Drosophila melanogaster Göz Fenotiplerinin Ölçülmesi: ilastik ve Flynotyper'ı Entegre Eden Hesaplamalı Bir Yaklaşım

Summary

Drosophila göz sistemi, özellikle insan nörodejeneratif hastalıkları olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir araçtır. Bununla birlikte, kaba göz fenotiplerinin manuel olarak ölçülmesi önyargılı ve güvenilmez olabilir. Burada, göz fenotipini tarafsız bir şekilde ölçmek için ilastik ve Flynotyper'ın kullanıldığı bir yöntemi açıklıyoruz.

Abstract

Drosophila melanogaster bileşik göz, simetrik ve altıgen bir desen sergileyen, yaklaşık 800 ommatidiadan oluşan iyi yapılandırılmış ve kapsamlı bir dizidir. Bu düzenlilik ve gözlem kolaylığı, Drosophila göz sistemini çeşitli insan nörodejeneratif hastalıklarını modellemek için güçlü bir araç haline getirir. Bununla birlikte, göz şiddeti skorlarının manuel olarak sıralanması gibi anormal fenotipleri ölçme yollarının, özellikle göz morfolojisindeki zayıf değişiklikleri sıralarken sınırlamaları vardır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için Flynotyper gibi hesaplamalı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bir halka ışığının kullanılması, bireysel ommatidia'nın sağlamlığına erişen daha iyi kalitatif görüntüler sağlar. Bununla birlikte, bu görüntüler, halka ışığının neden olduğu ommatidia üzerindeki gölgeler nedeniyle doğrudan Flynotyper tarafından analiz edilemez. Burada, Drosophila hastalık modellerinde gözlenen pürüzlü göz fenotiplerini ölçmek için iki yazılımı, ilastik ve Flynotyper'ı birleştirerek tarafsız bir yol açıklıyoruz. Görüntülerin ilastik ile ön işlenmesiyle, Flynotyper ile kaba göz fenotipinin başarılı bir şekilde ölçülmesi sağlanabilir.

Introduction

Drosophila melanogaster genomu, insan hastalıklarıyla ilgili gen ortologlarının ~%75'ini içerir. Ek olarak, Drosophila göz gelişimi sırasında, genomdaki genlerin yaklaşık üçte ikisi eksprese edilir, bu da Drosophila gözünü çeşitli moleküler ve hücresel fonksiyonları, gelişimi ve hastalık modellerini araştırmak için olağanüstü bir genetik sistem haline getirir ^1,2. Bu nedenle, Drosophila göz sistemi, çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir deneysel araçtır.

Drosophila bileşik gözü, simetrik ve altıgen bir desen^sergileyen iyi yapılandırılmış ve kapsamlı bir ~ 800 ommatidia dizisidir 3. Bu altıgen desenin düzenliliği, göz morfolojisinde ortaya çıkan mutasyonların ve gen ekspresyon değişikliklerinin etkisini tahmin etmek için kullanılabilir⁴. Göz morfolojisinin değerlendirilmesini gerektiren önceki çalışmalar, çıplak gözle tespit edilen göz fenotiplerinin ciddiyetinin manuel sıralamasına büyük ölçüde dayanıyordu. Göz fenotiplerini sıralamak için dış göz morfolojisi görüntüleri stereomikroskop^{ile alınır 5,6}. Her grubun göz fenotipi, dış gözün dört alana bölünmesi ve her alandaki dejenerasyon oranının^{hesaplanması 5,6} ile değerlendirilir. Daha sonra değerler, kontrol sineklerinden⁷ elde edilen değerlerle karşılaştırılan ortalamaları hesaplamak için kullanılır. Puanlama, füzyon derecesine, ommatidia kaybına ve kıl organizasyonuna^{dayanmaktadır 7,8}. Stereomikroskop ile çekilen sinek gözü fotoğrafları bir araştırmacı tarafından elde edilir ve göz fenotip analizi başka bir araştırmacı tarafından üçlü validasyon setleri ^7,8 ile gerçekleştirilir.

Çıplak gözle göz morfolojisindeki zayıf değişikliklerin sıralanması söz konusu olduğunda, sınırlamalar vardır⁴. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için FLEYE ve Flynotyper gibi hesaplama yaklaşımları geliştirilmiştir ^1,9. Flynotyper, Drosophila göz sistemindeki morfolojik değişiklikleri kantitatif olarak tahmin etmek için yeni bir hesaplama yöntemidir¹. Gözün düzensizliğine göre Fenotipik Skorları (P-Skorları) hesaplayarak Drosophila gözünü ve bireysel ommatidyumu otomatik olarak algılar ¹. Daha yüksek bir P-Skoru, sinek gözünün daha dejenere olduğunu gösterir. Bu yazılım, Drosophila gözlerinin¹⁰ anormalliğini ölçmede başarıyla kullanıldı. Flynotyper otomatik bir işlem sağlamasına rağmen, çeşitli ışık mikroskobu yöntemleri ile çekilen bazı göz görüntülerine hala başarılı bir şekilde uygulanamamaktadır.

Niteliksel olarak, her bir ommatidyumun daha doğru bir temsilini sunduğu için tek noktalı bir ışık kaynağına kıyasla bir halka ışık kaynağını tercih ediyoruz. Bununla birlikte, halka ışık kullanıldığında, ommatidyumun yarım küre şeklindeki şekli nedeniyle her ommatidiumun tepesinde halka şeklinde bir gölge oluşturur. Bu halka şeklindeki gölge, Flynotyper tarafından doğru ommatidial algılamayı engelleyerek P-Skorlarının yanlış hesaplanmasına yol açar.

Bu sorunların üstesinden gelmek için, sinek gözü görüntülerinde ommatidia'yı sınıflandırmak için çeşitli analizler için makine öğrenimi tabanlı bir araç olan ilastik'i uyguladık¹¹. Daha sonra P-Skorlarını hesaplamak için ilastik tarafından oluşturulan görüntüleri Flynotyper'a besledik. Bu, Drosophila göz morfolojik kusurlarını tarafsız bir şekilde ölçmemizi sağlar¹.

Protocol

1. Miktar tayini için hazırlanıyor

1. ilastik¹¹, ImageJ ve ImageJ eklentisi Flynotyper^1'i indirin ve yükleyin. Kurulumla ilgili web sitesi bağlantıları için Malzeme Tablosuna bakın. Bilgisayarın işletim sistemine (Mac, Windows, Linux vb.) göre uygun paketleri indirin. Kurulum talimatlarını tam olarak belirtildiği gibi izleyin.
   NOT: Verilen bağlantılarda belirtildiği gibi talimatlara tam olarak uyulması zorunludur. Kullanılan bilgisayarın 64 bit işletim sistemine ihtiyacı vardır; Aksi takdirde, başka gerekli özellikler yoktur. Bu protokol için kullanılan sistemin bilgisayar belirtimleri için Malzeme Tablosu'na bakın.
2. Makine öğrenmesi modelini eğitmek için standart bir görüntü kullanın. Gözün merkezini odak noktası olarak kullanarak, halka ışıklı (w1118 x GMR-GAL4 gibi) bir ışık mikroskobu kullanarak sağlıklı bir sinek gözünün görüntüsünü çekin. Erkekleri ve kadınları ayrı ayrı analiz edin; Bu nedenle, erkekler ve kadınlar için standart bir görüntü elde edin.
   NOT: Ayarlar, mikroskoba ve kameraya bağlı olarak büyük ölçüde değişecektir. Sinek hazırlığı ve görüntü elde etme hakkında daha genel bilgi için tartışmadaki ikinci paragrafa bakın.
3. Standart görüntü alımı için kullanılan ayarların aynısını kullanarak deneysel sinek gözlerinin görüntülerini çekin.
   NOT: Doğru niceleme için iyi yönlendirme çok önemlidir. Doğru yönlendirme için örnek olarak Şekil 4'e bakın.

2. Sinek gözü görüntülerinden ommatidia'yı tespit etmek için ilastik kullanma

1. Analize başlamadan önce, aşağıdaki işlemleri kolaylaştırmak için deney koşulundan bağımsız olarak tüm deney gruplarının aynı dosya klasöründe olduğundan emin olun. Deney gruplarını tanımlamak ve erkeklerle kadınları ayırt etmek için dosyaların uygun şekilde adlandırıldığından emin olun.
   NOT: Protokolü yazdırmanızı ve şekilleri yakınlaştırmak için bilgisayarı kullanmanızı öneririz, çünkü bu protokol görsel olarak en kolay şekilde takip edilir.
2. Yazılımı açın.
   NOT: Yazılımı çalıştırırken başka uygulamaların açık olmaması önerilir; Aksi takdirde, bilgisayar özellikle eski veya daha az sağlam sistemlerde çok yavaş çalışabilir.
3. Yeni Proje Oluştur'a tıklayın | Diğer İş Akışları, Hücre Yoğunluğu Sayımı'nı seçin ve proje dosyasını kaydetmek için bir konum seçin (Şekil 1A).
4. 1'e tıklayın. Giriş Verileri | Yeni Ekle | Ayrı resim(ler) ekleyin. Standart görüntüyü seçin (Şekil 1B).
5. 2'ye tıklayın. Özellik Seçimi ve kullanılacak özellikleri seçin. Şekil 1C'de gösterilen özellikleri seçin; Hassasiyeti artırmak için daha fazla sigma değeri seçin (yani, 10, 15, 20, vb.).
   NOT: Çok fazla kutu işaretlenirse, program uzun süre çalışabilir.
6. 3'e tıklayın. Sayma ve Ön Plan sigma değerini 5.00 olarak ayarlayın. Standart görüntüde Ön Plan aracını kullanarak 50 veya daha fazla bireysel ommatidiumu işaretleyin.
   NOT: Analiz için tipik olarak elli işaret yeterlidir; bununla birlikte, ommatidia ne kadar çok işaretlenirse, sonuçlar o kadar doğru olacaktır (Şekil 1D).
7. 3'e tıklayın. Ommatidia'nın dışını işaretlemek için Sayma ve Arka Plan aracını kullanın (Şekil 1E). Ommatidia'nın etrafına kafes şeklinde yeşil çizgiler çizin.
   NOT: Ommatidia üzerindeki daha fazla işarete benzer şekilde, ne kadar çok yeşil çizgi çizilirse, sonuçlar o kadar doğru olacaktır.
8. 4'e tıklayın. Yoğunluk Dışa Aktarma | Görüntü ayarlarını yapmak için Görüntü Ayarlarını Dışa Aktar'ı seçin (Şekil 1F). Çıktı Dosyası Bilgisi'ne tıklayın | Flynotyper'da daha fazla analiz için Format ve tif'i seçin.
9. 5'e tıklayın. Toplu İşleme | Ham Veri Dosyaları'nı seçin ve analiz edilecek tüm deneysel sinek fotoğraflarını seçin (Şekil 1G). Analiz edilecek içe aktarılan görüntülerin listesi, Ham Veri Dosyalarını Seç altında görülür (Şekil 1H). 5'in altındaki Tüm Dosyaları İşle'yi tıklayın. Toplu İşleme bölümü.
   NOT: Hatırlatmak gerekirse, erkek ve kadın analizleri ayrı ayrı yapılmalıdır. Kullanılan bilgisayara bağlı olarak, özellikle çok sayıda içe aktarılan görüntü varsa, bu adım 10 dakika veya daha uzun sürebilir.
10. Yazılım tamamlandıktan sonra, deneysel sinek gözü görüntülerini içeren aynı dosya klasörünü kontrol edin; "YourSampleName_Probabilities" adlı siyah görüntüler olacaktır (Şekil 1I).

3. Flynotyper için fotoğraf hazırlamak için ImageJ'yi kullanma

1. ilastik tarafından oluşturulan .tif dosyasını (kara kutular) ImageJ'de açın.
   NOT: ilastik tarafından oluşturulan her .tif dosyasının ayrı ayrı ele alınması gerekir.
2. Yalnızca gözün etrafında bir dikdörtgen oluşturmak için Dikdörtgen Seçimi aracını kullanın. Dikdörtgen çizildikten sonra, Ctrl + X veya Ctrl + C tuşlarını seçerek alanı kırpın (Şekil 2A). Dikdörtgen anahat şeklinde bir kara kutunun görünmesini bekleyin.
   NOT: Bilgisayarın işletim sistemi 'Ctrl + X' veya 'Ctrl + C' kullanılıp kullanılmayacağını belirleyecektir. Genellikle, 'Ctrl + X' Windows içindir ve 'Ctrl + C' Mac için kullanılır.
3. ImageJ kullanarak şimdi kesilmiş sinek gözünü açın; Dosya | Yeni | Dahili Pano (Şekil 2B).
4. Dosya | Farklı Kaydet | jpeg dosyasını açın. Kesilen görüntüler artık orijinal deneysel görüntülerle aynı dosya klasöründedir.
   NOT: Bir sonraki adımı kolaylaştırmak için, 'kes' adlı yeni bir dosya klasörü oluşturmanız ve kesilen tüm görüntüleri bu klasöre koymanız önerilir.

4. Fenotipik puanları hesaplamak için Flynotyper'ı kullanma

1. Eklentiler'e tıklayarak Flynotyper'ı bir ImageJ eklentisi olarak açın | Uçan çentik.
2. Genotip Ekle'yi seçin ve kesilmiş sinek gözü görüntülerini içeren klasörü açın (dosya klasörünü kes). Klasör adı Genotipler altında görünecektir (Şekil 2C).
3. Işık mikroskobu ve Dikey kutularını kontrol edin, ancak gerekirse buna göre ayarlayın. Rank Ommatidia altındaki Stabilite ve Merkeze Uzaklık kutularını şu şekilde kontrol edin: (Şekil 2C).
4. Dikkate alınan dereceli ommatidia sayısı için 200 girin.
   NOT: Genel olarak, 200 iyi bir sayıdır ancak tercihlere göre ayarlayın.
5. Çalıştır'a tıklayın ve analiz sonuçlarının görünmesini bekleyin (Şekil 2D).
   NOT: Bu adım, kullanılan bilgisayarın işlem gücüne bağlı olarak 5 dakika veya daha uzun (veya daha kısa) sürebilir.
6. Daha fazla analiz için Örnek Dosyayı ve P-Score'u kopyalayıp istatistiksel yazılıma yapıştırın.

Results

Önceki bir çalışmada, frontotemporal demans (ALS-FTD) ile amyotrofik lateral skleroz ile bağlantılı mutant VCP proteininin genetik değiştiricilerini belirlemek için bu protokolü ^kullandık12. Ek olarak, bu yöntem, daha eski bir stereomikroskop¹³ kullanıldığında bile, CHCHD10^S59L aracılı ALS-FTD'nin toksisitesini değerlendirmek için başka bir makalede de kullanılmıştır. Bu sonuçları daha da doğrulamak için, Baek ve ^ark.13 ile aynı ALS-FTD hastalık mutasyonunda ilastik ve Flynotyper kullandık; Ancak, eğitimli olmayan bir laboratuvar personeli deneyi gerçekleştirdi ve benzer sonuçlar elde etti. Bu nedenle, ilastik ve Flynotyper'ı birleştirmek, Drosophila ommatidia'nın dejenerasyonunu tarafsız bir şekilde puanlamak için sağlam bir yöntemdir.

Daha iyi kalitatif değerlendirmelere izin verdiği için halka ışık kullanmayı tercih ediyoruz (Şekil 3). Ancak, bir halka ışığı kullanmak, Flynotyper'ın doğrudan analiz edemediği bir gölgeye neden olur. Bunun üstesinden gelmek için, Flynotyper ile P-Skorlarını ölçmeden önce görüntüleri lastikte önceden işledik. Genel olarak, dejenere olmayan (GMR-GAL4) sinek gözün P-Skorları, orta derecede dejenere olmuş bir göze (2x_S81L) ve ciddi derecede dejenere olmuş bir göze (3x_S81L) kıyasla anlamlı derecede düşüktü (Şekil 4A, B ve Tablo 1). Flynotyper'dan üretilen daha yüksek P-Skorları daha dejenere bir gözü¹ gösterdiğinden, bu beklenen sonuçtur. İlastik kullanılmadığında, dejenere olmayan bir göz ile orta derecede dejenere olmuş bir göz arasında P-Skorlarında ihmal edilebilir farklılıklar vardı (Şekil 4C ve Tablo 1). Bu, Flynotyper'ın ilastik kullanmadan halka ışık koşulları altında ommatidia modellerini doğru bir şekilde tanımlamak için mücadele ettiğini gösteriyor. Bunun nedeni, Flynotyper'ın, ommatidial merkez^1'i tanımlamak için ek ayarlamalarla gri tonlamaya dönüştürülen çift noktalı bir ışıkla çekilen görüntüleri kullanmak üzere tasarlanmış olmasıdır. Itól, her ommatidyumun merkezinde bir nokta ekleyerek bu işlemi tekrarlar ve Flynotyper içinde nicelemeyi mümkün kılar.

Şekil 1: Örnek ilastik iş akışı. (A) ilastik'te yeni bir proje oluşturmak. (B) Standart görüntünün seçilmesi. (C) Özellik Seçimi altında sigma değerlerinin seçilmesi. (D) Hassasiyet için ommatidia'nın ön planını işaretlemek. (E) Hassasiyet için ommatidia'nın arka planını işaretlemek. (F) Yazılımın işlenmiş dosyaları nasıl dışa aktaracağını seçme. (G) Hangi deneysel sinek gözü görüntülerinin analiz edileceğini seçmek. (H) Hangi deneysel sinek gözü görüntülerinin analiz edileceğini göstermek. (I) Yazılımı çalıştırdıktan sonra bitmiş ürün. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Örnek Flynotyper iş akışı. (A) Daha fazla analiz için sadece sineğin gözünü seçmek. (B) Kesilen göz görüntüsünü yeni bir pencerede açma. (C) Hangi kesim görüntülerinin analiz edileceğini ve analiz için kontrol edilecek parametrelerin seçilmesi. (D) Örnek sonuçlar. Fenotipik skorlar en sağda sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kalitatif Drosophila göz görüntüleri. Dejenere olmayan (üstte) ve dejenere (altta) koşullarda halka ışıkla (solda) çekilen ve çift noktalı ışıkla (sağda) çekilen aynı sinek gözü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Drosophila'da kaba göz fenotipinin doğru bir şekilde ölçülmesi için Flynotyper'dan önce ilastik kullanılması. (A) Dejenere olmayan bir gözün (GMR-GAL4), orta derecede dejenere olmuş bir gözün (2x_S81L) ve ciddi derecede dejenere olmuş bir gözün (3x_S81L) temsili Drosophila göz görüntüleri. (B) ilastik kullanıldıktan sonra Flynotyper'dan elde edilen miktar belirleme sonuçları. Sonuçların yorumlanmasını kolaylaştırmaya yardımcı olmak için iki taraflı permütasyon t-testinin p değerleri hesaplandı (GMR-GAL4 ve 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 ve 3x_S81L: p = 0) (C) Flynotyper'dan ilastik kullanılmadan elde edilen miktar belirleme sonuçları. Sonuçların yorumlanmasını kolaylaştırmak için iki taraflı permütasyon t-testinin p değerleri hesaplandı (GMR-GAL4 ve 2x_S81L: p = 0.597, GMR-GAL4 ve 3x_S81L: p = 0.687). Her grup için N = 3. Veri noktaları, görsel netlik için x ekseninde titreşir veya yığılır. Düz yatay çizgi ortalamayı temsil eder. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

GMR-GAL4 Serisi		2x_S81L		3x_S81L
ilastik ile	İlastik olmadan	ilastik ile	İlastik olmadan	ilastik ile	İlastik olmadan
26.7	55.7	52.5	51.2	59.9	55.6
17.4	53.5	50	54.9	60.7	52
22.8	55.5	56.8	55.2	60.1	55.1

Tablo 1: Flynotyper'ı ilastik ile kullanırken ve Flynotyper'ı tek başına kullanırken P-Skorları.

Ek Şekil S1: Görüntü alımı için uçan kafa montajı kurulumu. Bu, birden fazla kağıt yaprağı kullanarak görüntü alımı için nasıl ayarlanacağına dair bir örnektir. Bununla birlikte, başın ve sinek gözünün doğru yönlendirilmesini sağlayan herhangi bir yöntem kullanılabilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: Özellik seçimi altında 2.5 sigma değeri kullanıldığında ilastik ve Flynotyper'ın nicel sonuçları. ilastik'te özellik seçimi altında 5.0 dışında bir sigma değeri kullanmak, yanlış nicelemeye neden olabilir. Spesifik olarak, 2.5'lik bir sigma değeri hassasiyet kaybına neden olur. Sonuçların yorumlanmasını kolaylaştırmak için iki taraflı permütasyon t-testinin p değerleri hesaplandı (GMR-GAL4 ve 2x_S81L: p = 0.192, GMR-GAL4 ve 3x_S81L: p = 0). Her grup için N = 3. Veri noktaları, görsel netlik için x ekseninde titreşir veya yığılır. Düz yatay çizgi ortalamayı temsil eder. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S3: Nekrotik yamalar nedeniyle duyarlılık kaybı ve yanlış P-Skorları. Beyaz oklar nekrotik yamaların segmentlerine işaret ediyor. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1: Özellik seçimi altında 2.5 sigma değeri kullanıldığında P-Skorları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Drosophila'nın ommatidiası, çeşitli biyolojik fonksiyonları ve genetik hastalıkları incelemek için yararlı bir sistem içerir. Ommatidia'nın düzenliliği, genetik mutasyonların etkisini incelemek için iyi bir ölçümdür⁴. Ommatidiyal düzenliliği hesaplamak için manuel sıralama gibi çeşitli yöntemler mevcut olsa da, bu yöntemler büyük ölçüde önyargılı olabilir. Bu önyargılı yaklaşımın üstesinden gelmek için yarı otomatik araçlar geliştirilmiştir ^1,11.

Doğru göz ölçümü için sinek hazırlığı ve kurulumu optimize edilmelidir. Her laboratuvarın kendi kurulumuna sahip olacağını anlasak da, okuyuculara sinekleri görüntü elde etmeye nasıl hazırlayacakları hakkında bir fikir vermek için laboratuvarımızda aşağıdaki kurulumu sağlıyoruz. Sinekler dondurulur ve -80 °C'de saklanır. 3'lük bir örneklem büyüklüğü kullandık, çünkü deneyimlerimize göre, GMR-GAL4 S81L mutasyonu ile birleştirildiğinde, popülasyon arasında çok az varyasyon var. Bununla birlikte, örneklem büyüklüğünün sıfır hipotez anlamlılık testi yapacak şekilde ayarlanması gerektiğini unutmayın. Görüntü elde etmek için sinekleri monte etmek için, sinek kafası, gözün merkezi kabaca odak düzlemi olacak şekilde yastık görevi gören çok küçük bir kağıda dayanır (Ek Şekil S1). Laboratuvarımız bir Z-yığını mikroskobu ve kamera kullanır ( Malzeme Tablosuna bakınız), çünkü bu genel olarak daha net görüntüler üretir ve sinek gözü kubbe şeklinde olduğu için tüm gözün en iyi şekilde görselleştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, Z-yığını işlevi bu protokol için bir gereklilik değildir, çünkü bu yöntemi Z-yığını işlevi¹³ olmadan daha eski bir stereomikroskopla başarıyla kullandık. Parlaklık için halka ışık kadranı, aşırı pozlamayı önlemek için yolun 1/4'ünden daha fazla döndürülmez. Numunelerimizin toplam kalınlığı 300 ile 450 mikron arasında değişmektedir.

Bu çalışmada, ilastik ve Flynotyper ile sinek gözlerinin analizinin tarafsız ve güvenilir ommatidia miktar tayini sonuçları ürettiğini gösterdik. Ommatidia'yı işaretlemek için makine öğrenimi tabanlı bir biyogörüntü analiz aracı olan ilastik kullanarak Drosophila ommatidia paternlerini ve ardından ommatidia düzenliliğini ölçmek için kullanılan bir hesaplama yöntemi olan Flynotyper'ı kullanarak analiz ettik ^1,11. Daha iyi kalitatif değerlendirme için görüntü elde etmek için bir halka ışık kullanmayı tercih ediyoruz. Ancak bu yaklaşım, Flynotyper'ın bu görüntüleri kullanarak nicel sonuçlar üretmesine izin vermez. Bu nedenle, bu görüntüleri ön işleme tabi tutmak için ilastik uygulanmış ve bu işlenmiş görüntüler, nicel sonuçlar üretmek için Flynotyper ile başarıyla kullanılmıştır. Görüntüler Flynotyper'dan önce ilastik ile önceden işlenmediğinde, genel P-Skorları dejeneratif olmayan ve dejeneratif gözler arasında benzerdi. Bu, nicel sonuçlar için bir halka ışık uygularken önce ilastik kullanmanın önemini vurgulamaktadır.

Yöntemlerimizde bazı sınırlamalar vardır. ilastik'teki ayarlar büyük ölçüde değişebilir ve önemsiz verilere neden olabilir. Örneğin, aynı görüntüleri kullanarak başka bir analiz seti gerçekleştirdik, ancak lastikteki ön plan sigma değerini 5 yerine 2,5 olarak ayarladık. Bu, orta derecede dejeneratif fenotiplerde duyarlılık kaybına neden oldu (Ek Şekil S2 ve Ek Tablo S1). Diğer bir sınırlama ise çok fazla dejenerasyon ile birlikte gözlerde hassasiyet kaybıdır. 3x_S81L bir gözle karşılaştırıldığında, nekrotik yamaları olan bir göz niteliksel olarak çok daha dejenere olur. Bununla birlikte, 3x_S81L gözler için ortalama P-Skoru 60.2 iken, nekrotik yamaları olan gözler için ortalama P-skoru 60.9 idi. Bu nedenle, nekrotik yamalar gibi çok fazla dejenerasyona sahip gözler de hassasiyet kaybına neden olabilir (Ek Şekil S3).

Bu protokolün kritik bir adımı, ilastik'i eğitmek için kullanılan uygun bir standart görüntünün seçilmesidir. Ommatidia ile kırmızı veya turuncu gözler gibi çevredeki pigment hücreleri arasında belirgin bir kontrasta sahip, dejenere olmayan standart bir görüntü, Flynotyper'da daha doğru bir miktar tayini ile sonuçlanacaktır. Bir diğer kritik adım, makine öğrenimi yazılımına ince ayar yapmak için sigma değerleri olarak temsil edilen hassasiyetin seçildiği itlastik'teki Özellik Seçimidir (Şekil 1D). Çok az özelliğin seçilmesi, ilastik'in hassasiyetini azaltabilir ve bu da ommatidia'nın yanlış işaretlenmesine yol açabilir. Çok fazla özelliğin seçilmesi, sonuç elde etmek için gereken süreyi ve işlem gücünü artıracak ve prosedürün verimliliğini azaltacaktır. Alternatif olarak, gözde gözle görülür kalitatif dejenerasyon varsa, ancak analiz sonuçları istatistiksel olarak anlamlı değilse, seçilen özelliklerin sigma değerini artırmak potansiyel bir düzeltme olacaktır. Ancak bu protokolde sağlanan özellik seçimleri düzenli olarak doğru sonuçlar vermektedir. Kritik adımların yazıldığı gibi takip edilmesi, gelecekte en yaygın sorunların azaltılmasına ve sorun giderilmesine yardımcı olacaktır.

Özetle, bu yöntem daha iyi kalitatif görüntüler sağlarken aynı zamanda Drosophila göz sisteminin tarafsız ve güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar. Sonuç olarak, bu yöntem, gelecekte dejeneratif hastalıkları modellemek için güçlü bir araç olarak göz dejenerasyonunun faydasını artırabilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bilgisayar özellikleri			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Yazılımı buradan indirin: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Açık kaynaklı yazılım. Flynotyper 2.0 kullanmayın. Yayınlandığı sırada, 2.0 oldukça yeniydi ve bu protokol Flynotyper'ın orijinal sürümü için optimize edilmiştir.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Yazılımı buradan indirin: https://www.ilastik.org/download.html	Açık kaynaklı yazılım. Bilgisayarınızın işletim sistemine karşılık gelen Normal Yapılar altında 1.4.0.post1 Sürümünü indirin.
ImageJ		Yazılımı buradan indirin: Açık	kaynaklı yazılım https://imagej.net/ij/download.html. 1.53 ve 1.54 sürümleri kullanıldı. 1.54 güncellenmiş sürümdür ve varsayılan indirmedir.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	Z-stack alımı için kullanılan sistem ve yazılım.
DMC2900 kameralı Leica Z16 APO mikroskobu	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Metinde Z-stack mikroskop ve kamera olarak anılmaktadır. Bu ürün artık arşivlenmiştir.