Yöntem makalesi

Maya Bütün Hücrelerinde Mitokondriyal Solunum Miktar Tayini

1.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67186

⸱

8 Kasım 2024

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

Bu makalede

Özet

Maya bütün hücrelerinde mitokondriyal solunum, hücre biyoenerjiğinin değerli bir göstergesidir. Burada, farklı maya türleri için geçerli olan bu fenotipi ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Metabolizma esas olarak hücresel enerji mevcudiyeti ve çevresel koşullar tarafından koordine edilir. Hücrelerin enerjik metabolizmayı farklı beslenme ve çevresel koşullara nasıl adapte ettiğini bilmek için yapılan tahliller, moleküler mekanizmaları aydınlatmak için değerli bilgiler verir. Oksidatif fosforilasyon, çoğu hücrede ATP'nin birincil kaynağıdır ve mitokondriyal solunum aktivitesi, ATP sentezi için mitokondriyal membran potansiyelini koruyan oksidatif fosforilasyonun önemli bir bileşenidir. Mitokondriyal solunum genellikle hücresel bağlamı eksik olan izole mitokondrilerde incelenir. Burada, maya bozulmamış hücrelerde mitokondriyal solunumu ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, genellikle Saccharomyces cerevisiae hücreleri için kullanılmasına rağmen, herhangi bir maya türü için geçerlidir. İlk olarak, belirli koşullarda maya büyümesi test edilir. Daha sonra hücreler yıkanır ve 1:1 oranında (a/h) deiyonize suda yeniden süspanse edilir. Hücreler daha sonra sürekli karıştırılarak bir oksimetre odasına yerleştirilir ve oksijen tüketimini ölçmek için bir Clark elektrodu kullanılır. Bazı moleküller sırayla odaya yerleştirilir ve elektron taşıma zinciri veya ATP sentezi üzerindeki bu etkiye göre seçilir. ATPaz inhibitörü oligomisin ilk olarak ATP sentezine bağlı solunumu ölçmek için eklenir. Daha sonra, maksimum solunum kapasitesini ölçmek için bir birleştirici kullanılır. Son olarak, mitokondriyal solunumla ilgisi olmayan oksijen tüketimini atmak için bir elektron taşıma zinciri inhibitörleri karışımı eklenir. Veriler, oksijen tüketim oranını temsil eden eğimi elde etmek için doğrusal bir regresyon kullanılarak analiz edilir. Bu yöntemin avantajı, hücresel bağlamı koruyarak maya mitokondriyal solunumuna özgü olmasıdır. Mitokondriyal solunum miktar tayininde kullanılan inhibitörlerin maya türleri arasında farklılık gösterebileceğini vurgulamak önemlidir.

Giriş

Mitokondri, hücresel biyoenerjetikte temel bir rol oynar, çünkü çoğu hücre için ATP'nin ana kaynağıdır ve birkaç yol birleşir ve mitokondriyal yollarınaktivitesine bağlıdır 1. Oksidatif fosforilasyon, oksijen ve F1F0- ATPaz aktivitesini azaltmak için elektron taşıma zinciri boyunca elektron taşınmasını birleştiren, elektron akısı2 nedeniyle üretilen mitokondriyal zar potansiyelini kullanarak ATP'yi sentezleyen ATP sentezi için gereklidir. Bu nedenle, mitokondriyal solunum oksidatif fosforilasyonunbir parçasıdır 3.

Mitokondriyal solunum zinciri, dört kompleks veya bazı durumlarda maya kompleksi I eksikliği olan (örneğin, Saccharomyces cerevisiae), üç kompleks ve üç dehidrojenaz proteiniiçerir 4. Solunum kompleksleri iç mitokondriyal zarda lokalizedir; bazı mayalar, kompleks I (NADH dehidrojenaz) veya üç NADH dehidrojenaz, ubikinon (Co Q), kompleks II (süksinat ubikinon oksidoredüktaz), kompleks III (ubikinon sitokrom oksidoredüktaz), sitokrom c (Cyt c) ve kompleks IV (sitokrom c oksidaz) ile kanonik elektron taşıma zincirini sunar5,6. Kompleksler boyunca elektron taşınması, protonların mitokondri matrisinden zarlar arası boşluğa pompalanmasına izin vererek bir mitokondriyal zar potansiyeli7 oluşturur. Zarlar arası boşlukta bulunan protonlar, pompalanan dört proton başına bir ATP molekülü sentezlemek için F1F0 -ATPaz ile mitokondri matrisine doğru ters yönde pompalanır8.

Mitokondriyal solunum ölçümleri, mitokondriyal bütünlük, hücre biyoenerjetik ve mitokondriyal solunum kapasitesi hakkında değerli bilgiler sağlar9. Mitokondriyal solunum fonksiyonu, çeşitli teknikler kullanılarak in vitro veya in situ olarak analiz edilebilir. Bununla birlikte, sağlam hücrelerde mitokondriyal solunum analizi, tüm hücreler kullanıldığında hücrelerin çevreleri ve hücre içi metabolizma ile etkileşimleri göz önünde bulundurulduğundan, tüm hücre metabolizmasını içerdiği için bir dizi avantaj sunabilir10. Ayrıca, sağlam hücrelerin kullanılması, çeşitli deney koşullarının kolayca değerlendirilmesine olanak tanır ve izole mitokondride gözlemlenemeyen minimal değişiklikleri tespit eder10,11. Sağlam hücrelerde mitokondriyal solunum miktar tayininin bir başka avantajı, mitokondriyal proliferasyon ve lokalizasyonun etkilerinin korunmasıdır12.

Sağlam hücrelerde memeli mitokondri solunumu, mayalar gibi diğer ökaryotik organizmaların incelenmesini bir kenara bırakarak, çok ayrıntılı olarak12 tanımlanmıştır. Burada, memeli protokollerinden mayaya uyarlanmış mitokondriyal solunumu ölçmek için bir teknik öneriyoruz. Bu nedenle, bu teknikte mitokondriyal solunumun memeli nicelleştirmesinden elde edilen kavramlar kullanılmıştır. Örneğin, bu teknik memeli protokolü olarak çeşitli aşamalara ayrılmıştır: 1) bazal solunum (substrata bağlı), 2) ATP'ye bağlı solunum (ATP sentazın inhibisyonu yoluyla), 3) maksimum solunum kapasitesi (protonların iç mitokondriyal zardan geçirgenliğine izin veren bir birleştirici kullanarak), 4) mitokondriyal solunum inhibisyonu (farklı diğer kaynaklar için oksijen tüketimini atmak için solunum zinciri inhibitörlerinin bir karışımını kullanarak) mitokondriyal solunum)11,13. Bu nedenle, bu makale mayada mitokondriyal solunumu ölçmek için bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.

Protokol

1. Kültür ortamı ve aşı hazırlığı

  1. 95 mL damıtılmış suya 1 g maya özütü, 2 g kazein pepton ve 2 g glikoz ekleyerek 100 mL maya özütü-pepton-dekstroz ortamı (YPD) hazırlayın. 3 mL'yi 10 mL'lik cam test tüplerine dağıtın, 121 °C'de ve 15 dakika boyunca 1,5 psi'de sterilize edin.
    NOT: Ortam 4 - 8 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.
  2. 3 mL YPD ortamı içeren 10 mL'lik bir cam test tüpünü 250 μL -20 °C gliserolle korunmuş maya hücreleri ile aşılayın. 200 rpm ve 30 °C'de sabit çalkalama ile gece boyunca inkübe edin.
    NOT: Sıcaklık inkübasyonu bazı maya türlerinde değişebilir (örneğin, Kluyveromyces marxianus'un optimal büyüme sıcaklığı 37 °C'dir).
  3. Bir Petri kabını (60 x 15 mm2) steril% 2 YPD agar ile doldurun (10 g maya özütü, 20 g kazein pepton, 20 g glikoz ve 20 g bakteriyolojik agar 950 mL damıtılmış suya ekleyin) ve Petri kabını steril bir halka kullanarak 10 mL cam test tüpünde büyütülen maya hücreleri ile çizin. Petri kabını izole koloniler görünene kadar 30 °C'de inkübe edin.
  4. Petri kabından iki veya üç maya izole koloni ile% 2 glikozda 3 mL YPD ortamı içeren steril bir 10 mL cam test tüpünü aşılayarak bir ön aşılama hazırlayın. 30 ° C'de sürekli çalkalama ile gece boyunca inkübe edin.

2. Büyüme koşulları ve deney tasarımı

  1. 100 mL steril sentetik tam ortam (SC ortamı; amino asitsiz maya nitrojen bazı, 0.5 g amonyum sülfat, 0.2 g dipotasyum fosfat, 1 g maya sentetik bırakma takviyeleri ve deneysel tasarıma göre glikoz, 98.02 mL damıtılmış su) içeren 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesini ilk OD600 ~ 0.1'de maya kültürü ile aşılayın, bu, gece boyunca yapılan ön aşılamanın yaklaşık 3 mL'sidir (OD600 ~ 3). Çevresel durumu ayarlayın veya mitokondriyal solunumda test edilecek kimyasal zorlukla destekleyin (örneğin, 100 μM resveratrol ekleyerek). Kimyasal zorluk için ayrı bir şişede bir araç kontrolü hazırlayın. En az üç biyolojik kopyayı test edin.
    NOT: Tahlilde besin gürültüsünü atmak için minimal bir besiyeri kullanılması önerilir ve bu noktada önerilen minimal besiyeri S. cerevisiae için kullanılır ve diğer maya türleri için farklılık gösterebilir. Son olarak, kültür ortamında takviye edilen glikoz konsantrasyonu, glikoz baskılanmasını veya mitokondriyal solunumu inhibe eden Crabtree etkisini önlemek için kritik öneme sahiptir; % 0.5'in (a / h) altındaki konsantrasyonlar, S. cerevisiae'de yüksek büyüme oranları ile birlikte mitokondriyal solunumda iyi yanıtlar verdi. Crabtree negatif mayalarda, yüksek glikoz konsantrasyonları mitokondriyal solunumu etkilemedi (örneğin, K. marxianus).
  2. Boş bir 50 mL konik tüpü tartın ve 5 dakika boyunca4000 x g'da santrifüjleme ile orta log fazında (OD 600 ~ 0.5) hücreleri hasat etmek için kullanın.
    NOT: Mid-log fazı, enerjik metabolizmanın daha aktif olduğu büyüme fazı olduğu için mitokondriyal solunumu test etmek için önerilir.
  3. Süpernatanı atın ve peleti 3x 25 mL deiyonize su ile yıkayın. Konik tüpü pelet hücreleriyle tartın (ıslak ağırlık) ve hücresel ıslak ağırlığı elde etmek için konik tüp ağırlığını çıkarın.
  4. Peletleri 2 mL deiyonize suda tekrar süspanse edin.
  5. mg hücre / mL elde etmek için ıslak ağırlığı 2'ye bölerek hücresel konsantrasyonu kaydedin. Bu değer, tahlil için 50 mg hücreye sahip olmak için ne kadar hacim eklenmesi gerektiğini belirlemek için gereklidir.

3. Oksijen tüketimi testi (Polarografi)

  1. Veri toplama için bir YSI5300A monitörüne ve bir bilgisayara bağlı Clark tipi bir oksijen elektrodu kullanın.
    1. Polarograf odasına trietanolamin (MES-TEA tamponu; 10 mM) ve 50 mg hücre (ıslak ağırlık) ile pH 6'ya ayarlanmış 5 mL morfo-etanol sülfonik asit yerleştirin. Kabarcık olmamasına dikkat ederek elektrodu nazikçe yerleştirin.
    2. YSI5300A monitörünü, veri toplama için bilgisayarı ve karıştırma odasını açın. AIR'de Kanal 1 Ayar Kadranı'nı seçerek YSI5300A monitörünü ayarlayın. Kanal 1 kalibrasyon kadranı ile kanal 1'i %100'e ayarlayın ve sinyali 5 dakika boyunca %100'de sabitleyin.
    3. Bilgisayara veri kaydetmeye ve bir kronometre kullanarak zamanı ölçmeye başlayın.
      NOT: YSI5300A monitöründe bir veri toplama bilgisayarı veya programı yoktur; Bu, kullanıcı tarafından harici olarak uygulanabilir.
    4. Oksitlenebilir substratı, oligomisini, birleştiriciyi ve solunum zinciri inhibitörlerinin karışımını sırayla eklemek için elektrotun oksimetre odasındaki yanal kanalını kullanın.
  2. Oksitlenebilir substratı (glikoz, gliserol, L-laktat veya deneysel tasarıma göre başka bir karbon kaynağı) bir kromatografi şırıngası ile 10 mM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Odayı her zaman kapalı tutun ve sürekli çalkalayın. Bazal solunumu belirlemek için 2-3 dakika boyunca hava yüzdesi tüketimini kaydedin.
    NOT: Glikoz, gliserol ve L-laktat, solunum zincirinin farklı bölgelerindeki elektron taşıma zincirini analiz etmek için kullanılır: glikoz metabolizması, NADH oluşturmak için NAD + 'yı azaltır ve tüm solunum zincirini analiz etmek için kullanılır; gliserol elektronları ubikinon'a aktarır ve ubikinon'dan solunum zincirini değerlendirmek için kullanılır; son olarak, L-laktat elektronlarını sitokrom c'ye bırakır ve sitokrom c14'ün etkisini belirlemek için kullanılır. Bu substratlar, maya türlerinin enzimatik yeteneğine bağlı olarak değişebilir.
  3. ATP'ye bağlı solunumu değerlendirmek ve 2-3 dakika boyunca hava yüzdesi tüketimini kaydetmek için bir kromatografi şırıngası kullanarak oksimetre odasında 0.01 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için oligomisin ekleyin.
  4. Maksimum solunum kapasitesini belirlemek ve 2-3 dakika boyunca hava yüzdesi tüketimini kaydetmek için bir kromatografi şırıngası ile oksimetre odasında 0.015 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için birleştirici, 3-klorofenilhidrazon karbonil siyanür (CCCP) ekleyin.
  5. Elektron taşıma zinciri inhibitörlerini eklemek için bir kromatografi şırıngası kullanın: önce 2-tenoiltrifloroaseton (TTFA) ve ardından sırasıyla 1 mM ve 1 mg / mL'lik nihai konsantrasyonlarda antimisin A (AA). Her inhibitörü 2-3 dakika boyunca ölçün.
    NOT: Elektron taşıma zincirinin inhibitörleri maya türleri arasında farklılık gösterebilir; Bu adımda bu dikkate alınmalıdır.
  6. Her karbon kaynağını bağımsız olarak tarayın (yani glikoz, gliserol veya L-laktat). Her karbon kaynağı için 3.3 ila 3.5 arasındaki adımları tekrarlayın. Her kullanımdan sonra hazneyi 3x'i %70 etanol ve 3x'i deiyonize su ile yıkayın.

4. Veri işleme

  1. Oksitlenebilir substratın (bazal solunum), oligomisin (ATP'ye bağlı solunum), CCCP (maksimum solunum), AA ve TTFA'nın (mitokondriyal solunum değil; Şekil 1). Aşağıda açıklandığı gibi doğrusal regresyon kullanarak her bir takviye edilen bileşik için ayrı eğimleri hesaplayın.
    1. İstatistik yazılımında yeni bir proje dosyası oluşturun. Oluştur bölümünde XY'yi seçin. Veri tablosu bölümünde Verileri Yeni Bir Tabloya Gir veya İçe Aktar seçeneğini belirleyin.
    2. Seçenekler bölümündeki X alt bölümünde Sayılar'ı seçin. Seçenekler bölümündeki Y alt bölümündeki yan yana alt sütunlarda 3 çoğaltma değeri girin'e tıklayın.
      NOT: Tablo biçiminde bir X sütunu ve birkaç Y sütunu bulunur ve her biri A: Y1 ve A: Y2 adlı 3 alt sütuna sahiptir.
    3. Zaman verilerini X sütunlarına girin (ör. 0, 2, 4, 6, 8 sn veya 0, 1, 2, 3 dk). Hava yüzdesini Y sütunlarına yazın.
    4. Doğrusal regresyon uygunluğu yapın. Menü çubuğunda Analiz Et'e tıklayın. Analiz seçeneğinde, XY analizlerinde Basit Doğrusal Regresyon'u seçin ve Tamam'a tıklayın.
    5. Ekranın sol tarafında yer alan Results in Data tablolarından eğim değerini elde edin.
  2. Eğim değerlerini bir veri sayfasına yazın ve solunum inhibitörleri karışımından (AA ve TTFA) elde edilen eğim değerini, mitokondriyal solunumdan farklı kaynaklardan oksijen tüketimini atmak için oksitlenebilir substrat, oligomisin ve CCCP'den elde edilen eğimlerden çıkarın.
  3. Elde edilen değerleri 237 μMO2 ile çarpın. Bu değer, 25 ° C'de hava ile dengelenmiş (% 20.9 O2) tamponlu bir mitokondriyal ortamda O2'nin çözünürlüğü olarak kabul edilir; Bu değer kullanılan sıcaklığa, yüksekliğe ve tampona göre değişir.
  4. Dakikaya dönüştürün; elde edilen değerler, μM O2/ dak elde etmek için zamanın nasıl çizildiğine bağlı olarak zaman başına μMO2'dir.
  5. 50'ye, yani kullanılan hücrelerin mg'ına bölün; Hücre MG, deneysel tasarıma göre değişebilir. Son olarak, oksijen tüketimi μM O2 / mg hücre x dk olarak ifade edilir

Sonuçlar

Bu mitokondriyal solunum tekniği, Scheffersomyces stipitis15 ve K. marxianus16 gibi S. cerevisiae dışındaki maya türleri için kullanılabilir. Bununla birlikte, temsili amaçlar için, yalnızca S. cerevisiae'den elde edilen sonuçları sunuyoruz. S. cerevisiae'nin düşük glikoz konsantrasyonlarında (0,8 mM'nin altında) baskın bir solunum metabolizması sergilediği iyi bilinmektedir17,18. Bu nedenle, solunum fenotipini doğrulamak için S. cerevisiae, mitokondriyal solunumu uyarmak (% 0.5 glikoz) ve sınırlayıcı (% 5 glikoz) için iki glikoz konsantrasyonunda büyütüldü18,19. Beklendiği gibi, bazal solunum (oksitlenebilir substrat), ATP'ye bağlı solunum (oligomisin) ve maksimal solunum kapasitesinde (CCCP) elde edilen sonuçlar, S. cerevisiae'nin karakteristik enerjik metabolizmasını doğrulamaktadır (Şekil 2). %0.5 glukoz ile büyütülen hücrelerde oksijen tüketimi (bazal solunum, ATP'ye bağlı solunum ve maksimal solunum kapasitesi) %5 glukoz ile büyütülen hücrelerde elde edilen değerlere göre daha yüksek değerler gözlenmiştir (Şekil 2).

Ek olarak, tahlillerde üç substrat kullanıldı: glikoz, gliserol ve L-laktat. Farklı substratların kullanılmasının amacı, mitokondriyal solunum zincirinin farklı kısımlarını değerlendirmektir. Bu koşullarda, mitokondriyal solunum, solunum zincirini bozacak herhangi bir tedavi eklenmediğinden substrata bağlı önemli değişiklikler göstermedi (Şekil 2).

Mitokondriyal solunumu olumsuz yönde etkileyen bir bileşik olan tekniğin kapasitesini değerlendirmek için quercetin kullandık20. Elde edilen veriler, quercetin'in% 0.5 glikoz ile desteklenmiş ortamda yetiştirilen hücrelerde mitokondriyal solunumu önemli ölçüde azalttığını göstermiştir (Şekil 3). Öte yandan,% 5 glikoz ile takviye edilmiş ortamda yetiştirilen hücreler, quercetinden önemli bir olumsuz etki göstermemiştir (Şekil 4).

figure-results-1
Şekil 1: Temsili oksijen tüketim eğrisi. SC besiyerinde büyütülen S. cerevisiae hücrelerinde elde edilen oksijen tüketim eğrisi (%0.5 glikoz). Renkler, substratta, ayrıştırıcılarda ve inhibitör takviyesinde elde edilen farklı eğimleri temsil eder. Yeşil: Substrat, glikoz ve eğime karşılık gelen bazal solunumu kullandı. Mavi: oligomisin, ATP sentaz inhibitörü, ATP'ye bağlı solunumun belirlenmesi için kullanılan eğim. Sarı: CCCP, birleştirici, maksimal solunumu değerlendirmek için kullanılan eğim. Gri ve kırmızı: sırasıyla inhibitör kompleksi II ve III; mitokondriye bağlı olmayan oksijen tüketimini belirlemek için kullanılan eğim. Kısaltmalar: CCCP = 3-klorofenilhidrazon karbonil siyanür; TTFA = 2- tenoiltrifloroaseton; AA = antimisin A. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: %0.5 ve %5 glikozda büyütülen S. cerevisiae hücrelerinde oksijen tüketimi testleri. Mitokondriyal solunum, bazal solunumda ölçülen oksijen tüketimi, maksimum solunum kapasitesi ve %0.5 ve %5 glikoz ile desteklenmiş SC'de yetiştirilen S. cerevisiae hücrelerinde ATP'ye bağlı solunum ile değerlendirilir. Elektron taşıma zinciri üzerindeki spesifik etkilerini değerlendirmek için üç substrat kullanıldı: glikoz (NADH dehidrojenazlar), gliserol (ubikinon havuzu) ve L-laktat (sitokrom c). (A) substrat olarak glikoz, gliserol ve L-laktat ile% 5 ve% 0.5 glikozda bazal solunum; (B) substrat olarak glikoz, gliserol ve L-laktat ile% 5 ve% 0.5 glikozda maksimum solunum; (C) Substrat olarak glikoz, gliserol ve L-laktat ile% 5 ve% 0.5 glikozda ATP'ye bağlı solunum. Sonuçlar, her deneyde iki teknik tekrara sahip olacak şekilde, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± S.D. olarak sunulmuştur. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (p ≤ 0.05; farklı harfler: anlamlı fark, aynı harfler: anlamlı fark yok) test uygulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Quercetin, yetiştirilen S. cerevisiae hücrelerinde düşük glikoz konsantrasyonunda mitokondriyal solunumu sınırladı. Oksijen tüketimi ölçümü, SC ortamında (%0.5 glukoz) quercetin takviyeli (100 μM) büyütülen S. cerevisiae hücrelerinde bazal solunum, maksimal solunum kapasitesi ve ATP'ye bağlı solunumda gerçekleştirildi. Kuersetin çözeltisini çözmek için etanol kullanıldı. Sonuçlar, her deneyde iki teknik tekrara sahip olacak şekilde, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± S.D. olarak sunulmuştur. İstatistiksel analizler öğrenci t-testi ile eşleştirilmiş olarak yapıldı (*, ** p ≤ 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Quercetin, S. cerevisiae'de yüksek glikoz konsantrasyonunda mitokondriyal solunumu etkilemez. Oksijen tüketimi, SC ortamında (%5 glikoz) quercetin takviyeli (100 μM) büyütülen S. cerevisiae hücrelerinde bazal solunum, maksimal solunum kapasitesi ve ATP'ye bağlı solunumda ölçüldü. Quercetin çözeltisini çözmek için etanol kullanılır. Sonuçlar, her biri iki teknik tekrara sahip üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± S.D.'yi göstermektedir. İstatistiksel analizler öğrenci t-testi eşleştirilmiş kullanılarak yapıldı (p ≤ 0.05; ns: anlamlı değil). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Mitokondriyal solunum fosforilasyonu, mitokondriyal membran potansiyeline bağlı olan ve oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP seviyelerini koruyan çeşitli yollarda temel bir rol oynar. Çevresel ve beslenme koşullarının mayaların mitokondriyal solunumunu nasıl etkilediğini anlamak, moleküler mekanizmaları aydınlatmak için bir araç olarak hizmet eder.

Bu yöntemden güvenilir sonuçlar elde etmek için aşağıdaki kritik adımları dikkate almak önemlidir. Ajitasyon >200 rpm, mitokondriyal solunumu test etmek için solunum büyüme koşulları altında yeterli biyokütle elde etmek için kritik öneme sahiptir; 200 rpm'den daha düşük çalkalama koşulları, zayıf büyüme ve biyokütle oluşumuna neden olur, orta log büyüme aşamasına ulaşmak için daha yüksek süreler alır ve hücreler daha az oksijenli bir ortamda hayatta kaldığından oksijen tüketim oranlarını etkileyebilir. Ortamdaki glikoz konsantrasyonu maya fenotipine (Crabtree-pozitif veya negatif) göre ayarlanır; bu, Crabtree pozitif mayalar söz konusu olduğunda kritiktir, çünkü yüksek glikoz konsantrasyonları mitokondriyal solunumu engeller ve veri yorumlamasında bir önyargı uygulayabilir. Örneğin, S. cerevisiae'de glikoz, yüksek glikoz konsantrasyonlarında mitokondriyal solunumu inhibe ederek katabolik baskılanmaya neden olur21,22. Bu kanıtlara dayanarak, düşük glikoz konsantrasyonunda (%0.5) büyütülen maya hücrelerine kıyasla bazal solunum, ATP'ye bağlı solunum ve yüksek glikoz konsantrasyonunda (%5) büyütülen hücrelerin maksimum solunumunda daha düşük değerler elde edilir. Solunum zinciri inhibitörleri, maya duyarlılığına göre dikkatlice seçilmelidir; Bu, mitokondriyal solunum dışındaki hücresel oksijen tüketimi kaynaklarını atmak için kritik öneme sahiptir.

Sağlam hücrelerde mitokondriyal solunumun farklı parametrelerini belirlemek için substratlar, mitokondriyal ayrıştırıcılar ve inhibitörler kullanılır. Bununla birlikte, kullanımlarının bazı sınırlamaları vardır. Örneğin, mitokondriyal inhibitörlerin ve sağlam hücrelerdeki ayrıştırıcıların mitokondri dışındaki spesifik olmayan hedefleri, oksijen tüketimi yorumunda yanlılığı önlemek için dikkate alınmalıdır. Ayrıca, solunum zincirindeki etki bölgesini taramak için alternatif karbon kaynaklarının kullanımı daha ayrıntılı olarak test edilmelidir, çünkü gliserol veya L-laktat metabolizmasının yan ürünleri, elektronları bırakan ve solunum zincirini aktive eden NAD + veya FAD + 'yı azaltmak için oksitlenebilir. Son olarak, S. cerevisiae ve diğer mayalar, oligomisinin hücrelerden23 dışarı akışını düşündüren Yor1p (maya oligomisin direnç proteini) gibi PDR taşıyıcılarını barındırır. Ayrıca, mitokondriyal solunum ölçümü için S. cerevisiae'de oligomisin kullanımını doğrulamak için PDR eksikliği olan hücreler, örneğin ana PDR taşıyıcıları ve PDR1 / PDR3 transkripsiyon faktörleri silinen AD1-3 suşu kullanılarak yapılan deneylere ihtiyaç vardır.

Mitokondriyal solunum ölçümü için sağlam hücrelerin kullanılması, hücresel bağlamı koruyarak maya biyoenerjetik üzerindeki besleyici veya çevresel etkileri bilmek için daha sağlam bir teknik sağlar. Ayrıca, mitokondriyal solunum ölçümü için maya bozulmamış hücrelerin kullanılması, izole edilmiş mitokondriden daha ekonomiktir ve teknik düzeyde daha kolaydır. Ek olarak, izole mitokondri tahlillerinde olduğu gibi, çeşitli karbon kaynakları, bazı moleküllerin solunum zincirindeki etki alanını gösterir. Kavramın kanıtı olarak, bu teknik, resveratrol takviyesinin NADH dehidrojenaz seviyesinde solunum zincirini etkilediğini doğrulamaktadır, çünkü bazal solunumda resveratrol inhibisyonu gliserol veya L-laktat24 ile değil, yalnızca glikoz ile gözlenir. Çözündürülmüş kompleks I ile yapılan in vitro çalışmalar, resveratrolün NAD + ile rekabet ettiğini ve kompleks I aktivitesini25 etkilediğini göstermiştir. Bu, burada sunulan teknikle sağlam hücrelerde gözlemlenen fenotipi doğrular. Ayrıca, bu teknik, kimyasalların maya mitokondriyal solunumu üzerindeki olumsuz etkilerini araştırmak için de güvenilirdir. Örneğin, quercetin, son yıllarda yaygın olarak çalışılan bir polifenoldür. Bulunan birincil kanıtlar arasında, karmaşık solunum zinciri aktivitesi26,27 ile doğrulanan sağlam hücrelerde mitokondriyal solunumu sınırladığı gösterilmiştir. Daha da önemlisi, çeşitli araştırmalar, farklı model çalışmalarında mitokondriyal solunum üzerinde quercetin inhibitör etkileri bildirmiştir28.

Biyoenerjetik de dahil olmak üzere maya metabolizmasının ayrıntılı bir tanımına sahip olmak önemlidir, çünkü bu mikroorganizmalar insanlar da dahil olmak üzere hayvan patojenleri olabilir ve ayrıca hücre fabrikaları olarak veya biyoteknolojik uygulamalarda kullanılır.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, LAMP'e verilen Tecnológico Nacional de México (Grant 20026.24-PD) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2- tenoiltrifloroaseton (TTFA)MerckT27006İnhibitör kompleksi II
3-klorofenilhidrazon karbonil siyanür (CCCP)MerckC2759Mitokondriyal solunum birleştirici   
Absolut ethanolMerck107017Quercetin 'yi çözmek için;
AgarMerckA1296YPD agar hazırlığı
Amonyum sülfat granül (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC et suyu hazırlama
Antimisin A (AA)MerckA8674İnhibitör kompleksi III
aYSI5300A--------Monitör 
SantrifüjHermleZ 206 A Hücrelersantrifüjleme
Clark tipi oksijen--------Elektrot 
Bilgisayar--------Veri toplama için 
Dipotasyum fosfat K2HPO4JT Baker3252-05SC et suyu hazırlama
GlikozMerckG7021YPD et suyu hazırlama
GliserolMerckG5516Substrat ortamı takviyesi 
LactateMerckL1250Substrat ortamı takviyesi 
Streptomyces diastatochromogenesMerck'ten oligomisinO4876Mitokondriyal ATP sentaz
Orbital ShakerThermo FisherSHKE6000 İnkübum inkübasyon cam tüpleri ve şişelerinin
Kazeinden pepton, enzimatik sindirimMerck82303YPD et suyu hazırlama
Quercetin Merck337951Mitokondriyal solunumu azaltmak için
Urasil MerckU0750SC et suyu hazırlama
Maya özüMerckY1625YPD et suyu hazırlama
Amino asit ve amonyum sülfat içermeyen maya azot bazıMerckY1251SC et suyu hazırlama
Maya Sentetik Urasil içermeyen bırakma ortamı takviyeleriMerckY1501SC et suyu hazırlama
için inhibisyonu

Kaynaklar

  1. Jang, D. H., Seeger, S. C., Grady, M. E., Shofer, F. S., Eckmann, D. M. Mitochondrial dynamics and respiration within cells with increased open pore cytoskeletal meshes. Biol Open. 6 (12), 1831-1839 (2017).
  2. Duvezin-Caubet, S., Caron, M., Giraud, M. F., Velours, J., di Rago, J. P. The two rotor components of yeast mitochondrial ATP synthase are mechanically coupled by subunit delta. Proc Natl Acad Sci. 100 (23), 13235-13240 (2003).
  3. Vakifahmetoglu-Norberg, H., Ouchida, A. T., Norberg, E. The role of mitochondria in metabolism and cell death. Biochem Biophys Res Comm. 482 (3), 426-431 (2017).
  4. Matus-Ortega, M. G., et al. New complexes containing the internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 32 (10), 629-641 (2015).
  5. Avéret, N., Jobin, M. L., Devin, A., Rigoulet, M. Proton pumping complex I increases growth yield in Candida utilis. Biochim Biophys. 1847 (10), 1320-1326 (2015).
  6. Schägger, H. Respiratory chain supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
  7. Lasserre, J. P., et al. Yeast as a system for modeling mitochondrial disease mechanisms and discovering therapies. Dis Model Mech. 8 (6), 509-526 (2015).
  8. Turina, P., Samoray, D., Gräber, P. H+/ATP ratio of proton transport-coupled ATP synthesis and hydrolysis catalysed by CF0F1-liposomes. EMBO J. 22 (3), 418-426 (2003).
  9. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Prot. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  10. Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal muscles. Int J Mol Sci. 23 (4), 2252(2022).
  11. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  12. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
  13. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. J Biol Chem. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  14. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen by Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  15. Granados-Arvizu, J. A., Canizal-García, M., Madrigal-Pérez, L. A., González-Hernández, J. C., Regalado-González, C. Inhibition of alternative respiration system of Scheffersomyces stipitis and effect on glucose or xylose fermentation. FEMS Yeast Res. 21 (2), foab005(2021).
  16. Carrillo-Garmendia, A., et al. Snf1p/Hxk2p/Mig1p pathway regulates hexose transporters transcript levels, affecting the exponential growth and mitochondrial respiration of Saccharomyces cerevisiae. Fungal Genet Biol. 161, 103701(2022).
  17. Maslanka, R., Zadrag-Tecza, R. Reproductive potential of yeast cells depends on overall action of interconnected changes in central carbon metabolism, cellular biosynthetic capacity, and proteostasis. Int J Mol Sci. 21 (19), 7313(2020).
  18. Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (10), 4535-4548 (2018).
  19. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Rep. 21 (11), e50845(2020).
  20. Carrillo-Garmendia, A., et al. Cytotoxicity of quercetin is related to mitochondrial respiration impairment in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 39 (11-12), 617-628 (2022).
  21. Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. FEBS J. 281 (21), 4805-4814 (2014).
  22. Gancedo, J. M. Yeast carbon catabolite repression. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (2), 334-361 (1998).
  23. Katzmann, D. J., et al. Expression of an ATP-binding cassette transporter-encoding gene (YOR1) is required for oligomycin resistance in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 15 (12), 6875-6883 (1995).
  24. Madrigal-Perez, L. A., Nava, G. M., Gonzalez-Hernandez, J. C., Ramos-Gomez, M. Resveratrol increases glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae via a SNF1-dependet mechanism. J Bioenerr Biomemb. 47 (4), 331-336 (2015).
  25. Gueguen, N., et al. Resveratrol directly binds to mitochondrial complex I and increases oxidative stress in brain mitochondria of aged mice. PloS One. 10 (12), e0144290(2015).
  26. Lagoa, R., Graziani, I., Lopez-Sanchez, C., Garcia-Martinez, V., Gutierrez-Merino, C. Complex I and cytochrome c are molecular targets of flavonoids that inhibit hydrogen peroxide production by mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1807 (12), 1562-1572 (2011).
  27. de Oliveira, M. R., et al. Quercetin and the mitochondria: A mechanistic view. Biotechnol Adv. 34 (5), 532-549 (2016).
  28. Carrillo-Garmendia, A., Madrigal-Perez, L. A., Regalado-Gonzalez, C. The multifaceted role of quercetin derived from its mitochondrial mechanism. Mol Cell Biochem. , (2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Oksijen T ketimiClark ElektroduOksidatif FosforilasyonElektron Ta ma ZinciriATP SenteziLineer RegresyonOksimetre OdasSaccharomyces Cerevisiae

İlgili makaleler