Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ex Vivo Modelde Doku Mineralizasyonunun Kapsamlı Karakterizasyonu

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67235

⸱

27 Eylül 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nantes Université, Univ Angers, Oniris, CHU Nantes, INSERM, Regenerative Medicine and Skeleton, RMeS, UMR 1229, 2CHU Angers, Departement pathologie cellulaire et tissulaire

Bu makalede

Özet

Önerilen protokol, multimodal analizler kullanarak kemik rejenerasyonu bağlamında kemik oluşumunu değerlendirmek için küresel bir yaklaşım gerektirmektedir. Yeni kemik oluşumu hakkında kalitatif ve kantitatif bilgi sağlamayı, temel ve klinik öncesi araştırmaların titizliğini ve geçerliliğini artırmayı amaçlar.

Özet

Kemik rejenerasyonu bağlamında doku mineralizasyonunun kapsamlı karakterizasyonu, şu anda analiz için mevcut olan çok sayıda modalite göz önüne alındığında önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Burada, ilgili büyük bir hayvan kemik ex vivo eksplant kullanarak yeni kemik oluşumunun kapsamlı bir değerlendirmesi için bir iş akışı öneriyoruz. Ekilen bir koyun femur başında bir kemik defekti (çap = 3.75 mm; derinlik = 5.0 mm) oluşturulur ve pro-osteojenik bir büyüme faktörü (kemik morfogenetik proteini 2 - BMP2) ile yüklü makro gözenekli bir kemik ikamesi enjekte edilir. Daha sonra, eksplant 28 günlük bir süre boyunca kültürde tutulur, bu da hücresel kolonizasyona ve ardından kemik oluşumuna izin verir. Yeni mineralize dokunun kalitesini ve yapısını değerlendirmek için aşağıdaki ardışık yöntemler oluşturulmuştur: (i) Mikro-BT kullanılarak tüm eksplantın karakterizasyonu ve yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleri, ardından mineralize dokuların ayrımını geliştirmek için derin öğrenme görüntü analizleri; (ii) Yeni oluşturulan dokunun mekanik özelliklerini belirlemek için nano girinti; (iii) Hematoksilen/Eozin/Safran (HES), Goldner'ın trikromu ve Movat'ın pentakromu gibi histolojik incelemeler, özellikle osteoid bariyerinin görselleştirilmesi ve kemik hücrelerinin varlığı ile ilgili olarak mineralize dokunun kalitatif bir değerlendirmesini sağlamak için; (iv) Mineralizasyon derecesini ölçmek ve yüzey morfolojisi, mineral bileşimi ve kemik-biyomalzeme arayüzü hakkında ayrıntılı bilgiler sağlamak için dahili referanslı geri saçılmalı taramalı elektron mikroskobu (SEM) haritalaması; (v) Mineralize matrisin moleküler bileşimini karakterize etmek ve peptit bağlarının tespiti yoluyla çimento içindeki BMP2'nin kalıcılığı hakkında bilgi sağlamak için Raman spektroskopisi. Bu multimodal analiz, yeni oluşan kemiğin etkili bir değerlendirmesini ve mineralize dokulara kapsamlı kalitatif ve kantitatif içgörüler sağlayacaktır. Bu protokollerin standardizasyonu yoluyla, çalışmalar arası karşılaştırmaları kolaylaştırmayı ve araştırma bulgularının geçerliliğini ve güvenilirliğini artırmayı amaçlıyoruz.

Giriş

Travma, tümör rezeksiyonu, konjenital anomaliler veya enfeksiyondan kaynaklanan kemik kusurları, rejeneratif tıp için büyük bir zorluk teşkil eder. Bu değişiklikler iskelet sisteminin yapısal bütünlüğünü tehlikeye atarak rahatsızlığa, fonksiyonel bozulmaya ve hastaların yaşam kalitesinde azalmaya yol açar.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, osteogenezi ve kemik dokusu yenilenmesini geliştirmeye odaklanan yenilikçi kemik onarım stratejileri ortaya çıkmıştır. Bu yaklaşımlar, doğal kaynaklı (örneğin, biyolojik kaynaklı makromoleküller, hayvan kaynaklı hidroksiapatit) veya sentetik (örneğin, biyocamlar, kalsiyum fosfatlar) olabilen implante edilebilir, enjekte edilebilir veya 3D yazdırılabilir kemik ikamelerinin kullanımını içerir1. Kemik rejenerasyonunu yönlendirme ve uyarma konusundaki düşük doğal yeteneklerini geliştirmek için, kemik ikameleri, progenitör hücrelerin osteojenik farklılaşmasını teşvik etmek ve kemik oluşumunu artırmak için kemik morfogenetik proteinleri (BMP'ler) gibi osteoindüktif faktörlerle yüklenebilir2.

Kemik oluşumu, daha sonra hidroksiapatit kristalleri tarafından mineralize edilen ve böylece kemik yapısını güçlendiren bir kollajen matrisinin ilk oluşumuna dayanır3. Bu işlem kemiğe belirli bir sertlik ve güç kazandırır. Mineralize dokunun kalitesi, karmaşık bir şekilde mikroyapısal özellikleri ve mineralizasyon derecesi tarafından yönetilir4. Bu kalite, kemik iyileşmesinde ve rejenere kemiğin işlevselliğinde çok önemli bir rol oynar5. Bununla birlikte, kemik mineralizasyonunu karakterize etmek, çok değişkenli çalışmalardaki doğal değişkenlik nedeniyle zorlu bir görev olmaya devam etmektedir 6,7,8.

Ek olarak, kemik grefti ikamelerinin biyouyumluluk, sitouyumluluk ve farklılaşma potansiyelinin ilk değerlendirmeleri tipik olarak in vitro olarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, metodolojik eşitsizlikler, sonuçların sorunsuz bir şekilde karşılaştırılmasını engellemektedir. Ayrıca, bu in vitro çalışmalar, kemik rejenerasyon sürecini düzenlemek için gerekli olan kemik iliği hücreleri de dahil olmak üzere hücre popülasyonları arasındaki çok hücreli etkileşimleri ve karmaşık diyaloğu tam olarak yakalamamaktadır9. Kemik mikroçevresinin bu doğru temsil eksikliği, sonraki klinik öncesi çalışmaların doğruluğunu tehlikeye atabilir10.

İn vivo değerlendirmeler fizyolojik bağlamların daha doğru bir temsilini sağlasa da, etik, lojistik ve finansal hususlarla sınırlıdır. Sonuç olarak, ex vivo değerlendirmeler, in vitro ve in vivo çalışmalar arasında bir arayüz olarak çok önemli bir rol oynar ve canlı denekler üzerinde deneylere geçmeden önce gerekli bir ara adım olarak hizmet eder11,12,13.

Bu bağlamda, rejenere kemik dokusunun kalitesini değerlendirmek ve klinik öncesi bir modele geçmeden önce stratejinin uygunluğunu sağlamak için kapsamlı karakterizasyon metodolojilerinin uygulanmasına ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, koyun diz eklem dokusu kullanılarak bir eksplant modelinin analizine dayanan bir protokol öneriyoruz. Bu yenilikçi metodoloji, BMP2 yüklü çimentonun eksplantlara implante edilmesini ve 28 günlük kültürden sonra doku mineralizasyonunun ayrıntılı bir analizinin yapılmasını içerir.

Bu çalışmada kullanılan teknik yaklaşımlar çeşitli ve tamamlayıcıdır ve toplu olarak rejenere kemik dokusunun kalitesini değerlendirmek için kapsamlı bir yaklaşım sağlar (Şekil 1). Yüksek çözünürlüklü mikro-BT görüntüleme, kemik yapısının ayrıntılı 3D görselleştirilmesini sağlayarak yeni oluşturulan dokunun mineral yoğunluğu, morfolojisi ve bütünlüğü hakkında değerli bilgiler sağlar. Bu teknik, kemik rejenerasyonunun etkinliğini değerlendirmek ve zaman içinde mineralizasyonun ilerlemesini izlemek için çok önemlidir. Nanoindentasyon, dokunun sertliği ve mukavemeti gibi mekanik özelliklerini belirlemek için kesin bir yaklaşımdır. Bu yöntem, malzemenin nanometrik ölçekte uygulanan bir kuvvete verdiği tepkiyi ölçerek, mineralize dokunun sağlamlığının ve kalitesinin değerlendirilmesini sağlar. Hematoksilen/eozin/safran (HES), Goldner'ın trikromu ve Movat'ın pentakromu gibi yaygın boyamaların kullanıldığı histolojik incelemeler, doku yapısı ve bileşimi hakkında paha biçilmez bilgiler sağlar. Bu boyamalar, hücreler, hücre dışı matris ve mineral birikintileri dahil olmak üzere çeşitli doku bileşenlerinin farklılaşmasına izin verir, böylece kemik rejenerasyon sürecinin kapsamlı bir kalitatif değerlendirmesini mümkün kılar. Geri saçılma taramalı elektron mikroskobu (SEM) haritalaması, numunelerin yüzeyinin yüksek çözünürlüklü bir görselleştirmesini sunarak, kemik matrisinin mineralizasyon derecesinin yanı sıra implante edilen materyal ile konakçı doku arasındaki arayüzlerin ayrıntılı analizine olanak tanır. Son olarak, Raman spektroskopisi, özellikle proteinler, lipitler ve mineraller gibi belirli bileşenlerin tanımlanması yoluyla dokunun moleküler bileşimi hakkında bilgi sağlar. Bu yaklaşım, mineralize matrisin karakterizasyonunu ve BMP2 gibi büyüme faktörlerinin tespit edilmesini sağlar, böylece rejenerasyon ortamında pro-osteojenik uyaranların kalıcılığı hakkında önemli bilgiler sağlar.

Çalışmamız, çeşitli analitik teknikleri entegre eden çok disiplinli bir yaklaşım kullanarak, rejenere kemik dokusunun kalitesinin kapsamlı ve kapsamlı bir değerlendirmesini sağlamayı, böylece kemik grefti ikamelerinin değerlendirilmesi ve potansiyel klinik uygulamaları için sağlam bir temel sağlamayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, bir etik ve hayvan refahı komitesi ve Fransız Ulusal Veterinerlik ve Gıda İdaresi tarafından G44171 numarası ile onaylanmıştır.

1. Osteokondral eksplantların hazırlanması ve kültürü

  1. Aseptik bir ortamda taze ötenazi yapılmış hayvanlardan koyun eklem örneklerini hasat edin. Koyunları sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve sol arka bacağını tıraş edin. Diz eklemi çevresini alkolle dezenfekte ederek hazırlanın. Ön ve arka çapraz bağları ortaya çıkarmak için lateral parapatellar artrotomi kullanın, ardından femoral trokleayı ortaya çıkarmak için patellar çıkık yapın.
    1. Doku alımını takiben, osteokondral otogreft transfer sistemi kullanılarak lateral kondilde 4.75 mm çapında bir defekt oluşturun.
  2. Ortopedik bir çekiç kullanarak, 10 mm derinliğinde bir kusur oluşturun ve eksplantı kondilden alın. Daha sonra, bir osteokondral otogreft transfer sistemi kullanarak, birincinin etrafında ortalanmış, 8 mm çapında ikinci bir kusur gerçekleştirin. Bu, 4.75 mm x 10.0 mm'lik bir merkezi defekt içeren 8 mm x 10 mm ölçülerinde osteokondral eksplantlar verir.
  3. Lojistik nedenlerle gerekirse, eksplantları %1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (hBSS) içinde taşıyın ve 4 °C'de saklayın.
  4. Eksplantları 3x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile durulayın, ardından 4.75 mm x 10.0 mm'lik kusuru 40 μg/mL BMP2 ile desteklenmiş bir kalsiyum fosfat çimentosu ile enjekte edin. Çimentoyu aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
    1. Apatitik trikalsiyum fosfat çubuklarının (120 MPa'da izostatik pres) 1364 °C'de en az 12 saat süreyle ısıl işlemle α-trikalsiyum fosfat (α12-TCP) üretin ve ardından havayla söndürme 14.
    2. 13,1 ± 1,7 μm'lik ince bir toz elde etmek için α-TCP çubuklarını bir planet değirmen bilyesi ile 2x bir planet değirmen bilyesi ile 500 rpm'de 5 dakika boyunca öğütün (daha önce açıklandığı gibi lazer kırınım kullanılarak ölçülmüştür14).
    3. α-TCP tozunu 180 °C'de 45 dakika kuru ısıtarak sterilize edin. Kalsiyum fosfat çimentosunu α-TCP tozunu %2,5 (a/a)Na2HPO4 0,22 μm filtrelenmiş çözelti (sıvı/toz oranı 0,35) ile 1 dakika karıştırarak hazırlayın.
    4. Çimento macununu enjeksiyondan önce 18 G'lik bir iğne kullanarak 3 mL'lik bir şırıngaya yükleyin.
  5. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika sonra, eksplantları 25 cm²'lik bir şişeye aktarın ve nazikçe fetal sığır serumu ve penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) yüksek glikozundan oluşan 10 mL tam kültür ortamı ekleyin.
  6. Eksplantları %5 CO2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde 28 güne kadar koruyun ve laminer akış başlığı altında her 2 günde bir tüm kültür ortamını değiştirin.
  7. Eksplantları 3x PBS ile durulayın. Bunları 50 mL'lik tüplere aktarın, 20 mL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve 3 gün boyunca 4 °C'de tutun. Daha sonra, eksplantları PBS ile durulayın ve sonraki analizlerden önce% 70 etanol içinde saklayın.

2. Mikro-CT analizi

  1. Mikro-CT X-ışını kullanarak mikro-tomografi analizleri yapın. 1200 ms pozlama süresi ve 1 mm alüminyum filtre (80 kV ve 125 μA) ile 10,7 μm çözünürlükte X-ışını projeksiyonları elde edin. Sinyal-gürültü oranını artırmak için her 0,45° dönüş artışı için ortalama üç görüntü.
  2. Üç boyutlu (3B) görüntüleri, bir referans taraması ile bir X/Y hizalamasından sonra üreticinin yeniden yapılandırma yazılımını kullanarak aşağıdaki parametrelerle yeniden oluşturun - Yumuşatma: 0, Halka Artefakt: 3, Işın Sertleştirme: 5. Görüntü işleme yazılımı ile görüntü yığınlarını temizleyin ve iki boyutlu (2D) ve 3D görselleştirme araçlarıyla gözlemleyin.

3. Derin öğrenme görüntü analizleri

  1. Özel özel yazılım kullanarak görüntü segmentasyonu gerçekleştirin. Kemik ve çimento ayrımı için derin bir öğrenme modeli eğitmek üzere entegre segmentasyon Sihirbazı'nı kullanın.
  2. Yeniden yapılandırılmış mikro-BT görüntülerinden kemik, çimento ve arka plan içeren temsili bir bölge (yani çerçeve) seçin. Bu ilk kareyi, yazılım tarafından sağlanan basit (örn. eşik) veya güçlü araçları (örn. yayılma) kullanarak manuel olarak bölümlere ayırın.
  3. Model sekmesinde bir derin öğrenme modeli oluşturun ve açılır menüden 3D-UNET Rutini'ni seçin. Oluşturulan modele sağ tıklayarak analiz edilecek görüntülerle birlikte deneysel parametrelerini tanımlayın; burada: 5 derinlik, yama boyutu 32 x 32, Adadetla algoritması, 0.25 adım oranı, veri büyütme x10.
  4. Hızlı ve doğru görüntü segmentasyon yetenekleriyle ilgili olduğu kabul edilen derin öğrenme rutinini eğitmek için bölümlere ayrılmış çerçeveyi kullanın (Eğit Düğmesine tıklayın) 3,15. Eğitim tamamlandıktan sonra, ikinci bir çalışma alanı (çerçeve) tanımlayın ve tahmin fonksiyonunu kullanarak otomatik olarak segmentlere ayırın.
    1. Daha doğru eğitim verileri oluşturmak için gerekirse manuel düzeltme uygulayın. Rutini bir kez daha eğitin. Tatmin edici bir sonuç elde edilene kadar işlemi tekrarlayın; Eğitim çerçevelerinin sayısı arttıkça veri büyütme sayısı giderek azalır.
      NOT: Model eğitimi sırasında sağlanan DICE indeksi, modelin doğruluğunun bir göstergesini verir (girdi bilgilerine kıyasla) ancak yeterli değildir. Modelin uygunluğunun doğrulanması, otomatik olarak bölümlere ayrılan verilerin 3 bağımsız deneyimli araştırmacı tarafından doğrulanmasıyla gerçekleştirilmelidir.
  5. Dışa Aktar düğmesine tıklayarak modeli yayınlayın ve Dışa Aktarılan Modeli Segmentlere Ayır >> Tam Veri Kümesini Segmentlere Ayır'a tıklayarak tüm mikro -CT veri setine uygulayın.

4. Gömme

  1. Kemik eksplantlarını, p aseton ve 0 ksilenden oluşan 25 mL dehidrasyon solüsyonu içeren 40 mL'lik bir cam şişeye yerleştirerek kurutun. Cam şişeyi RT'de 1 saat boyunca dönen bir tekerleğe yerleştirin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
  2. Dehidrasyon solüsyonunu 25 mL ksilen ile değiştirin ve cam şişeyi RT'de 1 saat boyunca dönen tekerleğe yerleştirin.
  3. Ksilen çözeltisini benzoil peroksit (BPO) ve dibutil ftalat (DBP) ile zenginleştirilmiş 25 mL metilmetakrilat (MMA) ile değiştirin. RT'de 1 saat boyunca dönen tekerleğin üzerine yerleştirin. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
  4. MMA çözeltisini% 10 BPO,% 10 DBP ile zenginleştirilmiş 25 mL MMA ve% 450 μL N, propan-2-ol içinde 1: 20 oranında seyreltilmiş N dimetilanilin ile değiştirin. Cam şişeyi gece boyunca -20 °C'ye yerleştirin. Çözelti sarımsı hale gelir.
  5. Eksplantı orta büyüklükte bir gömme kalıbına yerleştirin ve MMA-BPO-DBP-N, N anilin'i kalıba dökün. Kalıbı plastik bir kutuya yerleştirin ve 5 dakika boyunca nitrojen akışı ile havalandırın. Kutuyu hava geçirmez şekilde kapatın ve MMA polimerizasyonu ve sertleşmesi için 48 saat boyunca 4 ° C'ye yerleştirin.
  6. Eksplant içeren reçineyi kalıptan çıkarın ve sonraki analiz için işlenene kadar 4 °C'de tutun.

5. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) - kantitatif geri saçılmış elektron görüntüleme (qBEI)

  1. Eksplant içeren pMMA bloğunu uzun ekseni boyunca bir elmas testere ile kesin. Histolojik analiz için bloğun ilk yarısını saklayın. 1,5 mm kalınlığında bir bölüm oluşturmak için diğer yarısını daha fazla kesin. Kesimi 3000 rpm'de 3 mm/dak hızla gerçekleştirin.
  2. Bölümü, daha düşük tane boyutuna karşılık gelen artan sayılara sahip silisyum karbür kağıtla öğütün: 10 sn için SiC 320, 15 sn için SiC 1000, 30 sn için SiC 2000 ve 30 sn için SiC 4000.
  3. Bölümü elmas macunu ve özel giysilerle cilalayın: 3 μm Mol B3 elmas solüsyonu ile 1 dakika parlatma bezi ve 1 μm Nap B1 elmas solüsyonu ile 1 dakika polar kumaş.
  4. Bölümü çift damıtılmış su altında durulayın ve elmas parçacıklarını bir pamuklu çubukla temizleyin. Bölümü nitrojen gazı altında kurutun.
  5. Kalın bölümü (10 nm karbon film kalınlığı) karbonla kaplayın ve gümüş boyalı bir alüminyum saplama üzerine monte edin. Elektron yükünün toprağa tahliyesini sağlamak için bölüm üstü ile saplama arasında gümüş bir boya köprüsü yapın.
  6. Saplamayı SEM aşamasına yerleştirin. Numunenin yanında, SEM odasına karbon, alüminyum ve silikon standartlarına sahip bir Faraday kabından oluşan bir kontrol saplaması yerleştirin. Bu, elektron demetini kalibre etmek ve gri seviyeleri Ca'nın yüzdelerine dönüştürmek için kullanılacaktır. SEM odasını kapatın ve vakumlayın.
  7. Elektron ışınını açın ve SEM parametrelerini geri saçılmış elektron modunda çalışacak şekilde ayarlayın. Geri saçılmış görüntülerde, karbon standardının gri seviyesi 25, alüminyum standardı 225 ve silikon standardı 253'tür. Bir gösterge olarak, kullanılan sistemde SEM parametreleri hızlanma voltajı 20 keV, Faraday kabı ile ölçülen prob akımı: 250 pA, çalışma mesafesi: 15 mm, diyafram: 30 μm, görüntü çözünürlüğü: 1024 x 768 piksel, vakum: < 4.10-4 Pa, 100 μs/piksel bekleme süresi, parlaklık ~38 ve kontrast ~72.
  8. SEM standartlarla kalibre edildiğinde, geri saçılan elektron modunda numunenin görüntülerini elde edin.
  9. Roschger ve ark.16'da açıklandığı gibi, gri seviyeleri kalsiyum içeriğine dönüştürmek için numunenin geri saçılmış elektron görüntüsünü kullanın. Bunu herhangi bir görüntü analiz yazılımı kullanarak gerçekleştirin.
  10. Kalsiyum içeriğinin dağılımını çizin. Kalsiyum içerik dağılımı bir Gauss dağılımı gösterir. İlgilenilen üç ana parametre hesaplanır: Görüntüdeki ortalama kalsiyum içeriği olarak Caortalaması, görüntüde en sık karşılaşılan kalsiyum konsantrasyonu olarak Cazirvesi ve kalsiyum içeriği dağılımının maksimumunun yarısında tam genişlik olarak Cagenişliği .
    NOT: qBEi'nin tekrarlanabilirliği, aynı ilgi bölgesinin art arda 5 gün boyunca (günde bir edinim) görüntülenmesiyle araştırılmıştır. Bu, elektron demetinin seanslar arasında açılıp kapatıldığı anlamına gelir. Caortalaması, Cazirvesi ve Cawidth hata yüzdesi sırasıyla %0.5, %0.7 ve %1.2 olarak tahmin edildi. Kalsiyum içeriği ayrıca Enerji dağıtıcı X-ışını analizi (EDS) ile araştırılmıştır. Roschger ve ark. daha önce17 tarafından elde edilen verilere benzer şekilde, EDS tarafından tahmin edilen R² değeri 0.99 olan Caortalaması ile kalsiyum içeriği arasında çok iyi bir doğrusal ilişki kurulmuştur.

6. Histoloji

  1. Her numune için, tungsten bıçaklı 7 sert doku mikrotomu kullanarak 18,19 μm'lik kesitler kesin. Otomatik boyama sistemi kullanarak bölümleri Goldner trikrom, HES ve MOVAT boyası ile boyayın.
  2. Deplastifikasyon için, numuneleri art arda asetonda 5 dakika bekletin ve 2 kez tekrarlayın. Numuneleri damıtılmış suda 5 dakika durulayın ve 2 kez tekrarlayın.
  3. Goldner Trikrom renklendirmesini aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
    1. Örnekleri 20 dakika boyunca Weigert ferrik hematoksilen içine yerleştirin. Musluk suyu ile yıkayın. Numuneleri 30 s-1 dakika boyunca %0,5 asit alkole daldırın. 20 dakika musluk suyu ile yıkayın.
    2. Numuneleri 5 dakika boyunca Ponceau/fuksin asit/azofloksin çözeltisine yerleştirin. 1 dakika boyunca% 1 asetik aside daldırın.
    3. Fosfomolibdik asit / Turuncu G çözeltisi ile 20 dakika boyayın. 1 dakika boyunca% 1 asetik aside daldırın.
    4. Oda sıcaklığında 15 dakika veya 60 ° C'de 8 dakika hızlı yeşil çözelti ile boyayın. Musluk suyuyla iyice durulayın; 3x tekrarlayın.
  4. Movat Pentachrome renklendirme işlemini aşağıda anlatıldığı gibi gerçekleştirin.
    1. Alcian Blue boyama: numuneleri 30 dakika boyunca Alcian Blue solüsyonuna daldırın. Numuneleri musluk suyunda 5 dakika durulayın. Numuneleri 60 dakika boyunca alkali etanol içine yerleştirin. Numuneleri musluk suyunda 10 dakika durulayın. Damıtılmış su ile son bir durulama yapın.
    2. Weigert Hematoksilen boyama: Örnekleri 20-30 dakika boyunca Weigert Ferric Hematoxylin'e yerleştirin. Numuneleri musluk suyunda 15 dakika durulayın. Damıtılmış su ile tekrar durulayın.
    3. Crocein Brilliant/fuksin asit ile boyama: numuneleri 10 dakika boyunca bir Crocein Brilliant/Acid Fuchsin çözeltisine daldırın. % 0,5 asetik asit ile durulayın. Numuneleri 20 dakika boyunca %5'lik bir fosfotungstik asit çözeltisine daldırın. % 0,5 asetik asit ile 2 dakika durulayın. 0 etanol ile her biri 5 dakika süren üç ardışık durulama gerçekleştirin.
    4. Safran du Gatinais ile boyama: numuneleri 15 dakika boyunca Safran du Gatinais'e yerleştirin. Musluk suyuyla son bir durulama yapın.
  5. HES renklendirmesini aşağıda anlatıldığı gibi gerçekleştirin.
    1. Weigert Hematoksilen ile boyama: Örnekleri 30 dakika boyunca Weigert Hematoksilin'e batırın. Musluk suyu ile 2 dakika durulayın.
    2. Renk giderme: numuneleri 10 saniye boyunca hidroklorik asit alkole batırın. Musluk suyu ile 2 dakika durulayın.
    3. Nötralizasyon: numuneleri 1 dakika boyunca bir lityum karbonat çözeltisine daldırın. Musluk suyu ile 2 dakika durulayın. 1 dakika boyunca damıtılmış su ile son bir durulama yapın.
    4. Eozin-Eritrosin ile boyama: numuneleri 3 dakika boyunca bir Eozin-Eritrosin çözeltisine yerleştirin. Musluk suyu ile 10 saniye durulayın.



    1. figure-protocol-1

      figure-protocol-2

      figure-protocol-3

    2. figure-protocol-4

    3. figure-protocol-5

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Eksplantın mikro-BT görüntüsü Şekil 2'de gösterilmiştir. Manuel segmentasyon kullanmak, global eşikleme kullanarak kemiği merkezi kanalda bulunan çimentodan en iyi şekilde ayıramaz. Trabeküler kemik ve çimentonun tanınmasını geliştirmek için derin öğrenmeyi kullanmayı öneriyoruz. Derin öğrenme, biyomateryal özelliklerini tanımak için güçlüdür ve kemik ile çimento arasındaki ayrımı iyileştirmeye yardımcı olarak çimento-kemik etkileşimlerinin daha iyi değerlendirilmesini sağlar. Bu, çimento il...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kemik kusurlarının onarımı, hareketliliği geri kazanmak, ağrıyı azaltmak ve etkilenen bireylerin yaşam kalitesini iyileştirmek için rejeneratif tıpta büyük bir zorluktur. Eksplant modellerin kullanımı, kemik defekti onarımının araştırılması için in vivo çalışmalara kıyasla bir dizi avantaj sunar. Etik hususlara ek olarak, bu model deneysel koşulların titiz bir şekilde kontrol edilmesine ve biyolojik değişkenliğin azaltılmasına izin verir, böylece daha doğru ve tekrarlanabilir so...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

SC3M (SFR Francois Bonamy (UMS 016), Nantes Üniversitesi), SFR ICAT (Angers Üniversitesi), BIO3, HiMolA ve SC4BIO dahil olmak üzere örneklerin toplanması ve işlenmesinde yer alan teknik tesislere teşekkür etmek istiyoruz. Inserm UMR_S 1229 RMeS, Inserm, Nantes Université, Univ Angers ve Oniris VetAgroBio kurumları aracılığıyla Fransız Hükümeti'nden alınan hibelerle desteklenmektedir. CL ayrıca HTL Biyoteknoloji'ye de minnettardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.20 filtrelerVWR 28145-501
18 G iğne (1,2x40 mm)Sterican4665120
3 mL şırıngaHENKE-JECT8300005762
%37 hidroklorik asit VWR 1.00317.1000 
Asetik asit (buzul) Sigma A6283 
Aseton VWR 20063-365 
Alcian Mavisi 8GXVWR 
Amonyum hidroksitVWR 
Apatitik trikalsiyum fosfat Biyomedikal ve Sağlık Mühendisliği Merkezi (Mines Saint Etienne, Fransa)TV26U 
AzofloksinSigma 
Benzoil peroksitSigma 8.01641.0250
BMP2Medtronic ve nbsp;İndüktler 1.5 mg / mL
Brillant krosein Aldrich 
CTVox Bruker-DataViewer
 Skyscan-Diamond
bıçakStruersMOD13
Elmas testereStruersAccutom-50
DiaPro Mol B3 elmas çözeltisiStruers40600379
DiaPro Nap B1 elmas çözeltisiStruers40600373
Dibazik sodyum fosfat (Na2HPO4)Sigma 
Dibutil PhtalateChimie-Plus Laboratoires28656
DragonFly yazılımı ORS2022.1.0.1231. 
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) yüksek glikozu, GlutaMAX (TM), piruvatThermoFisher Scientific31966-021
Eozin Y-Surgipath Sigma 
Eritrosin BSigma 
Etanol mutlakVWR 
Eukitt Dutscher6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mLSarstedt62.547.254
Ferrik klorür hekzahidrat (FeCl3, 6H2O) Merck 1.03943.0250
Fetal Sığır Serumu (FBS) EurobioCVFSVF00
Fuksin asitMerck 1.05231.0025 
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)BioseraMS01NG100J
HematoksilenSigma 86.118.9 
İzostatik presNova SuissePmax 1500 bar
Lazer kırınım granülometrisi  MalvernMastersizer 3000
Açık yeşilProlabo 
Lityum karbonatSigma A13149 
MD-Mol parlatma beziStruers40500077
MetilsikloheksanVWR 8.06147.1000 
Metilsikloheksan VWR 8.06147.1000 
Metilsikloheksan VWR 8.06147.1000 
MetilmetakrilatSigma 8.00590.2500
Mikro-CT, mikro tarayıcı BrukerSkyscan 1272
Monobazik sodyum fosfat (NAH2PO4)Sigma 71496
HarçFritsch Pulverisette 6
N, N, DimetilanilinSigma 803060
Nanoindentasyon istasyonuAnton PaarNHT2
ND-Nap parlatma beziStruers40500080
OATS Osteokondral Otogreft Transfer Sistemi Seti, 4,75 mmArthrexAR-1981-04S
OATS Osteokondral Otogreft Transfer Sistemi Seti, 8 mmArthrexAR-1981-08S
Turuncu GRalM15
Paraformaldehit (PFA)Sigma P6148
Soyulabilir tek kullanımlık gömme kalıplarıPolysciences, Inc18646C-1
Penisilin / Streptomisin (P / S)ThermoFisher Scientific15140122
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Fosfomolibdik asit ve nbsp;Sigma 221856-100 g
Fosfotungstik asitAldrich 12863-5 
Parlatma makinesiSturersDap V
PoupinelMEMMERTTV26U 
Raman mikrospektrometresiRenishawInVia Qontor
Safran du Gâ tinais Labonord 
Taramalı elektron mikroskobuCarl ZeissEvo LS 10
SEMZeissCarl Zeiss Evo LS10
SiC folyolar/Taşlama kağıtlarıStruers40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Gümüş boyaElektron mikroskobu bilimleri12686-15
Faraday kabı, karbon, alüminyum ve silikon standartlarına sahip standart saplamaMikro Analiz Danışmanları Ltd8602
T25 şişesiCorning430639
KsilenVWR 28975.325
Ksilidin PonceauAldrich 19.976-1 
36118631861221063321075071024045981002830105102141057208203622894713511507737

Kaynaklar

  1. Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications. Biomed Eng Adv. 6, 100107(2023).
  2. Tsuji, K., et al. BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing. Nat Genet. 38 (12), 1424-1429 (2006).
  3. Hadjidakis, D. J., Androulakis, I. I. Boneremodeling. Ann N Y Acad Sci. 1092, 385-396 (2006).
  4. Boivin, G., Meunier, P. J. The degree of mineralization of bone tissue measured by computerized quantitative contact microradiography. Calcified Tiss Int. 70 (6), 503-511 (2002).
  5. Boivin, G., et al. Influence of remodeling on the mineralization of bone tissue. Osteoporo Int. 20 (6), 1023-1026 (2009).
  6. Zanghellini, B., et al. Multimodal analysis and comparison of stoichiometric and structural characteristics of parosteal and conventional osteosarcoma with massive sclerosis in human bone. J Str Biol. 216 (3), 108106(2024).
  7. Trento, G., et al. formation around two titanium implant surfaces placed in bone defects with and without a bone substitute material: A histological, histomorphometric, and micro-computed tomography evaluation. Clin Implant Dent Relat Res. 22 (2), 177-185 (2020).
  8. Palmquist, A. A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration. J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).
  9. Budán, F., et al. Novel radiomics evaluation of bone formation utilizing multimodal (SPECT/X-ray CT) in vivo imaging. PLoS ONE. 13 (9), e0204423(2018).
  10. Hulsart-Billström, G., et al. A surprisingly poor correlation between in vitro and in vivo testing of biomaterials for bone regeneration: results of a multicentre analysis. Eur Cells Mater. 31, 312-322 (2016).
  11. Cramer, E. E. A., Ito, K., Hofmann, S. Ex vivo bone models and their potential in preclinical evaluation. Curr Osteoporo Rep. 19 (1), 75-87 (2021).
  12. Chan, M. E., et al. A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblast co-culture for bone mechanobiology. Cell Mol Bioeng. 2 (3), 405-415 (2009).
  13. Doke, S. K., Dhawale, S. C. Alternatives to animal testing: A review. Saudi Pharma J. 23 (3), 223-229 (2015).
  14. Moussi, H., et al. New formulation of injectable and degradable calcium phosphate/silanized hyaluronic acid composite foam: Investigation in a rabbit model of long bone defect. SSRN. , (2024).
  15. Paré, A., et al. Standardized and axially vascularized calcium phosphate-based implants for segmental mandibular defects: A promising proof of concept. Acta Biomater. 154, 626-640 (2022).
  16. Roschger, P., Fratzl, P., Eschberger, J., Klaushofer, K. Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies. Bone. 23 (4), 319-326 (1998).
  17. Roschger, P., Plenk, H., Klaushofer, K., Eschberger, J. A new scanning electron microscopy approach to the quantification of bone mineral distribution: backscattered electron image grey-levels correlated to calcium K alpha-line intensities. Scanning Micro. 9 (1), 75-86 (1995).
  18. Porter, A., et al. Quick and inexpensive paraffin-embedding method for dynamic bone formation analyses. Sci Rep. 7, 42505(2017).
  19. Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. (35), e1707(2010).
  20. Kazanci, M., Roschger, P., Paschalis, E. P., Klaushofer, K., Fratzl, P. Bone osteonal tissues by Raman spectral mapping: Orientation-composition. J Str Biol. 156 (3), 489-496 (2006).
  21. Unal, M., Ahmed, R., Mahadevan-Jansen, A., Nyman, J. S. Compositional assessment of bone by Raman spectroscopy. Analyst. 146 (24), 7464-7490 (2021).
  22. Oliver, W. C., Pharr, G. M. An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments. J Mater Res. 7 (6), 1564-1583 (1992).
  23. Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
  24. Allen, M. J., Houlton, J. E. F., Adams, S. B., Rushton, N. The surgical anatomy of the stifle joint in Sheep. Vet Surg. 27 (6), 596-605 (1998).
  25. Kleuskens, M. W. A., van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. An ex vivo human osteochondral culture model. J Ortho Res. 39 (4), 871-879 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Kemik RejenerasyonuMikro BT GörüntülemeDerin Öğrenme AnaliziNano İndentasyonHistolojik İncelemeTaramalı Elektron MikroskobuRaman SpektroskopisiKemik Substitüsü
Ex Vivo Modelde Doku Mineralizasyonunun Kapsamlı Karakterizasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.