Method Article

Tek Moleküllü Manyetik Cımbız Kullanarak Telomerik Protein-DNA Etkileşimlerinin İncelenmesi

DOI:

10.3791/67251

⸱

August 30th, 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Pharmacy, Nankai University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, telomerik DNA bağlayıcı proteinler (Telomer Tekrar Bağlama Faktörü 1 [TRF1] ve TRF2) ile insan hücrelerinden ekstrakte edilen uzun telomerler arasındaki etkileşimleri incelemek için tek moleküllü manyetik cımbızların kullanılmasını göstermektedir. Telomerler ve telomerik tekrar bağlama faktörleri için hazırlık adımlarını, tek moleküllü deneylerin yürütülmesini ve veri toplama ve analiz yöntemlerini açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromozomların uçlarındaki koruyucu yapılar olan telomerler, hücresel uzun ömürlülüğü ve genom stabilitesini korumak için çok önemlidir. Düzgün işlevleri, sıkı bir şekilde düzenlenmiş çoğaltma, uzama ve hasar tepkisi süreçlerine bağlıdır. Shelterin kompleksi, özellikle Telomer Tekrar Bağlama Faktörü 1 (TRF1) ve TRF2, telomer korumasında çok önemli bir rol oynar ve ilaç keşfi için potansiyel bir anti-kanser hedefi olarak ortaya çıkmıştır. Bu proteinler, tekrarlayan telomerik DNA motifi TTAGGG'ye bağlanarak koruyucu yapıların oluşumunu ve diğer telomerik proteinlerin toplanmasını kolaylaştırır. Yapısal yöntemler ve ileri görüntüleme teknikleri, telomerik protein-DNA etkileşimleri hakkında bilgi sağlamıştır, ancak dinamik süreçleri araştırmak tek moleküllü yaklaşımlar gerektirir. Telomerik protein-DNA etkileşimlerini incelemek için manyetik cımbız, optik cımbız ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) gibi araçlar kullanılmış ve TRF2'ye bağlı DNA distorsiyonu ve telomeraz katalizi gibi önemli ayrıntıları ortaya çıkarmıştır. Bununla birlikte, telomerik tekrarlayan motiflerle tek moleküllü yapıların hazırlanması, tek moleküllü mekanik yöntemleri kullanan çalışmaların genişliğini potansiyel olarak sınırlayan zorlu bir görev olmaya devam etmektedir. Bunu ele almak için, manyetik cımbızla tam uzunlukta insan telomerik DNA'sını kullanarak etkileşimleri incelemek için bir yöntem geliştirdik. Bu protokol, TRF2'nin nasıl eksprese edileceğini ve saflaştırılacağını, telomerik DNA'nın nasıl hazırlanacağını, tek moleküllü mekanik tahlillerin nasıl kurulacağını ve verilerin nasıl analiz edileceğini açıklar. Bu ayrıntılı kılavuz, telomer biyolojisi ve telomer hedefli ilaç keşfi konusunda araştırmacılara fayda sağlayacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomerler,kromozom 1,2,3'ün uçlarındaki koruyucu yapılardır. Hücre bölünmesi sırasında telomer erozyonu hücre yaşlanmasına ve yaşlanmaya yol açarken, telomerlerin anormal uzaması kansere katkıda bulunur 4,5. Telomerlerin düzgün çalışması için replikasyonları, uzamaları ve hasar tepkileri yüksek düzeyde düzenlenmelidir 6,7,8. Altı alt birimden oluşan shelterin, telomer korumasında merkezi bir rol oynar 9,10,11. Telomerlerin daha derin bir şekilde anlaşılması, telomer biyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır.

Shelterinin temel alt birimleri olan TRF1 ve TRF2, telomerik bağlayıcı proteinlerdir12,13. Hem TRF1 hem de TRF2, Myb alanları14 aracılığıyla telomerlerdeki tekrarlayan DNA motifi TTAGGG'ye bağlanır. Telomerik çift sarmallı DNA'yı çevrelemelerine ve telomerik proteinleritoplamalarına izin veren ortak TRFH alanları aracılığıyla dimerler oluştururlar 15,16,17,18,19. TRF2, telomerik D-döngülerinin ve T-döngülerinin oluşumu için özellikle önemlidir20,21. Telomer korumasındaki önemli rolleri nedeniyle, TRF1 ve TRF2 potansiyel anti-kanser ilaç hedefleri olarak ortaya çıkmıştır 22,23,24,25.

Telomerlerdeki protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için önemli çabalar sarf edilmiştir. Bağlanma afinitelerini incelemek için Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi (EMSA) ve Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) gibi biyokimyasal yöntemler kullanılmıştır20,26. DNA ile kompleks oluşturan telomerik bağlayıcı proteinlerin çok sayıda yapısı, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM), X-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanılarak aydınlatılmıştır27,28,29. Stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) gibi süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri, TRF2'ye bağlı T-döngü oluşumunu ortaya çıkarmıştır21. Son zamanlarda, telomerik dizileri 4,30,31 profillemek için nanopor dizilimi geliştirilmiştir. Bu yapısal içgörüler, telomerik protein-DNA etkileşimleri hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiştir. Telomerik protein-DNA etkileşimlerinin dinamiklerini daha fazla araştırmak için yeni teknolojilerin geliştirilmesi esastır.

Tek moleküllü araçlar, telomer32,33,34'teki protein-DNA etkileşimlerini keşfetmek için güçlü tekniklerdir. Manyetik cımbız, optik cımbız ve AFM gibi tek moleküllü mekanik yöntemler, TRF2'ye bağımlı DNA distorsiyonunu araştırmak, insan telomerik kromatininin TRF2 aracılı sütunlu istiflenmesini ortaya çıkarmak ve diğer uygulamaların yanı sıra işlemsel telomeraz katalizini gözlemlemek için kullanılmıştır 35,36,37,38,39,40. Bu yöntemler özellikle topolojik konformasyonları ve protein-DNA birleşmesi ve ayrışma kinetiğini araştırmak için kullanışlıdır.

Bununla birlikte, telomerik tekrarlayan motiflerle tek moleküllü yapıların hazırlanması, tek moleküllü mekanik yöntemler kullanan çalışmaları sınırlayan zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu sınırlamayı ele almak için, tam uzunlukta insan telomerleri41 üzerindeki küresel protein-DNA etkileşimlerini incelemek için tek moleküllü bir mekanik yöntem geliştirdik. Bu yöntem, yapay telomerik DNA'nın zahmetli hazırlanmasını atlatarak insan hücrelerinden doğrudan telomerik DNA'yı çıkarır. Birkaç kilobaza yayılan uzun doğal telomerler üzerindeki kinetik süreçlerin araştırılmasını kolaylaştırır.

Bu protokolde, popüler bir tek moleküllü mekanik aletolan manyetik cımbız kullanarak telomerik protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için adımların ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz 42,43,44. Örnek olarak TRF2 kullanarak telomerik proteinlerin nasıl ifade edileceğini ve saflaştırılacağını ve insan hücrelerinden telomerik DNA'nın nasıl hazırlanacağını gösteriyoruz. Ek olarak, telomerik protein-DNA etkileşimlerini incelemek için manyetik cımbız üzerinde tek moleküllü bir testin nasıl kurulacağını gösteriyoruz ve tek moleküllü deneylerin sonraki veri analizini ele alıyoruz. Bu protokol, telomer biyolojisi ve telomer hedefli ilaç keşfi alanındaki araştırmacılara fayda sağlayacaktır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Genel materyal ve yöntemler

  1. Bu protokolde kullanılan tuzlar, kimyasallar, antibiyotikler, enzimler, antikorlar ve reçine malzemeleri için Malzeme Tablosu dosyasına bakın.
  2. Luria-Bertani (LB) sıvı ortamı, LB agar plakaları, HEPES tamponu, SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), Fosfat tamponlu salin (PBS), Tris-EDTA (TE) tamponunu soğuk kaplıca limanı protokolleri 45,46,47,48,49,50,51,52,53.
  3. Ticari kaynaklardan pET28a vektörünü (Addgene), prokaryotik ve ökaryotik hücre hatlarını (ATCC) edinin. Daha sonra bunları sürekli olarak kültürleyin ve laboratuvarda geçirin.
  4. Büyük hacimli sıvılar için 120 °C'de 20 dakika otoklavlayın. Küçük hacimler için 0,22 μm gözenek boyutuna sahip steril bir filtre kullanın.
  5. Çözeltileri nihai hacimlerine getirmeden önce HCl veya NaOH kullanarak pH'ı istenen seviyeye ayarlayın.
    NOT: Manyetik cımbızlar özel olarak üretilmiştir ve LabVIEW 2017 ortamında çalıştırılır, tek moleküllü veri analizi ise MATLAB 2017 2,54,55'te gerçekleştirilir.
  6. Güvenlik nedeniyle, uzun kollu laboratuvar önlükleri, nitril eldivenler (veya geçirimsiz ve maddeye dayanıklı bir malzemeden yapılmış eldivenler), koruyucu gözlükler veya gözlükler ve kapalı burunlu ayakkabılar giyin.

2. Protein ekspresyonu ve telomerik DNA bağlayıcı proteinlerin saflaştırılması

  1. Hücre kültürü yapın ve protein ekspresyonunu indükleyin.
    1. Telomerik DNA bağlayıcı proteinler için kodlama dizisini (Şekil 1A), bu durumda örnek olarak TRF2'yi, bir füzyon etiketi olarak SUMO ile enzim sindirimi ve ligasyonu yoluyla pET28a vektörüne yerleştirin. BamHI ve HindIII'ün kısıtlama bölgeleri arasına yerleştirin ve pET28a-SUMO-TRF2'nin plazmidini verin (Şekil 1B).
    2. BL21(DE3) hücrelerini pET28a-SUMO-TRF2 plazmidi ile dönüştürün.
      1. 50 μL'lik bir yetkin BL21 (DE3) hücresi alikotunu buz üzerinde çözün.
      2. Yetkili hücrelere pET28a-SUMO-TRF2 plazmidinin (50 ng DNA içeren) 1 μL DNA'sını ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetlemeden karıştırmak için hafifçe döndürün.
        NOT: Girdap yapmayın.
      3. Karışımı buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
      4. Isı şoku için, hücre karışımını bir su banyosunda tam olarak 45 s boyunca 42 °C'de ısıtın. Dönüştürülmüş hücreleri stabilize etmek için hücreleri hemen 2 dakika buza geri koyun.
      5. İyileşmeyi kolaylaştırmak için hücrelere 950 μL oda sıcaklığında (RT) LB ortamı ekleyin.
      6. Dönüştürülmüş hücreleri 220 rpm'de çalkalarken 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
      7. 50 μg/mL kanamisin (85.8 μM) içeren bir LB agar plakasına 100 μL dönüşüm karışımını yayın.
      8. Kaplanmış hücreleri gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. İnkübasyonun ardından, başlangıç kültürlerinin aşılanmasında kullanılmak üzere farklı koloniler seçin.
        NOT: Plakalardaki koloniler 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
    3. Dönüştürülmüş BL21 (DE3) hücrelerinin bir kolonisini alın ve 50 μg / mL kanamisin (85.8 μM) ile desteklenmiş 5 mL LB ortamında kültürleyin. 220 rpm'de çalkalanarak 37 °C'de 18 saat inkübe edin.
    4. Ölçeği büyütmek için, gece boyunca 2 mL kültürü 50 μg / mL kanamisin (85.8 μM) içeren 200 mL LB ortamına aktarın. 600 nm'deki (OD 600) optik yoğunluk 0,6-0,8'e ulaşana kadar 220 rpm'de çalkalanarak 37 °C'de inkübe etmeye devam edin.
    5. İndüklenmemiş bir kontrol numunesi olarak kültürün 1 mL'sini alın.
    6. Kalan kültürü İzopropil β-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ile 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona indükleyin ve protein ekspresyonunu teşvik etmek için 20 ° C'de 17 saat inkübe edin.
    7. %5 istifleme jeli ve %10 ayırma jeli kullanarak SDS-PAGE gerçekleştirin. Numuneleri SDS-PAGE yükleme tamponu ile yükleyin ve SDS-PAGE'i başlangıçta 30 dakika boyunca 100 V'ta, ardından bir Tris-Glisin tamponunda 50 dakika boyunca 120 V'ta çalıştırın. Protein ekspresyonunu görselleştirmek için Coomassie mavisi ile boyayın ( Ek Tablo 1'deki tariflere bakın) (Şekil 1C).
      NOT: İfade gözlenmezse sorun giderme için Tartışmaya bakın.
  2. Proteini saflaştırın.
    1. Hücreleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de, 8500 x g'da santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı atın ve peleti 200 mL PBS'de yıkayın. Tekrar santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletini 25 mL lizis tamponunda (20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol,% 10 gliserol, 0.5 mM DTT, 1 mM fenilmetilsülfonil florür [PMSF]) yeniden süspanse edin.
      DİKKAT: PMSF aşındırıcı ve toksiktir ve yanıklara neden olur. Uygun koruyucu giysi, eldiven ve göz/yüz koruması kullanın.
      NOT: Hemen devam etmiyorsanız -80 °C'de dondurun.
    2. Yeniden süspanse edilen hücrelere 5 μL 100 mg / mL lizozim, 5 μL 1 U / μL DNaz I ve 5 μL 10 mg / mL RNaz A ekleyin.
    3. 250 W'ta 1 s'lik patlamalar ve ardından 2 s'lik bir duraklama ile toplam 30 dakika boyunca buz üzerinde sonikasyon gerçekleştirin.
    4. 38.000 x g'da, 4 ° C'de 40 dakika (30-60 dakika kabul edilebilir) santrifüjleyin ve süpernatanı 0,22 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün.
    5. 8.76 g NaCl (son konsantrasyon 300 mM) ve 0.68 g imidazol (son konsantrasyon 20 mM) 20 mM HEPES (pH 8.0) içinde çözerek 500 mL Ni-sütun bağlama tamponu hazırlayın. Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir filtreden süzün.
      DİKKAT: İmidazol tehlikelidir ve cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Ayrıca doğmamış bir çocuğa da zarar verebilir. Göz, cilt ve giysilerle temasından kaçının. Yutmayın veya solumayın. Yüz koruması da dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman kullanın.
    6. Kademeli elüsyon için artan imidazol konsantrasyonları (100 mM, 200 mM, 300 mM ve 500 mM) ile Ni sütunlu elüsyon tamponları (20 mM HEPES (pH 8.0), 300 mM NaCl) hazırlayın ve tüm tamponların uygun şekilde filtrelendiğinden emin olun.
    7. Filtrelenmiş süpernatanı, bağlayıcı tamponda (20 mM HEPES (pH 8.0),300 mM NaCl,20 mM imidazol) önceden dengelenmiş Ni sütununa yükleyin. Bağlayıcı tampon ile yıkayın ve proteini hazırlanan imidazol gradyanı ile elüte edin, her biri 1 mL olan 12 fraksiyon toplayın (Şekil 1C). Fraksiyonları %>95 saflıkta birleştirin.
    8. Alüte edilmiş 6xHis-sumo-TRF2 füzyon proteininin konsantrasyonunu bir spektrofotometrede A280 ile ölçün.
    9. Tek moleküllü tahlillerde kullanılan protein için, üreticinin talimatlarına göre sumo proteaz ekleyin (tipik olarak 2 μg füzyon proteini başına 0,125 U proteaz) ve 4 °C'de gece boyunca sindirime izin verin.
    10. Sumo proteaz işleminden sonra, herhangi bir sindirilmemiş füzyon proteinini ve His etiketli sumoyu bağlamak için karışımı bir Ni-sütununa geri yükleyin ve etiketsiz TRF2 proteininin akmasına izin verin. Akışı toplayın.
  3. Protein konsantrasyonunu belirleyin ve proteini saklayın.
    1. Saflaştırılmış TRF2 proteinini 30 kDa'lık bir kesme santrifüj filtre ünitesi kullanarak konsantre edin ve imidazol konsantrasyonunu 150 mM'nin altına düşürmek için 20 mM HEPES (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT içeren bir depolama tamponuna değiştirin.
    2. Hacim 1 mL'nin altına düşene kadar konsantrasyon işlemini tekrarlayın.
    3. Proteinin saflığını ve bütünlüğünü değerlendirmek için her saflaştırma adımından numuneleri SDS-PAGE ile analiz edin (Şekil 1C).
      NOT: Afinite kromatografisi, proteinleri saflaştırmak, ayrıştırılmış numuneleri toplamak ve yıkamak ve protein bütünlüğünü değerlendirmek ve kalite kontrolünü sağlamak için SDS-PAGE yürütmek için kullanılır. Afinite kromatografisi tek başına saflık gereksinimlerini karşılamadığında, protein saflığını daha da artırmak için boyut dışlama kromatografisi kullanılır. UV absorbans eğrileri, elüsyon fraksiyonlarının değerlendirilmesine yardımcı olur ve SDS-PAGE, protein bütünlüğünü doğrulayarak süreç boyunca sıkı kalite kontrolü sağlar.
    4. Depolama için konsantre ve tampon değişimli proteine% 50'lik bir nihai konsantrasyona gliserol ekleyin.
    5. Proteini -80 °C'de saklayın.

3. İnsan telomerik kısıtlama fragmanlarının hazırlanması

  1. Genomik DNA'yı çıkarın.
    1. Akış şemasını takip ederek (Şekil 2A), 1 x 107 hücreyi 1000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Yıkamak için, hücreleri 200 μL PBS'de yeniden süspanse edin, 3 dakika boyunca 1000 x g'da tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    2. 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 100 mM EDTA ve %1 SDS içeren 760 μL tamponu 1 x 107 hücre içeren tüpe ekleyin ve hava kabarcıklarını önlemek için pipetleme ile nazikçe yeniden süspanse edin.
      NOT: Girdap yapmayın.
    3. Proteinlerin sindirimi ve numunedeki DNazların ve RNazların elimine edilmesi için, 10 mg/mL'lik bir stok çözeltisinin 40 μL'sine karşılık gelen 0.5 mg/mL'lik bir nihai konsantrasyona Proteinaz K ekleyin. Karıştırmak için tüpün altına hafifçe vurun (girdap yapmayın).
    4. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    5. 265 μL 5.4 M NaCl ekleyin. Tüpü dakikada beş kez ters çevirerek 5 dakika karıştırın, ardından 20 dakika buzun üzerine koyun.
    6. RT'de 10 dakika boyunca maksimum hızda (örn. 16.900 x g) santrifüjleyin.
    7. Süpernatanı bir santrifüj tüpüne aktarın ve yüzen lipitlerden veya tortulardan kaçınarak eşit hacimde izopropanol (yaklaşık 750 μL) ekleyin. DNA süpernatantın içindedir.
    8. Karıştırmak için tüpü beş kez ters çevirin. Santrifüj tüpünde çökelen bir DNA peletinin varlığını görsel olarak onaylayın.
    9. RT'de maksimum hızda 10 dakika santrifüjleyin.
    10. Süpernatanı atın. Santrifüj tüpünü beş kez ters çevirerek DNA peletini 500 μL %70 etanol ile yıkayın.
      NOT: Pelet DNA'dır.
    11. RT'de maksimum hızda (örn. 16.900 x g) 10 dakika santrifüjleyin.
    12. DNA peletini bırakarak tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın. Pelet havasının RT'de 5 dakika kurumasını bekleyin.
      NOT: Genomik DNA'nın çözülmesi zorlaşabileceğinden aşırı kurutmadan kaçının.
    13. DNA peletini 475 μL TE tamponunda (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA) yeniden süspanse edin. Tüpün altına hafifçe vurarak yavaşça karıştırın. DNA hazırlığı sırasında RNA'nın sindirimi için 25 μL 10 mg/mL RNaz A (son konsantrasyon 0.5 mg/mL) ekleyin ve DNA peleti tamamen eriyene kadar hafifçe vurarak karıştırın.
      NOT: DNA kesilmesini önlemek için girdaptan kaçının.
    14. DNA örneğini gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    15. Eşit hacimde Tris-doymuş fenol ekstraksiyonu gerçekleştirin: santrifüj tüpüne 500 μL fenol ekleyin, bir pipetle hafifçe karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin.
      DİKKAT: Fenole maruz kalmak ciltte, gözlerde, burunda, boğazda ve sinir sisteminde tahrişe neden olabilir. Göz, cilt ve giysilerle temasından kaçının. Yutmayın veya solumayın. Yüz koruması da dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman kullanın.
      NOT: DNA üst sulu fazdadır, proteinler interfazdadır ve organik faz alttadır.
    16. Üç kez tekrarlayın. DNA'nın süpernatantını alın (yaklaşık 280 μL).
    17. DNA örneğinin hacmine göre 1/10 hacim (28 μL) 3 M sodyum asetat (nihai konsantrasyon 0.3 M, pH 5.2) ve 2 hacim (616 μL) soğuk %100 etanol ekleyin. Santrifüj tüpünü -80 °C'de 2-3 saat yerleştirin.
    18. Maksimum hızda (örn. 16.900 x g) 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden önce donmuşsa çözeltiyi buz üzerinde çözdürün.
    19. Süpernatanı atın ve santrifüj tüpünü ters çevirerek 3-4 kez% 70 etanol ile yıkayın. 4 °C'de 5 dakika maksimum hızda santrifüjleyin.
    20. Etanolü çıkarın ve peletin RT'de 5 dakika kurumasını bekleyin.
    21. 100 μL TE tamponu ekleyin, karıştırmak için tüpe hafifçe vurun ve tamamen çözünmesi için 2 saat boyunca 4 ° C'de bekletin.
      NOT: Genomik DNA'nın bütünlüğünü %1'lik bir agaroz jel üzerinde inceleyin (Şekil 2B).
    22. DNA'yı -20 °C'de dondurucuda saklayın. En az 1 yıl boyunca stabil kalacaktır.
  2. Genomik DNA sindirimi ve modifikasyonu gerçekleştirin.
    1. 4 μg genomik DNA alın ve 1 μL CviAII (10 U), 2 μL 10x sindirim tamponu ile birleştirin (tarifler için Ek Tablo 1'e bakın) ve toplam 20 μL hacme ulaşmak için su ekleyin. Karışımı 25 ° C'de 12 saat inkübe edin.
      NOT: FatI, artık NEB tarafından durdurulan CviAII'nin yerini alabilir.
    2. Önceki karışımı (20 μL) içeren aynı tüpe 1 μL NdeI (20 U), 1 μL MseI (10 U) ve 1 μL BfaI (10 U) ekleyin. Ayrıca, toplam 40 μL'lik bir hacim elde etmek için 2 μL 10x sindirim tamponu ve 15 μL su ekleyin. 37 ° C'de 12 saat inkübe edin, ardından tüm enzimleri 80 ° C'de 20 dakika boyunca ısıyla inaktive edin.
      NOT: Genomik DNA'nın sindirimi, Terminal Kısıtlama Fragmanı (TRF) yöntemi kullanılarak incelenebilir (Şekil 2C). Dört kısıtlama enziminin (CviAII, NdeI, MseI ve BfaI) kombinasyonu, genomik DNA'yı yaklaşık 800 bp'lik parçalara sindirir ve minimum subtelomerik DNA kontaminasyonu ile TRF'leri verir.
    3. Digoxigenin modifikasyonu için, sindirilmiş genomik DNA'nın 40 μL'sini alın ve 4 μL 1 mM dATP (son konsantrasyon 0.08 mM), 4 μL 1 mM digoksigenin-11-dUTP (son konsantrasyon 0.08 mM), 1 μL Klenow Fragmanı (5 U), 0.5 μL 100 mM DTT (son konsantrasyon 1 mM) ve 1 μL 10x sindirim tamponu. 37 ° C'de 12 saat inkübe edin, ardından Klenow Parçasını etkisiz hale getirmek için 75 ° C'de 20 dakika ısıtın.
    4. Biyotin etiketlemesi için, 12.5 μL Digoksigenin ile modifiye edilmiş genomik DNA (1 μg) alın ve 1 μL 1 μM biyotinile telomerik telomerik prob (ör., 1 pmol) telomerik tek sarmallı çıkıntıya tamamlayıcı olan. 50 mM K iyonlarını 1 mM'ye seyreltmek için 611.5 μL TE Li tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl) ekleyin, toplam 625 μL'lik bir hacim elde edin, bu da her biri 39 μL'lik 16 tüpe bölünebilir.
    5. Bir termal döngüleyicide 3 dakika boyunca 75 °C'de ısıtın, ardından sıcaklığı 0.1 °C'ye ulaşana kadar her 30 saniyede bir 25 °C azaltın.
    6. DNA örneklerini en az bir yıl boyunca -20 °C'de saklayın.

4. Manyetik cımbızda telomerik DNA örneği için bir akış hücresi kurma

  1. Tek moleküllü tahliller için bir akış hücresi yapın.
    1. Üst lamellerde giriş ve çıkış olarak delikler açmak için bir elektrikli taşlama makinesi kullanın (# 2 0,2 mm kalınlığında kapak camı).
    2. Lamelleri deterjanda 30 dakika boyunca sonikasyon ile temizleyin.
    3. Kapak fişlerini 3 kez ultra saf su ile yıkayın.
    4. İzopropanoldeki lamelleri 30 dakika boyunca sonikasyon ile temizleyin.
    5. Lamelleri 3 kez ultra saf su ile yıkayın.
    6. Lamelleri 15-30 dakika boyunca sonikasyon ile ultra saf olarak temizleyin.
    7. Lamelleri nitrojenle kurulayın.
      NOT: Protokol burada durdurulabilir ve temizlenen lameller daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir.
    8. Alt lamelleri (deliksiz) 20 μL %0,1 nitroselüloz ile kaplayın ve referans boncukları (20x seyreltme, 3 μm çap) ekleyin. 100 °C'de 4 dakika pişirin.
    9. Çift katmanlı parafilm ara parçalarını metal bir kalıba göre kesmek için bir neşter kullanın. Kalıp, lamel ile aynı boyutlara sahip dikdörtgen bir alüminyum alaşımlı parçadır ve kanal kesmeyi kolaylaştırmak için içi boş bir merkeze sahiptir.
    10. Akış hücreli sandviçi monte edin (Şekil 3A). 85 ° C'de ısıtın ve parafilm kanalı kapatana kadar masaj yapmak için iki çubukla masaj yapın.
    11. Akış hücresini bir antikorla kaplayın. 70 μL anti-digoksijenenin antikorunu (0.1 mg / mL) doğrudan akış hücresine enjekte edin. RT'de 1 saat bekletin.
    12. Akış hücresini pasifleştirin. Anti-digoxigenin antikorunun yerini almak için 70 μL 10 mg / mL BSA enjekte edin. RT'de 12 saat bekletin. Bağlanmamış anti-digoksigenin antikorları, titiz bir yıkama ile aşağıdaki adımlarda yıkanacaktır.
      NOT: Akış hücresini 4 °C'de 1-2 hafta saklayın.
    13. DNA olmadan 5 μL yıkanmış MyOne (10 mg / mL) (veya 5 μL yıkanmış M270 (10 mg / mL)) boncukları akış hücresine yıkayarak spesifik olmayan bağlanmayı test edin. 10 dakika bekletin, ardından bir çalışma tamponu (20 mM HEPES (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) kullanarak boncukları yıkayın. Bir görüş alanında yüzeye yapışan boncukların sayısını sayın. İyi işlenmiş bir yüzey sıfır veya sadece birkaç boncuk göstermelidir.
  2. Bir akış hücresinde telomerik DNA bağlarını izole edin ve hareketsiz hale getirin.
    1. 10 μL M270 boncuk (10 mg / mL) veya 5 μL 10 mg / mL MyOne alın ve bunları 50 μL çalışma tamponu (20 mM HEPES [pH 7.5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) ile beş kez yıkayın.
    2. 500 ng sindirilmiş genomik DNA alın ve 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun. Tüm boncukları (50 μL) DNA örneğinin üzerine ekleyin.
    3. Pipetleme yapmadan, boncukları ve DNA örneğini karıştırmak için santrifüj tüpünü birkaç kez hafifçe vurun. Karışımı 1 saat buz üzerinde bırakın. Boncukları aşağı çekmek için bir mıknatıs kullanarak 500 μL çalışma tamponu ile üç kez, yıkamalar arasında 10 dakikalık aralıklarla yıkayın.
    4. 30 μL çalışma tamponu kullanarak numuneyi yeniden süspanse edin ve karışımı akış hücresine yükleyin. 30 dakika bekletin. Bağlanmamış manyetik boncukları yıkayın.
      NOT: Telomerik DNA, digoksijenenin-antikor ve biotin-streptavidinin aracılık ettiği afinite etkileşimleri yoluyla alt kapak kayması ile manyetik boncuk arasına bağlanır (Şekil 3B).
  3. Manyetik cımbızda bir akış hücresi kurun
    1. Akış hücresini %70 etanol ile temizleyin ve lens dokusu kullanarak yüzeyi kurulayın. Temizlenmiş akış hücresini alt numune tutucuya yerleştirin ve üst numune rafını bir tornavida kullanarak nazikçe monte edin.
    2. Akış hücresinin alt yüzeyine, objektif mercekle hizalandığı yere bir damla mercek yağı sürün. Ardından, numune tutucuyu objektif merceğin üzerine yerleştirin ve bir tornavida kullanarak sabitleyin.
    3. Dikey konfigürasyonda düzenlenmiş bir çift 5 mm kübik mıknatıs seçin. Görüntüleme için mıknatıs tutucuyu manyetik cımbızın ışık yolunun X ekseni ile hizalayın.
      NOT: Bu kritik bir adımdır. Manyetik alanın yönü hizalanır ve böylece mıknatıs tutucunun yönü ile belirlenir.
    4. Grafik programlama yazılımını başlatın ve manyetik cımbız için denetleyicileri bağlayın. Akış hücresinin altındaki bir referans boncuğu bulmak için görüş alanını ayarlayın ve referans boncuğu net kırınım halkaları gösterecek şekilde objektif merceğini hafifçe ayarlayın.
    5. Mıknatısları akış hücresinin üst kısmına doğru hareket ettirin.
      NOT: Bu kritik bir adımdır. Boncuk kırınım modelindeki ani değişiklikler, mıknatısların akış hücresinin yüzeyine yeni temas ettiğini gösterir. Bu konum, ölçüm sıfır noktası için ofset olarak kabul edilir.
      NOT: Mıknatısları dikkatlice indirin, daha büyük adımlarla başlayın ve yavaş yavaş daha küçük adımlara geçin. Akış hücresine yaklaşırken akış hücresine zarar vermemek için 0,1 mm'lik artışlarla hareket edin.
    6. Mıknatısları en yüksek konumlarına kaldırın ve mıknatıs tutucuyu çıkarın.
    7. Atık şişesine bağlı peristaltik pompayı açın ve sıvıyı atın. Girişe 100 μL çalışma tamponu ekleyin ve akış hücresini tamponla doldurmak için peristaltik pompa akış hızını 100 μL/dk'ya ayarlayın.

5. Tek moleküllü manyetik cımbız kullanılarak bir telomer ölçümü

  1. Kamerayı ayarlayın.
    1. Parlaklık ayarıyla tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) kameranın gri tonlamasını 150 seviyeye ayarlayın.
    2. İlgilenilen bölgenin boyutunu (ROI) tanımlayın.
    3. Kare hızını 5000 μs pozlama süresiyle 200 Hz'e ayarlayın.
      NOT: Bu kritik bir adımdır. Deklanşör ölü süresinin sıfıra ayarlandığından emin olun.
    4. Mıknatıs konumunu 3 cm'ye (yaklaşık 8 pN) getirin ve boncuklar üzerindeki objektif odağını ayarlayın.
  2. Arama tablosunu (LUT) oluşturun.
    1. DNA'ya bağlı manyetik boncuğu sıkıca germek için mıknatısları 8 pN'ye karşılık gelen bir konuma getirin.
    2. LUT'u 0,05 μm'lik bir adım boyutuyla 200 adıma ayarlayın.
    3. LUT'u oluşturmak için farklı konumlardaki manyetik boncukların profillerini yakalamak için bir CMOS kamera kullanın.
      NOT: Bu kritik bir adımdır. Akış hücresine sabitlenen polistiren boncuklar, ilgilenilen boncuklar için kaymayı ortadan kaldırmak için referans boncuklar olarak işlev görür.
  3. Tek moleküllü bir mekanik deney tasarlayın.
    1. Kuvvet rampası veya kuvvet atlama tahlilleri için motor hareketlerini kontrol etmek için MATLAB'da bir komut dosyası yazın.
      NOT: Bu kritik bir adımdır. Bu komut dosyası, mıknatıs hareketleri için komutları kodlar. Kuvvet yükleme hızı, bir kuvvet rampası tahlili için bu adımda ayarlanır. Kuvvet sıçrama deneylerinin seviyeleri ve süreleri de burada belirlenir (Şekil 4, Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3).
    2. Tek moleküllü deneyleri test etmek için komut dosyasını grafik programlama yazılımına aktarın.
    3. Tek moleküllü deneyi çalıştırmak için gereken toplam kareleri kontrol edin ve kullanılabilir belleğin bu gereksinimi aştığından emin olun.
      NOT: Verilerin kaydedilmesi zaman aldığından, ayrılan bellek gerekenden daha azsa veriler kaybolacaktır.
    4. Aynı anda izlenebilecek maksimum boncuk sayısını belirlemek için maksimum görüntüleme hızını doğrulayın.
      NOT: Görüntüleme hızı sınırı aşılırsa deney sonlandırılır.
    5. Örnek olarak bir kuvvet sıçrama testi kullanarak, tek moleküllü mekanik deneyi çalıştırın. Manyetik boncuğa aniden kuvvetler uygulanır, bu da bu kuvvetleri DNA molekülüne iletir ve hemen yukarı doğru gerer.

6. Manyetik cımbız kullanılarak bir telomer üzerinde TRF1/2 ölçümleri

  1. Kuvvet rampası tahlili
    1. Örnek olarak TRF1'i kullanarak, 200 μL 10 nM TRF1'i akış hücresine yavaş bir akış hızında (örn., 30 μL/dak) yükleyin. TRF1'in telomerik DNA'ya bağlanması için 30 dakika bekleyin.
    2. ±1 pN/sn kuvvet yükleme hızına sahip bir kuvvet rampası deneyi için bir komut dosyası seçin.
    3. Veri dosyalarını uygun şekilde adlandırın ve denemeyi çalıştırın. Veriler, analiz için belirtilen hedefe kaydedilecektir (Şekil 5).
      NOT: Bu deney sırasında, kuvvet 0 pN ile 17 pN arasında doğrusal olarak arttırılır ve azaltılır, bu da telomerik DNA'yı gerer ve gevşetir ve TRF1/2'nin aracılık ettiği DNA döngülerini kırar.
  2. Kuvvet Atlama testi
    1. Kuvvet atlama tahlili çalıştırmak için bir komut dosyası seçin.
      NOT: Telomerik DNA'yı germek için çeşitli kuvvetler uygulanır, örneğin, 0 s boyunca 40 pN'de "Dinlenme kuvveti" (Frest), 2 s için 8-60 pN arasında değişen "Test kuvveti" (Ftest), "Yüksek kuvvet" (Fhigh) 30 s için 10 pN'de ve "Maksimum kuvvet" (Fmax) 30 s boyunca 20 pN'de.
    2. Veri dosyalarını uygun şekilde adlandırın ve denemeyi çalıştırın. Veriler, analiz için belirtilen hedefe kaydedilecektir (Şekil 5).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1A, prokaryotik hücrelerde eksprese edilebilen sırasıyla 439 ve 542 amino asitten oluşan TRF1 ve TRF2'nin şematik alanlarını ve yapılarını göstermektedir. TRF1'in hazırlanması daha önce literatürdetanımlanmıştır 41. Burada, TRF2'nin hazırlanmasının kapsamlı bir tanımını ve temsili sonuçlarını sunuyoruz. Şekil 1B, E. coli'de TRF2'yi eksprese etmek için kullanılan plazmid haritasını göstermektedir. Şekil 1B'de gösterildiği gibi E. coli'de indüksiyondan önce ve sonra TRF2 ekspresyonunu değerlendirdik. Saflaştırma ve etiket bölünme süreçleri de SDS-PAGE kullanılarak analiz edildi (Şekil 1C). Bu protokolü takiben, her iki telomerik bağlayıcı protein, TRF1 ve TRF2, E. coli'de başarılı bir şekilde eksprese edildi.

Telomerik DNA, terminal kısıtlama fragmanları (TRF'ler) şeklinde, dört kısıtlama enziminin bir kombinasyonu kullanılarak insan genomlarından üretilir. Şekil 2A'da gösterilen akış şemasını takiben, insan hücrelerinden genomlar çıkardık. Enzimler, tam uzunluktaki telomerik DNA'yı bozulmadan bırakırken genomik DNA'yı seçici olarak sindirir, böylece tek moleküllü tahliller için materyal sağlar. TRF DNA preparatını çeşitli insan hücre dizileri kullanarak kapsamlı bir şekilde test ettik. Genomik DNA'nın bütünlüğü, Şekil 2B'de gösterildiği gibi agaroz jel elektroforezi kullanılarak incelendi. TRF'ler daha sonra, başka bir yerde açıklanan bir yöntem izlenerek, telomerik tekrar dizisi TTAGGG'ye (Şekil 2C) tamamlayıcı olarak floresan etiketli oligonükleotidler kullanılarak Güney lekeleme ile analiz edildi41,56. Ortalama olarak, insan TRF'lerinin uzunluğu birkaç kilobaz civarındadır.

Tek moleküllü tahliller, Şekil 3A'da tarif edildiği gibi bir araya getirilmiş bir akış hücresinde gerçekleşir. Bir nitroselüloz kaplama, negatif yüklü cam yüzeyi kaplayarak antikor adsorpsiyonu için hidrofilik bir matris sağlar. BSA pasivasyonu, nitroselüloz matrisinin anti-digoksigenin antikorları tarafından bağlanmayan alanlarını bloke eder. Demir nanopartikülleri içermeyen polistiren boncuklar, referans boncuk görevi görür. TRF bağları, nitroselüloz matris üzerindeki digoksigenin-antikor ile manyetik boncuk yüzeyindeki biyotin-streptavidin arasındaki afinite etkileşimleri yoluyla oluşturulur (Şekil 3B). TRF1 veya TRF2, serbest difüzyon yoluyla TRF DNA bağlarına bağlanarak akış hücresine sokulur. Manyetik cımbız, manyetik alanı modüle etmek, TRF bağlarını germek ve gevşetmek için manyetik boncuklar üzerinde kuvvetler oluşturmak ve böylece protein-DNA etkileşimlerinin araştırılmasını sağlamak için kullanılır.

Tek moleküllü bir mekanik tahlil, manyetik cımbız motorlarının hareketlerini kontrol etmek için bir senaryo geliştirilerek tasarlanmıştır. Bir akış şeması, manyetik cımbız kullanan tek moleküllü bir test için MatLab'da bu komut dosyasını oluşturmak için yapılandırılmış bir yaklaşım sağlar (Şekil 4A). Mıknatıslar, z ekseni boyunca 0-25 mm aralığında hareket eder. Kuvvetler, literatürde54 açıklanan denklemler kullanılarak, mıknatıs konfigürasyonuna göre mıknatıs konumlarına göre hesaplanır. Belirli bir kuvvet yükleme hızı için, mıknatıs konumları ve hareket hızları, kuvvet rampası tahlili örneğinde gösterildiği gibi, istenen kuvvet manipülasyon profilini elde etmek için MatLab'da tasarlanır ve programlanır (Şekil 4B-D).

Örnek olarak TRF1'i kullanarak, tek moleküllü manyetik cımbız ile telomerik DNA-protein etkileşimlerini araştırdık. Deney düzeneği, Şekil 5A'da gösterildiği gibi, kuvvet-uzama eğrilerinin, protein-DNA etkileşimlerinin kırılması ve gevşeme sırasında düzgün izler nedeniyle gerilme sırasında zikzak özellikler sergilediği ve protein aracılı döngüler olmadan DNA lifini yansıttığı bir kuvvet-rampa tahlili olarak yapılandırılabilir. Kurulum, Şekil 5B,C'de gösterildiği gibi, belirli kuvvetler altında genişlemedeki değişiklikleri ve protein-DNA etkileşimlerinin sürelerini ölçmemize izin veren bir kuvvet atlama testi olarak da yapılandırılabilir. Telomerik DNA-protein komplekslerinin ayrışma kinetiği bu ölçümlerden türetilebilir (Şekil 5D). Ek olarak, DNA-protein komplekslerindeki döngülerin oluşumu, uzantıdaki değişikliklerle ortaya çıkarılabilir (Şekil 5E). Ayrıca, protein konsantrasyonu bu telomerik DNA deney düzeneği içinde titre edilebilir. Ayrıca, insan hücrelerinden gelen telomerik DNA'nın uzunluk heterojenliği, çeşitli uzunluklardaki telomerlerdeki döngü oluşum mekanizmasını araştırmamıza izin verir (Şekil 6).

figure-results-1
Şekil 1: TRF1/2'nin ekspresyonu ve saflaştırılması. (A) TRF1 ve TRF2'nin etki alanı mimarisi. (B) E. coli'de TRF2'yi eksprese etmek için pET28a-SUMO-TRF2'nin plazmid haritası. (C) İfade ve saflaştırmanın çeşitli aşamalarında elde edilen numunelerin SDS-PAGE analizi. Şerit 1: IPTG tarafından indüklenmemiş. Şerit 2: Hücre lizizi ile elde edilen IPTG kaynaklı çökelti. Şerit 3: Hücre lizizinden sonra elde edilen IPTG kaynaklı süpernatant. Şerit 4: Ni sütunundan geçin. Şerit 5: Safsızlık proteinlerini çıkarmak için düşük imidazol tamponu ile yıkayın. Şerit 6: 300 mM imidazol içeren tampon ile 6xHis-SUMO-TRF2'nin elüsyonu. Şerit 7: SUMO etiketlerinin SUMO proteaz enzimi tarafından sindirilmesi. Şerit 8: Ni sütunu ile yeniden saflaştırma ve 20 mM imidazol içeren tampon ile TRF2'nin elüsyonu (6xHis ve SUMO etiketleri kaldırıldı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Terminal kısıtlama fragmanlarının (TRF) hazırlanması . (A) İnsan hücrelerinden TRF'lerin hazırlanması için akış şeması. (B) 5 insan hücre hattı için% 1 agaroz jel kullanılarak genomik DNA bütünlüğünün incelenmesi. (C) 5 insan hücre hattı için Southern blotting ile gerçekleştirilen TRF analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Tek moleküllü mekanik tahlillerin hazırlanması. (A) Tek moleküllü mekanik tahliller için bir akış hücresinin hazırlanmasını gösteren akış şeması. (B) Manyetik cımbız kullanılarak tek moleküllü mekanik tahlillerin şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Tek moleküllü bir mekanik tahlilin tasarımı. (A) Bir kuvvet rampası tahlili yürütmek için bir komut dosyası oluşturmak için akış şeması. (B) Mıknatısların z ekseni boyunca hareket profili. (C) Mıknatıs hareketine karşılık gelen kuvvet profili. (D) Mıknatıs konumları ile ortaya çıkan kuvvetler arasındaki korelasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Tek moleküllü manyetik cımbızla incelenen telomerik DNA-protein etkileşimleri. (A) TRF1-telomer etkileşimleri, 23 ° C'de 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA ve 100 mM NaCl içeren bir tamponda kuvvet-rampa deneylerinde (N = 10) araştırıldı. TRF1'in konsantrasyonu 10 nM idi ve ±1 pN/s'lik bir kuvvet yükleme hızı vardı. (B) TRF bağı, kuvvet atlama deneylerinde gerildi ve gevşetildi. Uygulanan kuvvet protokolü Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN ve Fmax = 20 pN idi. Tampon ve sıcaklık koşulları (A)'daki ile aynıydı. Kare hızı = 200 Hz. (C) TRF1-telomer etkileşimleri, 10 nM'lik bir TRF1 konsantrasyonu ile kuvvet atlama deneylerinde incelendi. (D) TRF1-telomer komplekslerinin ayrışma kinetiği. Test edilen kuvvetlerde ayrışma hızının logaritması (Ortalama ± SD, n = 206) Kramer-Bell-Evans modelini (kırmızı eğri ve efsane denklemi) takip eder. Ek, Ftest'te ortalama ayrışma süresini (<τ>) gösterir. (E) TRF1-telomer komplekslerinin yırtılma olayları üzerine uzamadaki (ΔL) değişikliklerin dağılımı. Siyah ve kırmızı eğriler Gauss bağlantı parçalarını temsil eder. Bu rakam Li ve ark.41'in izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Bir telomerde TRF1 tarafından oluşturulan DNA halkalarının sayısı ve boyutları. (A) [TRF1] = 20 nM'de DNA döngü boyutlarının (ΔL) telomer uzunluğu bağımlılığı. Eğriler Gauss bağlantı parçalarını temsil eder. (B) [TRF1] = 40 nM'de ΔL'nin telomer uzunluğu bağımlılığı. (C) ΔL ile telomer başına kopma olaylarının sayısı arasındaki korelasyon, N. Sıfır dereceli korelasyon r = -0.20, p < 0.001'dir (örneklem büyüklüğü = 1496). (D) ΔL ve N arasındaki negatif korelasyonu açıklayan olası bir mekanizmayı gösteren ve TRF1'in birincil döngü alanlarına sahip tek bir telomeri yüksek dereceli bir topolojiye sıkıştırabileceğini öne süren bir karikatür. Bu rakam Li ve ark.41'in izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Komut dosyaları oluşturmak için MatLab kodu.m Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Sabit kuvvet assay.txt için komut dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Kuvvet rampası assay.txt için komut dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Tarifler Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, TRF'lerin tek molekül seviyesi57,58,59'da manipülasyonu için manyetik cımbız kullanır. TRF'leri genomik DNA parçalarından ayırmak için manyetik boncuklar kullanıyoruz. Kısıtlama sindirimini takiben, TRF'ler manyetik boncuklara bağlanarak genomik DNA parçalarından kolayca ayrılmalarını sağlar. Bu yaklaşım, şeffaflık sorunlarıyla sınırlı optik cımbızların aksine, manyetik boncukları etkili bir şekilde yakalayabilen manyetik cımbız kullanılarak manipülasyona izin verir. Ayrıca, AFM tek moleküllü manipülasyon için kullanılabilirken, TRF'leri manyetik boncuklardan ayırmak ve bunları bir mika yüzeyi ile bir konsol ucu arasında hareketsiz hale getirmek için ek adımlar gereklidir. Buna karşılık, manyetik cımbız, TRF'lerin tek moleküllü manipülasyonu için daha basit ve verimli bir yöntem sunarak bu ekstra adımlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır41.

Genomik DNA ve TRF'lerin bütünlüğünün korunması çok önemlidir, çünkü tek moleküllü manipülasyon sağlam TRF'lere bağlıdır. Manyetik cımbız kullanarak, protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için iki ucunu tutarak TRF'leri gerer ve gevşetiriz. Manyetik boncuklar üzerinde doğru kuvvet ölçümü, tek moleküllü mekanik tahliller54 için esastır. Bu nedenle, kübik şekilli mıknatıslar, manyetik cımbızda kameranın ışık yoluna paralel veya ortogonal olarak hizalanmalıdır (adım 4.3.3'ün altındaki NOT), bu da belirlenen denklemlere54,60 göre hassas üç boyutlu boncuk konumu kaydı sağlar. Mıknatıs ofseti, konumlarını ve manyetik boncuklar üzerinde ortaya çıkan kuvvetleri belirlemek için çok önemlidir. Tutarlılık için yaklaşık 0,2 mm kalınlığında #2 kapak camı kullanıyoruz veya farklı kapak camları54 için denklemdeki ofseti ayarlıyoruz. Kare hızı, protein-DNA etkileşimlerinin dinamiklerini yakalamak için hayati önem taşır ve tam boncuk hareketi verileri için sıfır deklanşör ölü süresi gerektirir. Bir senaryo ile kodlanan motor hareketleri, tek moleküllü mekanik tahlillerin tasarlanmasında merkezi bir rol oynar. Kuvvet yükleme hızı, kuvvetler ve süreler gibi kritik parametreler yinelemeli olarak ayarlanmalı ve optimize edilmelidir. Tek moleküllü tahlillerde kullanılan protein konsantrasyonları, protein-DNA etkileşimlerini incelemek için en uygun seviyeyi belirlemek için kapsamlı titrasyon gerektirir. İlk kuvvet testi, kuvvet spektroskopisi ile kuvvet rampası deneyleri kullanılarak gerçekleştirilebilirken, kuvvet atlama tahlilleri, ilgilenilen kuvvetleri sabit bir seviyede değerlendirir.

Bu protokolü uyarlarken birkaç zorlukla karşılaşılabilir. TRF1 veya TRF2, E. coli'de eksprese edilmezse, küçük ölçekli bir deneme ile başlayın, hücreleri parçalayın ve proteinleri SDS-PAGE ve boyama yoluyla analiz edin, etikete özgü antikorlar kullanarak Western Blot ile onaylayın. Mutasyonlar, çerçeve kaymaları veya erken durdurma kodonları olmadan doğru klonlamayı sağlamak için yapı ve plazmid doğrulanmalı ve E. coli için promotör uygunluğu kontrol edilmelidir. İfade, farklı E. coli suşları (örneğin, BL21 (DE3), Rosetta), büyüme sıcaklığının (15-25 ° C), indüksiyon süresinin (2-16 saat) ve IPTG konsantrasyonunun (0.1-1 mM) ayarlanmasıyla optimize edilmelidir. İnklüzyon cisimleri, sonikasyondan önce ve sonra hücre peletlerini analiz ederek ele alınmalıdır. Nadir tRNA'lar veya kodon optimizasyonu sağlayan suşlarla kodon yanlılığı ele alınmalıdır. Farklı büyüme ortamlarını (LB, TB, otomatik indüksiyon) deneyin ve çalkalama hızını ve kültür hacmini ayarlayarak havalandırmayı iyileştirin. Toksisite sorunları için, sıkı bir şekilde düzenlenmiş promotörler veya daha düşük kopya sayılı vektörler kullanın ve sızdıran lak promotör ekspresyonunu bastırmak için glikoz (% 0.2) ekleyin. Uygun antibiyotik seçimi ile plazmit bütünlüğünü koruyun ve hücre lizis yöntemini optimize ederek tam protein salınımını sağlayın 61,62.

Tek moleküllü tahlillerde TRF bağları bulunmazsa, bir olasılık yeterli başlangıç genomik DNA'sının kullanılmamış olmasıdır. Tek moleküllü bir mekanik tahlil oluşturmak için TRF'lerin 500 ng genomik DNA eşdeğeri kullanmayı deneyin. Manyetik cımbızda TRF bağlarının bulunmasıyla ilgili kalıcı sorunlar, genomik DNA'nın aşırı uzun sindirim sürelerinden kaynaklanıyor olabilir. Yıldız aktivitesini önlemek için sindirim prosedürünü 12 saatin altında tutun. Ek olarak, telomerik DNA'nın tek sarmallı çıkıntısında G-dörtlülerinin oluşumu, manyetik boncuklara bağlanmak için biyotin etiketli oligonükleotidlerin tavlanmasını engelleyebilir. Bunu önlemek için, G-dörtlü oluşumunu önlemek ve tek moleküllü kurulumda TRF bağları oluşturma olasılığını artırmak için potasyum veya sodyum iyonu konsantrasyonlarını 1 mM'nin altında tutun. Ek olarak, tavlama adımı (adım 3.2.5) sırasında ısıtma sıcaklığının arttırılması, G-dörtlülerinin kararsızlaştırılmasına yardımcı olur ve biyotin etiketli oligonükleotidlerin TRF'lere bağlanmasını kolaylaştırır.

TRF1 veya TRF2 proteinlerinin varlığında, TRF DNA bağları, bu proteinler için telomer üzerindeki bağlanma bölgelerinin bolluğu nedeniyle manyetik cımbızda sıkıca sıkıştırılabilir ve gerilmesi çok zor olabilir. Protein konsantrasyonlarının titre edilmesi, tek moleküllü mekanik tahliller için optimal seviyelerin belirlenmesine yardımcı olabilir. Protein-DNA bağlanma afinitesi, ayrışma sabitini (KD) belirlemek için EMSA veya SPR testleri kullanılarak değerlendirilebilir, bu da daha sonra tek moleküllü testler için uygun konsantrasyonları bildirebilir.

Genomik DNA'dan üretilen sınırlı miktarda TRF, tek moleküllü tahlillerin verimliliğini engelleyebilir. Sonuç olarak, tek moleküllü verilerin toplanması, yapay olarak sentezlenmiş telomerik DNA yapılarının kullanılmasına kıyasla daha uzun zaman alabilir. Bununla birlikte, doğrudan insan genomundan elde edilen telomerlerin kullanılması, bakteri veya PCR yöntemlerinde yaygın olarak plazmit tarafından hazırlanan yapay telomerik DNA'nın sunamayacağı çeşitli avantajlar sağlar. Bir avantaj, insan TRF'lerinin uzunluk olarak heterojen olması ve protein-DNA etkileşimlerinde telomer uzunluğu bağımlılığının incelenmesine izin vermesidir. Buna karşılık, yapay telomerik DNA genellikle uzunluk olarak tekdüzedir ve çeşitli uzunluklarda yapay telomerik DNA üretmek zaman alıcı ve emek yoğun olacaktır. Ek olarak, insan TRF'leri, modifikasyonlar, mutasyonlar ve hasarlar gibi doğal belirteçler dahil olmak üzere hücrelerden orijinal diziler içerir. Bu, yapay telomerik DNA ile mümkün olmayan fizyolojik veya patolojik koşullar altında protein-DNA etkileşimlerinin araştırılmasına izin verir.

Bu protokol, tek molekül düzeyinde telomer biyolojisi alanındaki çalışmalar için gereklidir ve potansiyel olarak telomer hedefli ilaç keşfine fayda sağlayabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarlar veya diğer çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [Z.Y.'ye 32071227 Hibe Başvurusu], Çin Tianjin Belediye Doğa Bilimleri Vakfı (22JCYBJC01070 - ZY) ve Hassas Ölçüm Teknolojisi ve Aletleri Devlet Anahtar Laboratuvarı (Tianjin Üniversitesi) tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-DigoxigeninRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS kamera MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA ekstraksiyon çözeltisiG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnaz İçermeyen, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP karışımıNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270 ve nbsp; boncuklarThermo Fisher Scientific65305Streptavidin boncuklar
Dynabeads MyOne boncuklar ThermoFisher Scientific65001Streptavidin boncuklar
EtanolTianjin No.6 Kimyasal Reaktif Fabrikası1083
GliserolPekin Hwrkchemical ve Tic. Ltd. Şti. LtdSMG66258-1
İmidazolSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
İzopropanolTianjin No.6 Kimyasal Reaktif FabrikasıA1079
KanamisinThermo Fisher ScientificEN0523
Klenow parçası (3 & prime; -5 & prime; exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlGrafik programlama yazılımı 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LizozimSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClŞangay AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher BilimselSpektrofotometre
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Boncuk 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co., LtdSA005025
Nitroselüloz membranABklonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinaz KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart TamponNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Sodyum asetatSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteazBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human telomere biology: A contributory and interactive factor in aging, disease risks, and protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  2. Li, N., et al. The dynamics of forming a triplex in an artificial telomere inferred by DNA mechanics. Nucleic Acids Res. 47 (15), e86(2019).
  3. Yu, Z., et al. Click chemistry assisted single-molecule fingerprinting reveals a 3d biomolecular folding funnel. J Am Chem Soc. 134 (30), 12338-12341 (2012).
  4. Karimian, K., et al. Human telomere length is chromosome end-specific and conserved across individuals. Science. 384 (6695), 533-539 (2024).
  5. Maciejowski, J., De Lange, T. Telomeres in cancer: Tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (3), 175-186 (2017).
  6. Kinzig, C. G., Zakusilo, G., Takai, K. K., Myler, L. R., De Lange, T. Atr blocks telomerase from converting DNA breaks into telomeres. Science. 383 (6684), 763-770 (2024).
  7. Takai, H., Aria, V., Borges, P., Yeeles, J. T. P., De Lange, T. Cst-polymerase α-primase solves a second telomere end-replication problem. Nature. 627 (8004), 664-670 (2024).
  8. De Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
  9. De Lange, T. Shelterin-mediated telomere protection. Annual Review of Genetics. 52 (1), 223-247 (2018).
  10. Liu, B., et al. Structure of active human telomerase with telomere shelterin protein TPP1. Nature. 604 (7906), 578-583 (2022).
  11. Sfeir, A., De Lange, T. Removal of shelterin reveals the telomere end-protection problem. Science. 336 (6081), 593-597 (2012).
  12. Sarek, G., et al. Cdk phosphorylation of trf2 controls t-loop dynamics during the cell cycle. Nature. 575 (7783), 523-527 (2019).
  13. Myler, L. R., et al. DNA-PK and the TRF2 IDDR inhibit MRN-initiated resection at leading-end telomeres. Nat Struct Mol Biol. 30 (9), 1346-1356 (2023).
  14. Hanaoka, S., Nagadoi, A., Nishimura, Y. Comparison between TRF2 and TRF1 of their telomeric DNA-bound structures and DNA-binding activities. Protein Sci. 14 (1), 119-130 (2005).
  15. Chen, Y., et al. A shared docking motif in TRF1 and TRF2 used for differential recruitment of telomeric proteins. Science. 319 (5866), 1092-1096 (2008).
  16. Wan, B., et al. SLX4 assembles a telomere maintenance toolkit by bridging multiple endonucleases with telomeres. Cell Reports. 4 (5), 861-869 (2013).
  17. Rai, R., et al. NBS1 phosphorylation status dictates repair choice of dysfunctional telomeres. Molecular Cell. 65 (5), 801-817.e4 (2017).
  18. Benarroch-Popivker, D., et al. Trf2-mediated control of telomere DNA topology as a mechanism for chromosome-end protection. Mol Cell. 61 (2), 274-286 (2016).
  19. Poulet, A., et al. The n-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 40 (6), 2566-2576 (2012).
  20. Schmutz, I., Timashev, L., Xie, W., Patel, D. J., De Lange, T. TRF2 binds branched DNA to safeguard telomere integrity. Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 734-742 (2017).
  21. Doksani, Y., Wu, J. Y., De Lange, T., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence imaging of telomeres reveals TRF2-dependent t-loop formation. Cell. 155 (2), 345-356 (2013).
  22. Di Maro, S., et al. Shading the TRF2 recruiting function: A new horizon in drug development. J Am Chem Soc. 136 (48), 16708-16711 (2014).
  23. Gao, J., Pickett, H. A. Targeting telomeres: Advances in telomere maintenance mechanism-specific cancer therapies. Nat Rev Cancer. 22 (9), 515-532 (2022).
  24. Bejarano, L., et al. Inhibition of TRF1 telomere protein impairs tumor initiation and progression in glioblastoma mouse models and patient-derived xenografts. Cancer Cell. 32 (5), 590-607.e4 (2017).
  25. Chen, X., et al. Cyclic peptidic mimetics of apollo peptides targeting telomeric repeat binding factor 2 (TRF2) and apollo interaction. ACS Med Chem Lett. 9 (5), 507-511 (2018).
  26. Erdel, F., et al. Telomere recognition and assembly mechanism of mammalian shelterin. Cell Rep. 18 (1), 41-53 (2017).
  27. Pendlebury, D. F., et al. Dissecting the telomere-inner nuclear membrane interface formed in meiosis. Nat Struct Mol Biol. 24 (12), 1064-1072 (2017).
  28. Court, R., Chapman, L., Fairall, L., Rhodes, D. How the human telomeric proteins trf1 and trf2 recognize telomeric DNA: A view from high-resolution crystal structures. EMBO Rep. 6 (1), 39-45 (2005).
  29. Hu, H., et al. Structural basis of telomeric nucleosome recognition by shelterin factor trf1. Sci Adv. 9 (34), eadi4148(2023).
  30. Nurk, S., et al. The complete sequence of a human genome. Science. 376 (6588), 44-53 (2022).
  31. Rhie, A., et al. The complete sequence of a human y chromosome. Nature. 621 (7978), 344-354 (2023).
  32. Chang, T. R., Long, X., Shastry, S., Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule mechanical analysis of strand invasion in human telomere DNA. Biochemistry. 61 (15), 1554-1560 (2022).
  33. Kaur, P., et al. TIN2 is an architectural protein that facilitates TRF2-mediated trans- and cis-interactions on telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 49 (22), 13000-13018 (2021).
  34. Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule studies of telomeres and telomerase. Annu Rev Biophys. 46, 357-377 (2017).
  35. Zhao, X., et al. Exploring TRF2-dependent DNA distortion through single-DNA manipulation studies. Commun Biol. 7 (1), 148(2024).
  36. Patrick, E. M., Slivka, J. D., Payne, B., Comstock, M. J., Schmidt, J. C. Observation of processive telomerase catalysis using high-resolution optical tweezers. Nat Chem Biol. 16 (7), 801-809 (2020).
  37. Soman, A., et al. Columnar structure of human telomeric chromatin. Nature. 609 (7929), 1048-1055 (2022).
  38. Jansson, L. I., et al. Telomere DNA G-quadruplex folding within actively extending human telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (19), 9350-9359 (2019).
  39. Soranno, A., et al. Shelterin components modulate nucleic acids condensation and phase separation in the context of telomeric DNA. J Mol Biol. 434 (16), 167685(2022).
  40. Wong, S. Y., et al. The shelterin component TRF2 mediates columnar stacking of human telomeric chromatin. EMBO J. 43 (1), 87-111 (2024).
  41. Li, X., et al. Dynamics of TRF1 organizing a single human telomere. Nucleic Acids Res. 49 (2), 760-775 (2021).
  42. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers. J Vis Exp. (127), e56328(2017).
  43. Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for the measurement of twist and torque. J Vis Exp. (87), e51503(2014).
  44. Ma, K., et al. A DNA force circuit for exploring protein-protein interactions at the single-molecule level. Chinese Journal of Chemistry. 42 (13), 1456-1464 (2024).
  45. LB liquid medium. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (9), (2016).
  46. LB agar plates. Cold Spring Harb Protoc. 2024 (4), (2024).
  47. HEPES buffer. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
  48. SDS-PAGE gel. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), (2015).
  49. 10x PBS. Cold Spring Harb Protoc. 2007 (4), (2007).
  50. TE buffer (1x). Cold Spring Harb Protoc. 2016 (5), (2016).
  51. Green, M. R., Sambrook, J. Buffers. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).
  52. Tris buffer (1 M, pH 7.5). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), (2011).
  53. EDTA. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  54. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Rev Sci Instrum. 85 (12), 123114(2014).
  55. Wang, Z., et al. Reading time and DNA sequence preference of TET3 CXXC domain revealed by single-molecule profiling. Chinese J Chem. 41 (10), 1177-1184 (2023).
  56. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  57. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: Calibration and applications for DNA dynamics. Biophys J. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  58. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophys J. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  59. Te Velthuis, A. J., Kerssemakers, J. W., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophys J. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  60. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Rev Sci Instrum. 85 (10), 103712(2014).
  61. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (11), (2021).
  62. Haneskog, L. Purification of histidine-tagged proteins using stepwise elution with imidazole. Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telomeric Protein DNAMagnetic TweezersSingle Molecule MethodsTRF2 PurificationTelomeric DNA PreparationShelterin ComplexForce Ramp AssayDNA Protein InteractionsDissociation KineticsSouthern Blotting

Related Articles