Yöntem makalesi

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden 3D Orta Beyin Organoidlerinin Üretilmesi

DOI:

10.3791/67228

⸱

14 Şubat 2025

 ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden 3D orta beyin organoidleri oluşturmak için yeni bir yöntemi tanımlar, doğal orta beyin dokusunu taklit etmek için oluşumlarına rehberlik eder, böylece gelişim ve bozuklukların incelenmesine yardımcı olur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) orta beyin organoidlerinin (MO'lar) geliştirilmesi, beyin gelişimini anlamada, kesin hastalık modellemesini kolaylaştırmada ve terapötik araştırmaları ilerletmede önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Bu protokol, stratejik bir farklılaşma yaklaşımı kullanarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) kullanarak orta beyne özgü organoidler üretmek için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir. Anahtar teknikler arasında SMAD sinyalini baskılamak için çift SMAD inhibisyonu, fibroblast büyüme faktörü 8b'nin (FGF-8b) uygulanması ve agonist purmorfamin kullanılarak Sonic Hedgehog yolunun aktivasyonu yer alır ve iPSC'leri orta beyin kaderine doğru yönlendirir.

Bu yöntemle üretilen organoidler, 2 mm'ye kadar çaplara ulaşır ve orta beynin doğal hücresel çeşitliliğini yansıtan çok çeşitli nöroepitelyal hücre tiplerini içerir. Bu organoidlerin otantik orta beyin yapıları olarak doğrulanması, kimliklerini doğrulayan orta beyne özgü belirteçlerin ekspresyonunu içerir. Bu metodolojinin dikkate değer bir sonucu, iPSC'lerin orta beynin karakteristiği olan dopaminerjik nöronlara etkili bir şekilde farklılaşmasıdır.

Bu protokolün önemi, orta beynin temel yönlerini yakından kopyalayan, orta beyin gelişim süreçlerinin ve Parkinson hastalığı gibi ilgili bozuklukların patofizyolojisinin derinlemesine araştırılması için değerli bir model sunan, işlevsel olarak olgunlaşmış, orta beyne özgü organoidler üretme yeteneğinde yatmaktadır. Bu nedenle, bu protokol, insan beyni hakkındaki anlayışımızı geliştirmek ve nörodejeneratif hastalıklar için yeni tedaviler geliştirmek isteyen araştırmacılar için çok önemli bir kaynak görevi görür ve bu da onu nörolojik araştırma alanında vazgeçilmez bir araç haline getirir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karmaşık mimarisi ve karmaşık hücresel ve moleküler bileşimi ile insan beyni, özellikle hastalık modellemesi ve hücresel tedavi geliştirme bağlamında, sinirbilim araştırmalarında zorlu zorluklar ortaya koymaktadır1. Bu zorluklar, insan beyninin karmaşıklığını gerçekten temsil eden sofistike in vitro modellerin sınırlı mevcudiyeti ile daha da karmaşık hale geliyor. Bununla birlikte, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisindeki son gelişmeler, belirli nöronal alt tiplere kontrollü farklılaşmayı mümkün kılarak, insan beyninin gelişimini, hastalık patogenezini ve hücre bazlı terapötik stratejileri keşfetmek için umut verici yollar açmıştır.

Geleneksel olarak, iPSC'lerden türetilen iki boyutlu (2D) nöronal kültürler, insan nöronal fizyolojisini ve patolojisini taklit etmeyi amaçlayan in vitro çalışmaların temel taşı olmuştur. Bu tek katmanlı kültürler, nörolojik hastalıklar hakkındaki anlayışımızı geliştirmede ve nöroprotektif ajanlarınkeşfinde etkili olmuştur 2,3,4,5,6,7. Faydalarına rağmen, bu 2D sistemler, insan beyninin gerçek hücresel çeşitliliğini ve üç boyutlu (3D) yapısını taklit etmede yetersiz kalmaktadır.

Beyin organoid teknolojisinin ortaya çıkışı, in vitro modellemede önemli bir sıçramayı temsil eder ve insan beyninin karmaşık biyolojisini fizyolojik olarak ilgili bir çerçeve içinde yakından taklit eden bir araç sağlar8. Beyin organoid gelişimindeki erken teknikler, kendiliğinden ektoderm türevleri oluşturmak için iPSC'lerin doğal düzenleyici özelliklerinden yararlandı ve böylece beyin gelişiminin erken aşamalarını taklit etti 5,9,10,11,12. Nöronların diğer nöronal ve nöronal olmayan hücrelerle oluşturduğu karmaşık ağlar göz önüne alındığında, nörodejeneratif hastalıkları doğru bir şekilde incelemek için 3D modelleme gerekli hale gelir. 3D kültürler, hızlandırılmış nöronal farklılaşmayı ve ağ oluşumunukolaylaştırarak daha temsili bir in vivo ortam sağlar 12,13,14 ve 2D kültürlere kıyasla daha geniş bir nöronal gen ekspresyonunu teşvik eder 15. 3 boyutlu bağlamlarda geliştirilen nöronlar, in vivo muadillerini daha çok anımsatan morfolojiler ve fizyolojik özellikler kazanır16.

3D beyin modellerindeki son gelişmeler, insan beyninin uzamsal ve işlevsel karmaşıklığını daha etkili bir şekilde yakalamada çok önemli olmuştur. Son on yılda, hem tüm beyin organoidlerini hem de bölgeye özgü beyin modellerini 11,17,18,19,20,21,22 üretmek için çeşitli protokollerin ilerlemesi, mikrosefali 11, Alzheimer hastalığı 14,23 ve Parkinson hastalığı24 gibi nörolojik bozuklukların modellenmesinde paha biçilmez olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokolün amacı, insan iPSC'lerinden türetilen 3B insan MO'ları oluşturmak için bir yöntem geliştirmek ve iyileştirmektir. Bu protokol özellikle dopaminerjik nöronlarla zenginleştirilmiş ve insan orta beyninin doğal yapısını ve işlevselliğini yakından taklit edecek şekilde uzamsal olarak organize edilmiş organoidler üretmeyi amaçlamaktadır. Bu organoidlerin birincil amacı, Parkinson hastalığını incelemek için gelişmiş in vitro modeller olarak hizmet etmek ve bu durumla ilişkili nörogelişimsel süreçleri ve patolojileri keşfetmek için daha doğru ve fizyolojik olarak ilgili bir sistem sağlamaktır. Protokol, bu orta beyne özgü organoidleri üretmek için hastadan türetilmiş iPSC'lerden yararlanarak, Parkinson hastalığı mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirmeyi, potansiyel terapötik hedeflerin keşfini kolaylaştırmayı ve hücre bazlı tedavilerin geliştirilmesini iyileştirmeyi amaçlamaktadır. Bu yenilikçi yaklaşım sayesinde protokol, geleneksel 2D nöronal kültürlerin sınırlamalarının üstesinden gelmeyi ve in vitro hastalık modellemesi ve yeni tedavi stratejilerinin araştırılması için güçlü bir araç sunarak nörodejeneratif hastalık araştırmaları alanına önemli ölçüde katkıda bulunmayı amaçlamaktadır.

Son 10 yılda, çeşitli araştırma ekipleri, birkaç önemli benzerlik sergileyen metodolojileri kullanarak orta beyin organoidleri (MO'lar)8,21,25,26,27,28 geliştirdi. Parkinson hastalığının anlaşılmasını derinleştirme arayışımızda, insan iPSC'lerinden türetilen 3D insan MO'ları oluşturmak için bir protokol geliştirdik. Uzamsal olarak düzenlenmiş dopaminerjik nöronlarla zenginleştirilmiş bu organoidler, Parkinson hastalığını incelemek için ideal bir model sunar. Orta beyne özgü organoid protokolleri geliştirmemiz ve iyileştirmemiz, nörogelişimsel süreçleri ve nörodejeneratif hastalıkları anlamamıza önemli ölçüde katkıda bulunan gelişmiş in vitro modeller ortaya çıkarmıştır. Bu modeller, özellikle hastadan türetilen MO'lara uygulandığında, in vitro hastalık modellemesi için güçlü araçlar olarak etkinliklerini göstermiş ve gelişmiş 3D hücre kültürü alanında yeni bakış açıları ve metodolojiler sunmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan normal fibroblastları Detroit 551 ve insan embriyonik kök hücrelerinden (ESC'ler) üretilen iPSC'ler, daha önce tarif edildiği gibi hESC hattı 3604. iPSC'ler, Batı Norveç Etik Sağlık Araştırmaları Komitesi REK nr.'nin onayı ile elde edilmiştir. 2012/919. Tüm hücreler, MycoAlert Mikoplazma Tespit Kiti kullanılarak Mikoplazma kontaminasyonu açısından düzenli olarak izlendi. Malzeme Tablosu, bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar hakkında bilgi içerir. Tablo 1 , kullanılan ortamı ve diğer stokları açıklamaktadır.

1. iPSC'lerin çözülmesi

  1. Matris kaplı plaka ve temel 8 (E8) orta hazırlama
    1. Bazal membran matris şişesini gece boyunca buz üzerinde çözdürün. 1:100 oranında soğuk Advanced Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 DMEM/F12 (%1 nihai konsantrasyon) ile seyreltin (bkz . Malzeme Tablosu ve Tablo 1). Alikotları uzun süreli kullanım için -20 °C'de saklayın.
    2. Seyreltilmiş bazal membranı 4 °C'de çözdürün; 6 oyuklu bir plakayı oyuk başına 1 mL çözelti ile kaplayın. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    3. Plakayı inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına (RT) dengelenmesini bekleyin.
      NOT: Plakalar en fazla 2 hafta buzdolabında saklanabilir (kullanmadan önce RT'ye kadar ısındığından emin olun). Uzun süreli saklama için, jelin kurumasını önlemek için kaplanmış plakaya 1 mL E8 Medium (Malzeme Tablosu ve Tablo 1'e bakınız) ekleyin.
  2. E8 orta hazırlık
    1. Steril bir ortamda, E8 bazal ortamını E8 takviyesi ile birleştirin (bakınız Malzeme Tablosu ve Tablo 1).
      NOT: Bu, 2 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Tam ortamı hazırlamadan önce donmuş E8 takviyesini gece boyunca 4 ° C'de çözdürün. 37 °C'de çözdürmeyin, aksi takdirde stabilitesi bozulabilir. Kullanmadan önce, yalnızca gerekli hacimdeki E8 Medium'u oda sıcaklığına (RT) dokunulamayacak kadar soğuk olana kadar ısıtın.

2. iPSC'lerin tohumlanması

  1. Matris kaplı plakaları ve E8 Medium'u RT'de veya 37 °C'de inkübatörde önceden ısıtın.
  2. Aspirat kültürü besiyeri; %60-70 birleşim noktasında olan iPSC'leri Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu ile kalsiyum ve magnezyum içermez (DPBS Ca2 + / Mg2 + içermez, 6 oyuklu bir plakada oyuk başına 4 mL).
  3. Etilendiamintetraasetik asit ekleyin (EDTA, 0.5 mM, kuyucuk başına 1 mL, Malzeme Tablosu ve Tablo 1'e bakınız); Koloni kenarları ayrılana kadar (3-5 dakika) 37 °C'de inkübe edin.
  4. Ayrışma çözeltisini aspire edin; kolonileri ayırmak için, önceden ısıtılmış E8 Ortamını (oyuk başına 4 mL), pipetten normalden daha güçlü bir kuvvetle doğrudan kolonilerin üzerine dikkatlice pipetleyin, bu da hücre yüzeyi üzerinde lokalize bir sıvı hareketi oluşturur.
  5. Hücreleri, matris kaplı 6 oyuklu bir plakanın iki yeni oyuğuna aktararak 1:2 oranında bölün ve kuyucuk başına 2 mL ortam ekleyin. Daha sonra 37 °C'de inkübe edin.
  6. Koloniler% 80 birleşmeye ulaşana kadar medyayı günlük olarak değiştirin.
  7. 10x büyütmede bir mikroskop kullanarak, tipik olarak 0,5 ila 1 mm arasında değişen bir çapa sahip belirgin, yuvarlak bir şekil ile karakterize edilen uygun bir boyutta olduklarından emin olmak için kolonileri gözlemleyin. Kolonilerin, tanımlanmış, pürüzsüz sınırlara sahip yoğun, kompakt yapılar olduğunu onaylayın.

3. Nöral indüksiyon

  1. Orta hazırlık ve Gün 0 kurulumu
    1. Malzeme Tablosu ve Tablo 1'e atıfta bulunarak Kimyasal Olarak Tanımlanmış Ortam (CDM), Nöral İndüksiyon Ortamı (NIM) ve Nöral Kök Hücre Serumsuz (NSC SF) ortamın her birini 500 mL hazırlayın.
    2. Hücreleri 6 oyuklu bir plakada kuyucuk başına 4 mL DPBS (1x) (Ca2 + / Mg2 + - içermez) ile durulayın, ardından Gün 0 kurulumu için oyuk başına 3 mL NIM ilavesi yapın.
    3. 1, 3 ve 5. günlerde NIM'i (kuyu başına 3 mL) değiştirin; Her gün mikroskop altında gözlemleyin.
    4. 6. Günde, aşağıdaki adımları kullanarak nöral rozetleri bir süspansiyon kültürüne ayırın.
      1. DPBS (1x) (Ca2 + / Mg2 + içermez) (6 oyuklu bir plakada oyuk başına 4 mL) ile bir kez nazikçe yıkayın. Kollajenaz IV (6 oyuklu bir plakada oyuk başına 1 mL) ekleyin ve 1 dakika inkübe edin. Kollajenaz IV'ü çıkarın ve DPBS (1x) (Ca2 + / Mg2 + içermeyen) (6 oyuklu bir plakada oyuk başına 4 mL) ile bir kez nazikçe durulayın.
      2. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 2 mL NSC SF Medium ekleyin. Kuyu diplerini kazıyarak hücreleri ayırın ve 200 μL pipet ucu ile ızgaralar oluşturun.
      3. Hücre süspansiyonunu 6 oyuklu plakadan 10 cm'lik yapışmayan bir kaba aktarın. NSC SF Medium ile ses seviyesini 12 mL'ye ayarlayın.
      4. Yapışmayan kabı, topaklanmayıönlemek için % 5 CO 2 ile 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatörde 0° açıyla 85 rpm'de çalkalayıcı (ssm1 kompakt orbital çalkalayıcı) üzerine yerleştirin.

4. Orta beynin örüntülenmesi

  1. 7. Günde, 100 ng / mL FGF-8b ile 12 mL CDM ekleyin; Orbital Shaker inkübatörüne yerleştirin.
  2. 8-13. Günlerde, ortamı 2 günde bir değiştirin; Her gün mikroskop altında gözlemleyin.
  3. 14. Günde, 100 ng / mL FGF-8b ve 1 μM purmorfamin (PM) ile 12 mL CDM ekleyin; orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
  4. 15-20. Günlerde, ortamı her 2 günde bir değiştirin; Her gün mikroskop altında gözlemleyin.

5. Matrigel gömme ve MO sonlandırma ve olgunlaşma

  1. Matrigel'i 2-2 saat süreyle 2 °C ile 8 °C arasındaki bir sıcaklıkta buz üzerinde çözdürün.
    NOT: Her embriyoid cisimciği (EB) için 15 μL sağlamak için yeterli miktarda Matrigel çözün. Erken polimerizasyonu önlemek için Matrigel'i buz üzerinde soğuk tutun. Matrigel ile temas edecek tüm plastik malzemeleri kullanmadan önce -20 °C'de en az 30 dakika soğutun.
  2. Boş bir tabağa steril bir organoid gömme tabakası yerleştirin.
  3. Geniş delikli 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, organoidi tabaktan nazikçe çıkarın ve oyuk başına bir organoid ile gömme yüzeyine aktarın. Gömme yüzeyinde 12-16 EB toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın.
  4. Fazla ortamı her EB'den dikkatlice çıkarın ve ardından her EB'nin üzerine damla damla 15 μL soğuk Matrigel ekleyin. Bir pipet yardımıyla, EB'yi Matrigel damlacığının merkezine yeniden konumlandırın.
  5. Matrigel'in polimerize olmasına izin vermek için plakayı 37 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatörde 15-20 dakika inkübe edin.
  6. Steril forseps kullanarak, gömme tabakasını Matrigel damlacıkları ile kaldırın. Levhayı, 6 oyuklu ultra düşük yapışkan bir plakada doğrudan bir kuyunun üzerinde tutun. 10 ng/mL Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör (BDNF) ve 10 ng/mL Glial hücre hattı Türetilmiş Nörotrofik Faktör (GDNF) ile 3 mL CDM'yi pipetleyin ve Matrigel damlacıklarını tabakadan her bir oyuğa nazikçe durulayın. Tüm 6-8 Matrigel damlacıkları tek bir kuyucuğa aktarılana kadar bu işlemi tekrarlayın.
  7. Plakaları 85 rpm'de 37 °C'lik bir inkübatörde bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve CDM'yi her 3 günde bir 10 ng/mL BDNF ve 10 ng/mL GDNF ile değiştirin.
    NOT: Farklılaşan kültürleri 3 aya kadar koruyun; Nöral morfoloji, sonlandırmadan 2 hafta sonra ortaya çıkar. BDNF ve GDNF, 3 aydan fazla kültür için gerekli değildir.

6. İmmünofloresan boyama

  1. Organoidi ortamdan nazikçe almak için 1.000 μL'lik bir pipet kullanın ve minimum ortamlı bir mikroskop lamına nazikçe yerleştirin.
  2. RT'de tamamen kurumasına izin verin. 30 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA) (numune başına 300 μL) ekleyin.
    NOT: PFA tehlikelidir ve kanserojen özelliklere sahip olabilir. Dikkatli kullanın, cilt ve gözlerle doğrudan temasından kaçının ve kimyasal davlumbaz içinde kullanıldığından emin olun.
  3. Slaytlara %30 sükroz çözeltisi (numune başına 300 μL) ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe etmelerine izin verin.
  4. RT'de 2 saat boyunca (veya gece boyunca 4 ° C'de) PBS (Ca2 + / Mg2 + ile),% 0.3 Triton X-100 ve% 10 normal keçi serumu içeren bloke edici tampon (BB) (numune başına 300 μL) ekleyerek organoidleri bloke edin ve nüfuz edin. Organoidleri tanımlamak ve tamponu slayt üzerinde sınırlamak için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.
  5. Numuneleri, bloke edici tamponda uygun hacimde birincil antikor ile örtün (numune başına 300 μL), çatal başlı kutu proteini G1 (FOXG1, 1:200), anti-ortodontikül homeobox 2 (OTX2, 1:100), anti-Çatal Kutu A2 (FOXA2, 1:100), anti-Tirozin Hidroksilaz (TH, 1:100), anti-SRY (cinsiyet belirleyici bölge Y)-kutu 2 (SOX2, 1:100), anti-eşleştirilmiş kutu proteini (PAX6, 1:100) ve anti-mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2 1:500), ve gece boyunca karanlıkta 4 °C'de inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  6. Numuneleri hafifçe sallanan bir platformda iki ila üç tampon değişikliği ile 3 saat boyunca 1x PBS'de yıkayın.
  7. İkincil antikor (numune başına 300 μL), anti-Alexa Fluor 488 (1:800), anti-Alexa Fluor 594 (1:800) ve anti-Alexa Fluor 647 (1:800) ile gece boyunca 4 °C'de nemlendirilmiş bir karanlık odada inkübe edin. Hoechst 33342 (1:5,000) nükleer lekesini aynı anda ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
  8. Antikoru çıkarın, PBS ile hızlı bir şekilde durulayın ve ardından kontaminasyonu önlemek için 4 ° C'de 1-2 gün boyunca% 0.01 sodyum azid içeren PBS ekleyin.
  9. PBS'yi aspire edin, fazla çözeltiyi çıkarın ve organoidleri bir montaj ortamı kullanarak monte edin ( Malzeme Tablosuna bakın). Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için bir lamel yerleştirin ve montaj ortamının tamamen polimerize olmasını sağlamak için RT'de karanlık bir odada en az 12 saat saklayın.
    NOT: Örnek artık bir floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenmeye hazırdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, iPSC'lerden MO'ların türetilmesi için öncü bir protokol sunuyoruz. Metodolojimizin merkezinde, FGF-8b ve sonik kirpi (SHH) yolu agonisti purmorfamin (PM) ile sinerjik olarak birleştirilen çift SMAD inhibisyonunun yenilikçi kullanımı yer almaktadır. Bu yaklaşım Şekil 1'de gösterilmiştir. Farklılaşma süreci, iPSC'leri nöroektoderm soyuna doğru yönlendirerek başlar ve nöroepitelyal veya nöral rozet kolonileri oluşturur. Bu, SB2431542'yi anahtar bir bileşik olarak kullanan çift SMA...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırmada, MO'nun iPSC'lerden ayırt edilmesi için bir metodoloji geliştirdik. Protokolümüz, FGF-8b ve SHH agonisti PM dahil olmak üzere morfojenik faktörlerle geliştirilmiş bir çift SMAD inhibisyon stratejisi kullanır. Bu yaklaşım, orta beyin ontogenezisi için çok önemli olan gelişimsel ipuçlarını yakından simüle eder. Oluşturduğumuz farklılaşma yolu, doğal beyin gelişimi sırasında gözlemlenen nöral rozetleri anımsatan nöroepitelyal yapıların oluşumunu teşvik eder. İki boyutlu kültü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1 , BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Finansman için Bergen Üniversitesi Meltzers Høyskolefonds'a (proje no: 103517133), Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson ve Gerdt Meyer Nyquists legat'a (proje no: 103816102) teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CCD Mikroskop Kamera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Almanya
Kimyasal Olarak Tanımlanmış Lipid KonsantresiThermo Fisher Scientific11905031CDM bileşeni
Kollajenaz  IVThermo Fisher Scientific17104019İnsan iPSC'lerinin nazikçe ayrışması için reaktif
Corning  işlenmemiş kültür yemekleriSigma-AldrichCLS430589Süspansiyon kültürü 
DMEM / F-12, GlutaMAX takviyesiThermo Fisher Scientific10565018Astrosit farklılaşması bazal Orta
DPBSThermo Fisher Scientific14190250 Çeşitli hücre kültürü yıkamaları için kullanılır
EDTAThermo Fisher Scientific15575020İnsan iPSC'lerinin nazikçe ayrışması için reaktif
Temel 8 Bazal OrtaThermo Fisher ScientificA1516901iPSC kültürü için bazal ortam
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101iPSC kültürü için takviye edici gıda
FCCPAbcamab120081Mitokondriyal membran potansiyelini ve TMRE boyamayı ortadan kaldırır
FGF-basicPeproTech100-18BAstrosit farklılaşma ortamı bileşeni
Sıvı aspirasyon sistemi BVC kontrolüVacuubrand, Almanya
Formaldehit (PFA) %16Thermo Fisher Scientific28908Hücre fiksasyonu 
GDNFPeprotech450-10DA nöronları orta bileşen
Geltrex (Bazal membran matrisi)Thermo Fisher ScientificA1413302İnsan iPSC'lerinin takılması ve bakımı için kullanılır
GlutaMAX TakviyesiNSC kültürü içinThermo Fisher Scientific35050061
Heracell 150i CO2 İnkübatörleriFisher Scientific, ABD
IMDMThermo Fisher Scientific21980032CDM InSolution için bazal ortam
AMPK İnhibitörüSigma-Aldrich171261Nöral indüksiyon ortamı bileşeni
İnsülinRoche1376497
Detroit 551 fibroblatlarından türetilen CDM bileşeni iPSC'ler ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STED konfokal mikroskopLeica Microsystems, Almanya
MatrigelYaşam Bilimleri354230Matrigel gömme
MonotiyogliserolSigma-AldrichM6145CDM bileşeni
Normal keçi serumuThermo Fisher ScientificPCN5000Tampon Orbital'i bloke etmek için kullanılır
çalkalayıcılar - SSM1Stuart Ekipmanları, İngiltere
Organoid Gömme LevhasıSTEMCELL Teknolojileri8579Matrigel gömme
Organoid Gömme LevhasıSTEMCELL Teknolojileri 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Çeşitli yıkamalar için kullanılır
Poli-D-lizin hidrobromürSigma-AldrichP7405nöral hücrelerin bağlanmasını ve büyümesini destekler
Sigma-AldrichP4957İn vitro olarak nöral hücrelerin bağlanmasını ve büyümesini destekler
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Konfokal görüntü için lamel montajı
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204DA nöron farklılaşmasını teşvik eder
Rekombinant İnsan/Fare FGF-8b Proteini Ar-Ge D Systems423-F8-025 / CFDA nöron farklılaşmasını teşvik eder 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNöral İndüksiyon Orta bileşen
TRITON X-100VWR International9002-93-1İmmün boyama deneylerinde hücre geçirgenliği için kullanılır
SSM1 kompakt orbital çalkalayıcı Norrscope51901-10 SSM1 Çalkalayıcı, orbital, organoid kültürü için mini 230VDöndürücü.
Su Banyosu Jb Akademisi Temel Jba5 JBA5 Hibe AletleriHibe Aletleri, ABD
güçlü > immün boyama için kullanılan antikorlar< / güçlü >
< güçlü > birincil antikor< / güçlü >
anti-DATAbcamab128848, RRID: AB_2665470Tavşan; 1:100 
anti-FOXA2ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110Tavşan; 1:100 
anti-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604Tavşan; 1:200
anti-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684Tavşan; 1:100 
anti-MAP2Abcamab5392, RRID: AB_2138153Tavuk; 1:500
anti-OTX2ProteinTech13497-1-AP, RRID: AB_2157176Tavşan; 1:100 
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Tavşan; 1:100 
İkincil antikorSeyreltme (μ L)
  Alexa Flor  594 keçi anti-tavşan IgGThermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  488 keçi anti-tavşan IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  488 keçi anti-tavşan IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  488 keçi anti-tavşan IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  594 keçi anti-tavşan IgG Thermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  594 keçi anti-tavşan IgG Thermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  647 keçi anti-tavuk IgG Thermo Fisher BilimselA-21469  1:400
Takviyesi İn vitro poli-L-ornitin çözeltisi <

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Markram, H. Seven challenges for neuroscience. Funct Neurol. 28 (3), 145-151 (2013).
  2. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Exp Neurol. 33 (7), 113-536 (2021).
  3. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Front Cell Dev Biol. 9, 304-737 (2021).
  4. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Mol Med. 12 (10), 121-146 (2020).
  5. Xu, P., et al. Human midbrain dopaminergic neuronal differentiation markers predict cell therapy outcomes in a Parkinson's disease model. J Clin Invest. 132 (14), 156-768 (2022).
  6. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4 (141), 141-190 (2012).
  7. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8 (3), 267-280 (2011).
  8. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 73-102 (2021).
  9. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  10. Qian, X., Song, H., Ming, G. L. Brain organoids: advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074(2019).
  11. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  12. Shariati, L., Esmaeili, Y., Haghjooy Javanmard, S., Bidram, E., Amini, A. Organoid technology: Current standing and future perspectives. Stem Cells. 39 (12), 1625-1649 (2021).
  13. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  14. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37 (10), 1139-1148 (2015).
  15. Sun, A. X., Ng, H. H., Tan, E. K. Translational potential of human brain organoids. Ann Clin Transl Neurol. 5 (2), 226-235 (2018).
  16. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
  17. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  18. Asgrimsdottir, E. S., Arenas, E. Midbrain dopaminergic neuron development at the single cell level: In vivo and in stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 463(2020).
  19. Zagare, A., et al. Midbrain organoids mimic early embryonic neurodevelopment and recapitulate LRRK2-p.Gly2019Ser-associated gene expression. Am J Hum Genet. 109 (2), 311-327 (2022).
  20. Mohamed, N. V., et al. Midbrain organoids with an SNCA gene triplication model key features of synucleinopathy. Brain Commun. 3 (4), fcab223(2021).
  21. Jo, J., et al. Midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  22. Kwak, T. H., et al. Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson's disease modeling. Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).
  23. Karmirian, K., et al. Modeling Alzheimer's disease using human brain organoids. Methods Mol Biol. 2561, 135-158 (2023).
  24. Smits, L. M., et al. Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinsons Dis. 5, 5(2019).
  25. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  26. Smits, L. M., et al. Single-cell transcriptomics reveals multiple neuronal cell types in human midbrain-specific organoids. Cell Tissue Res. 382 (3), 463-476 (2020).
  27. Sozzi, E., Nilsson, F., Kajtez, J., Parmar, M., Fiorenzano, A. Generation of human ventral midbrain organoids derived from pluripotent stem cells. Curr Protoc. 2 (9), 555(2022).
  28. Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells Dev. 23 (13), 1535-1547 (2014).
  29. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  30. Mercurio, S., Serra, L., Pagin, M., Nicolis, S. K. Deconstructing Sox2 function in brain development and disease. Cells. 11 (10), 1604(2022).
  31. Hettige, N. C., Ernst, C. FOXG1 dose in brain development. Front Pediatr. 7, 482(2019).
  32. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Mol Cell Neurosci. 45 (3), 258-266 (2010).
  33. Millet, S., Bloch-Gallego, E., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. The caudal limit of Otx2 gene expression as a marker of the midbrain/hindbrain boundary: a study using in situ hybridisation and chick/quail homotopic grafts. Development. 122 (12), 3785-3797 (1996).
  34. Surmeier, D. J. Determinants of dopaminergic neuron loss in Parkinson's disease. FEBS J. 285 (19), 3657-3668 (2018).
  35. Chen, A., Yangzom, T., Sullivan, G. J., Liang, K. X. Mitochondrial dysfunction and neuronal anomalies in POLG mutant midbrain organoids. bioRxiv. , (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ift SMAD nhibisyonuSonic Hedgehog YolaDopaminerjik N ronlarFibroblast B y me Fakt rN roepitelyal H cre TipleriHastal k ModellemeBeyin Geli imiParkinson Hastal
Video yakında

İlgili makaleler