14-815-574Kollajen ekstrüzyonu için iğneler
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819 Hidrofobik slaytlar
PBS TabletlerThermo Fisher Scientific18912014
Polietilen Glikol 8000Fisher BioReagentsBP233-1
Dikişsiz Selüloz Diyaliz Tüpü ve nbsp;Fisher ScientificS25645G
SnakeSkin Diyaliz KlipsleriThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware Cam KesiciSynthware31-501-927Cam kesici seçeneği

Kaynaklar

  1. Padhi, A., Nain, A. S. ECM in differentiation: A review of matrix structure, composition and mechanical properties. Ann Biomed Eng. 48 (3), 1071-1089 (2020).
  2. Schlie-Wolter, S., Ngezahayo, A., Chichkov, B. N. The selective role of ECM components on cell adhesion, morphology, proliferation and communication in vitro. Exp Cell Res. 319 (10), 1553-1561 (2013).
  3. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978(2011).
  4. Shoulders, M. D., Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 78, 929-958 (2009).
  5. Gillies, A. R., Lieber, R. L. Structure and function of the skeletal muscle extracellular matrix. Muscle Nerve. 44 (3), 318-331 (2011).
  6. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. J Biomech. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  7. Friess, W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharm Biopharm. 45 (2), 113-136 (1998).
  8. Lee, C. H., Singla, A., Lee, Y. Biomedical applications of collagen. Int J Pharm. 221 (1-2), 1-22 (2001).
  9. Liu, X., Zheng, C., Luo, X., Wang, X., Jiang, H. Recent advances of collagen-based biomaterials: Multi-hierarchical structure, modification and biomedical applications. Mater Sci Eng C. 99, 1509-1522 (2019).
  10. Harris, J. R., Reiber, A. Influence of saline and pH on collagen type I fibrillogenesis in vitro: Fibril polymorphism and colloidal gold labelling. Micron. 38 (5), 513-521 (2007).
  11. Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen fibril formation. Optimal in vitro conditions and preliminary kinetic results. J Biol Chem. 253 (18), 6578-6585 (1978).
  12. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. J Biomed Mater Res A. 79A (3), 456-463 (2006).
  13. Malladi, S., et al. Continuous formation of ultrathin, strong collagen sheets with tunable anisotropy and compaction. ACS Biomater Sci Eng. 6 (7), 4236-4246 (2020).
  14. Lowe, C. J., Reucroft, I. M., Grota, M. C., Shreiber, D. I. Production of highly aligned collagen scaffolds by freeze-drying of self-assembled, fibrillar collagen gels. ACS Biomater Sci Eng. 2 (4), 643-651 (2016).
  15. Torbet, J., Ronzière, M. C. Magnetic alignment of collagen during self-assembly. Biochem J. 219 (3), 1057-1059 (1984).
  16. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3d cell migration. Curr Protoc Cell Biol. Chpater 10 (Unit 10.17), (2010).
  17. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomater. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  18. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: A potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  19. Yunoki, S., Hatayama, H., Ebisawa, M., Kondo, E., Yasuda, K. A novel method for continuous formation of cord-like collagen gels to fabricate durable fibers in which collagen fibrils are longitudinally aligned. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 107 (4), 1011-1023 (2019).
  20. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
  21. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3d collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), (2022).
  22. Su, C. Y., et al. Engineering a 3D collective cancer invasion model with control over collagen fiber alignment. Biomaterials. 275, 120922(2021).
  23. Nakayama, K. H., et al. Bilayered vascular graft derived from human induced pluripotent stem cells with biomimetic structure and function. Regen Med. 10 (6), 745-755 (2015).
  24. Nakayama, K. H., et al. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano Lett. 16 (1), 410-419 (2016).
  25. Nakayama, K. H., et al. Rehabilitative exercise and spatially patterned nanofibrillar scaffolds enhance vascularization and innervation following volumetric muscle loss. NPJ Regen Med. 3, 16(2018).
  26. Nakayama, K. H., et al. Treatment of volumetric muscle loss in mice using nanofibrillar scaffolds enhances vascular organization and integration. Commun Biol. 2 (1), 170(2019).
  27. Alcazar, C. A., Hu, C., Rando, T. A., Huang, N. F., Nakayama, K. H. Transplantation of insulin-like growth factor-1 laden scaffolds combined with exercise promotes neuroregeneration and angiogenesis in a preclinical muscle injury model. Biomater Sci. 8 (19), 5376-5389 (2020).
  28. Lai, E. S., Huang, N. F., Cooke, J. P., Fuller, G. G. Aligned nanofibrillar collagen regulates endothelial organization and migration. Regen Med. 7 (5), 649-661 (2012).
  29. Huang, N. F., et al. Spatial patterning of endothelium modulates cell morphology, adhesiveness and transcriptional signature. Biomaterials. 34 (12), 2928-2937 (2013).
  30. Weadock, K. S., Miller, E. J., Bellincampi, L. D., Zawadsky, J. P., Dunn, M. G. Physical crosslinking of collagen fibers: Comparison of ultraviolet irradiation and dehydrothermal treatment. J Biomed Mater Res. 29 (11), 1373-1379 (1995).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Nanofibriler KolajenKolajen DesenlemeKolajen FibrillogeneziH cre D MatriksDiyaliz T pKayma GerilmesiKolajen HidrojeliH cresel HizalanmaRejeneratif Biyomalzemeler
Doku Mühendisliği İçin Nanofibriler Desenli Kollajen Üretimi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.