İnsan Adenozin Deaminaz 1 Enziminin Serum Stabilitesinin Belirlenmesi

Özet

Bu makalede, bir enzimin insan serumunda 37 °C'de inkübe edildiğinde işlevini sürdürme yeteneğini karakterize etmek için yöntemleri detaylandırıyoruz, bu da serum stabilitesi olarak adlandırılan farmakolojik bir özelliktir. Bu yetenek, bir enzimin farmakokinetik profilini ve terapötik kullanım için uygunluğunu tahmin etmede önemli bir faktör olabilir.

Özet

Enzim stabilitesi kavramı tipik olarak bir enzimin termostabilitesine atıfta bulunmak için kullanılır - sıcaklık arttıkça yapı ve aktiviteyi koruma yeteneği. Terapötik bir enzim için, diğer stabilite ölçümleri de, özellikle insan serumunda 37 ° C'de fonksiyonu koruma kabiliyeti de kritik olabilir, buna serum stabilitesi denir. Burada, absorbans bazlı bir mikroplaka prosedürü kullanarak vahşi tip Homo sapiens adenosin deaminaz I (HsADA1) enziminin serum stabilitesini değerlendirmek için bir in vitro testi tarif ediyoruz. Spesifik olarak, bu el yazması, tamponların ve reaktiflerin hazırlanmasını, HsADA1'in serumda çakıştırılmasını düzenleyen bir yöntemi, bir mikroplaka okuyucu kullanarak test numunelerini analiz etmek için bir yöntemi ve bir HsADA1 enziminin serumda zamanın bir fonksiyonu olarak tuttuğu aktivite fraksiyonunu belirlemek için eşlik eden bir analizi açıklar. Protokolün serum stabilitesinin önemli olduğu diğer enzimlere adaptasyonuna yardımcı olmak için bir Homo sapiens kinüreninaz enzimi örneği kullanarak bu protokolü diğer enzimlere uyarlamak için düşünceleri daha fazla tartışıyoruz.

Giriş

Aşağıdaki yöntem, bir kullanıcının, intravenöz enjeksiyondan sonra karşılaşacağı şeyi taklit eden koşullara maruz kaldığında bir enzimin aktivitesini koruma yeteneğini kantitatif olarak değerlendirmesine olanak tanır. İn vitro yöntem, bu tür in vivo koşulları taklit eder ve enzimin 37 ° C'de havuzlanmış insan serumunda inkübasyonundan ve enzim aktivitesinin tutulmasının zaman vadeli analizlerinden oluşur. Bir enzimin bu koşullarda aktiviteyi koruma kabiliyetine serum stabilitesi olarak atıfta bulunuruz ve enzim aktivitesi için analiz yöntemi, bir enzimin substratı ile elde edilen ürün arasındaki absorpsiyon farklılık....

Protokol

1. Serum inkübasyonu

1. 10 μM'lik bir nihai konsantrasyonda 1x PBS pH 7.4'te (1x PBS) 10x HsADA1 stoğu hazırlayın. 15 mL'lik bir havuzlanmış insan serumu alikotunu çözün ve 37 ° C'ye ısıtın. 50 mL'lik 1x PBS'lik bir alikotu 37 °C'ye önceden ısıtın.
2. Enzim + serum karışımı olarak adlandırılan düşük bağlı bir mikrosantrifüj tüpünde 900 μL havuzlanmış insan serumuna 10 μL 10x HsADA1 stoğu ekleyerek enzim-serum inkübasyon karışımlarını hazırlayın. Ayrı bir düşük bağlı mikrosantrifüj tüpünde, enzim + 1x PBS karışımı olarak adlandırılan serum olmayan bir kontrolle karşılaştırmak için 10 μL 10x HsADA1 stokunu 900 μL 1x PBS'ye ekleyin. Her ka....

Sonuçlar

Şekiller, vahşi tip HsADA1 ile yapıldığında yapılan tahlil çalışmasının sonuçlarını göstermektedir. Şekil 3A,B, adenozin ilavesinden sonra vahşi tip HsADA1 için 1x PBS/serum-enzim karışımlarından kaynaklanan numunelerin 260 nm'deki absorbans düşüş eğrilerini göstermektedir. Zaman verilerinin bir fonksiyonu olarak bu azalan absorbans, kullanıcının mikroplaka bazlı testin başarılı bir şekilde tamamlanmasından sonra bekleyebileceği şeydir ve adenosine yeterli miktarda fonksiyon.......

Tartışma

Bu protokol, bir enzimin aktivitesini ölçmek için substrat ürüne dönüştürülürken absorbans değişimini kullanır. Bu nedenle, substrat ve ürün farklı spektral profillere sahip olmalıdır. Bu, her ikisi de farklı spektral profillere ve 260-265 nm 6,8,12,13 arasında sönme katsayılarına sahip adenozin ve inosin için geçerlidir. Bu tahlil, önceki birkaç çalışmadan esi.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Adenozin	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT Mikroplaka Okuyucu
Eppendorf LoBind Mikrosantrifüj Tüpleri: Protein	Fisher Bilimsel	13-698-795	2 mL
Gliserol	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	Ev
İçi İnsan Serumu, Havuzlanmış	MP Biyomedikaller	92931149	100 mL
Hidroksi-kinürenin	Cayman Kimyasalları	27778
İnosin	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
Piridoksal 5-fosfat monohidrat, %99	Thermo Scientifc 228170010		1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio
Wildtype İnsan Adenozin Deaminaz 1	Kurum

655801 İçi