Yöntem makalesi

Sağlık ve Hastalıkta Doku ve Plazmaya Özgü Proteomik Değişikliklerin Aydınlatılması

693 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67240

⸱

23 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NRC Fellow, 2Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 3ORISE Fellow, 4The Geneva Foundation, 5AEOP Fellow, 6Culmen International, LLC

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Proteomik, proteinlerin etkileşimlerinin, işlevinin, bileşiminin ve yapılarının ve hücresel aktivitelerinin yüksek verimli bir değerlendirmesidir. Burada, plazma ve dokular dahil olmak üzere çeşitli biyo-örneklerdeki toplam proteomik değişiklikleri değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Burada bildirilen metodoloji, protein içeren tüm biyo-numuneler için geçerlidir.

Özet

Proteomik, biyolojik bir sistem içindeki yapılarına, işlevlerine, etkileşimlerine, bolluklarına ve translasyon sonrası modifikasyonlarına odaklanan, eksprese edilen proteinlerin büyük ölçekli çalışmasıdır. Örneğin, toplam proteomiğin hayati bir alt kümesi olan fosfoproteomik, fosforilasyon modellerinin ve proteinler üzerindeki değişikliklerin incelenmesidir. Burada açıklanan metodoloji, araştırma hayvanı modellerinden (yani gelincikler ve fareler) toplanan plazma, beyin, akciğer, dalak ve karaciğer dokularında fosforilasyon paternleri dahil olmak üzere genel protein ekspresyon profillerindeki değişiklikleri aydınlatmak için toplam bir proteomik yaklaşımı göstermektedir. Bu teknik, diğer doku tiplerinin yanı sıra protein içeren hemen hemen tüm biyo-numuneler (örneğin, kültürlenmiş hücreler) için geçerlidir. Diseksiyonu takiben, ilgilenilen dokular hızlı donduruldu ve -80 °C'de saklandı. Dokular daha sonra protein bütünlüğünü ve fosforilasyon değişikliklerini korumak için sıvı nitrojenli bir havan ve havan tokmağı kullanılarak homojenize edildi. Toplam protein, evrensel bir nükleaz ve proteaz/fosfataz inhibitörleri içeren bir lizis tamponu kullanılarak doku homojenatlarından ekstrakte edildi. Dokudan ve eşdeğer plazmadan ekstrakte edilen proteinler, ticari bir kütle spektrometresi numune hazırlama kiti kullanılarak kontrollü proteaz sindirimi ile toplam peptitlere dönüştürüldü. Peptitler, ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi/Orbitrap-tribrid tandem kütle spektrometrisi kullanılarak doğrudan analiz edildi. Kurucu proteinlerin kimlikleri, türe özgü bir amino asit dizisi kitaplığıyla eşleştirildiği gibi, proteomik biyoinformatik yazılımı kullanılarak peptit kütle spektral verilerinden yeniden yapılandırıldı. Bunu takiben, analiz, özellikle yalnızca yüksek güvenilirlikli protein tanımlamaları kullanılarak katı kesme kriterleri içermelidir. Kontrol ve deney grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı proteomik farklılıklar (>2 kat değişim; p < 0.05) belirlenebilir.

Giriş

Proteom deneyi ve veri analizinin kombinasyonu olarak proteomik, proteinleri tanımlamaya ve ölçmeye, bunları bileşim, etkileşim, translasyon öncesi ve translasyon sonrası modifikasyonlara (örneğin, fosforilasyon), hücre altı lokalizasyona ve fizyolojik koşullar altında yapıya dayalı olarak karakterize etmeye odaklanır1. Ekspresyon proteomikleri, değişen biyolojik koşullar altında farklılık gösteren proteinlerin nicel karşılaştırmalarıyla ilgilenir2. Ayrıca, hücre çoğalması, farklılaşması, yaşlanma ve hücre ölümü mekanizmaları gibi ana biyolojik işlevleri doğrudan kontrol eden karmaşık, birbirine bağlı yolların, ağların ve moleküler sistemlerin bir haritasının çıkarılmasında da büyük önem taşır. Son yıllarda deneysel teknolojinin önemli ölçüde ilerlemesiyle birlikte, proteomik yöntemler, immünohistokimya ve enzime bağlı immünosorbent tahlili dahil olmak üzere geleneksel yaklaşımlardan sıvı kromatografisi 3,4 gibi yüksek verimli tekniklere doğru gelişmiştir. Proteomik temelli yaklaşımlar, benzersiz hastalık fenotiplerinin ve alt tiplerinin belirlenmesinde ve terapötik ilaçlar (farmakoproteomik) için yeni hedef etkileşimlerin belirlenmesinde ivme kazanmaktadır. Örneğin, hasta sınıflandırması öncelikle homojen grupları tanımlamak ve tedavi rejimlerini yönlendirmek için genomik yaklaşımlara odaklanmıştır. Bununla birlikte, tek başına transkripsiyon durumu, daha sonra çevrilen proteinlerin kaderini tahmin etmez (örneğin, stabilite veya modifikasyon); ve bu nedenle, genomik olmayan mekanizmalar hastalık gelişimine, ilerlemesine, şiddetine ve terapötiklere karşı dirence daha fazla katkıda bulunur 5,6,7.

Protein ekspresyonu ve aktivitesinin nicel karşılaştırmalarından büyük ölçüde yararlanan böyle bir araştırma alanı, nörodejeneratif hastalıklar ve travmatik beyin hasarı (TBI) alanında biyobelirteç keşfidir. Biyobelirteç keşfinin temeli, erken tespiti ve müdahale için potansiyel hedefleri kolaylaştıran teşhis teknikleri geliştirmektir. Biyoinformatik ile birleştirilmiş LC/MS-MS bazlı kantitatif proteomikler, glial fibriler asidik protein (GFAP) ve ubikuitin karboksil-terminal hidrolaz izozim L1 (UCH-L1) dahil olmak üzere önemli protein biyobelirteçlerinin ciddi bir etki veya nüfuz eden TBI 8,9 ile keşfedilmesine yardımcı olmuştur. Örneğin, Askeri personel, görevleri sırasında bomba patlamalarına (yani patlama-TBI) maruz kalmaları nedeniyle sıklıkla TBI olaylarına maruz kalır. Bununla birlikte, patlamaya bağlı hafif TBH'nin neden olduğu nörolojik defisitlerin altında yatan patobiyoloji belirsizliğini korumaktadır. Bu nedenle, patlamaya bağlı beyin hasarının moleküler ve ultrastrüktürel mekanizmalarını anlamak, spesifik biyobelirteç vekillerinin daha iyi tanımlanmasını gerektirir. Proteomik değişikliklerin gözlemlenmesi ile çalışmalar, beyindeki patlama kaynaklı oksidatif stresin olası mekanizmalarının, bozulmuş fisyon-füzyon dinamikleri, azalmış oksidatif fosforilasyon ve kompanse solunumla ilgili enzim aktiviteleri dahil olmak üzere mitokondriyal disfonksiyon ile ilişkili olduğunu göstermiştir10. Asetilasyon, nitrosilasyon, deaminasyon ve fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonların blast kaynaklı düzensizliğinin erken patogenezi hakkındaki bilgiler, aksonal hasar, inflamasyon ve kan-beyin bariyeri bozulmasında rol oynayan protein fonksiyonu üzerindeki etkilerinin daha fazla karakterizasyonunu da sağlayabilir11,12. Sistem biyolojisi yaklaşımlarının ilerlemesiyle birlikte, kemirgenler ve yaban gelinciği de dahil olmak üzere farklı hayvan türlerinde beyin ve periferik dokulardan gelen toplam proteom bilgilerinin haritalanması, patlama yaralanması araştırmalarında önemli bir prosedür haline geldi.

Bu makalede, hem fizyolojik fenomenleri hem de patolojik durumları izlemek için yaygın olarak kullanılan doku veya plazmadan başlayarak ekspresyon proteomiklerinin nicel yönlerini ve translasyon sonrası modifikasyonlarını değerlendirmek için metodoloji iş akışına odaklanıyoruz. Aşağıdaki metodolojinin kullanılması, numune hazırlama ve veri toplamada tutarlılık ve güvenilirlik sağlar. Bu standartlaştırılmış metodolojiye sahip olarak, doku tipleri arasında korunmuş proteomik kalıpları ve belirli dokulara özgü fosforilasyon modellerini belirlemek için karşılaştırmalar yapılabilir. Bununla birlikte, potansiyel olarak biyobelirteç olarak hizmet edebilecek korunmuş fosforilasyon modellerini elde etmek ve ilaç tedavi rejimlerini uyarlamak için çeşitli klinik öncesi hayvan modelleri ve insan klinik numuneleri üzerinde analiz yapılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Araştırma, IACUC onaylı bir hayvan kullanım protokolü kapsamında, Halk Sağlığı Hizmetleri Hayvan Refahı Güvencesi ile AAALAC International tarafından akredite edilmiş bir tesiste ve Hayvan Refahı Yasası ve laboratuvar hayvanlarıyla ilgili diğer federal tüzük ve yönetmeliklere uygun olarak yürütülmüştür. Bu prosedür için gerekli tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Prosedür yedi bileşene ayrılmıştır.

DİKKAT. Dokuyu homojenleştirmek için sıvı nitrojenle çalışırken uygun güvenlik protokollerinin takip edildiğinden emin olun. Laboratuvar personeli, donmuş dokunun homojenizasyonu sırasında dondurucu eldiven, dondurucu önlüğü, cerrahi yüz maskesi ve yüz siperi giydi. Bu homojenizasyon tekniği, harç ve havan tokmağının boyutunun buna göre ayarlanmasıyla, kemik gibi son derece sert maddeler de dahil olmak üzere her türlü doku tipi için kullanılabilir. İlk tezgah kurulumu için Şekil 1A'ya bakın. Fare ve gelincik dokularını homojenleştirirken kullanılan boyutlar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Dokuların havan ve havan tokmağı ile kriyojenik öğütülmesi

  1. Boş bir toplama tüpünün ağırlığını alın ve kaydedin. Toplama tüpündeyken, dokuyu analitik bir terazi kullanarak tartın ve ağırlığı bir laboratuvar defterine kaydedin. Kullanılan doku mg'ını elde etmek için boş bir tüpün ağırlığını doku artı tüp ağırlığından çıkarın.
    NOT: Proteomik çalışmalar için değerlendirilen dokular arasında beyin, akciğer, karaciğer ve dalak bulunur. Tüm doku, bir havan ve havan tokmağı kullanılarak kriyojenik olarak toz haline getirildi.
  2. Kriyopodun içine sıvı nitrojen dökün, ancak yarısından daha az dolu olduğundan emin olun.
  3. Numuneyi içeren tüpü ve boş, önceden otoklavlanmış 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünü/tüplerini kriyopodda bulunan tüp rafına aktarın. Bu, havan ve tokmağı soğuturken numunenin donmuş kalmasını sağlar ve homojenize edilmiş dokuyu boş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne/tüplerine aktarırken numunenin çözülmesini önler.
  4. Kullanmadan önce bu aletleri soğutmak için havan ve havan tokmağı üzerine sıvı nitrojen dökün. Havan ve havan tokmağı, kriyopodun dışına oturur (Şekil 1A,B).
  5. Dokuyu sıvı nitrojen içeren soğutulmuş harca aktarın (Şekil 1B).
  6. Havaneli kullanarak donmuş dokuya tekrar tekrar baskı uygulayın ve doku ince bir toz haline gelene kadar havaneli ile dokuya karşı dönen, öğütme hareketi yapın (Şekil 1C).
    1. Numunelerin harçtan dökülme riskini taşıyan aşırı kuvvet uygulanmadığından emin olun. Havaneli üzerinde sıkı bir kontrole sahip olduğunuzdan emin olun.
    2. Öğütme sırasında numunenin çözülme olasılığını azaltmak için büyük dokuları homojenleştirirken harca ilave sıvı nitrojen ekleyin.
    3. Dokuyu öğütürken çözülmediğinden emin olun. Çözülüyorsa, harca ilave sıvı nitrojen koyun.
  7. Metal spatulaların uçlarını soğutmak için sıvı nitrojene batırın. Bu, homojenize edilmiş dokunun 1,5 mL'lik tüpe kolayca aktarılmasına yardımcı olur. Bu, transfer sırasında dokunun çözülmesini ve spatulaya yapışmasını önler.
  8. Doku ince bir toz halinde homojenize edildikten ve metal spatulalar soğutulduktan sonra, homojenize edilmiş doku tozunu dikkatlice yeni 1,5 mL'lik tüplere aktarın.
    1. Numuneyi, tamamlanacak tahlillerin sayısına bağlı olarak alikotlara bölün.
      NOT: Örneğin, bu çalışmadaki numuneler için dört tahlil tamamlanacaktı, bu nedenle homojenize doku dört adet 1.5 mL'lik tüpe eşit olarak bölündü.
    2. Ekstra homojenize edilmiş dokuları otoklavlanmış 5 mL'lik geçmeli toplama tüpünde saklayın.
  9. Aliquoted dokuları gelecekteki analizlere kadar -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın ve proteinlerin hava ve ışık oksidasyonunu en aza indirmek için 1 yıl içinde gerçekçi bir kullanım sağlayın.
  10. Boş toplama tüpünü tartın.
  11. Doku örneğinin ağırlığını elde etmek için boş toplama tüpünün ağırlığını ilk ölçümden (toplama tüpü artı numune) çıkarın.

2. Protein izolasyonu için doku lizizi

  1. Kuru buzu bir buz tavası kabına alın.
  2. Kuru buza bir tüp rafı yerleştirin ve soğumaya bırakın.
  3. Homojenize doku örneklerini -80 °C'lik dondurucudan çıkarın ve soğutulmuş tüp rafına yerleştirin. Bu, tartım işlemi sırasında protein bozulmasına ve/veya fosforilasyon değişikliklerine neden olabilecek numunelerin çözülmesini önler.
    1. Numuneyi içeren 1,5 mL'lik tüplerin tüp rafında kuru buzda donmuş halde kaldığından emin olun.
  4. Kuru buza yeni bir 50 mL kanonik tüp yerleştirin.
  5. 50 mL'lik kanonik tüpün kapağını çıkarın ve tek kullanımlık plastik spatulaları serin tutmak için 50 mL'lik kanonik tüpe yerleştirin. Bu, numunenin homojenizasyon tüplerine aktarılması sırasında spatulalara yapışmasını önler.
  6. Doku lizizi ve protein izolasyonu için, beş adet 2,8 mm seramik boncuk içeren 2 mL'lik tüpler kullanın (bu protokolde homojenleştirici tüpler olarak anılır).
  7. Homojenleştirme tüpünün kapağını ve yan tarafını kalıcı mürekkepli işaretleme kalemi kullanarak numune kimliğiyle etiketleyin.
  8. Tüpleri soğuk tutmak ve numunenin çözülmesini önlemek için etiketli, homojenleştirici tüpleri kuru buzda bulunan tüp rafına yerleştirin.
  9. Bir homojenizasyon tüpünü analitik bir teraziye yerleştirin ve terazinin darasını alın.
  10. Homojenizasyon tüpünü kuru buz üzerinde tüp rafına geri koyun.
  11. Boncukları içeren homojenizasyon tüpünün kapağını çıkarın ve soğutulmuş plastik spatulalardan birini kullanarak 5 mg ila 10 mg toz doku örneğini ilgili homojenleştirme tüpüne aktarın.
  12. Kapağı tekrar homojenizasyon tüpünün üzerine yerleştirin.
  13. Homojenleştirme tüpünü analitik terazide tartın ve numune miktarını homojenizasyon tüpüne kaydedin.
    1. Etkili toplam protein ekstraksiyonu için gereken lizis tamponu miktarını belirlemek için bu ağırlığı kullanın.
  14. Ağırlık kaydedildikten sonra, numuneyi içeren homojenizasyon tüpünü, soğuk tutmak için kuru buz üzerindeki tüp rafına geri yerleştirin.
  15. Kullanılmış plastik spatulayı atın.
  16. Çapraz kontaminasyonu önlemek için aktarılacak ve tartılacak her numune için yeni, temiz bir plastik spatula kullanın. Tüm örnekler için 2.9 ila 2.15 arasındaki adımları tekrarlayın.
  17. Tüm numuneleri ayrı ayrı homojenleştirme tüplerine aktardıktan sonra, gereken Protein Lizis Ana Karışımı miktarını hesaplayın.
    1. İşlenmesi gereken numune sayısına ve toz haline getirilmiş her numunenin ağırlığına göre hesaplanan gerekli hacimde Protein Lizis Ana Karışımını hazırlayın. Her tüpe 5 mg doku başına 100 μL Protein Lizis Ana Karışımı ekleyin.
    2. Protein Lizis Ana Karışımını yapmak için reaktif hacimleri için şirket yönergelerine bakın (Malzeme Tablosuna bakın).
  18. Homojenize edilmiş, toz haline getirilmiş numuneleri içeren homojenizasyon tüplerini 4 °C'lik soğuk bir bloğa yerleştirin. Homojenizasyon tüpleri artık kuru buz üzerinde kalamaz. Homojenizasyon tüplerinin soğuk blok üzerine yerleştirilmesi, lizis çözeltisinin donmasını önler.
  19. Homojenizasyon tüplerinin kapağını çıkarın ve gereken hesaplanan Protein Lizis Ana Karışımı miktarını uygun kapasiteli pipet kullanarak ilgili homojenizasyon tüpüne aktarın.
    1. Kapağı tekrar homojenizasyon tüplerinin üzerine yerleştirin ve kapakları sıkılaşana kadar döndürün.
  20. Numune tüplerini homojenizatöre yerleştirin ve homojenizasyon için 4 °C'de yumuşak doku programına (hız 4500 RPM, döngü başına 2 x 30 sn, 30 sn duraklama) ayarlayın.
  21. Homojenizasyon döngüsü tamamlandıktan sonra tüpleri cihazdan çıkarın ve 4 °C'lik soğuk bloğa geri yerleştirin.
    1. Numune tüplerini görsel olarak inceleyin. Toz haline getirilmiş numunenin hala görünür olmadığından emin olun. Numune, Protein Lizis Ana Karışımı boyunca hala görselleştiriliyorsa, doku lizizini cihazda tekrar tamamlayın.
    2. Kullanılan doku türü için ayarları optimize edin. Örneğin, lifli organlardan (örneğin kalp) elde edilen toz doku, ek döngülere veya daha yüksek bir RPM'ye ihtiyaç duyabilir.
  22. Homojenleştirme tüplerini bir santrifüje aktarın. Santrifüjde aşağıdaki ayarları girin: 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 g ve santrifüjde Başlat'a basın.
  23. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, homojenizasyon tüplerini dikkatlice 4 °C'lik soğuk bloğa geri aktarın.
  24. Yeni 1,5 mL'lik tüpleri kapakta ve yan tarafta numune kimliği ve diğer ilgili bilgilerle etiketleyin. Etiketlendikten sonra, bu 1,5 mL'lik tüpleri 4 °C'lik soğuk bir bloğa yerleştirin.
    NOT: Tüpler en azından aşağıdakilerle etiketlendi: hayvan kimliği, çalışma zaman noktası, hayvan tipi ve doku tipi.
  25. Karşılık gelen protein lizatını homojenizasyon tüplerinden 4 °C'lik soğuk bir blokta tutulan ilgili etiketli 1.5 mL'lik tüplere aktarın.
  26. Daha fazla analiz için numuneleri -80 °C'de saklayın. Burası güvenli bir durma noktasıdır.

3. Toplam protein ölçümü

  1. Numuneleri -80 °C'lik dondurucudan çıkarın ve numuneleri bir buz kovasında ıslak buz üzerinde çözdürün.
  2. Çözüldükten sonra, protein miktar tayini kitindeki tüm numuneleri ve standartları en az 3 saniye vorteksleyin.
  3. Şematik düzene göre 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına standart, numune ve uygun boşlukların her bir kopyasından 10 μL ekleyin (Şekil 2A).
    NOT: Her doku örneği için, protein tahlili analizinde protein lizatının tercihen fosfat tamponlu salin içine 1:100 oranında seyreltilmesi kullanılır. Şematik düzen, protein tahlilinde kullanılan numune sayısına bağlı olarak değiştirilebilir. Numuneler, standartlar ve uygun boşluklar, protein konsantrasyonunun doğruluğunu değerlendirmek için 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına üç kopya halinde yüklenir, ancak birçok numunenin bir plakaya sığması gerekiyorsa, kopyalar kabul edilebilir.
    1. Düşük miktarda başlangıç dokusuna (yani 5 mg'dan az) sahip numuneler için, sonraki protein sindirimi için mevcut protein lizat miktarını en üst düzeye çıkarmak için protein tahlili için yalnızca tek bir kopya veya kopya kullanın.
    2. Doğru pipetleme ve kalibre edilmiş pipetlerin kullanıldığından emin olun.
  4. İyice karıştırmak için Protein Assay Reaktif şişesini birkaç kez ters çevirin ve ardından 10 mL'lik bir Reaktif Rezervuarına dökün.
  5. 200 μL maksimum kapasiteli çok kanallı pipet kullanarak, Sütun 1'e 150 μL Protein Tahlil Reaktifi ekleyin.
  6. Kuyucuklardaki çökeltiyi azaltmaya yardımcı olmak için protein tahlil reaktifini kuyuda bulunan 10 μL içerikle karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
  7. Pipet uçlarını atın ve 200 μL maksimum kapasiteli çok kanallı pipete yeni uçlar yerleştirin.
  8. 96 oyuklu plakanın tamamına protein tahlil reaktifi eklenene kadar 3.5-3.7 adımlarını tekrarlayın.
    1. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her kuyu sütunu için yeni pipet uçları kullanın.
    2. Protein ölçümü için boş absorbans değeri olarak kullanılmak üzere hiçbir reaktif veya numune eklenmeden en az bir kuyucuğun boş bırakıldığından emin olun.
  9. Protein tahlil reaktifi gerekli tüm kuyucuklara eklendikten sonra, 96 oyuklu plakayı bir alüminyum folyo plaka contası ile kapatın.
  10. 96 oyuklu plakayı bir girdap aleti üzerinde orta hızda 1 dakika vorteksleyin ve ardından plakayı okumadan önce oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
  11. 96 oyuklu plakayı ve alüminyum folyo contayı inceleyin. Reaktif alüminyum folyo contaya yapışmış halde kalırsa, uygun bir teraziyle bir santrifüjün içine yerleştirin.
    1. Hızlı sıkma düğmesini yaklaşık 200 g'a ulaşana kadar basılı tutun.
    2. 96 oyuklu plakayı çıkarın ve folyo üzerinde sıvı kalmadığından emin olmak için alüminyum folyo contayı görsel olarak inceleyin.
  12. Alüminyum folyo contayı yavaşça çıkarın ve şeffaf kapağı 96 oyuklu plakaya geri yerleştirin (Şekil 2B).
  13. Kolorimetrik reaksiyonun 5 dakika gelişmesine izin verdikten sonra 96 oyuklu plakayı 660 nm'de bir spektrofotometrede okuyun.
    NOT: UV/Görünür spektrofotometre kullanılarak absorbans okumaları oda sıcaklığında ölçülür. 660 nm Protein Testi, tescilli bir boya-metal kompleksinin, 660 nm'de ölçülen boyanın maksimum absorpsiyonunda bir kaymaya neden olan asidik koşullarda proteine bağlanmasına dayanır.
  14. Tüm numuneler için protein konsantrasyonlarını hesaplamak için daha fazla uygulanan grafik yazılımını (Şekil 2C-E) kullanarak standart eğriyi oluşturmak için bilinen standartların absorbans okumalarını kullanın.

4. Protein sindirimi

DİKKAT. Aşağıdaki protokolde kullanılan tehlikeli kimyasallarla çalışırken uygun güvenlik protokollerinin takip edildiğinden emin olun. Laboratuvar personeli kişisel koruyucu ekipman (KKD) giymiş ve bu adımları kimyasal çeker ocakta tamamlamıştır. Review Bu kimyasallarla çalışmadan önce tüm güvenlik bilgi formları.

  1. Yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü setini, tüplerin kapağında ve yan tarafında numune kimlikleri kalıcı mürekkeple etiketleyin. Diğer ilgili bilgileri ekleyin.
    1. Standart eğri denklemine, numune absorbans okumalarına ve seyreltme faktörüne dayanarak, her numunenin protein konsantrasyonunu mikrolitre başına mikrogram (μg/μL) cinsinden hesaplayın. 100 μg protein içeren gerekli numune lizat hacmini hesaplamak için bu değeri kullanın (Şekil 2C-E). Hesaplanan bu numune lizat hacmini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  2. Lizis tamponu ile son hacmi 100 μL'ye çıkarın; Bu, sindirim protokolü için gereken başlangıç hacmidir.
    NOT: Protein numunesi artı lizis tamponunun nihai hacmi 100 μL'ye eşit olmalıdır.
  3. Daha önce yayınlanmış literatüre göre, sindirim için yaklaşık 100 μg proteine eşit olan 1.5 μL plazma kullanın.
  4. Her 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne 50 μL İndirgeme Çözeltisi (10 mM ditiyotreitol) ekleyin, üstleri kapatın ve 3 saniye boyunca kısa bir süre vorteks yapın. Daha sonra her numuneye 50 μL Alkilasyon Çözeltisi (30 mM iyodoasetamid) ekleyin, üstleri kapatın ve 3 saniye vorteksleyin.
  5. Protein örneğini sırasıyla azaltmak ve alkillemek için numuneleri 95 °C'de 11 dakika boyunca bir ısı bloğu kullanarak inkübe edin. Bu, tüm disülfid köprülerini parçalar ve onları bir asetamid grubu ile kapatır, yeniden oluşumlarını önler ve böylece proteini tamamen katlanmamış bir duruma denatüre eder ve peptit sindirim bölgelerinin maruziyetini en üst düzeye çıkarır.
  6. İnkübasyondan sonra numuneleri ısı bloğundan çıkarın ve RT'ye soğumalarını bekleyin.
  7. Numunelerin soğumasını beklerken, liyofilize Tripsin/Lys-C Proteaz Karışımını (1:1 oranı, her biri 50 μg) 1 şişe katı reaktife 515 μL sıvı ekleyerek Enzim Sulandırma Çözeltisi ile sulandırın, yani her biri 0.1 μg/μL. Tripsin ciddi bir tahriş edici ve alerjen olabileceğinden, proteaz solüsyonu ve sonrasındaki tüm adımlarla doğrudan cilt temasından kaçının.
  8. Numuneler RT'ye soğutulduktan sonra, indirgenmiş ve alkillenmiş protein numunesi çözeltisine 50 μL sulandırılmış Tripsin/Lys-C Proteaz Karışımı (her biri 2.5 μg) ekleyin ve kısaca vorteksleyin.
  9. Protein örneğini sindirmek için 37 °C'de bir termomikserde inkübe edin ve 3 saat boyunca 1000 rpm'ye ayarlayın.
    NOT: Lys-C proteaz, katlanma veya amino asit dizisi (örneğin, Lys-Pro bağları) nedeniyle tripsin tarafından sindirime dirençli herhangi bir bölgenin parçalanmasına yardımcı olmak için dahil edilmiştir. Bu, her bir proteini yalnızca oldukça küçük bir boyuta ve toplam yüke sahip çok sayıda bilinebilir peptide indirgemekle kalmaz, aynı zamanda aynı sindirim koşulları yakından takip edilirse yüksek oranda tekrarlanabilir. Sindirim sırasında 3 saatlik inkübasyon süresi, tüm proteinlerin tam bölünmesini sağlamak için önerdiğimiz minimum süredir.
  10. 3 saatlik inkübasyondan sonra, parmak yanıklarını önlemek için bir çift forseps kullanarak termomikserden çıkarın.
  11. Numuneye 50 μL Sindirim Durdurma Solüsyonu (%6 trifloroasetik asit veya suda formik asit) ekleyin ve kısa bir süre vorteksleyin.
    NOT: Bu, reaksiyonu inhibe eder, çünkü iki proteaz nötr pH 7-8'de maksimum aktiviteye sahiptir.
  12. Numuneleri -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın, çünkü bu aynı zamanda herhangi bir kalıntı proteaz aktivitesini de durdurur. Burası güvenli bir durma noktasıdır.

5. Peptit temizleme, kurutma ve yeniden süspansiyon

NOT: Bu prosedür esas olarak, LC / MS-MS cihazına kolayca zarar verebilecek ve ayrıca üretilen peptitlerin izole edilmesine ve konsantre edilmesine yardımcı olabilecek sindirim reaktiflerini, özellikle uçucu olmayan tuzları uzaklaştırmak içindir. Peptit temizliği, başlangıçta peptitleri yakalayan ve daha sonra özellikle tuzların yıkanmasına izin veren bir boyut dışlama (jel filtrasyonu) reçinesi ile önceden paketlenmiş, kit tarafından sağlanan tuzdan arındırma spin kolonları kullanılarak gerçekleştirilir. Kit reaktiflerinin, toksik organik çözücüler içerdikleri için kimyasal bir çeker ocaktaki döndürme kolonlarına tam transferi.

DİKKAT. Aşağıdaki protokolde yer alan tehlikeli kimyasallarla çalışırken KKD'nin giyilmesi ve tehlikeli atık muhafaza düzenlemeleri de dahil olmak üzere uygun güvenlik prosedürlerinin takip edildiğinden emin olun. Bu adımları bir kimyasal çeker ocakta tamamlayın ve bu kimyasallarla çalışmadan önce tüm güvenlik bilgi formlarını gözden geçirin.

  1. Numuneleri -80 °C dondurucudan çıkarın ve numunelerin RT'ye gelmesine izin verin.
  2. Peptit Temizleme sütununun altındaki beyaz kapağı çıkarın, yeşil üst kapağı gevşetin ve 2 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirin.
  3. Bunları santrifüje yerleştirin, kapağı kapatın, başlat düğmesine basın ve tüm sevkiyat öncesi şartlandırma sıvısını çıkarmak için 3000 g'da 2 dakika santrifüjleyin.
  4. Akışı tehlikeli bir atık kabına atın ve peptit temizleme kolonunu 2 mL'lik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
  5. Peptit temizleme sütununun yeşil kapaklarını, kalıcı bir mürekkep işaretleme kalemi kullanarak Örnek Kimliklerle etiketleyin.
  6. Hacmi yaklaşık 300 μL olan protein sindirim preparatını, 200 μL'lik bir pipet (örneğin, iki kez 150 μL) kullanarak kuru peptit temizleme kolonuna yavaşça aktarın.
    1. Döndürme kolonunun reçinesinin üst kısmında kabarcık görülmediğinden emin olun. Kabarcıklar gözlenirse, kabarcıkları dağıtmak için kolona hafifçe vurarak veya temiz bir 10 μL pipet ucu kullanarak kabarcıkları çıkarın.
      NOT: Sıkışan hava kabarcıkları, numunenin reçineye düzgün geçişini engelleyebilir ve bu nedenle peptit temizliğinin ve veriminin verimliliğini olumsuz yönde etkileyebilir.
  7. Bunları santrifüje yerleştirin, kapağı kapatın, Başlat'a basın ve 2 dakika boyunca 1.500 g'da santrifüjleyin.
  8. Akışı tehlikeli bir atık kabına atın ve peptit temizleme kolonunu 2 mL'lik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
  9. Yine 200 μL'lik bir pipet kullanarak kolon reçinesinin üzerine 300 μL Yıkama Solüsyonu A (su,% 0.1 trifloroasetik asit / TFA) ekleyin.
    1. Döndürme kolonunun reçinesinin üst kısmında kabarcık görülmediğinden emin olun. Kabarcıklar gözlenirse, kolona hafifçe vurarak kabarcıkları çıkarın veya kabarcıkları dağıtmak için temiz bir 10 μL pipet ucu kullanın.
  10. Bunları santrifüje yerleştirin, kapağı kapatın, Başlat'a basın ve 2 dakika boyunca 1.500 g'da santrifüjleyin.
  11. Akışı tehlikeli bir atık kabına atın ve peptit temizleme kolonunu 2 mL'lik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
  12. Yine 200 μL'lik bir pipet kullanarak kolon reçinesinin üzerine 300 μL Yıkama Solüsyonu B (%5 metanol, %0,1 TFA) ekleyin.
    1. Döndürme kolonunun reçinesinin üst kısmında kabarcık görülmediğinden emin olun. Kabarcıklar gözlenirse, sütuna hafifçe vurarak kabarcıkları çıkarın veya kabarcıkları dağıtmak için temiz bir 10 μL pipet ucu kullanın.
  13. Bunları santrifüje yerleştirin, kapağı kapatın, Başlat'a basın ve 2 dakika boyunca 1.500 g'da santrifüjleyin.
  14. Akışı tehlikeli bir atık kabına atın ve peptit temizleme kolonunu 2 mL'lik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
  15. Kolonun Yıkama Solüsyonu B ile iki kez yıkanması için 5.12-5.14 adımlarını bir kez daha tekrarlayın.
  16. Peptit temizleme kolonunu yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    1. Bu adımda kullanılan 2 mL'lik mikrosantrifüj tüplerinin, kit tarafından sağlanan düşük protein bağlayıcı toplama tüpleri olduğundan emin olun.
    2. Mevcut düşük protein bağlayıcı toplama tüpü miktarını korumak için, önceki yıkama adımları için standart laboratuvar tüplerini kullanın.
  17. Yine 200 μL'lik bir pipet kullanarak kolon reçinesinin üzerine 300 μL Elüsyon Çözeltisi (%50 asetonitril, %0.1 TFA) ekleyin.
    1. Döndürme kolonunun reçinesinin üst kısmında kabarcık görülmediğinden emin olun. Kabarcıklar gözlenirse, kolona hafifçe vurarak kabarcıkları çıkarın veya kabarcıkları dağıtmak için temiz bir 10 μL pipet ucu kullanın.
  18. Bunları santrifüje yerleştirin, kapağı kapatın, Başlat'a basın ve temiz peptit örneğini yeni düşük protein bağlayıcı 2 mL toplama tüpünde toplamak için 3 dakika boyunca 1.500 g'da santrifüjleyin.
    1. İstenirse, ayrıştırılan temiz peptit çözeltisinin 125 μL'sini (yaklaşık yarısı) 200 μL'lik bir pipet kullanarak 1 mL'lik bir cam şişeye aktarın ve -80 °C'de saklayın.
      NOT: Bu alikot daha sonra, özellikle bağımsız olarak hazırlanmış setler olmak üzere numuneler arasında daha kesin miktar tayini için ticari olarak temin edilebilen bir kit tarafından yapıldığı gibi, peptitlerin tandem kütle etiketi (TMT) etiketlemesi gibi ek analizler için kullanılabilir.
  19. Kalan numuneyi, yaklaşık 175 μL'yi, kurutma ve sulandırmaya devam etmeye hazır olana kadar -30 °C'de düşük protein bağlayıcı 2 mL'lik tüplerde saklayın. Burası güvenli bir durma noktasıdır.
  20. Numuneyi kurutmak için peptit numunesini -30 °C'den RT'ye çözün. Peptit temizliğinden hemen sonra kurutma ve sulandırma işlemine devam ediyorsanız, bu adımı dikkate almayın.
  21. 2 mL'lik mikrosantrifüj tüplerini açın ve bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcısına yerleştirin.
    1. Aynı anda eşit olmayan sayıda numune çalıştırılıyorsa, vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcıyı dengelediğinizden emin olun.
    2. Vakum santrifüj yoğunlaştırıcı kapağını kapatın ve Başlat'a basın.
    3. Numunelerin vakum santrifüj konsantratöründe ısıtma uygulanmadan 3 saat çalışmasına izin verin.
    4. Peptitlerin LC/MS-MS cihazının ayırma kolonuna bağlanmasını engelleyebileceğinden, içinde sıvı kalmadığından emin olmak için tüpleri periyodik olarak inceleyin.
    5. Hala sıvı gözleniyorsa, numuneleri ek süre döndürmeye devam edin.
    6. Tüpte sıvı kalıp kalmadığını görmek için 30 dakika ile 1 saat arasında kontrol edin.
      NOT: Peptitler, vakum koşulları altında oldukları için bu işlem sırasında oldukça kararlıdır ve tek başına vakum santrifüj yoğunlaştırıcının çalışmasıyla üretilen kısa süreli kuruluk veya orta derecede sıcaklık ile bozulmaz.
  22. Kuruduktan sonra, numuneyi MS dereceli suda 50 μL %0,1 formik asit içinde hemen yeniden süspanse edin (örneğin, 5 mL suda 5 μL %100 formik asit).
    1. 200 μL'lik bir pipet kullanarak, kurutulmuş peptit örneğini içeren 2 mL'lik düşük protein bağlayıcı tüpün dibine 50 μL %0.1 formik asit ekleyin.
  23. Kapakları kapatın, ardından 15 saniye girdap yapın.
  24. Sulandırılmış numuneleri 200 μL'lik bir pipet kullanarak ilgili 1 mL'lik cam şişelere aktarın.
  25. Sulandırılmış numuneleri içeren cam şişeleri -30 °C'de saklayın ve mümkün olan en kısa sürede LC-MS/MS tabanlı yaklaşımla analiz edin.
    NOT: Dondurulmuş peptit numuneleri, kısa süreli depolama için -30 °C'de ve daha uzun depolama için -80 °C'de stabildir.

6. Bir UHPLC/MS-MS cihazında peptit numunelerinin veri toplama

DİKKAT. Ultra Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi/Orbitrap tribrid tandem Kütle Spektrometresi sistemi ile çalışırken uygun güvenlik protokollerinin takip edildiğinden emin olun. Laboratuvar personeli KKD giydi ve UHPLC/MS-MS üreticisi tarafından sağlanan resmi, uygulamalı cihaz eğitimine tabi tutuldu. Ana uyarılar, UHPLC için asidik ve organik çözücü mobil fazlarının ve MS için yüksek voltajlı iyonizasyon kaynağının uygun şekilde kullanılmasıdır.

  1. Ultra Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (UHPLC) sistemini kullanarak peptit ayırma işlemlerini gerçekleştirin. LC kolonu, aynı malzemeden bir koruma ön kolonundan sonra sıralı olarak yerleştirildiği gibi, 2 μm, 100 Å, 50 μm x 15 cm boyutlarında elektrosprey özellikli bir C18 ters faz, hızlı ayırma (RSLC) tasarımıdır.
  2. Aşağıdaki UHPLC mobil fazlarını kullanın: suda %0,1 formik asit (çözücü A), asetonitrilde %0,1 formik asit (çözücü B) ve %90 su ve %10 metanolde (çözücü C) %0,1 formik asit.
    NOT: Mobil fazları hazırlamak için kullanılan tüm çözücüler ve formik asit LC/MS sınıfındadır ve yalnızca gerektiğinde yapılır. UHPLC, pompalardan önce bir filtreleme ve gaz giderici ünitesine sahiptir, bu nedenle mobil fazlar manuel olarak filtrelenmez ve havadan arındırılmaz.
  3. Plazma ve doku numuneleri için hazırlanan toplam peptitlerin programlanmış enjeksiyonlarını, kullanılan başlangıç protein miktarına göre belirlenen ~3 μg peptit materyaline eşdeğer olan 3 μL'de ayarlayın.
    NOT: Bu, maksimum protein tanımlamaları için ideal bir MS sinyal yoğunluğu üretmelidir. Sinyal çıkışını daha da artırmak için enjeksiyon hacmi 15 μL'ye kadar artırılabilir veya aşırı yükleme belirginse 1 μL'ye kadar düşürülebilir.
  4. Kolonu ve otomatik numune alma cihazını sırasıyla 40 °C ve 10 °C'de tutun.
  5. UHPLC nano pompalarını kullanarak, suyun (A) asetonitril (B) mobil fazlarına doğrusal bir ayırma gradyanı ile proteomik kazanımı için çözücü akış hızını sabit 0,3 μL/dak'ya ayarlayın.
  6. UHPLC yükleme pompası başlangıçta 5 μL/dk'ya ayarlanmış haldeyken, su ve metanol mobil fazı (C) kullanarak enjeksiyon şırıngasının ve numune döngüsünün (20 μL kapasite) yıkamalarını gerçekleştirin.
  7. Toplam 80 dakikanın üzerindeki numune ayırma sırasında, LC gradyanını (doğrusal eğriler) aşağıdaki gibi ayarlayın: Başlangıç - %5 B; 0-60 dk -% 32 B; 60-61 dk -% 95 B; 61-65 dk - %95 B; 65-66 dk -% 2 B; ve 66-80 dk - %2 B. Benzer şekilde, yükleme pompasını sabit %100 A'da çalıştırın, ancak akış hızını doğrusal olarak aşağıdaki gibi ayarlayın: Başlangıç - 5 μL/dak; 0-5 dk - 1 μL/dk; 5-61 dk - 5 μL/dk; ve 61-80 dk - 5 μL/dk (Şekil 3A).
  8. Bilinmeyen peptit örneklerini sıralı çift çalıştırmalar olarak enjekte edin.
  9. Taşınmayı önlemek için, toplam 35 dakika boyunca kesik bir LC gradyanı (doğrusal eğriler) kullanarak numuneler arasında su içinde en az iki ardışık %0,1 formik asit enjeksiyonu gerçekleştirin: Başlangıç - %5 B; 0-23 dk -% 32 B; 23-24 dk - %95 B; 24-30 dk -% 95 B; 30-31 dk -% 2 B; ve 31-35 dk -% 2 B (Şekil 3B).
    1. Yükleme pompası LC eğimi ayarlarının değişmediğinden emin olun.
    2. Karaciğer (örneğin safra asitleri) gibi yüksek düzeyde endojen kirletici içeren peptit numuneleri için, LC kolonunun temizlenmesine yardımcı olmak için her 3 ila 5 numunede bir ve çalışmanın sonunda üçüncü bir boşluk ekleyin. Bu, her biri %25 asetonitril, izopropanol, metanol ve su içeren 1 ila 2 μL çözeltinin enjekte edilmesinden oluşur.
    3. Alternatif olarak veya yukarıdaki adımla birlikte, aşağıdaki gibi bir sistem yıkaması olarak toplam 35 dakika boyunca geliştirilmiş LC gradyanını (yani tahterevalli) yüzde değişikliği gerçekleştirin: Başlangıç - %2 B; 0-3 dk -% 2 B; 3-4 dk -% 95 B; 4-10 dk -% 95 B; 10-11 dk -% 2 B; ve 11-15 dakika - %2 B; 15-16 dk -% 95 B; 16-20 dk - %95 B; 20-21 dk -% 2 B; 21-25 dk -% 2 B; 25-26 dk -% 95 B; 26-30 dk - %95 B; 30-31 dk -% 2 B; ve 31-35 dk -% 2 B (Şekil 3C).
  10. Bir Orbitrap ve bir iyon tuzağı kombinasyonu tandem dört kutuplu kütle spektrometresi (MS-MS) sistemi kullanarak, LC kolonu tarafından ayrılan ve ayrıştırılan peptitlerin, yani karşılık gelen moleküler kütlelerin tespitini gerçekleştirin.
    1. Numune çalıştırmalarını gerçekleştirmeden önce, LC kolonunu doğrudan cihazın sol üst ön köşesinde bulunan MS cihazının değiştirilebilir nano sprey iyonizasyon (NSI) kaynağının yüzüne takın.
      NOT: Bu, LC mobil faz çözücüsünün yüklü mikro damlacıkları içinde asılı duran peptitleri dedektörün iyon transfer tüpünün girişine ileten LC kolonunun dahili elektrosprey iğnesini açığa çıkarır.
    2. Ayrıca, elektrosprey buharlaşma verimliliğini artırmak için NSI kaynağının dahili ısıtma ünitesini açın ve 40 °C'ye ayarlayın.
  11. Ayrıca, numune çalışmasından önce, MS cihazına tatmin edici bir harici sıkıştırılmış nitrojen ve helyum gazı girişi olup olmadığını kontrol edin. Bunu, regülatör göstergeleri sırasıyla 60 ve 40 psi statik akış basınçlarına ayarlanmış, her gazın ultra yüksek saflık dereceli, 300 boyutlu çelik silindir tanklarını kullanarak elde edin.
  12. MS cihazı nitrojen gazı girişinin kararsızlığı hakkında uyarılar verirse, basıncı maksimum 100 psi'ye yükseltin. Tankların en az %10-20 dolu olduğundan emin olun, bu da ~250-500 psi'lik bir üst valf göstergesi okumasıdır; ve değilse, onları yenileriyle değiştirin. Tam kapasitenin %10'unun altına düşmek, gaz tanklarının dibine yerleşebilecek kirletici maddelerin MS cihazına çekilmesi riskini taşır.
  13. Peptitlerin ve translasyon sonrası modifikasyonlarının optimal tespiti için tasarlanmış, kontrol yazılımı tarafından sağlanan bir şablonu kullanarak kütle spektrometresi yöntemini önceden yapın (Şekil 3D-H) ve aşağıdaki standart koşulları girin:
    1. Toplam algılama süresini 80 dakika olarak ayarlayın.
    2. Genel algılama modunu peptitlere ayarlayın.
    3. NSI kaynağını pozitif moda ayarlayın (yani, peptit iyonlarının yükü).
    4. Nano sprey iğne voltajını 2000 V'a ayarlayın ve statik olarak tutun.
    5. Azot gazı girişini NSI'ye ayarlayın ve dedektörleri statik olarak ayarlayın.
    6. İyon transfer tüpü sıcaklığını 275 °C'ye ayarlayın.
    7. Tüm peptitlerin kütlelerini tespit edin (yani, ana iyonlar; MS1) tarama aralığını 350-2000 m/z'ye, RF lensi %30'a, maksimum enjeksiyon süresini Otomatik olarak ve orbitrap kütle analizörünü 120.000 çözünürlüğe ayarlayarak.
      NOT: Cihazın alternatif iyon tuzağı özelliği, orbitrap'a kıyasla bu tip molekülleri izlemek için daha az hassas olduğundan, peptit kütlelerini taramak için burada kullanılmaz.
    8. İyon filtrelerini, 2-7 aralığında çoklu yük durumlarına sahip peptitler arasında ayrım yapacak şekilde ayarlayın. Bu, cihazın, verileri kaydederken, moleküllerin doğal olarak tespit edilen kütle aşırı yük oranlarını (m/z) otomatik olarak tam kütlelerine dönüştürmesine olanak tanır. Benzer şekilde, sadece tek bir yük durumuna (m/z = 1) sahip bir peptit, tam kütlesini elde etmek için herhangi bir dönüştürme faktörü gerektirmez.
    9. İyonlar için dinamik dışlama kapılarını 60 s sürede, ±10 ppm kütle toleransında 1 geçişe ve doğal izotopik atomları bulunan herhangi bir molekülü (örneğin, 14C) bırakmaya ayarlayın.
    10. Peptitler için üretilen kimlik doğrulama fragmanlarının kütlelerini tespit edin (yani, yavru iyonlar; MS2) cihazı veriye bağlı edinime (DDA modu) ayarlayarak.
    11. m/z = 1.6'lık kütle değişkenliği tolerans penceresi için bir ayar kullanarak tüm peptitleri (yani ana iyonları) dört kutuplu izolasyonla yakalayın.
    12. Elektron çarpma modunu HCD'ye (yani, elektron transfer maddesi olarak nitrojen ve helyum gazı kullanılarak daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması), çarpışma enerjisini %30'a, tarama aralığını Otomatik'e, maksimum enjeksiyon süresini Otomatik'e ve Orbitrap kütle analizörünü 30.000 çözünürlüğe ayarlayarak yakalanan peptitlerin parçalanmasını gerçekleştirin.
    13. Sinyal tepe şeklini ağırlık merkezi formatına ayarlayarak nihai verileri (MS1 ve MS2 iyonları) elde edin.
  14. Aşağıda açıklandığı gibi, genellikle her numune partisi çalışmasından önce cihazı rutin olarak kalibre ederek tespit edilen peptitler için doğru kütle belirlemelerini sürdürün.
    1. Kontrol yazılımını kullanarak MS cihazını bir iyon kaynağı güç kapalı durumuna getirin ve NSI kaynağını cihazın alternatif dahili ısıtmalı elektrosprey iyonizasyon (HESI) kaynağına geçirin. Bu, örneğin metabolomik ve ilaç farmakokinetik deneyleri gibi LC pompası için çok büyük numune enjeksiyon hacimleri ve buna karşılık gelen yüksek akış hızı (1-2500 μL/dak) gerektirebilen uygulamalar için kullanılan kaynaktır.
    2. Kontrol yazılımında tam kalibrasyon kontrolü seçeneğini seçin.
    3. Teflon kaplı bir pistona ve paslanmaz çelik kör iğneye sahip 500 μL'lik bir cam şırıngayı ticari olarak temin edilebilen bir MS standart solüsyonla doldurun ve ardından PTFE kılcal boru hattını HSEI kaynağına bağlayın (kapalıyken).
      NOT: Burada kullanılan standart, m/z = 50-2800 kütle aralığını kapsayan ve özellikle peptitlerle ilişkili olanlar (örneğin, amid grupları) olmak üzere çok çeşitli olası kimyasal bağ türlerini kapsayan doğal ve sentetik moleküllerin (toplam 16, örneğin kafein) bir karışımını içerir.
    4. Bir şırınga pompası kullanılarak yapıldığı gibi 3-5 μL/dak'lık bir hız kullanarak MS standardının HSEI kaynağına (açıkken) sabit bir infüzyonunu başlatın. Kontrol yazılımı canlı görüntü penceresinde sabit bir standart tepe noktası modeli kaydedildiğinde, otomatik kalibrasyon kontrolünü etkinleştirin.
      NOT: Standart için kütle belirlemelerinin hassasiyeti ve doğruluğu ile ilgili herhangi bir sorun bulunmazsa, başarılı bir tam kalibrasyon tipik olarak 40 dakika < sürer. Benzer şekilde, yalnızca cihaz kontrol edilen tüm MS donanım parametrelerini geçerse, numuneleri çalıştırmak için güvenilir kabul edilir.
    5. NSI kaynağını ve LC kolonunu sıfırlayarak ve ardından 1-10 ng'yi kapsayan toplam enjekte edilen miktarlarda standart bir insan [Glu 1]-Fibrinopeptid B (Glu-Fib) çözeltisi çalıştırarak kalibrasyonun başarısını onaylayın (örn., 1, 2, 6 ve 10 ng). Bilinmeyen numuneler için yukarıda açıklananlarla aynı LC ayırma ve MS algılama yöntemlerini kullanın.
    6. Uygun LC tutma süresi (~20 dakika), MS1 ve MS2 iyonlarının varlığı (m/z = 1285.54, 813.39, 785.84, 445.12, 333.19 ve 175.12) ve enjekte edilen miktarla artan tepe alanlarının doğrusallığı için Glu-Fib standardını kontrol edin.
    7. Ardından, numune tipini, dosya adını, numune kimliğini, veri yolunu, LC/MS cihaz yöntemini, flakon pozisyonunu ve enjeksiyon hacmini girmek için sütunlar içeren bilinmeyen peptit ve boş numuneleri çalıştırmak için kontrol ve veri yakalama yazılımını kullanarak dizi tabloları oluşturun (Şekil 3D-E).
    8. Ortaya çıkan MS veri dosyalarını (uzantı: RAW; her biri 500 - 800 GB) cihaz bilgisayarının sabit sürücüsündeki belirlenmiş yol klasörüne kaydedin. Daha sonra bu dosyaları, daha sonra açıklandığı gibi, son derece kapsamlı ve karmaşık peptit kütle spektral verilerini (yani MS1 ve MS2 sinyalleri) karşılık gelen toplam protein bileşimi profillerine dönüştüren biyoinformatik yazılımını çalıştıracak kadar güçlü bir iş istasyonu bilgisayarına aktarın.

7. Ham MS verilerinin temsili toplam proteom sonuçlarına dönüştürülmesi

NOT: Peptit numuneleri için yakalanan ham MS verileri, biyoinformatik yazılımı kullanılarak toplam protein bileşimi profillerine (proteom) işlenir. Kısaca, biyoinformatik yazılım, ham MS verilerini, proteinin amino asit dizisinin kapsamlı ve benzersiz kapsamı yoluyla, web tabanlı türe özgü, proteom referans kitaplığında bulunan bilinen peptit MS1 ve MS2 spektrumlarıyla eşleştirerek numunedeki orijinal proteinleri yeniden yapılandırır. Tanımlanan her proteinin nispi bollukları, eşleşen benzersiz peptitlerinin MS1 sinyal yoğunlukları kullanılarak program tarafından belirlenir. Belirlenen bolluklar, numuneler arasında güvenilir bir şekilde karşılaştırılabilir, ancak yalnızca aynı hazırlık partisi içinde ve aynı LC ve MS ayarları kullanılarak çalıştırılırlarsa. Aksi takdirde, her numune içindeki peptitlerin seçici TMT etiketlemesi gibi dahili standart/raportör iyon geri kazanımlarına dayanan daha önce bahsedilen mutlak kantitatif tekniklerin kullanılması gerekecektir.

  1. Web tabanlı kitaplıktan proteom referans dosyasını iş istasyonu bilgisayarının sabit sürücüsüne indirin.
    1. Bunu, ilgilenilen örnek türler (örneğin, gelincikler / Mustela furo) için Uniprot web sitesinde bulunan veri tabanını kullanarak bulun. Buna FASTA dosyası denir. Proteom referans dosyasını bulmak ve ardından indirmek için Proteomlar arama aracını ve Tablo görünümünü kullanın.
    2. Üretilen olası protein tanımlaması sayısını en üst düzeye çıkarmak için, FASTA dosyasını oluştururken Uniprot veritabanına hem komite hakemli (Swiss-Prot) hem de gözden geçirilmemiş (TrEMBL) girişleri seçin. Benzer şekilde, proteinler için incelenen tüm izoformları dahil etme seçeneğini seçin.
  2. Biyoinformatik yazılımını, yani Proteome Discoverer'ı Başlangıç Sayfası sekmesine açın ve ardından Yönetim sekmesini seçin.
  3. FASTA dosyalarını koru alt sekmesine gidin ve ardından deneyleriniz için oluşturulan yukarıdaki türe özgü FASTA dosyasını programa indirin.
  4. Başlangıç Sayfası sekmesine geri dönün ve Yeni Çalışma/Analiz'e tıklayın ve iletişim kutusunda, Çalışma Adı alanına bir çalışma adı yazın ve çalışmayı Çalışma Kök Dizini alanına kaydetmek için bir dosya klasörü seçin.
  5. İşleme İş Akışı ve Konsensüs İş Akışı alanlarını daha sonra seçileceği için şimdilik boş bırakın.
  6. Kaydetmek ve iletişim kutusundan çıkmak için Tamam'a tıklayın, ardından Çalışma Tanımı sayfası açılacaktır.
  7. Çalışma Tanımı sekmesine gidin ve sol orta tarafta bulunan Çalışma Açıklaması kutusuna projenin ayrıntılarını yazın.
  8. Giriş Dosyaları sekmesine gidin ve Dosya Ekle'ye tıklayın.
    1. Bu, toplam protein bileşimi profiline (proteom) işlenecek gerekli ham veri dosyalarının seçilebileceği ve bilgisayarın sabit sürücüsünden indirilebileceği bir iletişim kutusu getirecektir.
  9. Artık Giriş Dosyaları sekmesi altında listelenen, tek tek veya bir kerede seçilebilen ve vurgulanabilen ham MS veri dosyalarına tıklayın.
  10. Bunları üzerine sürükleyin ve İşleme Adımı alt kutusunun bir parçası olarak sağ orta tarafta bulunan Analiz kutusunun Analiz Dosyaları bölümüne bırakın.
  11. İş Akışları sekmesine gidin ve sağ orta tarafta bulunan Analiz kutusunun İşleme Adımı başlığının yanında bulunan Düzenle'ye tıklayın.
  12. Ortak Aç'a tıklayın ve ProcessingWF_Tribrid klasöründen, HCD parçalanmasına dayalı MS tespiti altında elde edildiği gibi, fosfoprotein alt tanımlamaları için özel olarak belirlenmiş işleme iş akışı dosyasını seçin (Şekil 4A).
    NOT: Düzenlenebilir düğümler içeren bir işleme adımı diyagramı daha sonra İş Akışı Ağacı kutusunda görünecektir. Aşağıda açıklandığı gibi, kullanıcı tarafından deneye özgü bilgilerin gerekli bir girişi olduğunu belirten ünlem işaretleriyle işaretlenmiş iki düğüm olacaktır.
  13. İşleme iş akışı ağacı diyagramında, Spectrum Files RC düğümüne tıklayın ve açın.
    1. Spektrum Dosyalarının Parametreleri RC kategorisinde, deneysel olarak ilgilenilen proteinleri tanımlamak için aranacak olan peptit MS spektrumlarının türe özgü referans kitaplığı için daha önce Uniprot web sitesi kullanılarak oluşturulmuş olan FASTA dosyasını Protein Veritabanı parametresi altında bulun ve seçin.
  14. Sequest HT düğümüne tıklayın ve açın ve aşağıdaki üç değişikliği yapın:
    1. Protein Veritabanı parametresi altında, yukarıda açıklandığı gibi aynı FASTA dosyasını seçin.
    2. Enzim Adı parametresi altında, orijinal peptit sindirimini hazırlamak için kullanılan ana ve yedek proteazlar olan Tripsin (tam) veya alternatif olarak Lys-C'yi seçin.
    3. Dinamik Değişiklikler parametresi altında, en az Fosfo / +79.966 Da (S, T, Y) seçildiğinden emin olun.
      1. Bir fosfat grubunun/gruplarının karşılık gelen MS spektrum kayıplarını arayarak, fosforilasyon ile translasyon sonrası modifiye edilen proteinlerle ilişkili peptitleri ortaya çıkarmak için ikinci ayarı kullanın (m/z = 79.97).
      2. Fosfatla dolu amino asit bölgelerini (yani, Serin, Treonin veya Tirozin) MS2 parçalanma modellerinde beklenen değişikliklerle bulun.
      3. Bu noktada, ilgili grupların tam kütle kaybı biliniyorsa, metilasyon, asetilasyon, miristilasyon gibi rutin ilginin diğer protein translasyon sonrası modifikasyonlarını bu noktada Sequest HT düğümüne ekleyin. Benzer şekilde, fosforilasyon bölgelerinin araştırılmasını daha az sıklıkla bildirilen diğer amino asitlere, örneğin histidin'e genişletin.
        NOT: İşleme adımı için iş akışı ağacının Spectrum Files RC ve Sequest HT düğümleri, herhangi bir parametrenin ayarlanmasını gerektiren tek iki düğümdür.
    4. Geri kalanını varsayılan ayarları olarak bırakın, çünkü bunlar üretici tarafından ilgilenilen en yüksek sayıda belirlenmiş protein tanımlamasını üretmek için zaten optimize edilmiştir. Benzer şekilde, bu durum iş akışı ağacındaki diğer tüm düğümler için de geçerlidir.
    5. Percolator ve IMP-ptmRS düğümlerinin iş akışı ağacının sonuna eklendiğinden emin olun.
      NOT: Percolator, nihai sonuçları büyük ölçüde iyileştirmek için yinelemeli uydurma kullanır. IMP-ptmRS, fosforilasyon da dahil olmak üzere tüm protein translasyon sonrası modifikasyonların uygun şekilde tanımlanmasını ve bölge lokalizasyonunu raporlamak için gereklidir.
  15. İş Akışları sekmesine geri dönün ve sağ üst tarafta bulunan Analiz kutusunun Konsensüs Adımı başlığının yanında bulunan Düzenle'ye tıklayın. Bu, fikir birliği adımı için iş akışı ağacı diyagramını getirecektir.
  16. Open Common'a tıklayın ve ConsensusWF klasöründen, protein bileşimi profili (proteom) sonuçları için istenen çıktı formatını üretecek konsensüs iş akışı dosyasını seçin (Şekil 4B).
    NOT: Düzenlenebilir düğümler içeren bir fikir birliği adımı diyagramı İş Akışı Ağacı kutusunda açılır. Verileri işlemek için kullanılan diyagram, protein nispi bolluklarının ölçülmesini kolaylaştırmak için satır içi Özellik Eşleyici ve Öncü İyon Niceleyici düğümlerinin ilk MSF Dosyaları düğümünden bir dal olarak eklendiği temel fikir birliği iş akışının değiştirilmesiyle oluşturulur. İş akışındaki tüm düğümler zaten üretici tarafından belirlenen optimize edilmiş parametreler içeriyor olsa da, aşağıda açıklandığı gibi doğru seçimi iki kez kontrol etmek için çok önemli girişler içeren bazıları vardır.
  17. İş akışı ağacı diyagramında, Öncü İyon Niceleyici düğümüne tıklayın ve açın. Bu, tanımlanan her proteinin nispi bolluğunu ölçmek için gerekli olan düğümdür.
    1. Genel Niceleme Ayarları kategorisi altında, Kullanılacak Peptitler parametresinin altında Benzersiz + Razor seçeneğini bulun ve seçin.
      NOT: Benzersiz peptitler, tek bir proteine özel amino asit dizileri içerenlerdir; ve bu nedenle, MS sinyal yoğunluklarına dayalı olarak miktarını spesifik olarak belirlemek için kullanılır. Jilet peptitleri, protein grupları arasında paylaşılanlardır; ve böylece hesaplanan göreli bollukları anlaşmaya varmak için kullanılır.
    2. Normalleştirme ve Ölçekleme kategorisi altında, hem Normalleştirme Modu hem de Ölçeklendirme Modu parametrelerini Yok seçeneği olarak değiştirin, çünkü bu tür bir ayarlama tüm proteom boyunca güvenilir uygulama için çok kısıtlıdır.
      NOT: Bu ayarlar yalnızca, ilgilenilen seçilmiş proteinlerin hesaplanan nispi bolluklarını, hücreye kararlı bir şekilde içsel olanlara, örneğin temizlik genlerine karşı normalleştirmek ve daha sonra elde edilen değerleri ölçekli bir oran olarak ifade etmek istendiğinde etkinleştirilir.
    3. Ardından, Peptit ve Protein Filtresi düğümüne tıklayın ve açın ve Peptit Filtreleri kategorisi altında En Azından Peptit Güveni ve Düşük Kendinden Emin PSM parametrelerini sırasıyla Yüksek ve Yanlış seçeneklerine değiştirin. Bu, protein tanımlamalarının yapılmasında kullanılan peptit eşleşmelerini en yüksek uyum önemi düzeyine (yani ≥ %95) ayarlar.
      NOT: Alternatif olarak, peptit eşleşmelerinin sıkılığını gevşetmek ve böylece protein vuruşlarının çıktısını büyük ölçüde artırmak için ilk parametre Orta olarak ayarlanabilir; Ancak bu, tersine, çok sayıda yanlış kimlik üretme riskinin çok yüksek olmasına yol açar. Aynı şekilde, her iki parametre için de kabul edilebilir bir seçenek olarak "Düşük" bir değerin kullanılması asla söz konusu olmamalıdır.
    4. Bunlar, konsensüs adımının parametrelerin ayarlanması gereken tek düğümleridir, geri kalanını varsayılan ayarlarını kullanarak bırakın.
      NOT: Genel olarak, konsensüs adımı iş akışı, tüm post-hoc analizleri, yani protein nispi bolluklarının belirlenmesini, tanımlama güvenlerini (yani, Yanlış Keşif Oranları ve peptit spektral eşleşme puanları) ve haritalanmış peptit kapsamını ele alır. Sonuç istatistikleri ve veri dağılımları da son tablolar olarak sağlanır.
  18. Yukarıdaki işleme ve fikir birliği adımı iş akışları yerine getirildikten sonra, tüm çalışmayı kaydedin ve ardından Analiz kutusunun üst kısmında bulunan Çalıştır simgesine (dişliler) tıklayın. Aynı anda birden fazla ham MS veri dosyası işleniyorsa, işleme çalıştırmasına başlamadan önce, yakındaki Dosyaya Göre simgesine (kare) tıklayın ve işaretleyin.
    NOT: Bir MS ham veri dosyasının toplam proteom sonuç dosyasına işlenmesi tipik olarak 20-40 dakika sürer, ancak düşük, orta, yüksek güvenilirlikli eşleşmelere kadar değişen binlerce protein tanımlamasının çalışan bir listesini verebilir (yani, yüksek isabetlere doğru bir ağırlıklandırma ile), her bir varlıkta mevcut olan fosfat modifikasyonları ile birlikte (Şekil 4C). Tanımlanan proteinler için ana sonuç çıktı parametreleri FDR (güven), Master (FASTA dosyası / kitaplık girişi gözden geçirildiyse), Erişim #, Açıklama, Kapsam %, Dizi Kapsamı, Peptit Spektral Eşleşmeleri (örneğin, benzersiz peptitlerin sayısı), Fiziksel Özellikler (örneğin, kDa cinsinden MW), Bağıl Bolluklar ve Modifikasyonlar (yani, fosforilasyon grupları).
    1. Sütun, araştırma ilgi alanlarına göre araç çubuğundaki Huni simgesini (Şekil 4C) kullanarak toplam proteom sonuçlarını artan veya azalan sırada veya tamamen filtrelenmiş olarak düzenler, örneğin, yalnızca yüksek güvenilirlikli tanımlamaya (protein FDR) veya yüksek derecede peptit eşleşmesine (örneğin, kapsama yüzdesi ve/veya bulunan benzersiz sayıya göre) sahip olanları gösterin.
    2. Translasyon sonrası modifikasyon bilgisi özellikle isteniyorsa, daha fazla analiz için fosforilasyona sahip tanımlanmış proteinleri filtreleyin.
    3. Filtrelenen sonuçları, yalnızca uygulanan filtreleri kaldırarak ve pencereyi yenileyerek orijinal çıktıya geri yüklenebilecekleri için dosya adı değişikliği olmadan kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Volkan grafiklerine isteğe bağlı işleme ile toplam proteom sonuçlarının görselleştirilmesi
Her numune için toplam proteom sonuçları, araştırma ilgisinin spesifik proteinleri için katılım # veya açıklama ile kolayca aranabilir ve ilişkili nispi bollukların ortalaması alınır ve daha sonra önemli farklılıklar için tedavi grupları arasında karşılaştırılır (örneğin, t-testinden türetilmiş p-değerler). Alternatif olarak, deneyin tedavi gruplarını oluşturan bireysel numuneler arasında tamamen paylaşılan herh...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yukarıdaki yöntemde, uzun süreli depolama için -80 °C'ye aktarılmadan önce tüm biyolojik aktiviteyi derhal durdurmak için sıvı nitrojen içinde dondurulan dokular kullanıldı. Tüm numuneler toplandıktan sonra doku homojenizasyonu meydana geldi. Homojenizasyon sırasında, proteinlerin yeniden aktivasyonunu veya bozulmasını önlemek için tüm dokuları ve aletleri soğuk tutmak çok önemlidir. Ayrıca, homojenize dokudan proteinin ilk ekstraksiyonu sırasında, protein aktivitesinin kaybını veya prot...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu proje kısmen, Ulusal Bilim, Mühendislik ve Tıp Akademileri Burs Ofisi ve Walter Reed Ordu Araştırma Enstitüsü'ndeki Oak Ridge Bilim ve Eğitim Programı Enstitüsü tarafından yönetilen Ulusal Araştırma Konseyi Önlisans Programına yapılan bir atama ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
660 nm Protein Test KitiPierce / Thermo Scientific22662BCA'nın numunelerin protein konsantrasyonlarını belirlemesi için, Pierce 660nm Protein Test Reaktifi ve Önceden Seyreltilmiş Protein Test Standartlarını içerir
Asetonitril, Optima LC/MS sınıfıThermo Fisher Bilimsel047138.K2Sıvı kromatografisi/kütle spektrometrisi için kullanılan ultra saf asetonitril
Alüminyum Folyo Plaka-ContaBeckman Coulter538619Protein tahlil plakasının geliştirilmesi sırasında kullanılan conta
BioTek Synergy Neo2 Çok Modlu Okuyucu / UV-Vis SpektrometresiGilenthttps://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195Spektrofotometre/test plaka okuyucu aleti, protein konsantrasyonlarını belirlemek için 660nm absorbans okumalarını tamamlamak için kullanılır 
ChromaCare LC-MS Alet Yıkama SolüsyonuThermo Fisher BilimselT111101000Numuneleri çalıştırdıktan sonra LC sisteminin temizlenmesine yardımcı olmak için her biri %25 oranında asetonitril, izopropranol, metanol ve su kullanımı içeren çözelti
CK28 Precellys tüpBertin Corp / TeknolojilerP000911LYSK0A.0Homojenize dokular, Precellyis cihazı kullanılarak doku lizizi ve protein izolasyonu için bu tüplere yerleştirilir. Bunlar, laboratuvarımız tarafından kullanılan ve protokolde "homojenleştirici tüpler" olarak adlandırılan tüplerdir.
KriyopodBrooks / Azenta Yaşam Bilimlerihttps://www.azenta.com/products/cryopod-carrierTisuse homojenizasyonu sırasında harcı soğutmak için sıvı nitrojeni tutmak için kullanılan kap
EasyPep Mini MS Numune Hazırlama KitiThermo Fisher BilimselA40006 SerisiBir kit 20 numuneyi işleyebilir, içerikler protein ekstraksiyonu için lizis solüsyonunu, ekstraksiyon solüsyonunda takviye edilen evrensel nükleazı ve Adım 1.4 ve 1.5 için gerekli regeantları içerir
EASY-Spray C18 LC kolon (15 cm L, 50 µ m Dia, ve 2 µ m parçacık boyutu)Thermo Fisher BilimselES901 SerisiMS tespitinden önce peptitlerin ayrılması için kullanılan elektrosprey LC kolonu
FlexMix kalibrasyon çözümüPierce / Thermo ScientificA39239 SerisiNumune çalışmalarından önce MS cihazının dedektör doğruluğunu ve hassasiyetini kalibre etmek için kullanılan 16 standart molekülün karışımı
Formik Asit, LC/MS sınıfıThermo Fisher Bilimsel85178Tüm LC çözeltilerini ve numunelerini %0,1 (h/h) nihai konsantrasyonda işlemek için kullanılan ultra saf formik asit
Proteazı Durdur & Fosfotaz Tek Kullanımlık İnhibitör Kokteyli (100x)Thermo Fisher Bilimsel78442Numunedeki proteinlerin ve fosfoproteinlerin bozulmasını önlemek için ekstraksiyon tamponunda desteklenir
Metanol, Optima LC/MS sınıfıThermo Fisher Bilimsel047192.K2Sıvı kromatografisi/kütle spektrometrisi için kullanılan ultra saf metanol
Porselen Harcı, 150 mLThermo Fisher BilimselFB961C150 mL kapasite, daha küçük gelincik dokularını (yani beyin) homojenleştirmek için kullanılır
Porselen Harcı, 275 mLThermo Fisher BilimselFB961D275 mL kapasite, büyük gelincik dokularını (yani karaciğeri) homojenleştirmek için kullanılır
Porselen Harcı, 50 mLThermo Fisher BilimselFB961A SerisiFare dokularını homojenleştirmek için kullanılan 50 mL kapasite
Porselen Pestl, 50 mlThermo Fisher BilimselFB961K Serisi50 mL harç ile kullanım için
Porselen Havan Tokmağı, 150 mLThermo Fisher BilimselFB961M Serisi150 mL harç ile kullanım için
Porselen Havan Tokmağı, 275 mLThermo Fisher BilimselFB961N Serisi275 mL harç ile kullanım için
Precelly'lerBertin Corp / Teknolojilerhttps://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/Doku örneklerini homojenleştirmek için kullanılan alet. Aşağıdaki ayarlar kullanıldı: 4500 RPM, döngü başına 2 x 30 s, 30 s duraklama. 
Protein Test ReaktifiPierce / Thermo Scientific22662Adım 3.4&ndash'ta kullanılan Protein Assay Reaktifi; 3.8
Proteom KaşifiThermo Fisher BilimselCSW0064764Proteomik/fosfoproteomik verilerinin analizi için biyoinformatik yazılımı
SureSTART MSCERT vidalı kapaklı LC enjeksiyon şişeleri (0.02– 1,5 mL kapasite)Thermo Fisher Bilimsel6PMCK39TRYüksek performans uygulama sertifikalı, vidalı kapaklı (PTFE, ön-yarık septa) cam şişeler, LC/MS cihazında enjeksiyon için örnekleri içerir     
Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC/MS) sistemiThermo Fisher BilimselLC: indirimli / MS: FETD2-10002, özel istek üzerineNumunelerdeki peptitleri ayırmak ve daha sonra moleküler ağırlığa göre tespit etmek için kullanılan ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi (LC/MS) cihazı
Hücre Lizizi için Evrensel Nükleaz, 100kU, 400 µ LPierce / Thermo Scientific88702Ek evrensel nükleaz satın alındı 
Vacufuge PlusEppendorf Belediyesihttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748Vacufuge, peptid örneklerini yeniden oluşturmadan önce kurutmak için kullanılır. 
Su, Optima LC/MS sınıfıThermo Fisher Bilimsel047146.K2Sıvı kromatografisi/kütle spektrometrisi için kullanılan ultra saf su

Kaynaklar

  1. Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
  2. Souchelnytskyi, S. Bridging proteomics and systems biology: what are the roads to be traveled. Proteomics. 5 (16), 4123-4137 (2005).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  5. Casado, P., et al. Integrative phosphoproteomics defines two biologically distinct groups of KMT2A rearranged acute myeloid leukaemia with different drug response phenotypes. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 80(2023).
  6. Fazakerley, D., et al. Phosphoproteomics reveals rewiring of the insulin signaling network and multi-nodal defects in insulin resistance. Nat Commun. 14 (1), 923(2023).
  7. Emdal, K. B., et al. Phosphoproteomics of primary AML patient samples reveals rationale for AKT combination therapy and p53 context to overcome selinexor resistance. Cell Rep. 40 (6), 111177(2022).
  8. Boutté, A. M., et al. Proteomic analysis and brain-specific systems biology in a rodent model of penetrating ballistic-like brain injury. Electrophoresis. 33 (24), 3693-3704 (2012).
  9. Peters, M. E., et al. Head injury serum markers for assessing response to trauma: Design of the HeadSMART study. Brain Inj. 31 (3), 370-378 (2017).
  10. Song, H., et al. Proteomic analysis and biochemical correlates of mitochondrial dysfunction after low-intensity primary blast exposure. J Neurotrauma. 36 (10), 1591-1605 (2019).
  11. Attilio, P. J., et al. The effects of blast exposure on protein deimination in the brain. Oxid Med Cell Longev. 2017, 8398072(2017).
  12. Zhao, Z., Zlokovic, B. V. Acetylated tau: A missing link between head injury and dementia. Med. 2 (6), 637-639 (2021).
  13. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. J Vis Exp. (168), e61941(2021).
  14. Blagoev, B., Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. Nat Biotechnol. 22 (9), 1139-1145 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Doku Proteomi iPlazma Proteomi iProtein EkspresyonuFosfoproteomikProtein EkstraksiyonuK tle SpektrometrisiS v KromatografisiProtein SindirimiBiyoenformatik Analiz

İlgili makaleler