Yöntem makalesi

Hücre dışı vezikül izolasyonu için başarılı bir sıralama ayarlama

DOI:

10.3791/67232

⸱

11 Ekim 2024

 ,  ,  ,  , 
1FRACTAL - Flow cytometry Resource, Advanced Cytometry Technical Applications Laboratory, IRCCS Ospedale San Raffaele, 2Laboratorio di Biotecnologie Applicate all'Ortopedia, IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, 3Università Vita-Salute San Raffaele

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, mezenkimal stromal hücreler tarafından salınan hücre dışı veziküllerin (EV'ler) sıralanmasının ayrıntılı bir tanımını sağlar. Özellikle, cihaz ayarına ve sıralama koşullarının optimizasyonuna odaklanır. Amaç, özelliklerini koruyarak hücre dışı vezikülleri sıralamaktır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler) tarafından salınan hücre dışı veziküller (EV'ler), rejeneratif ve antienflamatuar rollere sahip bir dizi mikroRNA içerir. Bu nedenle, saflaştırılmış MSC-EV'ler, çok çeşitli hastalıklar için yeni nesil bir terapötik seçenek olarak öngörülmektedir. Bu protokolde, genellikle ortopedik rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılan adipoz türevli MSC'lerin (ASC'ler) süpernatantından EV'leri başarılı bir şekilde ayırma stratejisini rapor ediyoruz.

İlk olarak, floresan tespiti için karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) ile EV izolasyonu ve etiketleme adımlarına odaklanarak numune hazırlamayı tanımladık; Akabinde protokolün ana kısmını oluşturan tasnif sürecini detaylı bir şekilde gerçekleştirdik.

MISEV 2023 ve MIFlowCyt EV kılavuzlarında tanımlanan kurallara ek olarak, nozul boyutu, frekansı ve kılıf basıncı ile ilgili özel deneysel koşullar uyguladık. Morfolojik parametreler, EV boyutunun teorik aralığını kapsayacak şekilde seçilen çap boncukları kullanılarak oluşturulur. ASC-EV'lerin tasnifinden sonra, tasnif edilen fraksiyonun sorter ile yeniden analiz edilerek ve nanopartikül izleme analiz tekniği ile EV boyut dağılımını doğrulayarak saflık kontrolü gerçekleştirdik.

EV'lerin artan önemi nedeniyle, incelemek ve karakterize etmek için saf bir nüfusa sahip olmak çok önemli hale geliyor. Burada, bu hedefe ulaşmak için sıralamayı ayarlamak için bir kazanan stratejisi gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre Dışı Veziküller (EV'ler), hemen hemen tüm hücreler tarafından salınan, bir lipid çift tabakası ile sınırlandırılmış, kendi başlarına çoğalamayan heterojen bir zar yapılı vezikül grubudur1. Kan plazması, serum, tükürük, anne sütü, idrar, bronş lavaj sıvısı, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı ve malign asit gibi çeşitli biyosıvılarda bulunabilirler2. EV'lerin ana işlevlerinden biri, nükleik asitler, proteinler, lipitler ve karbonhidratlar dahil olmak üzere çeşitli molekülleri bir verici ve bir alıcı hücre arasında taşımaktır. Bu, doğrudan membran füzyonu, reseptör-ligand etkileşimi, endositoz ve fagositoz gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla ortaya çıkabilir 3,4. Bu nedenle, birçok fizyolojik ve patolojik süreçte önemli bir rol oynadıkları gösterilmiştir ve hastalığın yeni biyobelirteçleri, ilaç dağıtım araçları ve terapötik ajanlar olarak önemli umut vaat etmektedirler 5,6.

Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler), yağ dokusu, diş pulpası, göbek kordonu kanı, plasenta, amniyotik sıvı, Wharton jölesi ve hatta beyin, akciğer, timus, pankreas, dalak, karaciğer ve böbrek dahil olmak üzere birçok dokudan izole edilebilen multipotent hücrelerdir. Son yıllarda rejeneratif tıbba büyük ilgi görmüşlerdir7. Adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücreler (ASC'ler), kemik iliği gibi diğer kaynaklara kıyasla daha az invaziv bir prosedürle yağ dokusundan toplanabilir, bu da ciddi komplikasyon risklerini azaltır ve etik sorunlardan kaçınır8.

Ek olarak, yağ dokusu, kemik iliğinden (%1'e karşı %>0.01) ve dermis, diş pulpası, göbek kordonu ve plasenta gibi diğer kaynaklardan önemli ölçüde daha yüksek konsantrasyonda MSC içerir. MSC'ler, farklılaşma yetenekleri ve geniş bir büyüme faktörleri, kemokinler ve sitokinler repertuarını salgılamaları nedeniyle yaralı doku ve hücrelerin yenilenmesinde çok önemlidir; Bu terapötik faydalar, farklılaşma yeteneklerine ve aynı zamanda geniş bir büyüme faktörleri, kemokinler ve sitokinler repertuarı salgılamalarına bağlanabilir. Çarpıcı bir örnek, MSC'lerin ortopedik durumlar için terapötik potansiyeli ile verilmektedir ve "Kas-İskelet Sistemi Hastalıkları" terimi, clinicaltrials.gov kapsamında daha fazla sayıda kayıtlı klinik çalışmaya sahiptir (erişim tarihi: 13Mayıs 2024).

Ayrıca, MSC'ler, hasarlı hücrelere veya dokuya bilgi aktararak doku rejenerasyonunda rol alan ve ana hücrelere benzer biyolojik aktivite gösteren EV'leri de salgılayabilir 9,10. Bu nedenle, MSC-EV'ler, ortopedik durumlar için MSC-EV'leri içeren iki klinik çalışma (NCT05261360 ve NCT04998058) ile hücresiz bir yaklaşım11 elde etmek için hücre tedavisinin değerli bir ikamesi olabilir. Bununla birlikte, EV'lerin klinik uygulamaları için hala çeşitli zorluklar mevcuttur. Örneğin, EV izolasyon teknikleriyle ilgili bazı endişeler vardır: bunların çoğu vezikül saflığını veya bütünlüğünü garanti etmez. Ayrıca, bazı izolasyon teknikleri karmaşık, zaman alıcı ve düşük tekrarlanabilirliğe sahiptir, bu da onları klinik kullanım için uygun hale getirmez12.

Hücre sıralama ise spesifik floresan markörler13 kullanarak tek hücrelerin heterojen hücre süspansiyonlarından izolasyonuna izin veren yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Birçok uygulama için kullanılabilir ve farklı numune türlerine uyarlanabilir. Bununla birlikte, hücre sıralama iyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan bir teknoloji olmasına rağmen, EV sıralama hala çok zordur çünkü çoğu EV, en hassas akış sitometreleri için bile minimum algılama eşiğinin altındadır. Bir sıralayıcıyı bu amaç için daha uygun hale getiren bazı özellikler vardır. Her şeyden önce, parçacıkları askıya alan akışın bir akış hücresi içinde değil, havadaki lazerler tarafından sorgulandığı bir Jet-in-air sistemi kullanarak; Bu sistem, maruz kaldığı stresi azaltarak numuneyi korur. İkinci önemli nokta, akış ile toplama merceği arasında, cihazın arka plan optik gürültüsünü azaltan bir "karartma" çubuğunun varlığıdır. Düşük olmasına rağmen, arka plan gürültüsü tamamen ortadan kaldırılmaz ve eşiğin altına düşen olaylara kısmi bir pencere sağlayan bir referans oluşturur: cihazın14 "algılama sınırına" yakın olan olayların analizi için çok önemlidir. Son olarak, sıralayıcı, numunedeki küçük ve büyük parçacıklar arasında daha iyi ayrım yapılmasına izin veren iki farklı maskeye sahip çift bir İleri Saçılma (FSC) özelliğine sahiptir.

Buna dayanarak, yüksek hassasiyetli bir hücre sıralayıcı kullanarak karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) etiketli MSC-EV'leri ayırmayı amaçlayan bir protokol geliştirdik. EV'lerin manipülasyonunu en aza indirmek ve bütünlüklerini ve miktarlarını korumak için, numune hazırlama sırasında ultrasantrifüj adımlarından kaçındık. Ayrıca, ayırma koşulları, meme boyutuyla ilişkili ayırma basıncını azaltarak (35 psi'lik bir basınç için 70 μm meme) cihazımızın daha fazla optimizasyonu da dahil olmak üzere, veziküller üzerindeki stresi en aza indirecek şekilde ayarlandı.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Buradaki protokol dört bölümden oluşmaktadır: (1) Numune hazırlama, (2) ASC-EV'lerin karakterizasyonu, (3) ASC-EV'lerin sınıflandırılması ve (4) Sıralama sonrası analiz. İş akışını temsil eden bir şema Şekil 1'de gösterilmiştir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Protokol Akış şeması. Akış şeması, protokolde yer alan adımları gösterir. (1) numune hazırlama, (2) tasnif öncesi veziküllerin karakterizasyonu, (3) tasnif ve (4) tasnif sonrası veziküllerin analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Numune hazırlama

  1. Hücre dışı veziküller (EV) ile zenginleştirilmiş süpernatan koleksiyonu
    1. EV'lerin toplanmasından önce (genellikle 1'den 5'e kadar olan geçiş) pasajı kültürleyen adipoz-MSC'leri (ASC'ler) çözün veya toplayın ve her ASC başına tohum, aynı miktarda hücreyi izole edin (ör., 175cm2 başına 1 milyon hücre şişe yüzeyi yaklaşık% 60 -% 70 birleşme ile sonuçlanır).
    2. ASC'leri, istenen protokole göre EV içermeyen fetal sığır serumu (FBS) veya insan trombosit lizatı (hPL) ile desteklenmiş uygun kültür ortamında (bu protokol için DMEM-F12) 48-72 saat büyütün.
      1. EV içermeyen FBS veya hPL elde etmek için, gece boyunca 4 ° C'de 120.000 x g'da ultrasantrifüj yapın ve süpernatanı kullanın.
        NOT: Bu noktadan itibaren, belirtilen merkezkaç kuvveti, kullanılan alet, rotor ve borular için her zaman ortalama anlamına gelir. Farklı rotorların veya tüplerin rpm başına değişken g-kuvvetine ve k faktörüne sahip olabileceğini unutmayın. Rotorları karşılaştırmanın ve g-kuvveti ile hızı ayarlamanın kolay bir yolu için, https://www.beckman.it/centrifuges/rotors/calculator mevcut dönüştürme tablolarından birine bakın.
    3. % 90 hücre birleşmesinde, ASC'leri ayırın ve sayın ve uygun bir hacimde serum içermeyen ortamda, ideal olarak 1 x 106 ASC başına 1 mL'de askıya alın. Tohum ASC'leri, kuyucuk başına 1 mL olan 24 oyuklu plakalarda süspansiyon halindedir. Serum olmadan, hücreler süspansiyon halinde kalacak ve bir küre oluşturacaktır. 96 saat sonra, süpernatanı toplayın.
    4. 4 ° C'de seri santrifüjleme ile yüzen hücreleri ve kalıntıları çıkarın: 10 dakika boyunca 400 x g , 10 dakika boyunca 1.000 x g , 10 dakika boyunca 2.000 x g ve 10 dakika boyunca iki kez 4.000 x g .
    5. 220 nm'den daha büyük kalan parçacıkları çıkarmak için süpernatanı 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.
      NOT: Aşağı akış uygulamaları için hemen kullanın veya 4 °C'de en fazla bir gece saklayın veya 80 saat içinde başka adımlar atılmazsa -24 °C'de dondurun.
  2. Sıralama için EV'ler boyama
    1. 5 mM'lik bir 5(6)-Karboksifloresein diasetat N-süksinimidil ester (CFSE) çözeltisi hazırlayın. Taze hazırlanmış olarak kullanın veya -20 °C'de ışıktan koruyarak dondurun.
    2. Doğrudan adım 1.1.1-1.1.5'ten (24 saat içinde) ilerleyin veya -80 °C'de depolanmış EV içeren süpernatanları 4 °C'de çözün.
    3. Boyamadan önce, süpernatanları 37 °C'de ısıtın ve 10 μM'lik (500 kat seyreltme) son konsantrasyon için CFSE ekleyin. Karanlıkta 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    4. İnkübasyon sırasında, bir santrifüj yoğunlaştırıcıya (rejenere selüloz membran, MWCO 100 kDa), kapağa 2 mL PBS ekleyin ve sallanan bir kova rotorunda 10 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyin. Filtrelenmemiş PBS'yi filtre cihazının altından çıkarın ve süzüntüyü toplama tüpünden aspire edin.
      NOT: Ana hatlarıyla belirtilen santrifüjlü ultrafiltrasyon protokolü, numunenin 15 mL'ye kadar (maksimum hacim) işlenmesine dayanmaktadır.
    5. Santrifüj yoğunlaştırıcıya 15 mL'ye kadar numune ekleyin ve cihazı kapatın. 4.000 x g'da 30 dakikaya kadar santrifüjleyin.
      NOT: Bu, ortalama olarak 500 μL'lik bir nihai numune verecektir. Bununla birlikte, numunenin doğası ve akış hızı gibi faktörlere bağlı olarak, istenen konsantrasyonu elde etmek için gereken santrifüjleme süresi değişebilir.
    6. Cihazı santrifüjden çıkarın ve toplama tüpünü boşaltın. Filtre cihazına 14 mL PBS ekleyin. 4.000 x g'da 30 dakikaya kadar santrifüjleyin.
    7. Adım 1.2.6'yı tekrarlayın.
    8. Konsantre CFSE lekeli EV numunesini filtre cihazından yaklaşık 500 μL'lik bir şekilde geri kazanın ve kalan numunenin sınıflandırılmasına devam ederken karanlıkta 4 °C'de 100 μL saklayın.

2. ASC-EV'lerin karakterizasyonu

  1. EV belirteçlerinin Western blot analizi
    1. Pelet ASC'leri (1 x 10,6) RT'de 376 x g'da 5 dakika süreyle askıya alın ve proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş uygun lizis tamponunda askıya alın. Tercih edilen tahlil ile protein miktar tayini gerçekleştirin.
      NOT: Bu çalışmada deneyimlendiği gibi, en iyi miktar tayini sonuçları Biskinkoninik asit tahlil tekniği ile elde edilmiştir.
    2. Bradford tekniği ile 1 x 106 ASC'ye eşdeğer ASC konsantre süpernatanı veya 1 saat boyunca 4 ° C'de 100.000 x g'de 1 x10 6 ASC'ye karşılık gelen pelet EV'leri ölçün ve proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş uygun lizis tamponunda askıya alın. Tercih edilen tahlil ile protein miktar tayini gerçekleştirin.
      NOT: Bu çalışmada deneyimlendiği gibi, EV peletleri için en iyi miktar tayini sonuçları Biskinkoninik asit tahlil tekniği ile elde edilmiştir.
    3. Saflaştırılmış EV'ler yerine konsantre süpernatan kullanılıyorsa, numuneleri %5 2-Merkaptoetanol ve 2x Laemmli tamponunda parçalayın.
      NOT: Bu çalışmada deneyimlendiği gibi, hem konsantre süpernatan hem de saflaştırılmış EV'ler, pozitif ve negatif EV belirteçleri için karşılaştırılabilir sonuçlar verir.
    4. Numuneleri (1-10 μg) 'luk bir poliakrilamid jel içinde 110 V'ta 90 dakika boyunca yükleyin ve ayırın.
    5. 120 dakika boyunca 250 mA'da bir nitroselüloz membrana aktarın.
    6. Numuneleri görselleştirmek ve merdiven transferini sağlamak için Ponceau S ile membranı lekeleyin. PBS'li Ponceau S'yi hafifçe sallayarak çıkarın.
    7. PBS'de %5 yağsız kurutulmuş süt ve %0.1 Tween ile membranları 60 dakika boyunca bloke edin.
    8. Gece boyunca 4 ° C'de pozitif (örneğin, bu çalışmada CD9, CD81, TSG101 ve Flotillin) ve negatif (örneğin, bu çalışmada Calnexin) EV belirteçleri dahil olmak üzere çalışma seyreltmelerinde uygun antikorlara sahip prob membranları.
    9. PBS'de% 0.1 Tween ile yıkayın ve tercih edilen ECL sistemi ile bant ortaya çıkmadan önce RT'de 45 dakika boyunca uygun peroksidaz konjuge ikincil antikorlarla inkübe edin. Mevcut bir görüntüleme sistemi ile görüntüler elde edin (Şekil 2A).
  2. EV belirteçlerinin akış sitometrisi analizi: yüzey boyama
    1. Kullanmadan önce, yanlış pozitif sinyallere neden olabilecek agregaları ortadan kaldırmak için her bir monoklonal antikoru (mAb) 15.000-17.000 x g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin. Ayrıca, mAb'leri, tüm karışım filtreden geçene ve filtrenin yüzeyinde hiçbir antikor sıvısı kalmayana kadar 4 ° C'de 1.000 x g'de ayrı 0,22 μm santrifüj filtre tüplerine filtreleyin. mAb'leri 4 °C'de saklayın.
    2. 0,22 μm filtreli PBS'de CFSE lekeli EV'lerin 1:10 oranında seyreltilmesini hazırlayın (bkz. adım 1.2.1-1.2.8).
    3. Daha önce titre edilmiş EV'ye özgü mAbs (anti-CD9/63/81) veya MSC'ye özgü mAbs (anti-CD44) ile veya bunlar olmadan 100 μL numune veya 0,22 μm filtrelenmiş PBS'yi inkübe edin. Karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübasyon yapın.
      NOT: Tipik EV'leri ve MSC soy belirteçlerini tespit etmek için geliştirilen bu protokol, diğer tüm hücre soylarını veya EV'lerin alt tipine özgü yüzey belirteçlerini kapsayacak şekilde genişletilebilir. EV'lerin CFSE boyaması ile örtüşmeyi önlemek için floresein izotiyosiyanat (FITC) kanalına düşen florokromları kullanmayın. Bir florokrom, örneğin allofikosiyanin (APC) ile konjuge edilmiş her mAb'yi kullanarak tek bir boyama gerçekleştirin. Çok renkli boyama mümkündür, ancak potansiyel antikor sterik engelleme sorunlarını ele almak için kontroller dahil edilmelidir. Tek tek antikorları tek başına veya bir karışım içinde test etmek ve sinyalin karşılaştırılabilir olduğundan emin olmak gerekir. Ek olarak, FMO'ların kontroller arasına dahil edilmesi gerekir.
    4. Dağılım kalibrasyonunu adım 3.2'de açıklandığı gibi ayarlayın.
    5. FITC günlük ölçeğine karşı yan saçılma (SSC) günlük ölçeğinin bir nokta grafiğini oluşturun ve 0,22 μm filtrelenmiş PBS veya boyanmamış EV'lerden oluşan bir tüp çalıştırın; FITC kanalındaki eşiği ayarlayın ve arka plan gürültüsünün çoğunu hariç tutan en yüksek değerlere ayarlayın. CFSE pozitif olaylarını tanımlayan bir bölge çizin.
    6. CFSE pozitif olaylar bölgesinde kapılı bir APC histogram grafiği oluşturun ve 0,22 μm filtreli PBS veya boyanmamış EV'lerden oluşan bir tüp çalıştırın.
      NOT: APC kazancı için, cihaz performanslarını optimize etmek için belirli bir kazanç gerçekleştirmeniz tavsiye edilse de, cihaz QC ile belirlenen kazancı kullanın.
    7. Lekeli numunelere 200 μL 0.22 μm filtrelenmiş PBS ekleyin ve elde edin. Çekim ve kayıt için düşük bir akış hızı (dakikada 10 μL) kullanın. Mümkünse, FITC pozitif kapısında en az 5.000 olay kaydedin.
    8. mAbs'nin olası aspesifik sinyallerini tespit etmek için mAb lekeli PBS kontrolünü kullanın. Çalışmalar arasında tutarlılığı sağlamak için tüm numune tüplerini aynı akış hızında okuyun.
    9. Numune çapraz kontaminasyonunu önlemek için, analiz edilen her tüp arasında 10 saniye boyunca bir deterjan çalıştırın, ardından deiyonize (DI) su ile 10 saniye boyunca çalıştırın (Şekil 2B).
      NOT: Herhangi bir akışkan cihaz kararsızlığını önlemek için, s'yi alınamp10 sn ve ardından kayda başlayın.
  3. EV markörünün akış sitometrisi analizi: Hücre içi boyama
    NOT: Hücre içi boyama için, fiksasyon ve geçirgenlik reaktifleri içeren özel bir kit kullanın. Anti-Caveolin mAb, Alexa 488 ile konjuge edilmiştir. IC boyaması CFSE yokluğunda gerçekleştirilmiştir.
    1. Kullanmadan önce, mAb'yi daha önce açıklandığı gibi santrifüjleyin (adım 2.2.1).
    2. Hücre içi boyama için üreticinin talimatlarına uyun (Şekil 2C).
  4. Nanopartikül izleme analizi (NTA) ile EV konsantrasyonunun ve boyutunun karakterizasyonu
    1. NTA cihaz ekranının görüntüleme çerçevesinde 20-120 olay elde etmek için numunelerin uygun seyreltmelerini yapın.
    2. Numuneleri 1 mL'lik bir insülin şırıngası kullanarak NTA cihazı numune odasına enjekte edin.
    3. Kayıt için NTA yazılımını aşağıdaki gibi ayarlayın: Her biri 60 sn olan 5 standart ölçüm ve 30'a ayarlanmış bir akış pompası.
    4. Işık yoğunluğunu, parçacıkları arka plandan net bir şekilde ayırt etmeye izin veren uygun bir değere ayarlayın ve yakalama komut dosyasını NTA yazılımında çalıştırın.
      NOT: Kamera seviyesi ayarı partikül algılamayı etkileyebilir. Değer çok yüksekse, parçacık sinyallerinin çoğunu kaplayan sütlü bir arka plan ve güçlü parçacık ışığı saçılımı ortaya çıkar. Değer çok düşükse, daha koyu bir arka plan elde edilmesine rağmen, daha az parlak olayların çoğunun gözden kaçması mümkündür. Optimum ayar için her numune izlenmelidir.
    5. Çerçeve başına parçacıklar 20'den düşük veya 80'den fazlaysa seyreltme faktörünü ayarlayın.
    6. Süpernatantın ortalama modal boyutunu ve parçacık konsantrasyonunu analiz etmek için eşiği 4'e ayarlayın. İlk seyreltme faktörlerini hesaba katın.
    7. Çapraz kontaminasyonu önlemek için alet odasını her numuneden sonra deiyonize su ile temizleyin.
    8. NTA analiz yazılımını açın ve seyreltme faktörünü dikkate alarak elde edilen numuneler üzerinde analiz yapın (Şekil 2D).
  5. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile EV morfolojisinin karakterizasyonu
    1. ASC konsantre süpernatanı toplayın veya EV'leri ultrasantrifüjleme (1 saat boyunca 4 ° C'de 100.000 x g ) ve ardından aynı hacimde PBS'de pelet süspansiyonu ile izole edin.
    2. 5 μL konsantre süpernatan veya EV'lerin karbon kaplı ızgaralarda 10 dakika boyunca emilmesine izin verin. Fazla sıvı damlasını filtre kağıdı ile kurulayın.
    3. Aynı hacimde numune damlası (5 μL) kullanarak sulu süspansiyon içinde 10 dakika boyunca% 2 uranil asetat ile negatif boyama yapın. Izgaraya filtre kağıdı ile dokunarak fazla uranil asetatı çıkarın.
    4. Izgarayı oda sıcaklığında (RT) kurutun ve 120 kV'da bir transmisyon elektron mikroskobu ile inceleyin (Şekil 2E).

figure-protocol-2
Şekil 2: ASC-EV karakterizasyonu. (A) EV'lerin pozitif (CD9, CD81, TSG101 ve Flotillin) ve negatif (Calnexin) belirteçlerinin temsili Western blot'u. Karşılık gelen moleküler ağırlıklar rapor edilmiştir ve ASC lizatları kontrol olarak kullanılmıştır. (B) EV belirteçlerinin akış sitometrisi analizi. Aşağıdaki belirteçlerin ekspresyonu analiz edildi: CD9, CD63, CD81 ve CD44. Belirteç ekspresyonu için sadece CFSE pozitif ASC-EV'ler analiz edildi. Histogramlar, boyanmamış (kırmızı histogramlar) ve lekeli (mavi histogramlar) ASC-EV'leri temsil eder. (C) EV markörü Caveolin'in akış sitometrisi hücre içi analizi. Histogramlar, lekelenmemiş (gri histogram) ve lekeli (mavi histogramlar) ASC-EV'leri temsil eder. (d) ASC-EV'lerin NTA tarafından karakterizasyonu. Histogramlar, numunenin konsantrasyonunu (partiküller/mL)/boyutunu (nm) temsil eder. (E) ASC-EV'lerin TEM ile görselleştirilmesi. Ölçek çubukları = 100 nm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. ASC-EV'lerin sınıflandırılması

  1. Hücre sıralayıcı kurulumu
    NOT: Hücre sıralayıcı, heterojen bir başlangıç numunesinden saf bir popülasyonun izolasyonunu sağlayan bir akış sitometresidir. Hücre sıralayıcı, bir olay içeren damlalar oluşturmak için akışı yüksek frekansta bir piezoelektrik ile salarak hedef parçacıkları ayırır. Hücreler veya veziküller gibi ilgilenilen parçacıkları içeren damlalar, metal saptırma plakaları aracılığıyla yüklenir ve saptırılır. Sıralanan fraksiyon, aşağı akış analizi yapmak için kullanılır.
    1. Basınç hattını açın ve vakumlayın.
      NOT: Bazı sıralayıcılar otomatik başlatmaya sahipken, diğerleri manuel başlatmaya sahiptir. Frekans, basınç ve nozul ucu seçimi gibi bazı teknik özelliklerin optimizasyonuna izin verdiği için manuel başlatmalı bir sıralayıcı tercih edilir. Özellikle 66.000 Hz frekans, 35 psi basınç ve 70 μm nozul ile çalışılması tavsiye edilir.
    2. Cihazı açın, biyogüvenlik kabinini açın ve ayırıcı yazılımını başlatın.
    3. Akışkanlara basınç uygulayın ve ardından akışkan sistemini açın.
    4. Nozuldaki piezoelektrik kristal olan ve damlacıklara sahip olacak şekilde titreşen Drop Drive'ı etkinleştirin.
    5. Sistemdeki kabarcıkların varlığını ortadan kaldırmak için Kabarcık Giderme prosedürünü uygulayın ve ardından 5 mL'lik bir temizleme solüsyonu tüpünü yüksek diferansiyel basınçta 5 dakika ve 5 mL'lik DI tüpünü 5 dakika boyunca çalıştırın.
    6. Manuel Başlatma prosedürünü gerçekleştirin.
      1. Lazer Kontrol Sekmesinde, lazer gücünü açmak için Lazer Gücü düğmesine basın.
        NOT: Tüm lazerler için bu prosedürü tekrarlayın: Mavi 488 nm, Sarı-Yeşil 561 nm, Mor 405 nm ve Kırmızı 640 nm.
      2. Akışın dikey hizalamasını inceleyin.
        NOT: İhtiyaç durumunda, dikey hizalamayı ayarlamak ve dikey akışı yukarı ve aşağı mikrometre ile doğrulamak için nozul montaj aşamasını, özellikle ön ve arka mikrometreyi, sol ve sağ mikrometreyi ve gimbal'ı hareket ettirin; En iyi hizalama için, akış her lazerde dikey olmalıdır. Belirli bir nozul ilk kez kullanılıyorsa, bir Lazer Gecikmesi yapılması gerekir. Dokunmatik ekran panelinde, Lazer ve Akış Kesişimi sekmesinde, doğru nozul boyutunu seçin, Lazer Gecikme düğmesine basın ve lazer gecikme prosedürünü gerçekleştirmek için lazer gecikme talimatlarını izleyin. Genel olarak, kılıf basıncını ve dolayısıyla nozul ucunu değiştirirken, hizalama bulunmadan önce Lazer Gecikme Belirleme işlemi gerçekleştirilir. Lazer Gecikme prosedürünün sonunda, arka plan sinyalini en aza indirmek için ekrandaki talimatlara göre Arka Plan Görüntüsü Çıkarma Prosedürünün gerçekleştirilmesi önerilir.
      3. Lazer Akışı Kesişim Noktası sekmesine, Yeşil Ok düğmesine basarak ve dokunmatik ekran monitöründeki talimatları izleyerek Lazer Noktası Belirleme işlemini gerçekleştirin.
    7. Intellisort'u başlatın. Bırakma sürücüsü frekansını ve akışın bir damlacık oluşturmasına neden olan varsayılan genlik değerini ayarlayın.
      1. Bu adım gerçekleştirildikten sonra, kaydedilmiş bir yapılandırmayı yükleyin. Kaydedilmiş bir ayar yapılandırmasını yüklemek için, sıralayıcı yazılımı araç çubuğunda Sıralama Ayarını Yükle'yi seçin. Farklı frekansları ve genlikleri kontrol ettikten sonra, en iyi düşme kararlılığını sağlayan en iyisini seçin. 66.000 Hz frekansında ve yaklaşık 40-45 V genlikte çalışın.
    8. İnce Lazer Hizalama prosedürünü gerçekleştirin.
      1. Örnekleyiciye 5 mL'lik bir tüp QC hizalama boncukları yükleyin ve çalıştırın; İnce Hizalama sekmesinde, iyi sıkıştırılmış ve harmanlanmış boncukları görselleştirmek için X ve Y ekseninde istenen parametreyi seçin. Veri Görüntüleme Alanında, öncelikle Y ekseni parametresi için 488 - 513/26-H'yi ve X ekseni parametresi için 488-FSC1-H'yi seçin. Ardından, tüm lazerlerde ince ayar yapmak için Y ekseni parametresi için 405-488/59-H'yi ve X ekseni parametresi için 640-795/70-H'yi seçin.
        NOT: Seçilen parametreler, sıralayıcının lazer konfigürasyonuna bağlıdır. Cihaz kılavuzu önerisi, iğne deliği şeridi üzerinde en büyük uzamsal ayrıma sahip lazerlerin seçimidir. Bunun için Mor lazer (405 nm) ve Kırmızı lazer (640 nm) kullanın.
      2. Manuel hizalama, sıralayıcı uzmanı tarafından kontrol edildikten sonra, Otomatik QC'yi gerçekleştirin. QC boncuklarının çapını seçin: 3 μm çap.
        NOT: Bu prosedürün sonunda, sonuç QC geçmedi veya QC geçti olabilir. QC'nin başarısız olması durumunda, hizalamayı manuel olarak optimize etmek gerekir.
      3. QC alımını yazılım Hizalama protokolüne kaydedin.
    9. Intellisort prosedürünü sonlandırma
      1. Saptırma plakalarını sıralayıcıda doğru konuma yerleştirin ve voltajı açın (saptırma plakalarında 3.000 V şarj önerilir).
      2. 6 Tüp Tutucu sıralama çıkışını seçin, Akış Göstergesinde bunları seçerek akışları etkinleştirin ve Test Akışını gerçekleştirin.
        NOT: Akışlar net bir şekilde ayrılmamış ve tanımlanmamışsa, açıkça tanımlanmış ve salınım yapmayan bir akış elde etmek için şarj fazını, fanı gidermeyi ayarlayın veya diğer parametreleri değiştirin.
      3. Intellisort Otomatik Bırakma Gecikmesi Belirleme düğmesini etkinleştirin. Bu adım, doğru düşme gecikmesinin ayarlanmasını sağlar. Bu adımdan sonra akışları yeniden doğrulayın.
      4. Intellisort Bakım Modu'nu etkinleştirin. Düşme Gecikmesini manuel olarak doğrulayın.
      5. Manuel Drop Delay protokolünü sıralayıcı yazılımına yükleyin. Floresan kontrol boncukları edinin.
      6. Doğru kaydırma tutucusunu takın. Sıralayıcı yazılımında, Bırakma Gecikmesi Sihirbazı'nı > Sırala'yı seçin. Sıralama Mantığı'nı seçin.









figure-protocol-3

figure-protocol-4

figure-protocol-5




figure-protocol-6

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FSC polistiren tanecikleri, cihaz kurulumunu ve sıralama koşullarını doğrulamak için sıralanmıştır. FSC polistiren boncuklar, 100 nm, 300 nm, 500 nm ve 900 nm arasında değişen floresan boncukların bir karışımıdır ve FITC kanalında görülebilir. Şekil 7A , sıralamadan önce dört boncuk popülasyonu ile FITC günlük ölçeği nokta grafiğine karşı SSC günlük ölçeğini göstermektedir. 100 nm, 300 nm ve 500 nm'lik floresan popülasyonları kapılı ve sıralanmıştır. Sıralanan boncuklar, ilk kavram kanıtı olarak saflık ve zenginleştirme açısından analiz edildi (Şekil 7B). Sıralamadan sonra tüm popülasyonlar saftı. Referans arka plan gürültüsü, sıralamadan önce ve sonra nokta grafiklerinde her zaman görünür.

MISEV2018/2023'te listelenen gereksinimleri karşılamak ve veziküllerin doğasını ve saflık derecelerini göstermek için, EV'lerde bulunan veya bulunmayan belirteçleri analiz etmek için deneyler yapılmıştır. EV'ler bazı spesifik yüzey belirteçleri15 için pozitiftir: CD9, CD63, CD81 ve CD44. CD9, CD63 ve CD81, tetraspanin membran proteinleri ailesine aittir ve eksozomları tanımlamak için en yaygın belirteçlerdir16. CD44, MSC'ler ve ASC'ler17 tarafından yüksek oranda ifade edilen bir belirteçtir.

EV'ler, Hücre içi akış sitometrisi deneyinde gösterildiği gibi sitozolik protein Caveolin için de pozitiftir. Ek olarak, western blot, CD9, CD81, TSG101, Flotillin için pozitifliği ve Calnexin için negatifliği doğrulamaktadır (Şekil 2).

Daha sonra, CFSE etiketli ASC-EV'ler protokolde bildirildiği gibi sıralandı. Bu sıralama prosedürü, numune hazırlama, boyama ve ayırma için tam olarak aynı koşullar korunarak dört kez tekrarlandı (Tablo 1). Bu şekilde protokolün tekrarlanabilirliği ortaya konmuştur.

CFSE tarafından sıralanan ASC-EV popülasyonunu analiz etmek ve özelliklerinin sıralama ile değişmediğini göstermek için bir dizi deney yapılmıştır. Özellikle, CD9, CD63, CD81 ve CD44'ün ifadesi sıralamadan sonra değişmez (Şekil 6A).

Diğer bir kritik nokta, EV'lerin boyutları ve basıncın neden olduğu stres nedeniyle sıralama işleminden sonra nasıl değişebilecekleri ile ilgilidir. Az miktarda numune olması nedeniyle sıralama sonrası analizin gerçekleştirilmesi zordu, ancak nanopartikül izleme analizi, iki ASC-EV numunesinin dağılımının (sıralama öncesi ve sonrası) aynı olduğunu göstermektedir (Şekil 6B). Son olarak, EV'lerin TEM aracılığıyla analizi, sınıflandırmanın ardından morfolojilerinin önemli ölçüde değişmediğini göstermektedir (Şekil 6C).

MIFlowCyt-EV çerçeve yönergeleri18 tarafından önerildiği gibi, %0.1 Triton X-100 numune tedavisi üzerine CFSE pozitif EV'lerin miktarında bir azalma gözlenmiştir, böylece veziküler kökenlerini desteklemiştir (Şekil 8).

figure-results-1
Şekil 7: FSC polistiren boncuk sıralaması. (A) Sıralamadan önce boncukların SSC/FITC nokta grafiği. Sıralama sonrası yeniden analiz edilen boncukların SSC/FITC nokta grafiği: (B) 100 nm sıralanmış boncuklar, (C) 300 nm sıralanmış boncuklar ve (D) 500 nm sıralanmış boncuklar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 8: Triton X-100 varlığında EV membran bozulması. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca numuneye% 0.1 konsantrasyonda Triton X-100 ilave edilmiştir. İşlenmemiş (solda) ve işlenmiş (sağda) numunelerin üç bağımsız deneyinden elde edilen temsili dağılım grafikleri rapor edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

DeneySıralanan EV sayısıCFSE+ sıralanmış EV sayısıBasınç (psi)Nozul mmFrekans (Hz)
174 x 1064,8 × 106357066000
244 x 1067 x 106357066000
338 x 1063 x 106357066000
416 x 1062 x 106357066000

Tablo 1: Sıralama prosedürünün tekrarlanabilirliği

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV'leri analiz etmek ve sıralamak, küçük boyutları ve çoğu akış sitometresinin algılama sınırına yakın olmaları nedeniyle zordur. Amacımız, CFSE ile etiketlenmiş AMSC'lerden türetilen EV'leri izole etmek için bir protokol geliştirmekti. CFSE, antikorlar tarafından verilen protein agregatları gibi istenmeyen partiküllerin oluşumu olmadan, bildirilen yüksek EV etiketleme verimliliği (%≥90) nedeniyle boyama yöntemi olarak seçilmiştir. Bununla birlikte, esteraz içermeyen birkaç EV'nin gözden kaçırılması mümkündür ve bu parçacıkları sıralama protokolleri19 için etiketleyebilen boyama yöntemlerini belirlemek için gelecekteki çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır.

Saf EV'lerin fiziksel özelliklerini değiştirmeden toplanmasına izin veren ayırma koşulları oluşturmayı amaçladık. Bu, kullanılan ayıklayıcının teknik yeteneklerinden yararlanılarak ve nozul boyutuna göre standart ayırma basıncının düşürülmesi gibi özel önlemler uygulanarak başarıldı. FSC polistiren boncuklar kullanarak bu sıralama koşullarını oluşturduk ve doğruladık. Daha sonra, bu protokolü ASC EV'lere uyguladık, deneyi dört kez tekrarladık ve tutarlı bir şekilde benzer sonuçlar elde ettik, böylece protokolümüzün tekrarlanabilirliğini doğruladık.

Bununla birlikte, burada ana hatlarıyla belirttiğimiz bazı kritik yönlere ve sınırlamalara dikkat etmek önemlidir. (i) Tasnif edilen numunenin saflığı: Cihazın arka plan gürültüsü her zaman yeniden analiz sırasında ortaya çıktığından, tasnif edilen CFSE pozitif EV'lerin saflığını kesin olarak kanıtlamak zordur. Bununla birlikte, CFSE pozitif popülasyonu zenginleştirdiğimizi varsayabiliriz. CFSE negatif popülasyonda CFSE pozitif olayların olmaması, sıralama işlemimizin başarılı olduğunu gösterir ve dolaylı olarak sınıflandırılan numunenin saflığını gösterir. (ii) Tasnif edilen numunenin potansiyel kontaminasyonu: Tasnif edilen fraksiyonun, cihaz tarafından tespit edilemeyen ve yanlışlıkla tasnif damlalarına dahil edilebilecek küçük veziküller içerme olasılığını göz ardı edemeyiz. (iii) Sıralama sonrası EV'lerin bütünlüğü: Cihaz tarafından uygulanan basıncın veziküllere potansiyel olarak zarar verebileceğinin farkındayız. Bunu azaltmak için standart 60 psi yerine 35 psi'lik daha düşük bir basınca sahip 70 μm'lik bir nozul kullandık. Ek olarak, EV'lerin fiziksel özelliklerini değiştirebilecek ultrasantrifüj adımlarından kaçınarak numuneleri dikkatli bir şekilde hazırladık. Bu önlemlere rağmen, sınıflandırılan EV'lerin bozulmadan ve değiştirilmeden kalacağını garanti edemeyiz. Bu nedenle, EV'lerin durumunu değerlendirmek için sıralama sonrası analiz ve mümkün olduğunda işlevsellik testlerinin dahil edilmesini öneririz.

Protokolde bazı olası değişiklikler ve sorun giderme aşağıda verilmiştir. Bu protokol, basınçların değiştirilmesine izin veren bir cihaz kullanılarak ayarlanmıştır; bununla birlikte, daha katı ayarlara sahip cihazlar için, EV'lerin bütünlüğünü mümkün olduğunca korumak için daha düşük bir basınca sahip olmak için 100 μm'lik bir nozul kullanılması önerilir.

Bu hususlara rağmen, protokolümüzün EV ayırma için diğer yöntemlere kıyasla önemli avantajlar sunduğunu iddia ediyoruz. İlk olarak, belirli EV popülasyonlarının izolasyonuna izin verir. Vezikülleri, sağlam hücre zarlarına sahip yapıları tanımlayan bir floresan boya olan CFSE ile boyamayı seçmiş olsak da, monoklonal antikorlar kullanarak spesifik EV popülasyonlarını sıralamak da mümkündür. Bu gibi durumlarda, ek boyama kontrolleri gereklidir. Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği (ISEV), Uluslararası Sitometri İlerleme Derneği (ISAC) ve Uluslararası Tromboz ve Hemostaz Derneği (ISTH), tekrarlanabilir akış sitometrisi deneyleri yürütmek için kapsamlı kılavuzlar sağlar. Ayrıntılı talimatlar MISEV 20231 ve MIFlowCyt -EV yönergelerinde18 bulunabilir. İkincisi, bu prosedür, birden fazla ultrasantrifüj adımı içeren diğer yöntemlerden daha az zaman alıcıdır.

Bize göre, bu protokol, terapötik amaçlar için potansiyel olarak yararlı olabilecek belirli bir EV popülasyonunu ayırmak ve toplamak için başarılı bir strateji olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik destek için Emanuele Canonico'ya teşekkür ederiz. Bu çalışmanın bir kısmı, IRCCS Ospedale San Raffaele ve Università Vita-Salute San Raffaele tarafından kurulan gelişmiş bir mikroskopi laboratuvarı olan ALEMBIC'de gerçekleştirildi. Enrico Ragni ve Laura de Girolamo'nun çalışmaları İtalya Sağlık Bakanlığı "Ricerca Corrente" tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5(6)-Karboksifloresein diasetat   N-süksinimidil esterMerck150347-59-4
Adipoz Mezenkimal Stromal HücrelerWepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Gré guare, FransaBu çalışmada kullanılan hücreler
Alexa 488 anti-CaveolinR& D SystemsIC5736GAkış sitometrisi antikoru
APC anti-insan CD44BioLegend338805Akış sitometrisi antikoru
APC anti-insan CD63BioLegend353007Akış sitometrisi antikoru
APC anti-insan CD81 (TAPA-1)BioLegend349509Akış sitometrisi antikoru
APC anti-insan CD9BioLegend312107Akış sitometrisi antikor
BC CytoFLEX SBeckman CoulterBC CytoFLEX S, 3 lazerle donatılmış, Mavi, Kırmızı ve Mor
Flow-Check Pro FluorospheresBeckman CoulterA63493MoFLO için floresan kontrol boncukları Astrios EQ
FlowJo yazılımı (sürüm 10.8.1)BDsürüm 10.8.1Analiz yazılımı
IntraSure kitiBD Biosciences641776Hücre içi boyama için fiksasyon ve geçirgenlik
Megamix-Plus FSCBioCytex7802FSC polistiren boncuklar 
MoFLO Astrios EQBeckman CoulterMoFLO Astrios EQ 4 lazer, Mavi, Sarı - Yeşil, Mor ve Kırmızı
Mouse anti-FLOT1 antikoruile donatılmıştır BD Transdüksiyon Laboratuvarları610820Western Blot antikoru
NanoSight NS300MalvernNS300
Tavşan anti-Calnexin antikoruOrigeneTA336279Western Blot antikoru
Tavşan anti-CD9 ve CD81 antikoru (ExoAb antikor kiti)Sistem BiyobilimleriEXOAB-KIT-1Western Blot antikorları
Tavşan anti-TSG101 antikoru MerckHPA006161Western Blot antikoru
Triton X-100Merck9036-19-5
Ultra Gökkuşağı Floresan ParçacıklarıSpherotechURFP-30-2
Ultracel 100 kDa MWCOMerckUFC910024
VER01 - Dağılım kalibrasyonu için Verity ShellsExometryOrgano silika boncuklar

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  2. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: Toward clinical application. J Clin Invest. 126 (4), 1152-1162 (2016).
  3. Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).
  4. Witwer, K. W., Wolfram, J. Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery. Nat Rev Mater. 6 (2), 103-106 (2021).
  5. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).
  6. Du, S., et al. Extracellular vesicles: A rising star for therapeutics and drug delivery. J Nanobiotechnology. 21 (1), 231(2023).
  7. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).
  8. Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, 461718(2012).
  9. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  10. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Mol Ther. 23 (5), 812-823 (2015).
  11. Galipeau, J., Sensébé, L. Mesenchymal stromal cells: Clinical challenges and therapeutic opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
  12. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  13. Ohnuma, K., Yomo, T., Asashima, M., Kaneko, K. Sorting of cells of the same size, shape, and cell cycle stage for a single cell level assay without staining. BMC Cell Biol. 7, 25(2006).
  14. Morales-Kastresana, A., et al. High-fidelity detection and sorting of nanoscale vesicles in viral disease and cancer. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1597603(2019).
  15. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 734(2020).
  16. Andreu, Z., Yanez-Mo, M. Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function. Front Immunol. 5, 442(2014).
  17. Mildmay-White, A., Khan, W. Cell surface markers on adipose-derived stem cells: A systematic review. Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 484-492 (2017).
  18. Welsh, J. A., Tang, V. A., Van Der Pol, E., Gorgens, A. MIFlowCyt-EV: The next chapter in the reporting and reliability of single extracellular vesicle flow cytometry experiments. Cytometry A. 99 (4), 365-368 (2021).
  19. Maia, J., et al. Employing flow cytometry to extracellular vesicles sample microvolume analysis and quality control. Front Cell Dev Biol. 8, 593750(2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mesenchymal Stromal CellsEV SortingFlow CytometryAdipose Derived MSCsNanoparticle TrackingTransmission Electron MicroscopyCFSE LabelingGating StrategyEV Purity Check

İlgili makaleler