Kantitatif Tersinmez Tethering Testi Kullanılarak Kovalent Fragman Taraması

Summary

Kantitatif geri dönüşümsüz bağlama (qIT) testi, bir hedef proteinle seçici olarak etkileşime giren kovalent fragmanları tanımlamak için floresan tabanlı bir yöntemdir. Burada, qIT testini tanımlamak için örnek sonuçlar dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir.

Abstract

Spesifik hedef proteinlerle kovalent bağlar oluşturan bileşikler, kimyasal problar ve terapötik ajanlar olarak çeşitli avantajlar sunar. En yaygın olarak, hafif reaktif, elektrofilik küçük moleküller, spesifik proteinlerde seçilmiş sistein yan zincirleri ile kovalent bağlar oluşturmak için kullanılır. Elektrofilik küçük moleküllerden oluşan bir kütüphanenin bir protein hedefine karşı tarandığı ligand keşfinin elektrofil öncelikli yaklaşımları, bir elektrofilik savaş başlığının zaman alıcı aşağı akış kurulumuna olan ihtiyacı ortadan kaldırdıkları için popüler hale gelmiştir. Bununla birlikte, elektrofilik ligandlar, sisteinlerle çok çeşitli spontan reaksiyon oranları sergileyebildiğinden, bu tür bir tarama karmaşıktır. Kantitatif-geri dönüşümsüz bağlama (qIT), içsel bileşik reaktivitesindeki bu farklılıklar için verileri normalleştiren isabet tanımlama ve geliştirme için floresan tabanlı bir yöntem sunar. Tek tek bileşiklerin bir hedef protein ile reaksiyon hızları belirlenir ve yapılandırılmamış tripeptit glutatyon (bu, spontan bileşik reaksiyonu için bir vekildir) ile bileşik reaktivitesi ile karşılaştırılır, bu da tercihen ilgilenilen protein ile reaksiyona giren bileşiklerin tanımlanmasını sağlar. Bu metodoloji, SARS-CoV-2 ana proteaz, siklin bağımlı kinaz 2 ve RAP27A dahil olmak üzere çeşitli ilaç hedeflerine karşı seçici kovalent fragmanları tanımlamak için başarıyla uygulanmıştır. Burada, kantitatif ve sağlam bir veri seti oluşturmak için qIT'nin bir hedef proteine uygulanmasını gösteriyoruz ve gelecekteki gelişim için isabet ligandlarının önceliklendirilmesine izin veriyoruz.

Introduction

Sistein reaktif hedefli kovalent ligandlar (belirli bir protein üzerinde seçilmiş bir sistein kalıntısı ile reaksiyona girerek biyolojik bir etki gösteren moleküller) son yıllarda kimyasal araçlar ve terapötikler olarak giderek daha popüler hale gelmiştir¹. Bunlar tipik olarak, bir protein hedefi² için yüksek afiniteye sahip bir ligand parçasına eklenen hafif reaktif bir elektrofilden (bir akrilamid, kloroasetamid veya vinil sülfon gibi) oluşur. İdeal olarak, ligand-protein etkileşimi, ilk kovalent olmayan ligand bağlanmasını ve ardından hedef sistein ve elektrofil³ arasında geri dönüşümsüz kovalent bağ oluşumunu içeren iki aşamalı bir mekanizma yoluyla ilerler.

Bruton'un Tirozin Kinaz inhibitörü Ibrutinib de dahil olmak üzere birkaç erken hedeflenen kovalent ligand, önceden tanımlanmış bir geri dönüşümlü ligandın bir elektrofilik sap⁴ ile donatılmasıyla geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım her zaman başarılı değildir ve diğer girişimlerde elektrofil kurulumunun önemli bir optimizasyon gerektirdiği bulunmuştur⁵. Bunun yerine, özellikle elektrofilik parçalar kullanan elektrofil öncelikli yaklaşımlar son yıllarda daha popüler hale geldi. Bunlar tipik olarak, bir elektrofil kütüphanesinin bir protein ile inkübe edilmesini ve daha sonra, ligand ve bağlanma cebi⁶ arasındaki üretken kovalent olmayan etkileşimler tarafından indüklendiği varsayılan bir sisteine karşı gelişmiş bir reaksiyon hızına sahip bileşiklerin seçilmesini içerir. Özellikle, bu yöntemler KRAS (G12C) inhibitörü Sotorasib^1'in geliştirilmesi sırasında başarıyla uygulanmıştır.

Elektrofil öncelikli tarama, geleneksel kovalent olmayan ligand taraması ile karşılaştırıldığında, esas olarak savaş başlığı sınıfları⁷ içinde ve arasındaki reaktivitedeki yüksek değişkenlik nedeniyle birkaç benzersiz zorluk ortaya çıkarmaktadır. Çoğu sistein-reaktif elektrofil, zamanla, hedef protein için herhangi bir seçici etkileşimden bağımsız olarak, solvente maruz kalan tüm sistein kalıntıları ile reaksiyona girecektir. Bu nedenle, ligand doluluğu hemen hemen tüm elektrofiller için zamanla artacaktır ve reaktiviteyi kontrol etmeden, vuruş seçimi genellikle bir hedefe daha hızlı giren daha reaktif parçalara doğru önyargılı olacaktır⁸.

Ayrıca, elektrofil öncelikli tarama yöntemleri, verim^9'da sınırlı olan protein-ligand eklenti oluşumunu tespit etmek için genellikle kütle spektrometresi kullanır. Çeşitli elektrofilikliğe¹⁰ sahip bileşiklerden oluşan bir kütüphane için reaksiyon kinetiğini uygun şekilde karakterize etmek için uzun bir süre boyunca (saatler ila günler) düzenli reaksiyon örneklemesi gereklidir. Bu nedenle, 10 zaman noktasında örneklenen 300 parçadan oluşan bir ekran, çoğu protein kütle spektrometresi sisteminin verimini aşan 3000 kütle spektrumunun gerçekleştirilmesini gerektirecektir. Bu nedenle, protein-ligand eklenti oluşumunu izlemek için daha yüksek verimli yöntemler arzu edilir.

Burada özetlenen yaklaşım, kantitatif geri dönüşümsüz bağlama (qIT) testi, içsel reaktiviteyi kontrol eden ve basit bir floresan okuması⁷ kullanan elektrofil öncelikli bir tarama yöntemidir. Protein veya glutatyon (içsel reaktivite için bir kontrol olarak kullanılan yapılandırılmamış, tiyol içeren bir tripeptit), bir elektrofilik fragman kütüphanesi ile inkübe edilir ve bir CPM çözeltisine (7-Dietilamino-3- (4'-Maleimidylphenyl)-4-Metilkumarin, bir florojenik tiyol-miktar tayini ajanı) içine söndürülmek üzere düzenli numuneler alınır. Sistein ve elektrofilik fragman arasındaki eklenti oluşumu, CPM ile reaksiyon için mevcut olan tiyol miktarını azaltır ve su verme sırasında ortaya çıkan floresansı azaltır. CPM floresansı bu nedenle reaksiyona girmemiş tiyol için bir vekil görevi görür ve her bir elektrofilik parça ile tiyol reaksiyonunun kinetiğinin belirlenmesine izin verir. Glutatyon üzerinde önemli ölçüde geliştirilmiş protein reaktivitesine sahip elektrofilik fragmanlar, isabet olarak seçilir ve daha fazla geliştirme için önceliklendirilir (Şekil 1).

Şekil 1: qIT şeması. qIT testine şematik bir genel bakış. (BioRender kullanılarak oluşturulmuştur). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

REF değerlerini kullanarak isabet seçimi, içsel reaktiviteyi kontrol eder ve fragmanların yalnızca bir protein hedefiyle üretken kovalent olmayan etkileşimler oluşturmaları durumunda isabet olarak seçilmesini sağlar. Basit floresan okuması aynı zamanda qIT testinin yüksek düzeyde ölçeklenebilir olduğu ve kütle spektrometresi tabanlı reaksiyon izleme yöntemleri gerektirmediği anlamına gelir.

Burada, qIT testi için kapsamlı bir prosedür ana hatlarıyla belirtilmiştir ve test performansını ve isabet seçimini göstermek için örnek sonuçlar dahil edilmiştir.

Protocol

1. Parça kütüphane yapımı

1. Elektrofilik parçalardan oluşan bir kütüphane tasarlayın ve bunları sentezleyin veya satın alın. Elektrofilik parça kitaplıkları tipik olarak, çeşitli kimyasal iskelelere eklenen hafif reaktif elektrofillerden (akrilamidler, kloroasetamidler ve vinil sülfonamidler gibi) oluşur. Elektrofilik parça kütüphaneleri ticari tedarikçilerden yaygın olarak temin edilebilir ve tasarımları ve yapıları hakkında daha fazla ayrıntı başka bir yerde gözden geçirilmiştir ^5,11.
2. Her bir bileşiği DMSO'da 50 mM'lik bir konsantrasyona çözün, daha sonra Parça Kitaplık Plakası olarak adlandırılan 384 oyuklu bir rezervuar plakasının 3 ila 22 numaralı sütunlarının her bir oyuğuna farklı bir bileşik dağıtın.
   1. Pozitif ve negatif kontroller için DMSO'yu 1, 2, 23 ve 24 numaralı sütunların her birine dağıtın. Plaka yerleşimi, taranan bileşiklerin sayısına bağlı olarak değiştirilebilir (Şekil 2). Kütüphane plakasına eklenen hacim, qIT ekranı başına her bir kuyucuktan yaklaşık 1,8 μL gerektiği göz önüne alındığında, gerçekleştirilecek ekran sayısına bağlı olacaktır. Bu Parça Kitaplık Plakasını önceden hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.

Şekil 2: Plaka düzeni. qIT tahlili 384 kuyulu plaka düzenine genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Tahlil kurulumu (Şekil 3)

1. Aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: rekombinant protein çözeltisi (herhangi bir tamponda hedef protein), qIT tahlil tamponu (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 8)), qIT tahlil söndürme tamponu (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 7.5)) ve bileşik stok çözeltileri (DMSO'da elektrofilik fragman (50 mM)).
   NOT: Hedef sistein kalıntısı ve fragmanlar arasındaki reaksiyonu hızlandırmak için reaksiyon tamponunda pH 8 kullanılır, bu da son derece hafif reaktif fragmanlar için bile reaksiyon hızının ölçülmesine izin verir. CPM'nin maleimidi ile sistein tiyol arasında oluşan tiyoeter bağı daha bazik pH'larda hidrolize eğilimli olduğundan, söndürme tamponunda 7.5'lik biraz daha düşük bir pH kullanılır (örneğin, önceki çalışma, sistein-maleimid konjugatlarının pH 7.3'te pH 8'den çok daha kararlı olduğunu buldu¹²).
2. DMSO parça stok çözeltilerini depodan çıkarın ve bileşik stokların çözülmesini sağlamak için en az 2 saat oda sıcaklığında bırakın.
3. Yaklaşık 30 dakika boyunca argon gazı ile köpürtülerek qIT test tamponunu degas.
4. Hedef protein çözeltisini gazı alınmış qIT tahlil tamponuna iyice değiştirin. En önemlisi, DTT ve TCEP gibi indirgeyici ajanlar, tiyol miktar tayinine müdahale edeceği için 100 nM< konsantrasyonlara kadar tamamen uzaklaştırılmalıdır. Bu adım, aşağıda açıklandığı gibi tekrarlayan bir dizi arabellek değişimi yoluyla gerçekleştirilebilir.
   1. Bir spin filtre ünitesinde gazı alınmış qIT tahlil tamponundan fazla protein çözeltisini seyreltin, santrifüjleme (4000 x g, 4 ° C, 15 dakika) kullanarak konsantre edin ve tekrarlayın. Tipik olarak, 1 mL rekombinant protein stok çözeltisinden DTT'yi (1 mM) yeterince çıkarmak için 15'te 1'lik 4 tur seyreltme gereklidir, ancak bu adım, orijinal rekombinant protein çözeltisindeki indirgeyici ajan konsantrasyonuna bağlı olarak ayarlanabilir.
      NOT: Alternatif olarak, hedef protein çözeltisinin büyük miktarda gazı alınmış qIT tahlil tamponuna karşı diyalize edilmesi de aynı sonucu elde edebilir.
5. Hedef protein çözeltisini (adım 2.1'de üretilen) gazı alınmış qIT tahlil tamponunda 15 μM'lik bir protein konsantrasyonuna seyreltin. 384 oyuklu bir plakayı yeterli ölü hacimle doldurmak için yaklaşık 9 mL hedef protein çözeltisi gereklidir.
6. Gazdan arındırılmış qIT tahlil tamponunda %1,5 (h/h) TCEP-agaroz süspansiyonu hazırlayın. Eleme plakası başına yaklaşık 9 mL TCEP-agaroz süspansiyonu gereklidir.
7. İki adet 384 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 20 μL TCEP-agaroz çözeltisi dağıtın.
8. Gazdan arındırılmış qIT tahlil tamponunda 15 μM'lik bir glutatyon stoğu hazırlayın. Bu, kaplamadan hemen önce hazırlanmalıdır, çünkü glutatyon indirgeyici ajan olmadan çözelti içinde hızla oksitlenir.
9. 20 μL qIT tahlil tamponunu her iki 384 oyuklu plakanın 1. ve 2. sütunlarına dağıtın.
10. 20 μL 15 μM protein veya glutatyon çözeltisini (amaçlanan plakaya uygun olarak) 384 oyuklu plakanın 3-24 sütunlarına dağıtın. Bunlar Protein Reaksiyon Plakası ve Glutatyon Reaksiyon Plakası olarak adlandırılır. RT'de 1 saat azalmaya bırakın.
11. 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 58,2 μL gazı alınmış qIT tahlil tamponu dağıtın, ardından her bileşiğin qIT tahlil tamponunda 1,5 mM'lik bir konsantrasyona seyreltildiği bir Bileşik Seyreltme Plakası oluşturmak için Parça Kitaplık Plakasının karşılık gelen her bir kuyucuğundan 1,8 μL aktarın artı %3 DMSO.
    NOT: Bu adım, her kuyucuk için bileşik stokların tek bir işlemde aktarılmasına olanak tanıyan 384 pipetleme istasyonu ile daha kolay hale getirilmiştir.
12. Protein ve glutatyonun TCEP-agaroz ile 1 saat inkübasyonunu takiben, tahlili başlatmak için Bileşik Seyreltme Plakasının her bir oyuğundan 20 μL bileşik çözeltiyi hem protein hem de glutatyon reaksiyon plakalarına aktarın. Bu adım, 384 pipetleme istasyonu ile de daha kolay hale getirilmiştir. Test adımları Şekil 3'te özetlenmiştir.
    NOT: Fragman konsantrasyonu gerektiği gibi değiştirilebilir ve istenirse, protein afinitesinin yüksek fragman konsantrasyonunun bir artefaktı olmadığını doğrulamak için daha düşük konsantrasyonlardaki isabetler için qIT tahlilleri tekrarlanabilir. Nispeten yüksek fragman konsantrasyonu, hafif reaktif bileşikler için doğru oranların belirlenebilir olmasını sağlamak için k_pro ve k_GSH'yi yükseltmek için kullanılır (bu, tahlil koşulları altında t_1/2 (GSH) > 24 saat gösterebilir). Ayrıca, 500 μM'lik bir fragman konsantrasyonu yüksek olmasına rağmen, fragman taramasında yüksek μM ila düşük mM konsantrasyonları kullanılmıştır, örneğin¹³.
13. Bir zamanlayıcı başlatın - tahlil başladı ve söndürmeler aşağıdaki bölüme göre düzenli zaman noktalarında yapılmalıdır.

Şekil 3: qIT test özeti. qIT tahlil reaksiyon kuyusu kurulumunun temel adımlarını gösteren bir özet. (BioRender kullanılarak oluşturulmuştur). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. BGBM söndürür

NOT: CPM söndürmeleri, protein ve glutatyon reaksiyon plakalarında kalan reaksiyona girmemiş tiyol miktarını ölçmek için gerçekleştirilir. Bunlar, reaksiyon kinetiğinin izlenmesine izin vermek için ayrı zaman noktalarında (örneğin, aşağıdaki zaman noktaları tipik olarak kullanılır: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 ve 1440 dakika) gerçekleştirilmelidir.

1. DMSO'da CPM stok çözeltileri (500 μM) hazırlayın, bunları mikrosantrifüj tüplerinde 111.2 μL'lik alikotlara dağıtın ve -20 °C'de saklayın. Bu CPM stokları önceden hazırlanabilir ve söndürme zaman noktası başına 1 alikot gerekecektir.
2. Donmuş bir CPM stok çözeltisini (500 μM) çözdürerek ve 40 mL qIT tahlil söndürme tamponuna ekleyerek CPM söndürme solüsyonunu (1,4 μM) hazırlayın.
3. İki 384 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 27 μL CPM söndürme çözeltisi dağıtın - hem protein hem de glutatyon reaksiyon plakalarını söndürmek için iki tane gereklidir. Bunlara CPM-Söndürme Plakaları denir, kullanmadan önce en fazla 30 dakika hazırlayın.
4. TCEP-agarozun peletlendiğinden emin olmak için protein reaksiyon plakasını 200 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
5. Önceden belirlenmiş zaman noktalarında, Protein Reaksiyon Plakasının her oyuğundan 3 μL'lik bir numuneyi önceden doldurulmuş bir CPM Söndürme Plakasına aktarın. Bu adım, 384 pipetleme istasyonu kullanılarak da basitleştirilmiştir.
6. CPM Söndürme Plakasını 3 x 25 μL'yi aspire ederek ve dağıtarak karıştırın. CPM söndürmeye müdahale edecek olan TCEP-agarozun altta aspire edilmesini önlemek için numuneyi kuyunun üstünden çıkarmak önemlidir.
7. Glutatyon Reaksiyon Plakası ile 3.4-3.6 adımlarını tekrarlayın.
8. CPM Söndürme Plakalarını (3.4-3.6'da hazırlanmış) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
9. CPM söndürme plakasının floresan yoğunluğunu ölçün (384 nm'de uyarma ve 470 nm'de emisyon).

4. Veri analizi ve isabet seçimi

1. Her söndürme için, test kalitesinin bir ölçüsü olarak Z'yi hesaplayın. Z' < 0,5 olan herhangi bir BGBM söndürmesi göz ardı edilmelidir.
   Z' = 1 - ((3σ_{pozitif kontrol} + 3σ_{negatif kontrol}) / (μ_{pozitif kontrol} - μ_{negatif kontrol}))
   Burada σ = floresan yoğunluğu standart sapması ve μ = floresan yoğunluğu ortalaması
2. Negatif ve pozitif kontrol kuyuları için ortalama floresan değerlerini hesaplayın (sırasıyla sütun 1 ve 2 ve 23 ve 24).
3. Her reaksiyonu, pozitif ve negatif kontrollerin ortalama floresan değerlerine iyi bir şekilde normalleştirin:
   % modifiye = 100 x (bileşik kuyu floresansı - negatif kontrol floresansı) / (pozitif kontrol floresansı - negatif kontrol floresansı)
4. Glutatyon ve hedef protein ile reaksiyona giren her bileşik için zamana karşı değiştirilen % 'yi ayrı ayrı çizin.
5. Aşağıdaki denklemi kullanarak hem protein hem de glutatyon ile reaksiyon için tek fazlı üstel bozunma modeline göre normalleştirilmiş % değiştirilmiş zaman verilerini uygun hale getirin:
   % Değiştirilmiş = ae ^{- kt + c}
   Burada a = % değiştirilmiş değerler aralığı, k = reaksiyon hızı, t = zaman, c = sonsuz zamanda % değiştirilmiş değer. Eğri uydurma ve parametre belirleme, ticari yazılımlar (Graphpad gibi) kullanılarak gerçekleştirilebilir.
6. Her parça için Hız Geliştirme Faktörü (REF) değerini hesaplamak için parçaların protein (k_pro) ve glutatyon (k_GSH) ile reaksiyona girme hızını kullanın:
   REF = k_yanlısı / k_GSH
7. İsabet parçalarını seçmek için REF değerlerini kullanın. Bu, bir REF eşiği (örneğin, REF > 3), keyfi bir isabet oranı (örneğin, en yüksek %2) ayarlayarak veya geometrik ortalamadan daha büyük REF 3 standart sapmalarına sahip parçalar seçilerek gerçekleştirilebilir.

Results

qIT testi burada isimsiz, tek bir sistein proteini için kovalent fragman isabetlerini tanımlamak için kullanılır. Hedef proteinin^Mg 2+ iyonlarına bağlandığı bilindiği için reaksiyon tamponlarına MgCl₂ (10 mM) eklendi. Tarama üç kopya halinde gerçekleştirildi ve her bir parçanın hem hedef protein (k_pro) hem de glutatyon (k_GSH) ile reaksiyona girme hızı belirlendi. Z' değerleri, tüm söndürme plakaları için 0.5'ten büyüktü ve protein söndürmeleri için ortalama 0.75 ve glutatyon söndürmeleri için 0.79 idi, bu da mükemmel test performansını gösteriyordu. Daha sonra her parça için REF değerleri hesaplandı ve REF'in 3 olduğu yerde isabetler > seçildi.

Temsili sonuçlar (Şekil 4), qIT tahlili kullanılarak isabet seçimine bir örnek sağlar. Bileşik 1 , hedef protein üzerindeki sistein kalıntısı ile glutatyona göre 6.0 kat daha fazla oranda reaksiyona girdi ve REF > 3 kriteri kullanılarak bir isabet olarak seçildi (Şekil 4B). Bu hız ivmesi, bir şablonlama etkisinin varlığını gösterir, bu sayede kovalent olmayan etkileşimler, hedef protein üzerindeki sisteinin kloroasetamid savaş başlığı ile reaksiyona girmesi için doğru oryantasyonda 1'i konumlandırır. Buna karşılık, 2 ile hedef sistein kalıntısı arasındaki reaksiyon, 2 ile glutatyon arasındaki reaksiyona göre hızlandırılmadığından, 2 isabetsiz bir fragman örneğidir. Hız ivmesinin olmaması, 2'yi hedef sistein kalıntısı ile reaksiyona girmek için doğru yönde konumlandıran üretken kovalent olmayan etkileşimlerin olmadığını gösterir.

Şekil 4: Temsili sonuçlar. Sonuçlar, (A) yüksek bir içsel reaktivite, olası bir yanlış pozitif isabet fragmanı ve (B) bir isabet fragmanı için qIT ile protein ve glutatyon reaksiyonunun izlenmesini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

qIT testi, sistein-reaktif elektrofilik fragmanların bir hedef proteine karşı taranması için etkili ve uygun bir platform sağlar. Bununla birlikte, yeterince açıklanmadığı takdirde tahlil performansını engelleyebilecek kritik hususlar vardır. En önemlisi, diğer sistein kalıntıları CPM ile reaksiyona gireceğinden ve floresan ölçümlerine müdahale edeceğinden, hedef proteinlerin qIT taraması için uygun olması için yalnızca tek bir yüzeye maruz kalan sistein içermesi gerekir. Hedef proteinlerin birden fazla yüzeye maruz sistein içerdiği önceki durumlarda (SARS-CoV-2 ana proteazı, küçük GTPaz RAP27A ve Sikline bağımlı kinaz 2 gibi), enterferans yapan kalıntıların çıkarıldığı tarama yapıları daha önce başarıyla kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu stratejinin etkinliği^{proteine bağlı} olarak değişecektir ^10,14,15.

Ek olarak, qIT testi, zaman içinde CPM ile reaksiyona girmek için mevcut olan tiyoldeki azalmayı ölçtüğünden, tiyol oksidasyonu veya protein agregasyonu gibi mevcut tiyollerin oranını azaltan herhangi bir faktör, test performansını engelleyebilir. Tampon gazdan arındırma ve hareketsizleştirilmiş bir indirgeyici ajanın (TCEP-agaroz) kullanılması, tiyol oksidasyonunun yavaş olmasını sağlar ve kalan oksidasyon, floresan ölçümlerinin pozitif kontrol kuyularınınkine normalize edilmesiyle hafifletilmelidir. Bununla birlikte, kuyucuklar arasında eşit olmayan bir TCEP-agaroz dağılımı düzgün olmayan tiyol oksidasyonuna neden olduğunda sorunlar ortaya çıkabilir. Bu nedenle, TCEP-agaroz partikülleri pipetleme rezervuarlarında battığı için zorlayıcı olabilen tahlil performansı için tutarlı TCEP-agaroz kaplama çok önemlidir.

Tahlil koşulları (oda sıcaklığında 24 saat inkübasyon) nispeten sert olduğu için protein agregasyonu da bir sorun olabilir. Etiketleri çözündürmek için hedef proteinleri kaynaştırmak, reaksiyon tamponlarını değiştirmek veya tahlili daha düşük sıcaklıklarda gerçekleştirmek gibi sorun giderme stratejileri, agregasyonu azaltabilir ve protein stabilitesi sorunlarını çözebilir. Bazı fragmanlar ayrıca protein agregasyonunu indükleyebilir, bu da CPM ile reaksiyona girmek için mevcut olan tiyol oranını tekrar azaltır ve yanlış pozitif isabetler oluşturur. Bozulmamış protein kütle spektrometresi kullanılarak yapılan ortogonal isabet doğrulaması, bu durumları tespit etmek için etkili bir yöntemdir, çünkü yanlış pozitif isabetler, bir hedef protein ile inkübe edildiğinde küçük veya var olmayan bir etiketli tür popülasyonu oluşturacaktır.

Bu hususlar kontrol edildiğinde, qIT testinin diğer kovalent fragman tarama yöntemlerine göre bazı belirgin avantajları vardır. REF kullanılarak yapılan vuruş seçimi, isabetlerin yalnızca hedef protein ile üretken kovalent olmayan etkileşimler oluşturmaları durumunda seçilmesini sağlar. Parça elektrofilikliği, hem farklı savaş başlıkları arasında hem de savaş başlığı sınıfları içinde geniş aralıklarda değişir; Örneğin, önceki çalışmalar, akrilamidler¹⁰ arasındaki glutatyon reaktivitesi oranında birkaç yüz kat varyasyon bulmuştur. Bu geniş elektrofiliklik aralığı, şablonlama etkisi nedeniyle yüksek k_pro değerlerine sahip parçaları, basitçe oldukça reaktif olanlardan ayırt etmeyi zorlaştırabilir ve bu da yüksek reaktif parçaların yanlış pozitif vuruşlar olarak seçilmesine yol açabilir. Örneğin, 2, hedef sistein kalıntısı ile 1'den daha hızlı reaksiyona girdi ve içsel reaktivite dikkate alınmadan, bir isabet olarak seçilebilir. Bununla birlikte, 2, hedef sistein kalıntısı ile glutatyondan daha yüksek bir oranda reaksiyona girmez, bu da 2'nin 1'e göre daha büyük k_pro'sunun, bir şablonlama etkisinden değil, daha büyük fragman içsel reaktivitesinden kaynaklandığını gösterir.

Kalan tiyolu ölçmek için qIT tahlili tarafından kullanılan basit floresan okuması da oldukça avantajlıdır. Diğer kovalent fragman tarama yöntemleri, fragmanların bir hedef protein ile reaksiyona girme hızını belirlemek için bozulmamış protein kütle spektrometresi ve glutatyonun fragmanlarla reaksiyona girme hızını belirlemek için LC-MS kullanır - her ikisi de özel ekipman gerektirir ve verim eksikliği^{vardır 8,16}. Kullanışlı floresan okuması, qIT testini yüksek düzeyde ölçeklenebilir hale getirir ve yalnızca yaygın olarak bulunan laboratuvar ekipmanı gerektirir.

Bu yenilikler bir araya geldiğinde, kütle spektrometresi ekipmanına olan ihtiyacı ortadan kaldıran sağlam ve ölçeklenebilir bir kovalent parça tarama yöntemi oluşturur.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Argon Gazı	BOC	I1149
Corning 384 kuyulu, düşük flanşlı, düz tabanlı tahlil plakaları	Corning	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
İmmobilize TCEP-agaroz	Pierce	77712
Mikro plaka okuyucu	CLARIOstar
PCR Plaka Contaları	BioRad	MSA5001
Azaltılmış L-glutatyon	Sigma-Aldrich	G4251
Sodyum Klorür	Sigma-Aldrich	S9888
Sodyum Hepes	Sigma-Aldrich	RES6007H-A7