Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Tina Batista Napotnik; Bor Kos; Lea Rems

doi:10.3791/67257

Method Article

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

DOI:

10.3791/67257

⸱

September 6th, 2024

Tina Batista Napotnik¹ , Bor Kos¹ , Lea Rems¹

¹Faculty of Electrical Engineering, University of Ljubljana

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uyarılabilir hücrelerin tepkilerini in vitro olarak incelemek için protokol, genetik olarak tasarlanmış tet-on spiking HEK hücrelerinin basit bir uyarılabilir hücre modelinde elektroporasyona bağlı aksiyon potansiyeli üretimindeki değişikliklerin yanı sıra ilgili parametrelerin otomatik olarak çıkarılması ile transmembran voltajındaki değişikliklerin optik olarak izlenmesini açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronal ve kas hücreleri gibi uyarılabilir hücreler, hızla ortaya çıkan elektroporasyon bazlı tedavilerde birincil hedefler olabilir. Bununla birlikte, birincil hedef olmadıkları tedavilerde bile elektrik darbelerinden etkilenebilirler ve bu da olumsuz yan etkilere neden olabilir. Bu nedenle, uyarılabilir ve uyarılamayan dokuların elektroporasyona dayalı tedavilerini optimize etmek için, elektrik darbelerinin uyarılabilir hücreler, iyon kanalları ve in vitro uyarılabilirlik üzerindeki etkilerini incelemeye ihtiyaç vardır. Bu amaçla, genetik olarak tasarlanmış tet-on spiking HEK hücrelerinin basit bir uyarılabilir hücre modeli üzerinde elektroporasyona bağlı aksiyon potansiyeli oluşumundaki değişikliklerin optik olarak izlenmesi için bir protokol geliştirilmiştir. Floresan potansiyometrik boya kullanılarak, transmembran voltajındaki değişiklikler bir floresan mikroskobu altında izlendi ve hücre yanıtlarının ilgili parametreleri bir MATLAB uygulaması ile otomatik olarak çıkarıldı. Bu şekilde, farklı elektrik darbelerine karşı uyarılabilir hücre tepkileri ve uyarma ile elektroporasyon arasındaki etkileşim verimli bir şekilde değerlendirilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporasyonda, yüksek voltajlı elektrik darbeleri, aksi takdirde kötü bir şekilde kullanılan moleküller için plazma zarı geçirgenliğinde bir artışa neden olur¹. Elektroporasyona dayalı teknikler günümüzde tıp², biyoteknoloji³ ve gıda teknolojisi^4'teki uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

Nöronal ve kas hücreleri gibi uyarılabilir hücreler, kalp, beyin ve iskelet kaslarında hızla ortaya çıkan elektroporasyona dayalı tedavilerde birincil hedefler arasındadır⁵. Ayrıca, birincil hedef olmadıkları tedavilerde bile elektrik darbelerinden etkilenebilirler ve bu da ağrı, kas seğirmesi ve sinir hasarı gibi olumsuz yan etkilere neden olabilir⁶. Yani, elektrik darbeleri, uyarılabilir hücrelerin elektriksel uyarılmasına neden olabilir: voltaj kapılı iyon kanallarını aktive ederler ve aksiyon potansiyellerini (AP) tetiklerler. Bununla birlikte, daha yüksek elektrik alanlarında, hücrelerin plazma zarı geçirgen hale gelir ve gözeneklerden/kusurlardan ek iyonik akım meydana gelir⁷. Bu ek iyonik akım, uyarma ve elektroporasyon arasındaki karmaşık bir etkileşimde hücre uyarılabilirliğini etkiler. Bu nedenle, uyarılabilir ve uyarılamayan dokuların elektroporasyona dayalı tedavilerini optimize etmek için, elektrik darbelerinin uyarılabilir hücreler, iyon kanalları ve in vitro uyarılabilirlik üzerindeki etkilerini incelemeye ihtiyaç vardır.

Yakın tarihli bir çalışmada⁸, Cohen ve ark.9,10 tarafından geliştirilen genetik olarak tasarlanmış insan embriyonik böbrek (HEK) hücrelerini, uyarılabilir hücrelerde elektroporasyonu incelemek için değerli bir araç olarak araştırdık. Aksi takdirde uyarılamayan bu hücrelerde, uyarılabilirlik için gerekli olan sodyum ve potasyum kanallarının (Na_V1.5 ve K_ir2.1) minimal bir tamamlayıcısı eksprese edilir. Bu hücrelerde K_ir2.1'in ekspresyonu, iki hücre varyantının oluşturulmasına izin veren bir doksisiklin kaynaklı tet-on sistemi tarafından kontrol edilir: uyarılabilir sivri uçlu S-HEK (Na_V1.5 ve K_ir2.1 içeren) ve uyarılamayan sivri uçlu olmayan NS-HEK hücreleri (sadece Na_V1.5 kanalları içeren). Bu, elektrik darbelerinin aynı tip hücrelerin uyarılabilir ve uyarılamaz varyantları üzerindeki etkilerini karşılaştırmamızı sağlar. İzole edilmiş birincil uyarılabilir hücreler, embriyonik veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden farklılaşan uyarılabilir hücreler ve uyarılabilir dokulardan türetilen hücre dizileri ile karşılaştırıldığında, S-HEK hücrelerinin çeşitli avantajları vardır: kullanımları, yetiştirilmeleri ve çoğaltılmaları kolaydır, iyi tanımlanmış sodyum ve potasyum kanallarına sahiptirler ve sağlam AP'ler üretirler⁸.

Floresan potansiyometrik boya kullanarak farklı genliklerdeki elektrik darbeleri tarafından tetiklenen transmembran voltajındaki (TMV) değişiklikleri izlemek için bir protokol tasarladık. Bu şekilde, elektroporasyonun S-HEK hücrelerinde AP oluşumunu ve hem S-HEK hem de NS-HEK hücrelerinde TMV'deki diğer değişiklikleri nasıl etkilediğini inceleyebiliriz. Kısaca, S-HEK veya NS-HEK hücreleri her 2 dakikada bir 100 μs'lik tek bir elektrik darbesine maruz bırakılır ve floresandaki nispi değişiklikler her darbe uygulamasının etrafında yaklaşık 3 saniye boyunca kaydedilir. Uygulanan darbeler artan voltaja sahiptir, önce hücrelerde AP'leri tetikler ve daha yüksek bir elektrik alanında elektroporasyona neden olur. Darbe uygulaması arasındaki 2 dakikalık aralık, ardışık darbelerin olası kümülatif etkilerini en aza indirmek ve deneyleri hücreleri bozmayacak kadar kısa tutmak için seçildi. Görüntü işleme, potansiyometrik boyanın floresan tepkilerinin ilgili parametrelerini çıkarmak için özel bir MATLAB uygulaması ile otomatikleştirildi, böylece S-HEK ve NS-HEK hücrelerinde TMV'deki değişiklikler (AP'ler ve elektroporasyona bağlı sürekli depolarizasyon) değerlendirildi.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Reaktiflerin ve hücre kültürünün hazırlanması

Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın Orta-yüksek glikozunu %10 fetal sığır serumu, 2 mM glutamin, penisilin-streptomisin (penisilin 100 U/mL, streptomisin 100 μg/mL), 2 μg/mL puromisin, 5 μg/mL blastisidin ve 200 μg/mL genetizle.
137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 ve 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4 ilefosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi hazırlayın. 0,22 μm gözenek boyutuna sahip bir sterilizasyon membran filtresinden süzün.
2 mM KCl, 125 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 30 mM glikoz, pH 7.3 ile Tyrode çözeltisi hazırlayın. 0.5 mM KCl, 126.5 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 30 mM glikoz, pH 7.3 ile düşük potasyumlu Tiroz çözeltisi hazırlayın. Her iki çözeltiyi de 0,22 μm gözenek boyutuna sahip bir sterilizasyon membran filtresinden süzün.
5 mg poli-L-lizin içeren bir şişeye 5 mL PBS ekleyerek 1 mg / mL poli-L-lizin stok çözeltisi hazırlayın.
Damıtılmış suda 2 mg / mL doksisiklin stok çözeltisi hazırlayın ve 0.22 μm gözenek boyutuna sahip bir sterilizasyon membran filtresinden süzün.
Saf etanol içinde 4 mM potansiyometrik boya ElectroFluor630 stok çözeltisi hazırlayın (100 nM - 73 μg boya içeren tüpe 25 μL saf etanol ekleyin).
Daha önce tarif edildiği gibi 6 mL hücre kültürü ortamında bir T25 şişesinde genetik olarak tasarlanmış HEK hücrelerinin kültürü:⁸. Kültür ortamının bileşenleri ışığa duyarlıdır; Bu nedenle, ortamı ışıktan koruyun (orta şişeyi alüminyum folyoya sarın) ve düşük ışık koşullarında pasaj gerçekleştirin.
3 x 10⁵ veya 5 x 10⁵ hücreyi taze bir T25 şişesine tohumlayarak hücreleri her 3-4 günde bir geçirin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri, sürekli K_ir2.1 ekspresyonunu tolere etmedikleri için doksisiklin ilavesi olmadan uyarılamayan NS-HEK hücreleri olarak bir ana şişede tutun. Deneylerde 14'ten daha düşük pasajlardan hücreler kullanın.

2. Numune hazırlama

Kapak cam haznesi slaytlarının poli-L-lizin kaplaması
1. 2 oyuklu kapaklı cam hazne slaytlarının bir kuyucuğuna 1 mL PBS pipetleyin, 10 μL steril 1 mg / mL poli-L-lizin çözeltisi ekleyin ve bir pipetle iyice karıştırın.
2. Laminer akış başlığında steril koşullarda oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe edin. PBS'yi daha fazla yıkamadan poli-L-lizin ile çıkarın.
Hücrelerin tohumlanması
1. 1.5 mL'lik bir tüpte bir kültür ortamında 1:10 oranında seyreltilmiş bir doksisiklin stok çözeltisi hazırlayın. Her kuyucuk için 30 μL 1:10 doksisiklin seyreltmesi gereklidir (3 μL doksisiklin stok çözeltisi ve 27 μL kültür ortamı), toplam deney kuyusu sayısına bağlı olarak nihai hacmi hazırlayın.
2. Kültür ortamını T25 şişesinden çıkarın ve hücreleri 2.5 mL Tripsin-EDTA çözeltisi ile bir CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de 2 dakika boyunca tripsinize edin.
3. 2,5 mL taze kültür ortamı ekleyin ve nazik pipetleme ile hücreleri yüzeyden ayırın. Hücre süspansiyonunu iyice karıştırın.
4. Hücreleri bir hemositometre ile sayın ve süspansiyondaki hücrelerin yoğunluğunu belirleyin.
5. Kültürü oluşturmak için gereken tripsinlenmiş hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın. 2 günlük kültür için 2.5 x 10⁵ hücre tohumlayın ve 3 günlük kültür için oyuk başına 1 x 10⁵ hücre tohumlayın. Gerekirse tam hücre sayısını ayarlayın.
6. Önceden hesaplanan hücre süspansiyon hacmini 1470 μL'den çıkararak kültür ortamının hacmini hesaplayın. Kalan 30 μL, 1:10 doksisiklin seyreltme hacmini temsil eder. Her bir oyuktaki toplam hacim 1500 μL (hücreler, doksisiklin ve kültür ortamı) olacaktır.
7. Uyarılabilir S-HEK hücreleri ile numuneler hazırlamak için, hesaplanan kültür ortamı hacmini ve tripsinizlenmiş hücre süspansiyonunu bir oyuğa pipetleyin ve 30 μL 1:10 doksisiklin seyreltmesi ekleyin. Deney uzun sürdüğü için (yaklaşık 40 dakika) iki kuyulu odalardan sadece bir kuyu kullanın. Hazneleri CO₂ inkübatörüne yerleştirmeden hemen önce nazikçe pipetleyerek iyice karıştırın.
8. Uyarılmayan NS-HEK hücreleri ile numuneler hazırlamak için, hesaplanan kültür ortamı hacmini bir kuyuya pipetleyin ve doksisiklin içermeyen S-HEK hücreleri için hesaplanan hücre süspansiyonu hacminin% 90'ını ekleyin. NS-HEK hücreleri, S-HEK hücrelerinden biraz daha hızlı büyür.
9. Deneyden 2-3 gün önce% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Doksisiklinli numuneler için bu inkübasyon süresi, hücreleri uyarılabilir hale getirmek için yeterlidir.
Hücrelerin etiketlenmesi
1. Deneyden önce, 3 μL potansiyometrik boya stok çözeltisini 1,5 mL'lik bir tüpe pipetleyin ve etanolün buharlaşmasını ve potansiyometrik boyanın kurumasını sağlamak için (yaklaşık 15 dakika) açık tüpü oda sıcaklığında laminer bir akış başlığında bırakın. Tüpe 997 μL soğuk kültür ortamı (4 ° C'deki bir buzdolabından) ekleyin ve boyayı 12 μM'lik bir nihai konsantrasyona çözün.
2. Kültür ortamını kuyudan çıkarın ve hücrelere 1 mL potansiyometrik boya çözeltisi ekleyin. 4 °C'de soğutun ve 20 dakika inkübe edin.
3. Potansiyometrik boya çözeltisini çıkarın ve daha fazla yeniden kullanım için tüpte saklayın (1 günde altı ardışık deneye kadar).
4. Hücreleri 3x Tyrode solüsyonu ile nazikçe yıkayın ve son yıkamadan sonra 1 mL düşük potasyumlu Tyrode solüsyonunu kuyuya pipetleyin.

3. Elektrostimülasyon ve elektroporasyon

Darbe üretecini tetikleyen mikroskop sisteminden gelen bir TTL sinyalini kullanarak darbe iletiminin görüntü alma ile senkronizasyonunu yapılandırın. Yüksek voltajlı darbelerin üretilmesi için, özel bir darbe üreteci¹¹ veya bir TTL sinyali ile harici olarak tetiklenebilen herhangi bir darbe üreteci kullanın.
NOT: Sunulan deneysel konfigürasyonda, hızlandırılmış bir alım sırasında önceden seçilmiş bir zamanda bir TTL sinyali gönderecek şekilde yapılandırılabilen görüntü alımı için LAS X yazılımı kullanılmıştır.
Haznenin dibine 0,8 mm çapında ve iç kenarları arasında 5 mm mesafe olan iki paralel Pt / Ir tel elektrot yerleştirin ve hazneyi mikroskop altında sabitleyin.
Elektrotları darbe üretecine bağlayın. Deney sırasında darbelerin doğru şekilde iletildiğini doğrulamak için bir voltaj ve bir akım probu kullanarak darbe üretecinin çıkışını bir osiloskopa bağlayın.
Hücreleri parlak alana odaklayın. Elektrotlar arasında kabaca ortada bulunan hücreleri görüntüleyin.
Floresan sinyalini tüm görüş alanına kaydeden 40x objektif ile hızlandırılmış modda floresan görüntülerin ilk çekimini başlatın. Kamera, bir aksiyon potansiyelinin net bir zaman seyrini elde edecek kadar hızlı olmalıdır (ideal olarak 25 kare/sn'den daha yüksek).
1. Aksiyon potansiyelinin gerçek zamanlı seyrini çözmek için en az 25 kare/sn ile hızlandırılmış modda 80 görüntü elde edin. Görüntü elde etmenin toplam süresi yaklaşık 3 saniye ile sonuçlanır. Görüntü elde etme sırasında, hücreleri 635 nm'lik bir uyarma dalga boyu, 10 ms'lik maruz kalma süresi ile aydınlatın ve emisyonu yaklaşık 700 nm'de tespit edin. Bu ilk edinimde, herhangi bir darbe uygulamayın - bu edinim, boya foto ağartma için sonraki alımları düzeltmek için kullanılacaktır. Bu alımdan sonra 2 dakika bekleyin.
  NOT: Bu deney 27,8 kare/sn, yani hızlandırılmış kayıtta ilk görüntü alımının başlangıcından bir sonraki görüntü alımının başlangıcına kadar geçen süre olan 36 ms'lik süre kullanır).
Her 2 dakikada bir, adım 3.5'teki gibi bir hızlandırılmış çekim kaydedin. Bu alımlar için, 10. görüntünün alınması sırasında (324 ms'de) tek bir 100 μs darbe uygulayın. Aşağıdaki darbe voltajlarına sahip görüntüler elde edin: 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V ve 200 V. Uygulanan voltaj-elektrot mesafe oranı olarak hücrelerin maruz kaldığı elektrik alanını tahmin edin (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 ve 400 V/cm).
NOT: Daha düşük elektrik alanlarında, darbeler aksiyon potansiyellerini tetikleyecektir; Daha yüksek elektrik alanlarında, uzun süreli bir depolarizasyon olarak ortaya çıkan elektroporasyonu tetiklerler. Her bir hücre örneği üzerinde deneyin süresi yaklaşık 40 dakikadır (etiketleme için 20 dakika ve mikroskopi için 20 dakika).

4. Veri analizi

Hızlandırılmış kayıtları tiff formatına aktarın.
Bireysel bir deney sırasında (bir hücre örneği) uygulanan tüm voltajların hızlandırılmış kayıtlarını tek bir klasöre yerleştirin. Zaman atlamalı kayıtları, elektrik alanı E'nin MATLAB uygulaması tarafından tanınabileceği şekilde yeniden adlandırın: Vcm (örn. 126 V/cm için 126Vcm). İsmin geri kalan kısımları isteğe bağlı olabilir. Deneyin başında hiçbir darbenin uygulanmadığı alım için, 000Vcm ifadesini kullanarak yeniden adlandırın. Hızlandırılmış kayıt adlarına bir örnek: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm, vb.
adresinden indirilebilen uygulamayı açın
https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Bir deneyin hızlandırılmış kayıtlarını içeren klasörü seçmek için Veri Klasörü Seç'e tıklayın.
Daha fazla veri analizi için kullanılacak pikselleri seçin. Bunu yapmak için, zarların net bir görüntüsü için düşük eşiği (mor renkte) ve analizden kalıntıları (yüksek floresan içeren büyük noktalar) ortadan kaldırmak için yüksek eşiği (yeşil renkte) belirlemek için iki kaydırıcı kullanın.
Verileri Analiz Et'i seçin. Analiz sekmesinde, ayıklanan parametreleri içeren bir tablo görüntülenir. Tablonun sağ tarafında, kullanılan her E için zaman içinde bağıl floresan grafikleri görünür. Tablonun sol tarafında bulunan açılır menüden belirli bir E için grafikleri seçin.
Tüm grafikleri inceleyin ve yanlış tepe tespiti durumunda manuel düzeltme yapın. Analiz sekmesinin alt kısmındaki OTOMATİK Tepe Noktalarını Temizle'yi seçin ve otomatik olarak algılanan tepe noktaları temizlenir. Yeni bir zirve zaman noktasını manuel olarak belirlemek için Grafiğe tıklayın.
Otomatik tepe algılamayı tekrar gerçekleştirmek için Analiz sekmesinin alt kısmındaki OTOMATİK Tepe Algılamayı Yeniden Çalıştır'ı seçin. Çıkarılan parametreler şimdi yeni tepe noktasına ayarlanacaktır.
Verileri kullanılan her E için bir .mat dosyası, elektronik tablo dosyası ve PNG görüntüleri biçiminde aynı klasöre aktarmak için Analiz sekmesinin sağ alttaki Verileri Dışa Aktar'ı seçin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrik darbeleri ile tetiklenen in vitro uyarılabilir hücrelerde TMV'deki değişiklikler bu protokol ile optik olarak izlenebilir ve floresan sinyalleri, ilgili parametrelerini çıkarmak için analiz edilebilir.

Deney düzeneği Şekil 1A'da gösterilmiştir. Deneylerde kullanılan 100 μs'lik tipik bir elektrik darbesi sinyali Şekil 1B'de gösterilmiştir. Mikroskop altına yerleştirilen odacıklardaki hücreler tipik olarak Şekil 1C (parlak alan görüntüsü) ve Şekil 1D'deki (floresan görüntü) hücrelere benzer. Her 2 dakikada bir, aynı hücrelere artan voltajlı bir elektrik darbesinin uygulandığı bir deney yapıyoruz. 2 dakikalık darbe arası sürenin, özellikle belirgin elektroporasyon ile ilişkili olan en yüksek genlikli darbeler kullanıldığında, hücre zarlarının tam olarak yeniden sızdırmaz hale getirilmesine ve geri kazanılmasına izin vermek için yeterince uzun olmayabileceğini unutmayın. Bu nedenle, bakliyatların bazı kümülatif etkileri beklenebilir. Bu kümülatif etkilerden kaçınmak için, darbeler arası gecikme uzatılabilir, ancak test edilen darbe genliklerinin sayısını azaltmak ve hücreleri mikroskopta çok uzun süre tutmaktan kaçınmak pahasına.

Deneylerde floresan görüntüleri yakaladıktan sonra, bunları özel MATLAB uygulamasıyla analiz edin. İlk olarak, piksel eşiklerini belirleyin (Şekil 2A); Düşük eşiği ayarlayarak, hücrelerin etrafındaki zarların (mor renkte) net bir görüntüsünü elde ederiz ve yüksek eşiği ayarlayarak döküntü sinyalini (yeşil) kaldırırız. Uygulama daha sonra, floresan F/F0'daki nispi değişimin zamana bağlı bir sinyalini elde etmek için iletilen her ardışık darbe için tüm eşik piksellerinin ortalama floresan yoğunluğunu belirler. Bu sinyal, hiçbir darbenin uygulanmadığı kontrol hızlandırılmış kaydından belirlenen F'nin doğrusal azalmasının eğiminin çıkarılmasıyla boya fotoağartması için düzeltilir (Şekil 2B). Sinyali düzelttikten sonra, yanıtların parametreleri bir uygulama içi tablo ve düzeltilmiş floresan sinyalinin bir grafiği şeklinde çıkarılır (Şekil 2C). Nadir durumlarda, algoritma belirgin bir tepe noktası algılamaz veya sahte gürültü sinyallerini yanlış pozitifler olarak algılar. Bu durumlar için, kullanıcı, floresan sinyalindeki ilgili noktayı bir tepe noktası olarak manuel olarak seçme veya tespit edilen yanlış tepe noktasını kaldırma seçeneğine sahiptir (Şekil 2D-elektrik darbesi uygulanmadan önce anormal bir şekilde tespit edilen küçük bir tepe noktasının çıkarılması).

MATLAB uygulamasını kullanarak, hem uyarılabilir S-HEK (Şekil 3A) hem de uyarılamayan NS-HEK hücrelerinde (Şekil 3B) elektrik darbelerine TMV yanıtlarının görüntülerini elde edebiliriz. Aşağıdaki yanıt parametreleri çıkarılır (Tablo 1

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S-HEK hücreleri, iyi tanımlanmış sodyum ve potasyum kanalları, Na_V1.5 ve K_ir2.1⁹ ile basit bir uyarılabilir hücre modelidir. Bu, uyarılabilir hücrelerin uygulanan elektrik darbelerine nasıl tepki verdiğine dair derinlemesine çalışmalar yapmamızı ve deneysel verileri, S-HEK hücrelerinde ifade edilen kanalların iyi bilinen teorik özelliklerine dayanan matematiksel modellerle ilişkilendirmemizi sağlar. Bir önceki çalışmamız^{olan 8'de}, bu hücrelerin 100 μs'lik artan E darbelerine verdikleri yanıtları hem deneysel hem de teorik olarak tanımlamıştık. Daha düşük E'de, S-HEK hücreleri tek veya çoklu aksiyon potansiyelleri ile yanıt verirken, daha yüksek E'de AP'ler uzar ve sürekli bir depolarizasyona dönüşür. Sürekli depolarizasyon, bu hücrelerin uyarılamayan bir versiyonunda (NS-HEK) da açıkça görülebildiğinden, elektroporasyona ve seçici olmayan iyonik akımdaki ilişkili artışa atfedilir.

Floresan potansiyometrik boyanın kullanımının, uyarılabilir hücrelerde AP'leri ve elektroporasyonu incelemek için çok etkili bir yol olduğu kanıtlandı. Yama kelepçesi gibi klasik elektrofizyolojik yöntemlerle karşılaştırıldığında, optik ölçümler çok daha uygundur, zaman açısından verimlidir ve özel teknik beceriler gerektirmez. Ayrıca, yüksek voltajlı elektrik darbelerinin kullanılması ölçümlere müdahale etmez, bu da yama kelepçesi ölçümlerinde bir sorun haline gelebilir¹². Bununla birlikte, bu protokolün en büyük dezavantajları boyanın doğası ile ilgilidir. Foto ağartma nedeniyle, yakalanan floresan sinyalinin düzeltilmesi gerekir. Boya kendiliğinden hücre içine yayılır, bu nedenle zarlardan gelen sinyal zamanla azalır. Bu nedenle boya, TMV'deki aksiyon potansiyellerini ve diğer kısa vadeli değişiklikleri izlemek için uygundur (bu deneylerde ~ 3 sn). Boya, oransal görüntülemeyi¹³ mümkün kıldığından, bu tür bir görüntüleme, boya difüzyonu ile ilgili bazı sorunları önleyebilir, ancak daha düşük ulaşılabilir görüntüleme hızı pahasına. Bu deneysel konfigürasyonda, oransal görüntüleme, aksiyon potansiyellerinin şeklini doğru bir şekilde yakalamak için çok yavaş olacaktır. Ayrıca, boya floresansında ölçülen değişiklikler, TMV'deki değişiklik hakkında kalitatif bilgi sağlar; Bununla birlikte, boya, kantitatif ölçümleri mümkün kılmak için kalibre edilebilir.

Özel bir MATLAB uygulaması kullanan otomatik görüntü analizi, büyük miktarda veriyi analiz etmemizi ve TMV yanıtlarının değerli özelliklerini kısa sürede verimli bir şekilde çıkarmamızı sağlar. Uygulama, görüş alanındaki tüm hücrelerin zarlarından gelen floresan sinyalini yakalayacak şekilde yapılandırılmıştır. Bu, sinyal-gürültü oranını iyileştirir, ancak TMV'nin bireysel hücre düzeyinde nasıl değiştiğine dair bilgi kaybetme pahasına. Verilen deneysel konfigürasyonda, tek tek hücrelerden gelen sinyal, yararlı ölçümleri mümkün kılmak için çok gürültülüydü. Dahası, bitişik hücrelerin zarlarını ayırt etmek zordu. Bununla birlikte, HEK hücreleri, elektriksel olarak bağlandıkları boşluk bağlantılarını endojen olarak ifade eder. Önceki çalışmada sunulan matematiksel modelleme⁸, elektriksel bağlantıları nedeniyle, görüş alanı içindeki hücrelerin aynı anda AP'yi tetikleyecek kadar yakın olduğunu göstermiştir. Ayrıca, AP hücre tek tabakası boyunca yüksek hızda yayılır (kabaca 34 mm/sn, 5x objektif büyütmede görüntülemeye dayalı olarak tahmin edilmiştir)^8,9. Görüş alanının yan uzunluğu (~ 0,33 mm) göz önüne alındığında, AP bu uzunluğu yaklaşık 10 ms'de hareket edecektir, bu da görüntü elde etme süremizden daha kısadır. Bu nedenle, bu büyütme ve kayıt hızı ile AP yayılma etkisi görülemez. Bununla birlikte, AP'nin elektrotlardan görüş alanına yayılması, uygulanan darbe ile yakalanan AP⁸ arasında bir gecikmeye neden olabilir.

Önceki çalışmada⁸, bu yayında olduğu gibi, 100 μs süreli darbelerin uyarılabilirlik ve elektroporasyon arasındaki etkileşim üzerindeki etkileri açıklanmaktadır. Bununla birlikte, bu protokol, diğer parametrelerle (farklı süre, voltaj, sayı, tekrarlama oranı veya şekilde) veya diğer uyarılabilir hücrelerle elektrik darbelerini incelemek için uyarlanabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Slovenya Araştırma ve Yenilik Ajansı (ARIS) tarafından P2-0249 araştırma programı, altyapı programı I0-0022 ve J2-2503 araştırma projesi kapsamında desteklenmiştir. Çalışma kısmen ARIS ve Ljubljana Üniversitesi tarafından Start-up Araştırma Programları için fon sağlanarak desteklendi. Çalışma, MN-0023 projesi kapsamında NextGenerationEU ve NOO finansmanı yoluyla kısmen Avrupa Birliği ve ARIS tarafından desteklenmiştir. Çalışma kısmen Avrupa Birliği tarafından ERC Başlangıç Hibesi (No. 101115323 - REENCARNATION) ve Marie Skłodowska-Curie bursu (No. 893077 - EPmIC) aracılığıyla desteklendi. Bununla birlikte, ifade edilen görüş ve görüşler yalnızca yazar(lar)a aittir ve Avrupa Birliği veya Avrupa Araştırma Konseyi'nin görüşlerini yansıtmayabilir. Bunlardan ne Avrupa Birliği ne de izin veren makam sorumlu tutulamaz. Yazarlar, Harvard Üniversitesi'nden Adam E. Cohen'e tet-on spiking HEK hücrelerini sağladıkları için ve Duša Hodžić'e hücre kültürü laboratuvarındaki yardımları için teşekkür eder.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tüp	Ratiolab	5615000
2 kuyulu Nunc Lab-Tek II Odacıklı #1.5 Alman Kapak Camı Sistemi	Thermo Fisher Scientific
155379 ADP305 Diferansiyel voltaj probu	Teledyne LeCroy
AP015 Akım probu	Teledyne LeCroy
Blasticidin	Thermo Fisher Bilimsel
CO2 inkübatörü ve nbsp;	PHCbi	MCO -230AICUV
Doksisiklin ve nbsp;	Sigma-Aldrich/Merck	D9891
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta yüksek glikoz büyüme ortamı	Sigma-Aldrich/Merck	D5671
ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)	Potansiyometrik Problar	31795
Fetal sığır serumu	Sigma-Aldrich/Merck	F2442
Geneticin	Thermo Fisher Scientific
Glutamin	Sigma-Aldrich/Merck	G7513
Laminer akış başlığı	Iskra Pio	MC 15-2
MATLAB	Matematik İşleri
Penisilin– streptomisin	Sigma-Aldrich/Merck	P07681
Poli-L-lizin hidrobromür	Sigma-Aldrich/Merck	P9155-5MG
Darbe üreteci	Özel yapım		referansa bakın^{11< / sup}
>Puromycin	Thermo Fisher Scientific
T25 25cm ve sup2; Doku kültürü şişesi	TPP	90026
Tet-on spiking HEK hücreleri	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu ATCC	CRL-3479
Floresan mikroskobu için Gök Gürültüsü Görüntüleyici Canlı Hücre sistemi	Leica Microsystems
Tripsin-EDTA çözeltisi	Sigma-Aldrich/Merck	T3924
WavePro 7300A Osiloskop	Teledyne LeCroy

A111390310131035A1113803

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models. Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).
Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
Kotnik, T., et al. Electroporation-based applications in biotechnology. Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).
Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. Electroporation in food processing and biorefinery. J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).
Reddy, V. Y., et al. Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation. New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).
Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses. Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).
Tung, L., Tovar, O., Neunlist, M., Jain, S. K., O'neill, R. J. Effects of strong electrical shock on cardiac muscle tissue. Ann New York Acad Sci. 720 (1), 160-175 (1994).
Batista Napotnik, T., et al. Genetically engineered HEK cells as a valuable tool for studying electroporation in excitable cells. Sci Rep. 14 (1), 720(2024).
McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue. Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).
Tian, H., et al. Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators. Nat Methods. 20 (7), 1082-1094 (2023).
Sweeney, D. C., et al. Quantification of cell membrane permeability induced by monopolar and high-frequency bipolar bursts of electrical pulses. Biochim Biophys Acta Biomembranes. 1858 (11), 2689-2698 (2016).
Pakhomov, A. G., et al. Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsed electric field (nsPEF). Bioelectromagnetics. 28 (8), 655-663 (2007).
Lee, P., et al. In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models. Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles