Yöntem makalesi

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/67234

⸱

20 Eylül 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, kollajenaz tip I ile sindirim ve ultrasantrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullanarak fare dalağından türetilmiş eksozomları izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksozomlar (Exo), hayvanlar, bitkiler ve prokaryotlar da dahil olmak üzere çeşitli hücreler tarafından salgılanan lipid-çift katmanlı yapılardır. Önceki çalışmalar, humoral veya hücre süpernatanından türetilen Exo'nun yeni tanısal veya prognostik biyobelirteçler için umut verici hedefler olduğunu ve hastalık patogenezindeki önemli rollerinin altını çizdiğini ortaya koymuştur. Doku kaynaklı Exo (Ti-Exo), doku özgüllüğünü ve mikro çevreyi doğru bir şekilde yansıtma yeteneği nedeniyle artan ilgi görmüştür. İnterstisyel uzayda bulunan Ti-Exo, hücreler arası iletişimde ve organlar arası sinyalleşmede çok önemli roller oynar. Hastalık mekanizmalarının aydınlatılmasında bilinen değerlerine rağmen, doku matrislerinin karmaşıklığı ve ekstraksiyon yöntemlerindeki değişkenlik nedeniyle Ti-Exo'nun izole edilmesi zor olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada, farelerin dalak dokusundan eksozomları izole etmek için pratik bir protokol geliştirdik ve daha sonraki tanımlama analizi ve fonksiyonel çalışmalar için tekrarlanabilir bir teknik sağladık. Dalak kaynaklı Exo'yu izole etmek için diferansiyel ultrasantrifüjleme ile birlikte Tip I kollajenaz sindirimi kullandık. İzole edilmiş Exo'nun özellikleri elektron mikroskobu, nano akış sitometresi ve western blot ile belirlendi. İzole edilmiş dalak türevli Exo, 30 nm ila 150 nm arasında değişen partikül boyutları ile lipid çift katmanlı veziküllerin tipik morfolojisini sergiledi. Ek olarak, eksozom belirteçlerinin ekspresyon profili, eksozomların varlığını ve saflığını doğruladı. Birlikte ele alındığında, farelerde dalak kaynaklı Exo'yu izole etmek için pratik bir protokolü başarıyla oluşturduk.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksozomlar (Exo), proteinler, nükleik asitler ve lipitler dahil olmak üzere çok çeşitli biyomolekülleri kapsayan, boyutları 30 ila 150 nm arasında değişen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) bir alt grubudur1. Bu biyomoleküller ebeveyn hücrelerinden türetilir ve hücre dışı boşluğa salınır. Exo, hem prokaryotik hem de ökaryotik sistemlerde rol oynayarak hücreler ve çevrelerindeki mikro ortamlar arasında biyomoleküler bilgi alışverişini kolaylaştırır2. Eksozomların içerik, boyut, zar bileşenleri ve hücresel köken gibi özellikleri oldukça değişkendir ve kaynak hücre tipi, hücresel durum ve çevresel koşullardan etkilenir.

Eksozomlar genellikle kaynaklarına göre üç kategoriye ayrılır: hücre kültüründen türetilmiş, vücut sıvısından türetilmiş ve dokudan türetilmiş (Ti-Exo). Hücre kültüründen türetilmiş eksozomlar, erişilebilirlikleri ve tutarlı verimleri nedeniyle kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, kullanımları, biyolojik işlevlerini yanlış temsil edebilecek uzun süreli kültürden sonra hücre özelliklerindeki potansiyel değişikliklerle sınırlıdır 3,4,5. Ayrıca, çoğu hücre kültürü, kompleks in vivo hücreler arası etkileşimleri taklit etmeyen iki boyutlu ortamlarda tutulur ve bu da potansiyel olarak veri yorumlamasınıetkiler 6. Tersine, biyolojik sıvılardan izole edilen eksozomlar, hastalığın ilerlemesini gerçek zamanlı olarak izlemek için minimal invaziv bir seçenek sunar7. Bununla birlikte, bu numuneler genellikle çeşitli kökenlerden gelen eksozomların bir karışımını içerir ve bu da birincil kaynaklarının doğru bir şekilde tanımlanmasını zorlaştırır8. Bu zorluklar göz önüne alındığında, hücre dışı interstisyumda bulunan ve hücreler arası sinyalleşmenin anahtar aracıları olan Ti-Exo'ya artan bir ilgi vardır.

Dalak, bağışıklık fonksiyonunda ve iç homeostazın korunmasında çok önemli bir rol oynar. Ti-Exo'yu beyin, karaciğer ve tümörler gibi organlardan izole etmek için mevcut protokollere rağmen, dalak kaynaklı eksozomlar için pratik yöntemler sınırlı olarak rapor edilmiştir 9,10. Bu çalışma, önceki bir rapordan modifiye edilmiş farelerde dalak dokusundan eksozomları izole etmek için pratik bir protokol oluşturmayı amaçladı11. Kollajenaz sindirimini ve ardından hücre zarının bozulmasını en aza indiren ve dalak türevi Exo'nun yüksek saflığını ve verimini sağlayan ultrasantrifüjlemeyi içeren bir yöntemi detaylandırıyoruz. Bu yerleşik protokol kullanılarak izole edilen Exo'nun özellikleri, elektron mikroskobu (TEM), nano-akış sitometresi (Nano-FCM) ve western blot ile doğrulandı ve protokolün daha ileri deneysel araştırmalar için etkinliğini doğruladı.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örnekler, Guangdong Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından verilen etik onay ile farelerden elde edildi. Bu protokolde kullanılan malzeme, ekipman ve yazılımların ayrıntılı açıklamaları Malzeme Tablosunda verilmiştir. Ekstraksiyon öncesi preparatın detayları Şekil 1'de gösterilirken, Spleen-Exo ekstraksiyonu ve zenginleştirme işlemi Şekil 2'de açıklanmaktadır.

1. Hazırlık

  1. Yüksek hızlı ve ultra yüksek hızlı santrifüjleri 4 °C'ye önceden soğutun ve masaüstü çalkalayıcının sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
  2. Şekil 1A, B'de gösterildiği gibi hücre kültürü kapları (figure-protocol-1100 mm), 50 mL steril santrifüj tüpleri, buz ve steril hücre süzgeci (figure-protocol-270 μm) hazırlayın.
  3. Makas ve forsepsleri u alkol spreyi kullanarak sterilize edin, ardından yüksek sıcaklıkta sterilizasyon yapın. Bu araçlar Şekil 1C'de gösterilmiştir.
  4. Dalak dokusunu buz üzerinde 100 mm'lik steril figure-protocol-3bir Petri kabına yerleştirin ve yüzey kanını 1x buzlu steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Dalak dokularını steril gazlı bezle kurulayın ve kuruduktan sonra tartın.
    NOT: Doku donmuşsa, devam etmeden önce bir tabakta buz üzerinde 15 dakika çözdürün.
  5. Steril bir transfer pipeti kullanarak süzgecin içine 1 mL steril PBS bırakarak hücre süzgecini (figure-protocol-470 μm) nemlendirin.
  6. Sindirim tamponunu (% 0.1 tip I kollajenaz) bir girdap karıştırıcı ile 1x PBS kullanarak hazırlayın.
    NOT: Her 100 mg dalak dokusu için 10 mL sindirim tamponu kullanın. Bu çalışmada kollajenaz konsantrasyonu, ürün talimatlarına göre seçilmiştir. Diğer doku türleri için, araştırmacıların bu parametreleri doku yoğunluğuna ve bileşimine göre ayarlamaları gerekebilir. Her doku tipi için en uygun koşulları belirlemek için değişen konsantrasyonlarda ve sindirim sürelerinde ön deneyler yapılması önerilir.

2. Doku sindirimi

  1. Dokuyu buz üzerinde bir kültür kabında makasla düzgün küçük parçalar halinde kesin (Şekil 3A) ve steril bir transfer pipeti ile 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  2. Yukarıda belirtildiği gibi dalak dokusu ağırlığına göre tüpe sindirim tamponu ekleyin (Şekil 3B), ardından tüpü 37 °C'de yatay bir çalkalayıcı üzerinde 45°'lik bir açıyla çalkalayın. Sindirim ilerlemesini izleyin ve doku parçaları dağıldığında ve çoğu şeklini kaybettiğinde sindirimi durdurun. Sindirim süresi dokular arasında farklılık göstermelidir. Bu çalışmadaki deney koşullarında sindirim süresi yaklaşık 30 dakikadır.
  3. Fibröz ve daha büyük doku kalıntılarını gidermek için sindirilmiş karışımı oda sıcaklığında (RT) bir hücre süzgecine (Ф70 μm) aktarın.
    NOT: Sindirimden hemen sonra filtrelemeyi tamamlayın.
  4. Süzüntüyü 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüpünde toplayın.

3. Diferansiyel santrifüjleme ile eksozom izolasyonu

  1. Santrifüj filtratları 500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca süzülür. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra artık hücreler, hücre kalıntıları ve çekirdekler içeren bir pelet görülebilir.
  2. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleyin. Şekil 3D'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra apoptotik cisimler ve mikrozomlar içeren bir pelet görülebilir.
  3. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Pelet içeren mikro-parçacıklar ve plazma zarı, Şekil 3E'de gösterildiği gibi santrifüjlemeden sonra görülebilir.
  4. Elde edilen süpernatanı 4 ° C'de 2 saat boyunca 120.000 x g'da ultrasantrifüjleyin. Şekil 3F'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra tüpün dibinde bir pelet görülebilir.
  5. Süpernatanı atın, peleti PBS ile yıkayın ve eksozomları elde etmek için 4 ° C'de 2 saat boyunca 120.000 x g'da tekrar ultrasantrifüj edin. Şekil 3G'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra tüpün dibinde bir pelet görülebilir.
  6. İzole eksozomları steril PBS (dalak başına 200 μL) ile çözün ve izole edilen eksozomları -80 °C'de yeni bir 2 mL santrifüj tüpünde saklayın.

4. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile eksozom karakterizasyonu

NOT: Ekstrakte edilen Exo'nun vezikül özellikleri gösterip göstermediğini belirlemek için TEM kullanıldı. Elektron mikroskobu ile tanımlanan Exo numuneleri taze numuneler olmalı veya kısa bir süre için 4 °C'de kısa bir süre saklanmalıdır.

  1. Eksozomları (2-6 μg/μL) %2 elektron mikroskobu (EM) dereceli paraformaldehit ile RT'de 2 saat sabitleyin.
  2. Bakır bir ağ üzerine 10 μL eksozom solüsyonu yerleştirin, RT'de 10 dakika inkübe edin, steril damıtılmış su ile durulayın ve fazla sıvıyı emici kağıtla kurulayın.
  3. Bakır ağı 1 dakika boyunca %2 uranil asetat ile boyayın, fazla sıvıyı filtre kağıdı ile kurulayın ve 2 dakika akkor lamba altında kurutun.
  4. Hazırlanan numuneyi 80 kV'da bir transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemleyin.

5. Eksozomların boyut dağılımı ve partikül konsantrasyonu ölçümü

  1. Standart polistiren nanopartikülleri (250 nm) nano akış sitometresine yükleyin.
  2. Bir BCA protein test kiti kullanarak Exo numunelerinin protein konsantrasyonunu ölçün. BCA Protein Testi sonuçlarına göre Exo örneğini PBS ile seyreltin (eksozomları 1-10 ng/μL'ye seyreltin), ardından yan saçılma yoğunluğunu (SSI) ölçmek için Exo örneklerini nano akışa yükleyin.
  3. Standart polistiren nanopartiküllerdeki SSI'nin partikül konsantrasyonuna oranına göre Exo konsantrasyonunu hesaplayın.
    NOT: Boyut ölçümü için, gradyan boyutlarına (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) sahip standart silika nanopartiküllerin nano akış sitometresine yüklenmesiyle standart bir eğri oluşturulur. Exo numunesinin yüklenmesi bunu takip eder. Exo'nun boyut dağılımı standart kürlemeye göre hesaplandı.

6. Eksozom proteinlerinin lizis ve immünoblot doğrulaması

  1. Protein analizi için eksozom peletine 100 μL radyo immünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu ekleyin.
  2. Kuvvetlice girdap yapın, parafilm ile örtün, RT'de 20 dakika sallayın, sonra tekrar girdap yapın.
  3. Numuneyi toplamak için 30-60 saniye boyunca 1000 x g'da kısa bir süre santrifüjleyin, yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve analize kadar -20 °C ila -80 °C arasında saklayın.
  4. İmmünoblot için, 1x konsantrasyon elde etmek için numuneleri 5x yükleme tamponu ile karıştırın ve jel elektroforezi için hazırlanın.
  5. Tüm doku homojenat kontrolleri isteniyorsa, yukarıda detaylandırıldığı gibi dokuyu parçalamak için bir proteaz inhibitörü ile güçlü bir lizis tamponu kullanın. Ardından, numuneleri 10,000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve kalan hücre dışı matrisi, tüm hücreleri veya sağlam hücresel kalıntıları atın.
  6. Eksozom veya doku homojenatı içeren numune tamponunu 95 °C'de 5-10 dakika kaynatın. 'luk bir SDS-PAGE jele şerit başına eşit protein yükleyin. Kontrol olarak eşit doku homojenat proteini yükleyin.
  7. Konvansiyonel elektroforez tamponunu kullanarak yaklaşık 2 saat boyunca 80 V'luk bir voltaj altında jel elektroforezine devam edin. Saflaştırılmış lizatlardaki Exo protein ekspresyonunu doğrulamak için western blot analizi yapın ve fraksiyonlardaki nispi Exo bolluğunu karşılaştırın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dalak kaynaklı eksozomların izolasyonu ve saflaştırılması
Eksozomları fare dalak dokusundan izole etmek için, kollajenaz sindirimi ve diferansiyel ultrasantrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullandık (Şekil 2). İlk adımlar, yüzey kanını çıkarmak için dalak dokusunun ön işlemden geçirilmesini ve ardından Tip I kollajenaz ile sindirimi içeriyordu. Bu enzimatik işlem, hücre dışı matris bileşenlerinin parçalanmasını kolaylaştırdı, böylece bütünlüklerini korurken eksozomları serbest bıraktı. Sindirim sonrası, hücresel kalıntıları, apoptotik cisimleri ve daha büyük vezikülleri sırayla çıkarmak için bir dizi santrifüjleme aşaması kullanıldı ve eksozomları peletlemek için süpernatantın 120.000 x g'da ultrasantrifüjlenmesiyle sonuçlandı. Sonraki izolasyon prosedürleri, Şekil 3G'de gösterildiği gibi, dalak türevi Exo ile zenginleştirilmiş PBS'de çözünür peletler verdi.

TEM sonuçları
İzole edilen eksozomların morfolojisi, eksozomların karakterizasyonunu incelemek için altın standart bir yöntem olan transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak incelendi. TEM, eksozomların varlığını doğrulamak, eksozomların kalitesini değerlendirmek ve eksozomların morfolojisini gözlemlemek için yaygın olarak kullanılır. TEM görüntüleri (Şekil 4A), eksozomların karakteristiği olan fincan şeklindeki veziküllerin varlığını ortaya çıkardı. Bu veziküller, eksozomların dalak dokusundan başarılı bir şekilde izole edildiğini doğrulayan berrak bir lipid çift katmanlı yapı sergiledi.

Dalak-Exo'nun boyut dağılımı
Eksozomların boyut, dağılım ve konsantrasyonu bir nano akış sitometresi kullanılarak belirlendi. Sonuçlar (Şekil 4B), izole edilen eksozomların çapının 30-150 nm arasında değiştiğini ve tepe konsantrasyonunun yaklaşık 60 nm olduğunu göstermiştir. İzole edilmiş parçacıkların çapı baskın olarak 50-80 nm arasındaydı ve ortalama parçacık konsantrasyonu 4.6 x 109 parçacık / mL'dir. Bu boyut aralığı, eksozomların daha önce bildirilen özellikleriyle tutarlıdır ve izolasyon protokolünü daha da doğrular.

Batı lekesi analizi
Ekzozomal belirteçlerin varlığını doğrulamak için bir western blot analizi yaptık. Spleen-Exo örneklerinde ekzozomal belirteçler TSG101 ve CD9 tespit edilirken, negatif kontrol olarak kullanılan bir Golgi matris proteini olan GM130 tespit edilmedi (Şekil 4C). Karşılaştırıldığında, bu belirteçlerin proteini fare dalak dokularında (Dalak-T) eksprese edildi. Bu, hücresel kirleticilerden yoksun oldukları için izole edilen eksozomların yüksek saflığını gösterir.

figure-results-1
Şekil 1: Tedarik hazırlığı. (A) 50 mL'lik santrifüj tüpleri, kültür kapları, buz ve cerrahi aletler bir biyogüvenlik kabinine yerleştirildi. (B) Steril bir hücre süzgeci (figure-results-270 μm). (C) Sterilize edilmiş cerrahi aletler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 2: Dalak-Exo izolasyon prosedürü. Dalak dokusunu hazırlayın ve buzlu PBS'de küçük parçalar halinde kesin, ardından Tip I kollajenaz ile sindirim ve belirtildiği gibi santrifüjleme yapın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 3: Dalak-Exo izolasyonunun temsili görüntüleri. (A) Sonraki sindirim için hazır küçük dalak blokları. (B) Sindirim tamponu ile dalak dokusu blokları. (C) 500 x g santrifüjlemeden sonra peletler. (D) 3.000 x g santrifüjlemeden sonra peletler. (E) 10.000 x g santrifüjlemeden sonra peletler. (F) 120.000 x g santrifüjlemeden sonra peletler. (G) 120.000 x g santrifüjlemeden sonra eksozom peletleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 4: Dalak-Exo'nun tanımlanması. (A) İzole edilmiş parçacıkları fincan şeklinde morfolojiye sahip yuvarlak veya oval zarlı veziküller olarak gösteren TEM sonuçları. Ölçek çubuğu = sırasıyla 200 nm ve 50 nm. (B) Flow Nano Analizörü ile yapılan boyut dağılımı analizi, Spleen-Exo'nun çapının baskın olarak 50 nm ila 80 nm arasında değiştiğini ve ortalama partikül konsantrasyonunun 4.6 × 109 partikül / mL olduğunu gösterdi. (C) GM130'un negatif ekspresyonu ile Dalak-Exo'da eksozoma özgü belirteç proteinlerinin (TSG101 ve CD9) ekspresyonunu gösteren Western blot analizi. Bu belirteçler, fare dalaklarından (Dalak-T grubu) ekstrakte edilen protein örneklerinde tespit edilebilirdi. Temsili western blot görüntüleri gösterildi (n = 6 doku). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son zamanlarda yapılan araştırmalar, dalak kaynaklı eksozomların (Spleen-Exo) mide kanserinin tedavisinde kritik bir rol oynadığını bildirmiştir12. Spleen-Exo'nun işlevlerini daha da aydınlatmak için, dalak dokusundan çıkarılması için tekrarlanabilir ve optimal bir yöntem oluşturmak gerekir. Beyin ve karaciğer kanserinden eksozomları izole etmek için protokoller mevcut olsada 13,14, diğer dokular için yöntemler az gelişmemiştir ve daha fazla doğrulama gerektirir. Bu çalışmada, Exo'yu dalak dokusundan izole etmek için pratik bir yöntem belirledik.

Geçtiğimiz yıllarda, bilimsel araştırma ve uygulamalarda Exo'yu çıkarmak için ultrasantrifüjleme, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, manyetik boncuk immünoadsorpsiyonu, ultrafiltrasyon ve polimer çökeltme15 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Ultrasantrifüjleme, Exo'yu çeşitli kaynaklardan çıkarmak için altın standart yöntem olmaya devam etmektedir. Önceki çalışmalar, hücre içi ve hücre dışı Exo16 kaynaklarından oluşan daha yüksek konsantrasyonlarda Exo elde etmek için doku yapılarını bozmaya odaklanmıştır. Kollajenaz, hücre zarının bütünlüğü üzerindeki etkiyi en aza indirerek Ti-Exo3'ün saflığını sağlar. Kollajenaz, insan metastatik melanomu, adipoz, kolon kanseri ve karaciğer kanseri dokularından hücre dışı vezikülleri çıkarmak için kullanılmıştır 5,10,13,17. Bununla birlikte, kollajenazın konsantrasyonu ve sindirim süresi farklı dokular arasında farklılık gösterir.

Sindirim için Tip I kollajenaz kullanarak Spleen-Exo'yu izole etmek için özel bir protokol oluşturduk, ardından yüksek kaliteli Spleen-Exo elde etmek için diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla filtrasyon yaptık. Ultrasantrifüjleme, numunelerden artık hücreleri, büyük vezikülleri, hücre kalıntılarını ve apoptotik cisimleri etkili bir şekilde çıkarabilir16. Crescitelli ve ark. çapı ortalama 75 nm olan küçük hücre dışı vezikülleri izole etmek için kollajenaz D ve gradyan ultrasantrifüjleme kullandı5. Protokolleriyle karşılaştırıldığında, protokolümüz eksozomların optimal saflığını elde etmek için tip I kollajenaz ve 120.000 x g'da ek bir ultrasantrifüj adımı kullandı. Doku süspansiyonu14,18 elde etmek için doku homojenizasyonunu kullanan önceki raporların aksine, yaklaşımımız dokulardaki hücrelerin zar bütünlüğünü korumaktadır. Ek olarak, Vella ve ark. işlem10 için ekstra zaman gerektiren üç parçacık grubu oluşturmak için yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (üçlü sükroz gradyanı) uyguladı. Bu yaklaşım, 200 nm'nin üzerinde bir boyuta sahip büyük veziküller, 50 nm ila 200 nm arasında değişen boyutlarda heterojen bir vezikül popülasyonu ve yaklaşık 20 nm boyutunda küçük veziküller üretti. Bu çalışma protokolünde açıklanan protokol, artık hücreleri, hücre kalıntılarını, apoptotik cisimleri ve daha büyük vezikülleri metodik olarak ortadan kaldırmak ve böylece elde edilen Exo'nun saflığını arttırmak için bir dizi ultrasantrifüjleme adımını içerir. Çökelmiş peletleri rahatsız etmemek için süpernatan toplama sırasında dikkatli kullanımı vurguluyoruz.

İzole edilmiş Spleen-Exo'nun morfolojisini ve saflığını TEM ve nanopartikül izleme analizi ile değerlendiriyoruz. Her iki test de, bu protokol ile izole edilen dalak türevli parçacıkların, eksozomların19 tipik özellikleri olan 30 nm ila 150 nm arasında değişen boyutlarda bir lipid çift tabakası ve fincan şeklinde veziküller sergilediğini ortaya koydu. CD9 ve TSG101, eksozom belirteçleridir19 ve bir Golgi proteini olan GM130, eksozom tanımlaması20 için negatif bir belirteç olarak kullanılır. Sonuçlar, Spleen-Exo'nun CD9 ve TSG101 için pozitif olduğunu, GM130'un ise tespit edilmediğini gösterdi ve bu da dalaklardan yüksek kaliteli, doku kaynaklı Exo'nun başarılı bir şekilde izole edildiğini doğruladı.

Yüksek kaliteli Ti-Exo elde etmek için, uygun enzim tipinin, konsantrasyonunun ve sindirim süresinin yanı sıra uygun doku depolamasının seçilmesi çok önemlidir. Taze ve donmuş dalak dokularından elde edilen Exo arasında protein konsantrasyonlarında önemli bir fark gözlemlemedik (veriler gösterilmemiştir), bu da iş akışını azaltmak için büyük miktarlarda donmuş dokuların işlenmesinin fizibilitesini gösterir. Ti-Exo'nun izole edilmesi, ultrasantrifüj için uzun bir çalışma süresi gerektirir, bu da klinik uygulamalarda taze dokular kullanılırken tüm protokolün uygun bir süre içinde tamamlanmasını pratik hale getirir. Bu nedenle, eksozom izolasyonu için donmuş dokuların kullanılması daha iyi bir seçenek olacaktır. 37 °C'de çözdürme, kriyoprotektif ajanların dokulara tam nüfuz etmemesi nedeniyle donmuş dokular için uygun değildir. Buz üzerinde çözdürülen donmuş dokular kullanılarak eksozom izolasyonu yapılırken, eksozom veriminin taze dokulara kıyasla içerik olarak anlamlı bir şey göstermediği bildirilmiştir21. Bu nedenle, -80 °C'de saklama örneklerini kullanırken eksozom izolasyonu gerçekleştirmek için donmuş dalak dokularını buz üzerinde çözdük.

Bununla birlikte, bu çalışmada açıklanan protokolün çeşitli sınırlamaları vardır. Çıkarma ve tanımlama ile ilgili kapsamlı adımlar zaman alıcıdır. Exo araştırmalarını klinik hastalık tedavisine uygulamanın nihai hedefi göz önüne alındığında, daha hızlı ve daha uygun maliyetli yöntemler giderek daha kritik hale geliyor. Ek olarak, sonuçlar fare dokusu örneklerine dayansa da, insan dokularına uygulanabilirliği henüz belirlenmemiştir.

Sonuç olarak, protokol, dalak dokusundan yüksek saflıkta Exo'nun çıkarılması için ayrıntılı aşağı akış analizi için uygun bir yöntem sağlar. Doku kaynaklı Exo, kökenlerinin mikro çevresini daha doğru bir şekilde yansıtır ve canlı organizmalardaki fizyolojik ve patolojik süreçleri aydınlatmak için önemli bir potansiyele sahiptir. Gelecekteki çalışmalar, bu protokolü insan dokularına uyarlayabilir ve tanı ve tedavi amaçlı klinik olarak ilgili eksozomların ekstraksiyonunu mümkün kılabilir. Bu teknik, dalağın bağışıklık sistemindeki kritik işlevi göz önüne alındığında, eksozomların bağışıklık tepkilerindeki rolünü incelemede özellikle yararlı olabilir. Ayrıca, protokol, eksozomları diğer dokulardan izole etmek için modifiye edilebilir ve potansiyel olarak dokuya özgü biyobelirteçlerin ve hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Bu protokol, eksozom biyolojisi anlayışımızı geliştirerek, hassas tıptaki ilerlemelere ve yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82370281, 81870222), Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2022A1515012103) ve Bilim, Zhanjiang Şehri Teknoloji Geliştirme Özel Fonu Rekabetçi Tahsis Projesi (2021A05086) ve Guangdong Tıp Üniversitesi İkinci Bağlı Hastanesi'nden Başlangıç Vakfı (23H03) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
70 ve mikro; m Hücre SüzgeciBiologix Group Co., Ltd.ABD15-1070
Anti CD9 antikoruHücre Sinyalleme Teknolojisi, Inc (CST), ABD983275
Anti GM130 antikoruProteintech Group, Inc.China 66662-1-lg
Anti TSG101 antikoruAbcam Plc, İngiltere125011
Hücre Kültürü KabıWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Çin704001
Santrifüj tüpüWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Çin788211
Kollajenaz Tip ISigma-Aldrich Corp., ABDC2674
Masaüstü Termostatik ÇalkalayıcıShanghai bluepard instruments Co., Ltd., ÇinTHZ-100
Elektroforez tamponuWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Çin G2081-1L
Gelişmiş BCA Protein Test KitiShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Çin P0010S
Akış NanoAnalizörüNanoFCM Inc., ÇinN30E
Floresan / Kemilüminesans görüntüleme sistemi Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., ÇinGelView 6000Plus
HRP Keçi anti-Fare IgGProteintech Group, Inc.China 15014
HRP Keçi anti-Tavşan IgG ProteintechGroup, Inc.China 15015
mikroplaka okuyucuMoleküler Cihazlar, ABDCMax Plus
MicroscissorsŞangay  Tıbbi  Aletler (grup)   Co., Ltd., ÇinWA1010
Mikroskobik cımbızŞangay & nbsp; Tıbbi  Aletler (grup)   Co., Ltd., ÇinWA3010
Multifuge X1R Pro santrifüjThermo Fisher Scientific, ABD75009750
Oftalmik makasŞangay  Tıbbi  Aletler (grup) Co., Ltd.,ÇinY00030
Oftalmik cımbızŞangay  Tıbbi  Aletler (Grup) Co., Ltd., Çin JD1060
Optima XPN-100 Ultrafiltrasyon santrifüjüBeckman Coulter, ABDA94469
fosfat tamponlu salin (PBS)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., ÇinP1003
RIPA lizis tamponu (güçlü, inhibitörsüz)Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Çin P0013K
CetvelŞarküteri  İmalat  Şirket, Çin
SDS-PAGE Numune Yükleme Tamponu, 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Çin P0015
Transfer PipetiBiologix Group Co., Ltd.USA30-0238A1
Transmisyon Elektron MikroskobuHitachi, JaponyaH-7650
Ultrasantrifüj tüpüBeckman Coulter, ABD355618
Batı Transfer Tamponu Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Çin G2028-1L

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).
  2. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  3. Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  4. de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine. Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).
  5. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  6. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  7. Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics. Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).
  8. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).
  9. Wang, X., et al. An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue. J Vis Exp. (192), e64499(2023).
  10. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
  11. Hoshino, A., et al. Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers. Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).
  12. Chen, Y., et al. Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes. Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).
  13. Useckaite, Z., et al. Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles. Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).
  14. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).
  15. Lai, J. J., et al. Exosome processing and characterization approaches for research and technology development. Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).
  16. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  17. Roh, Y. J., et al. Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model. PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).
  18. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).
  19. Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review. Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).
  20. Menu, E., Vanderkerken, K. Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).
  21. Shen, S., et al. Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins. iScience. 26 (4), 106521(2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Spleen ExosomesExosome IsolationTissue Derived ExosomesDifferential UltracentrifugationType I CollagenaseTransmission Electron MicroscopyNano Flow CytometryExosome MarkersImmune ResponseMouse Spleen Tissue

İlgili makaleler