Optogenetik Allosterik Regülasyon Yoluyla Protein Aktivitesinin Uzay-Zamansal Kontrolü

Özet

Bu protokol, protein aktivitesinin tersinir uzay-zamansal kontrolü için tasarlanmış bir mavi ışıkla aktive edilen allosterik anahtar (LightR) alanının uygulamasını açıklar. Src tirozin kinazını bir model olarak kullanan bu çalışma, ışık regüle edilmiş Src'yi (LightR-Src) geliştirmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu yaklaşımın enzim sınıfları arasında çok yönlülüğünü göstermektedir.

Özet

Optogenetik, enzim aktivitesinin karmaşık uzay-zamansal kontrolünü hücre altı çözünürlüğe kadar taklit etme potansiyeli sunar. Bununla birlikte, çoğu optogenetik yaklaşım, çok çeşitli hedef proteinlere uygulanabilen tek bir araçta birden fazla yeteneği entegre etmede genellikle önemli zorluklarla karşı karşıyadır. AÇMA/KAPAMA kinetiği üzerinde hassas kontrol sağlamak, karanlıkta minimum sızıntı sağlamak ve memeli hücrelerinde hücre altı hassasiyetle verimli performans göstermek, bu alanda karşılaşılan en yaygın zorluklardan bazılarıdır. Umut verici bir çözüm, protein aktivitesini allosterik olarak kontrol etmek için rasyonel olarak tasarlanmış ışığa duyarlı alanların uygulanmasında yatmaktadır. Bu stratejiyi kullanarak, istenen tüm özellikleri birleştiren bir optogenetik yöntem oluşturduk. Yaklaşım, mavi (465 nm) ışık kullanarak enzim aktivitesini düzenlemek için Işık tarafından düzenlenen allosterik anahtar modülünün (LightR) hedef proteine dahil edilmesini içerir. LightR alanı, iki Canlı (VVD) fotoreseptör alanının birbirine bağlanmasıyla oluşturulur ve bir enzimin katalitik alanı içinde küçük esnek bir döngüye dahil edilebilen ışığa duyarlı bir kelepçe oluşturur. Karanlık durumda, LightR kelepçesi açıktır, böylece enzimin katalitik alanını bozar ve onu etkisiz hale getirir. Mavi ışığa maruz kaldığında, LightR alanı kapanır ve katalitik alanın yapısını ve enzim aktivitesini geri yükler. Bu el yazmasında, ışıkla regüle edilmiş bir protein kinaz oluşturmak için tasarım stratejilerini tartışıyoruz ve bunun mavi ışık, tersinirlik, kinetik ve subselüler düzeyde hassas regülasyon ile kontrolünü göstererek, sıkı uzay-zamansal hassasiyet sağlıyoruz. Src tirozin kinazını bir model olarak kullanarak, LightR-Src kinaz aktivitesini etkin bir şekilde düzenlemek için bir protokol sergiliyoruz. Ayrıca, LightR'ın farklı enzim sınıfları arasında uygulanabilirliğini göstererek, farklı hastalıklardaki sinyal yollarının mekanik sorularını ele almada araç sisteminin faydasını genişletiyoruz.

Giriş

Hücrenin dış sinyalleri yorumlama ve bunları fizyolojik veya patolojik bağlamlarda belirli tepkilere dönüştürme yeteneği, özel protein grupları tarafından yönlendirilir. Herhangi bir proteinin bu tür karmaşık tepkilere katkısı genellikle hücre altı konumu, ekspresyon seviyesi ve geçici, sürekli veya salınımlı aktivasyonun zamanlaması ile tanımlanır. Sinyalleşmenin düzenlenmesinde bu bireysel parametrelerin rolünün incelenmesi, hücre altı düzeyde protein aktivitesinin karmaşık uzay-zamansal kontrolünü kopyalayabilen yöntemler gerektirir. Genetik manipülasyon ve küçük molekül inhibitörleri gibi geleneksel teknikler bu konuda yetersiz kalmaktadır. Buna karşılık, optogenetik teknikler, fizyolojik ve patolojik süreçleri manipüle ederek veya taklit ederek biyolojik süreçlerin diseksiyonu potansiyelini vaat etmektedir. Bununla birlikte, mevcut araçlar genellikle geniş uygulanabilirlikten veya hücre altı kontrolden yoksundur. Mevcut birkaç strateji, protein lokalizasyonunun ve etkileşimlerinin sıkı bir şekilde düzenlenmesini sağlar; ancak enzimatik aktivite üzerinde doğrudan kontrol eksikliği^vardır 1,2,3,4. Diğerleri enzimatik aktivitenin düzenlenmesini sağlar, ancak hücre altı kontrolden yoksun olabilir veya farklı enzim sınıfları 5,6,7,8,9 arasında sınırlı uygulanabilirliğe sahip olabilir. Bu protokol belgesinde, optogenetiğin avantajlarını tek bir araçta birleştiren yeni bir protein mühendisliği yöntemini açıklıyoruz: sıkı zamansal düzenleme, ayarlanabilir kinetik, hücre altı kontrol ve geniş enzim uygulanabilirliği¹⁰. İlgilenilen hedef proteine yerleştirildiğinde allosterik bir anahtar olarak işlev gören Işık ayarlı (LightR) bir alan tasarladık. Bu strateji, canlı hücrelerde ilgilenilen bir proteinin aktivasyonunun ve deaktivasyonunun sıkı uzay-zamansal kontrolünü sağlar.

Burada, çeşitli enzim sınıflarında LightR optogenetik aracının tasarımı ve uygulama stratejisi tartışılmaktadır. Bu çalışma, ışık regüle tirozin kinaz Src'nin (LightR-Src) geliştirilmesi, karakterizasyonu ve uygulanması için adım adım bir protokol sunmaktadır. Çalışma ayrıca LightR anahtarı inaktivasyon kinetiğinin ayarlanabilirliğini göstermektedir. Yavaş inaktive eden LightR anahtarı, düşük aydınlatma frekansı ile enzim aktivitesini koruyabilirken, hızlı döngülü versiyon FastLightR, aktivasyon için daha sık aydınlatma gerektirir ancak aydınlatma kapatıldığında hızlı inaktivasyon gösterir. FastLightR-Src'nin canlı hücrelerde aktivasyonu/inaktivasyonu, hücre yayılma ve geri çekilme döngülerini indükler. FastLightR-Src ile indüklenen hücre yayılımı, Src kinaz ^11,12'nin fizyolojik rolü ile uyumludur. Hızlı inaktivasyon kinetiği nedeniyle, FastLightR-Src hücre altı düzeyde de düzenlenebilir, bu da lokal çıkıntıların uyarılmasına ve hücre polarizasyonuna neden olur. LightR aracının diğer enzim türlerine uygulanabilirliğini göstermek için, okuyuculara tasarlanmış ışık regüle kinaz bRaf (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) ve bölgeye özgü bir DNA rekombinaz Cre (LightR-Cre) ile benzer başarıyı kısaca gösteriyoruz. Genel olarak, bu yaklaşım, çeşitli hastalıkların patofizyolojisini şekillendiren karmaşık sinyal yolakları hakkındaki anlayışımızı geliştirme potansiyeline sahiptir.

Protokol

1. LightR'nin tasarımı ve geliştirilmesi (Şekil 1)

1. Stratejik planlama
   NOT: LightR alanı, Neurospora crassa'dan iki tandem bağlantılı Vivid (VVD) fotoreseptör alanından oluşur^13,14,15,16. VVD'ler ışık varlığında homodimerize olur ve bu tür bir dimerizasyon, bir VVD monomerinin N-terminalini başka bir VVD monomerinin C-terminalinin yanına getiren konformasyonel bir değişikliği içerir (Şekil 1A). İki VVD alanını esnek bir bağlayıcı ile bağlamak, karanlıkta açılacak ve mavi ışıkla aydınlatıldığında kapanacak kelepçe benzeri bir alan oluşturur. Bu kelepçeyi bir enzimin katalitik alanına entegre etmek, aktivitenin ışık aracılı düzenlenmesini sağlar. Karanlıkta, açık kelepçe alanı bozarak enzimi devre dışı bırakır; Mavi ışıkla aydınlatma, kelepçenin kapanmasına neden olarak enzimin aktivitesini geri yükler (Şekil 1B). Bu kavram, protein kinazlar ve DNA rekombinazları dahil olmak üzere çeşitli ailelerden enzimlere uygulanabilir¹⁰ (Şekil 1C).
   1. LightR'ın Tasarımı
      1. İki VVD molekülünü bağlamak için, her monomer arasında esnek bir 22 amino asit bağlayıcı (GGS)4G(GGS)3 kullanın.
         NOT: Bağlayıcı, VVD monomerlerinin ilişkilendirilmesini ve ayrışmasını sağlamak için yeterli esneklik ve uzunluk sağlar.
      2. GPGGSGG ve GSGGPG bağlayıcılarını sırasıyla LightR etki alanının N ve C terminallerine ekleyin.
         NOT: Bağlayıcıların uzunluğunun ve bileşiminin belirli bir protein için ayarlanması gerekebilir. Daha kısa GSG ve tek Gly bağlayıcılar, daha sıkı düzenleme gerektiğinde rutin olarak kullanılır. Yerleştirme döngüsünün boyutu ve katalitik kalıntılara yakınlığı da dinamik düzenleme aralığını etkileyecektir. Daha kısa döngülerin katalitik aktivitenin daha sıkı düzenlenmesini sağlama olasılığı daha yüksektir, ancak aydınlatmadan sonra daha düşük aktiviteye neden olabilir. LightR etki alanının sırası Ek Tablo 1'de verilmiştir.
   2. LightR'ın Eklenmesi
      NOT: Uygun bir LightR yerleştirme bölgesi, etkileşimlerini sterik olarak engellemeden veya biyolojik rolünü etkileyecek geri dönüşü olmayan yapısal değişikliklere neden olmadan hedeflenen alan işlevinin sıkı bir şekilde düzenlenmesini sağlayacaktır. Hedef proteinin kristal yapısı, LightR'nin eklenmesi için bu tür esnek döngü bölgelerinin tanımlanmasında ideal bir kılavuzdur. Gerekirse, yakın bir homologun kristal yapısı yeterli olabilir. Dikkate alınması gereken bazı genel kriterler aşağıda verilmiştir.
      1. Yerleştirme döngüsünün, enzimin kritik katalitik elemanlarına yapısal olarak bağlı olduğundan emin olun. Seçilen ekleme döngüsünün protein için mevcut bir bağlanma bölgesi olmadığından ve LightR'nin eklenmesinin sterik etkiler nedeniyle herhangi bir fonksiyonel etkileşimi potansiyel olarak bozmadığından emin olun.
      2. İlk strateji olarak, LightR'yi yerleştirirken yerleştirme döngüsündeki bir amino asidi değiştirin. Çözücüye maruz kalan ve molekül içi etkileşimlerde yer almayan polar veya küçük bir amino asit (örneğin, Glu, Arg, Lys, Gly) içeren yerleştirme döngüsünün ortasını hedefleyin.
         NOT: Bir amino asit replasmanı fonksiyonel bir proteinle sonuçlanmadığında, LightR yapısının optimizasyonu, birden fazla amino asidin veya tüm ekleme döngüsünün değiştirilmesini gerektirecektir. Tanımlanan döngü içinde LightR için birden çok ekleme sitesinin işlevselliğini değerlendirin.
      3. Hedef enzimin endojen regülasyondan bağımsız olarak çalıştığından emin olun. Bunu, yerleştirme şablonu için enzimin yapısal olarak aktif bir mutant versiyonunu kullanarak başarın.
         NOT: Vahşi tip enzimler, LightR yapıları oluşturmak için de kullanılabilir, ancak bu, endojen mekanizmalar ve ışık tarafından düzenlenecek bir AND kapılı sistemle sonuçlanabilir.
      4. Pozitif ve negatif kontroller, LightR enzim aktivite analizi için hayati önem taşır. Endojen proteinlerin yapısal olarak aktif mutantlarını pozitif kontroller olarak ve hedeflenen LightR enziminin katalitik olarak aktif olmayan mutant versiyonlarını negatif kontroller olarak kullanın.
         NOT: İnaktive edici mutasyonları seçerken, LightR enzimi katlanmasının geri dönüşümsüzlüğünü bozmamak için mutasyonun LightR yerleştirme bölgesinden yeterince aralıklı olduğundan emin olmak çok önemlidir. Yukarıdaki kriterlere dayanarak, Src kinazdaki LightR yerleştirme bölgesi, bir beta-iplik aracılığıyla ATP bağlayıcı G-döngüsü/glisin açısından zengin döngü bölgesindeki yüksek oranda korunmuş GXGXXG motifine yapısal olarak bağlanan esnek bir döngü bölgesinde seçilir. Daha da önemlisi, ATP bağlanma cebinden ve substrat bağlama bölgesinden^10,17 uzağa konumlandırılmıştır (Şekil 1C (i)).
         NOT: Kinazlar arasındaki yapısal homoloji nedeniyle, bRaf'taki LightR yerleştirme bölgesi, Src'deki yerleştirme bölgesi ile aynı yapısal döngüde seçilir (Şekil 1C (ii)).
         NOT: Bölüm 1.1.2.'de belirtilen ilkelere dayanarak, kinaz olmayan Cre rekombinaz içindeki LightR yerleştirme bölgesi, katalitik çekirdekten, yani DNA bağlanma bölgesinden uzaktaki esnek döngülerden birinde seçilir. Bununla birlikte, ekleme döngüsü, LightR-Cre işlevselliğinin başarısını sağlamak için bir α-sarmal aracılığıyla DNA bağlanma alanı içindeki kritik katalitik kalıntılara hala yapısal olarak bağlanmıştır (Şekil 1C (iii)). Mevcut protokolde tarif edilen farklı enzimler için pozitif ve negatif kontrollere sahip tüm yerleştirme bölgeleri Ek Tablo 2'de detaylandırılmıştır.
   3. FastLightR'ın Geliştirilmesi.
      NOT: LightR'de her iki VVD'ye I85V mutasyonunun eklenmesi, mutantın karanlık duruma hızlı dönüşümüne^{atfedilen daha} hızlı bir aktivasyon-inaktivasyon dinamiği sağlar ^18,19. Hızlı inaktivasyon kinetiğine sahip FastLightR-Src ve FastLightR-bRaf nesli, aktivasyon ve inaktivasyonun sıkı zamansal kontrolünü sağlar. Canlı hücrelerde LightR-Src'nin hücre altı regülasyonunun sağlanmasına izin verir.
      NOT: Cre rekombinaz aktivitesi geri dönüşümsüz DNA rekombinasyonuna neden olur; bu nedenle, LightR'nin tersinirlik özellikleri geçerli değildir.
      NOT: LightR yapısının tespitini basitleştirmek için, hedef proteinin N veya C terminaline bir floresan proteini veya başka herhangi bir uygun etiket eklenebilir. Bu çalışmada LightR-Src için mCherry-myc, LightR-bRaf için Venüs ve LightR-Cre rekombinaz için miRFP670 kullanılmıştır.
2. Klonlama Stratejisi
   NOT: Klonlama yaklaşımı, geleneksel yaklaşımlardan farklı olarak, belirli kısıtlama bölgelerine dayanmayan, bölgeye yönelik mutajeneze dayanmaktadır^10,20.
   1. Bir "Megaprimer" Üretimi
      1. Memeli hücrelerinde mantar kökenli iki tandem VVD DNA dizisinin kararlı ekspresyonunu sağlamak ve PCR kullanarak hatasız klonlama için dizileri mümkün olduğunca farklı hale getirmek için LightR genlerini kodon-optimize eder. Kodon optimizasyonunu gerçekleştirmek için 1.2.1.2-1.2.1.3 adımlarını izleyin.
      2. LightR'nin teorik dizi haritasını oluşturmak için VVD'lerin amino asit dizisini ve seçilen bağlayıcıları yan yana hizalayın.
      3. Diziyi, minimum karmaşıklıkla en iyi dizi seçeneğini belirlemek için kodon optimizasyonu için gelişmiş bir algoritma kullanan herhangi bir çevrimiçi kodon optimizasyon platformuna yapıştırın. Hedef organizmanın seçildiğinden, okuma çerçevesinin korunduğundan ve optimizasyon için VVD dizilerinin seçildiğinden emin olun.
      4. LightR DNA'sını özel sentezlenmiş bir parça olarak ( Bkz. Ek Tablo 1) veya daha önce yayınlanmış bir LightR yapısından¹⁰ elde edin.
      5. Şekil 1D'de özetlenen daha önce açıklanan²⁰ stratejiyi kullanarak "Megaprimer" oluşturmak için LightR genini çoğaltın. LightR "Megaprimer"ı, üreticinin spesifik DNA polimeraz için tavsiyelerini izleyerek ve aşağıdaki PCR reaksiyon karışımını kullanarak PCR yoluyla sentezleyin:
         5x DNA Polimeraz uyumlu tampon: 10 μL
         100 μM İleri megaprimer: 0,5 μL
         100 μM Ters megaprimer: 0,5 μL
         10 nM dNTP karışımı: 2 μL
         DNA polimeraz (2000 birim/mL): 1 μl (0,02 U/μL)
         50 ng Şablon DNA: 1 μL
         PCR sınıfı su: 35 μL
         NOT: Burada, üniversal primer tavlama sıcaklıklarına sahip yüksek kaliteli, sıcak başlangıçlı DNA polimeraz kullanılmıştır.
      6. Elde edilen megaprimeri agaroz jel elektroforezi ile ayırın. Ürün yaklaşık 1000 nükleotid uzunluğunda olacaktır. Megaastarı agaroz jelden çıkarın ve üreticinin tavsiyelerine uyarak veya benzer bir teknik kullanarak bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın.
   2. Bölgeye yönelik mutajenez kullanılarak LightR geninin eklenmesi: İstenen bir amino asidi veya bir amino asit uzunluğunu değiştirerek LightR'yi yerleştirin. Şablon plazmidi, LightR etki alanının eklendiği yer olacaktır. Aşağıdaki karışımı kullanarak daha önce²⁰ tarif edildiği gibi PCR reaksiyonu gerçekleştirin.
      5x DNA Polimeraz uyumlu tampon: 5 μL
      10 nM dNTP karışımı: 1 μL
      DNA polimeraz (2000 birim/mL): 1 μL (0,02 U/μL)
      50 ng Hedef Şablon DNA'sı: 1 μL
      Ekstrakte edilen Megaprimer (hesaplanan kütle): 10 μL
      DMSO: 2,5 μL
      PCR sınıfı su: 2,5 μL
      NOT: Megaprimer kütlesi (ng) = istenen kesici uç/vektör molar oranı x vektör kütlesi x kesici ucun vektör uzunluklarına oranı. Kullanılan istenen kesici uç/vektör molar oranı 3/1'dir.
   3. PCR reaksiyonunun tamamlanmasından sonra, sadece fazla ve metillenmiş DNA'yı seçici olarak sindirmek için 1 μL DpnI (2000 birim / mL) enzimi ekleyin ve karışımı 37 ° C'de 1-1.5 saat inkübe edin. Bu, değiştirilmiş yapının verimini önemli ölçüde artıracaktır.
   4. PCR reaksiyonunun 1-2 μL'sini üretici protokollerini izleyerek DH5α yetkin hücrelere dönüştürün.
   5. Luria Broth (LB)-agar plakası üzerindeki plaka, seçim için uygun antibiyotik ile bakterileri dönüştürdü. Plakayı gece boyunca 37 °C'de veya oda sıcaklığında (RT; 25-30 °C) 72 saat inkübe edin.
      NOT: Üzerinde koloniler yetiştirilen LB plakaları 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir ve protokol duraklatılabilir.
   6. Koloni ekranı PCR
      1. PCR tabanlı koloni taraması için, LightR ekinde tavlanan ve yaklaşık 400-700 bp fragmanı oluşturmak için DNA'yı hedefleyen primerler tasarlayın.
      2. LB plakasından aşağıda verilen PCR karışımına az miktarda koloni ekleyin ve spesifik DNA polimeraz için üreticinin tavsiyelerine göre termosiklasyona devam edin.
         2x Taq RED Master Karışımı: 5 μL
         PCR sınıfı su : 5 μL
         100 μM İleri astar : 0.5 μL
         100 μM Ters astar: 0,5 μL
      3. Agaroz jel elektroforezi ile pozitif kolonileri kontrol edin.
      4. İstenen PCR ürün boyutunu oluşturan kolonileri seçin ve bunları plazmid omurgasındaki antibiyotik direncine uygun olarak antibiyotikle birlikte 3 mL LB suyuna ayrı ayrı aşılayın. Daha sonra inkübe edin ve gece boyunca 37 °C'de çalkalayın.
      5. Plazmit DNA ekstraksiyonu için plazmit saflaştırma kitinin üreticisinin talimatlarını izleyerek sıvı kültürden plazmit DNA'yı çıkarın ve dizileme ile ekin varlığını doğrulayın.
         NOT: Klonlama primerleri Ek Tablo 3'te özetlenmiştir.

2. Hücre kaplaması ve LightR enzim aktivitesinin biyokimyasal analizi (Şekil 2A)

1. LightR-kinazların (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf) biyokimyasal analizi için, her deney grubu için 3,5 cm hücre kültürü kabı başına 1 x 10⁶ LinXE hücresi yerleştirin. Ek Tablo 4'e bakın.
2. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 16-18 saat inkübe edin.
3. Ertesi gün, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak uygun bir transfeksiyon reaktifi kullanarak, seçilen DNA yapısına sahip hücreleri transfekte edin (Ek Tablo 4).
   NOT: Optimal transfeksiyon reaktifi, kullanılan hücrelerin yapısına, vektörüne ve tipine bağlı olacaktır. Bu çalışmada, bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak 3,5 cm'lik bir tabakta 2 μg DNA kullanılmıştır. Optimal transfeksiyon reaktifini belirlemek için ampirik test yapılmalıdır. Transfekte edilmiş yapılar mavi ışıkla düzenlenen proteinleri eksprese edeceğinden, transfekte edilmiş hücreleri işleyen sonraki tüm adımlar kırmızı ışık altında gerçekleştirilmelidir. Yanlışlıkla aydınlatmayı önlemek için inkübatöre yerleştirmeden önce plakaları transfekte edilmiş hücrelerle alüminyum folyo ile sarın.
4. 16-18 saat transfeksiyondan sonra hücreleri mavi ışığa^{maruz bırakın 10}. Bunu gerçekleştirmek için, doku kültürü inkübatörüne 465 nm ışık yayan diyot (LED) panel lamba sistemi yerleştirin. İstenilen 3 mW/^cm2 aydınlatmayı elde etmek için lambanın 10 cm yukarısına delikli bir pleksiglas panel yerleştirin (Ek Dosya 1). İnkübatörde kesintisiz hava sirkülasyonu sağlamak için delikli bir panele ihtiyaç vardır. Hücreleri istenen süre boyunca aydınlatın.
5. LightR-Src ve LightR-bRaf'ın etkinleştirilmesi için sürekli aydınlatma kullanın. Sürekli aydınlatma için LED paneli manuel olarak açıp kapatın.
6. FastLightR Src'nin etkinleştirme/devre dışı bırakma döngüsünü sürdürmek için, manuel olarak veya bir mikro denetleyici tarafından kontrol edilen AÇMA/KAPAMA döngülerini kullanın.
   NOT: Gerekli kodu yazmak ve yüklemek için bir Entegre Geliştirme Ortamı (IDE) sağlayan çeşitli yazılım araç setleri kullanılabilir. Bu araç kitleri, C/C++ programlamayı destekler ve darbeli aydınlatmayı kontrol etmek için gerekli olan genel amaçlı giriş/çıkış (GPIO) erişimi sunar. Bu amaçlar için kullanılan protokollerin ve kodun ayrıntılı bir açıklaması Ek Dosya 1'de açıklanmıştır.
7. Deneyin ilgili zaman noktalarının sonunda (Ek Tablo 4), hücreleri güvenli kırmızı ışıklar altında hasat edin. Ortamı aspire edin ve hücreleri soğuk PBS ile yıkayın.
8. Proteini izole etmek için, hücreleri %5 v/v 2-Merkaptoetanol ile desteklenmiş 500 μL 2x Laemmli numune tamponu ile parçalayın. Lizatı 100 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Protein jel elektroforezi ve Western blotting ile hücre lizatlarını analiz edin²¹.
   NOT: 2x Laemmli tamponunun bileşimi aşağıdaki gibidir: 500 mL için: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL gliserol, 52.5 mL SDS, 0.5 g bromofenol mavisi, nihai pH 6.8.
9. Tyr249 22,23 üzerindeki endojen p130ca'ların ve TyrY118 22,23'teki paxillin'in fosforilasyon seviyesini değerlendirerek LightR-Src aktivitesini değerlendirin. Ser1/217'de MEK221'in ve TyrY1/202'te ERK202/204'in fosforilasyon seviyesini değerlendirerek LightR-bRaf aktivitesini değerlendirin^24,25.

3. LightR-Cre aktivitesinin fonksiyonel analizi

1. LightR-Cre aktivitesinin fonksiyonel analizi için, 3,5 cm'lik hücre kültürü kabı başına 1 x 10⁶ LinXE hücresi ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 16-18 saat inkübe edin.
2. Bölüm 2, Şekil 2A ve Ek Tablo 5'te belirtilen protokolü izleyerek hücreleri transfekte edin. 1:9 oranında LightR-Cre-iRFP670 ve bir Reporter plazmid Floxed-STOP-mCherry² ile toplam 2 μg DNA'yı birlikte transfekte edin.
3. Transfeksiyondan 16-18 saat sonra hücreleri aydınlatın. Verimli bir LightR-Cre aktivasyonu için uzun süreli aydınlatma gerekir. Bu nedenle, fototoksisiteyi önlemek için, bölüm 8 ve Ek Dosya 2'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir mikrodenetleyici tarafından kontrol edilen 20 nm LED panel lamba sistemi kullanarak 2 s AÇIK ve 2 s KAPALI döngüleri ile 1 saat boyunca darbeli aydınlatma kullanın.
4. 20x hava objektifi ile epifloresan mikroskobu kullanarak görüntüleme yapın. LightR-Cre-iRFP670'in görselleştirilmesi için Cy5 filtre setini kullanın ve Floxed-mCherry ifadesinden mCherry'nin görselleştirilmesi için RFP filtre setini kullanın.
   NOT: Görüntüleme için, Cy5/RFP ışık küpleri ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu kullanılır.

4. Canlı hücre görüntüleme için numunelerin hazırlanması

1. Plaka 2 x 10 Hücre kültürü ortamında 35 mm doku kültürü kabı başına⁵ HeLa hücresi ve 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 2 saat inkübe edin.
2. Hücreler bağlandıktan ve birleşme yaklaşık% 60 -% 70 olduğunda, HeLa hücrelerini aşağıdaki karışımlardan biriyle birlikte geçirin: (i) 0.85 μg FastLightR-Src-mCherry-myc / 0.15 μg Stargazin-iRFP veya (ii) 0.75 μg FastLightR-bRaf-Venüs / 0.25 μg mCherry-ERK2
   NOT: FastLightR-Src deneylerinde, Stargazin-iRFP, hücre yayılma analizi için plazma zarını etiketlemek için kullanılır. Daha yüksek FastLightR-Src ifadesi isteniyorsa, stargazin-iRFP atlanabilir ve bunun yerine 1 μg FastLightR-Src kullanılabilir. Bu durumlarda, hücreleri görselleştirmek için bir zar boyası kullanılmalıdır. Plazma zarı lekeleri, hücre zarlarını etiketlemek için rutin olarak kullanılır.
3. Hücrelerin yanlışlıkla yanmasını önlemek için çanağı alüminyum folyo ile örtün ve 37 ° C ve% 5 CO_2'de 16-18 saat inkübe edin.
4. Yapıların yanlışlıkla etkinleştirilmesini önlemek için aşağıdaki tüm adımları kırmızı ışık aydınlatması altında tamamlayın. Beyaz ışığa maruz kalmak, LightR-kinazların aktivasyonunu indükler ve sonraki sonuçları etkileyebilir.
5. Aynı gün, 3 yuvarlak cam lamel (25 mm çap, 0,17 mm kalınlık) gece boyunca 37 ° C'de PBS'de 5 mg / L fibronektin ile kaplayın.
6. Lamelleri transfeksiyondan 16-18 saat sonra PBS ile durulayın ve her bir lamel üzerine ~ 10⁵ transfekte edilmiş HeLa hücrelerini plakalayın. Hücre kültürü ortamında 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 2 saat inkübe edin.
   NOT: Düşük tohumlama yoğunluğu, görüş alanındaki hücrelerin birbirine değmemesini sağlamak için gereklidir.
7. FBS'yi Levobitz'in L-15 görüntüleme ortamına %5'lik bir nihai konsantrasyona ekleyerek görüntüleme ortamını hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtreden süzün ve 37 °C'ye ısıtın.
8. Mineral yağı 37 °C'ye ısıtın.
9. Hücreleri içeren lamelleri PBS ile iki kez yıkayın. Membran boyası kullanıyorsanız, lamelleri yıkamadan önce üreticinin talimatlarına göre hücreleri boyayın.
10. Lameli dikkatlice canlı bir hücre görüntüleme odasına yerleştirin. Hazneye 1 mL L-15 görüntüleme ortamı ekleyin.
11. Görüntüleme işlemi sırasında buharlaşmayı önlemek için ortamın üzerine 1 mL mineral yağ ekleyin.
12. Görüntüye hazır olana kadar hazneyi 37 °C'de ışıktan koruyun.

5. FastLightR-Src'nin küresel aktivasyonu ve görüntülenmesi (Şekil 3)

1. Mikroskop kondansatörüne mavi bir LED mikroskop halkası ışığı takın ve numune tutucunun yaklaşık 1.5 cm üzerine yerleştirin. Halka ışığı için AC/DC kontrol rölesini mikroskop bilgisayarına bağlayın.
   NOT: Bu çalışmadaki deneyler için aydınlatma, görüntüleme yazılımı aracılığıyla bir Transistör-Transistör Mantığı (TTL) arayüzü aracılığıyla kontrol edilmiştir. Epifloresan aydınlatma, harici bir aydınlatma kaynağı mevcut olmadığında LightR yapılarını küresel olarak etkinleştirmek için de kullanılabilir. 490/20 nm uyarma filtresi gibi GFP uyarma dalga boyları, LightR'yi aktive etmede etkilidir.
2. Odayı önceden 37 ° C'ye ısıtılmış bir mikroskop aşamasına yerleştirin ve FastLightR-Src-mCherry ve Stargazin-iRFP (Şekil 3B) veya FastLightR-bRaf-Venüs ve mCherry ERK-2 (Şekil 5B) eksprese eden hücreleri seçin.
3. Küresel aydınlatma ve görüntüleme deneylerinin incelenmesi için, apokromatik düzeltme, düz alan düzeltmesi ve yüksek sayısal diyafram açıklığı ile mikroskop uyumlu, yüksek performanslı objektifler (40x) kullanın.
   1. Src kinazın küresel aydınlatma tabanlı çalışmaları için, FastLightR-Src-mCherry'yi görselleştirmek için 561/10 nm uyarma ve 595/40 nm emisyon filtreleri kullanın ve stargazin-iRFP'yi görselleştirmek için 640/20 nm uyarma ve 655LP emisyon filtresi kullanın.
   2. bRaf kinazın küresel aydınlatma tabanlı çalışmaları için, FastLightR-bRaf-Venus'ü görselleştirmek için 514/10 nm uyarma ve 540/21 nm emisyon filtreleri kullanın ve mCherry-ERK-2'yi görselleştirmek için 561/10 nm uyarma ve 595/40 nm emisyon filtreleri kullanın.
   3. Tüm floresan görüntüleme kanallarında çok bantlı bir polikroik ayna kullanın.
4. Deneysel koşullara bağlı olarak, aşağıdaki önerileri göz önünde bulundurun.
   1. Hücrelerin temel aktivitesini belirlemek için hücreleri aydınlatmadan en az 10 dakika önce görüntüleyin.
      NOT: Bu taban çizgisi, FastLightR kinazın aydınlatma ile aktivasyonunun hücre davranışında veya protein lokalizasyonunda herhangi bir değişikliğe neden olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Daha fazla istatistiksel anlamlılık sağlamak için daha uzun bazal görüntüleme periyotları da gerçekleştirilebilir.
   2. FastLightRs'ın hızlı inaktivasyon kinetiği nedeniyle, görüntüleme için birçok hücrenin dahil edilmesi, aşama pozisyonları arasında Src / bRaf'ın devre dışı bırakılmasına neden olabilir ve yanıtını azaltabilir. Bu tür bir hatayı önlemek için, açıklanan protokolde FastLightR-Kinaz aktivitesini analiz ederken 4 hücre/dk görüntüleyin ve seçilen her hücreyi toplam 110 dakika boyunca her dakika görüntüleyin (Ek Dosya 2).
   3. Mavi ışığın potansiyel fototoksik etkilerini azaltmak için sürekli aydınlatma yerine darbeli aydınlatma kullanın. 4 hücre/dk'nın her biri için 12 sn aydınlatma etkilidir (Ek Dosya 2, Şekil 3A).
      NOT: Aydınlatma döngüleri, farklı yapılar ve aydınlatma kaynağı türleri için ampirik olarak belirlenmelidir.
   4. Floresan kanallarında sızıntıyı önlemek için hücre görüntüleme sırasında Aydınlatmayı kapatın.
      NOT: Aynı anda çok fazla hücrenin görüntülenmesi, numune için mevcut olan toplam aydınlatma süresini azaltacak ve yetersiz aktivasyondan kaynaklanan zayıflatılmış bir yanıta yol açacaktır.
5. Görüntülemeden sonra, filmleri bir . Analiz için TIF yığın dosya biçimi.
   NOT: Halka ışığına kıyasla GFP epifloresan ile daha az homojen aydınlatma nedeniyle, GFP epifloresan kullanan deneyler daha sık aydınlatma gerektirecektir. Bu, deney başına daha az hücrenin görüntülenmesine neden olur.

6. FastLightR-Src'nin hücre altı aktivasyonu ve görüntülenmesi (Şekil 4)

1. Odayı önceden 37 °C'ye ısıtılmış bir mikroskop sahnesine yerleştirin ve hem FastLightR-Src-mCherry hem de Stargazin-iRFP'yi ifade eden tek bir hücre seçin.
2. Aydınlatmak için hücre içindeki belirli bölgeleri (ROI) seçin. Bu çalışma, seçilen hücrenin çevresinde küçük bir alan seçer.
   NOT: Yerel aydınlatma için, FRAP modunda bir TIRF modülü tarafından odaklanan 445 nm'lik bir lazer veya görüntüleme yazılımı aracılığıyla TTL arayüzü aracılığıyla kontrol edilen mikro ayna cihazı kullanılır. Bu deneyler için herhangi bir desenli aydınlatma sistemi çalışacaktır. Tarama tabanlı bir sistem kullanılıyorsa, hücreye zarar vermeden yeterli aktivasyon için lazer yoğunluğunu ve homojenliğini belirleyin.
3. Seçilen hücreyi aydınlatmadan önce bazal durumda 20 dakika, yerel olarak aydınlatırken 50 dakika, ardından aktivasyondan 20 dakika sonra toplam 90 dakika boyunca her dakika görüntüleyin (Ek Dosya 2).
4. Aktivasyon ve deaktivasyon için, LightR proteininin tamamen deaktivasyonuna izin vermek için hedef protein için uygun bir süre sağlayın. FastLightR-Src için, artık aktivitenin azalması için en az 10 dakikalık devre dışı bırakmaya izin verin ve yerel aydınlatma için gösterilen deney kurulumunda 20 dakikalık devre dışı bırakmaya izin verin.
5. Görüntülemeden sonra filmleri farklı kaydedin. Analiz için TIF yığın dosya biçimi.

7. Hücre yayılma analizi

1. Veri işleme ve analiz için görüntüleri hazırlayın. Görüntülerin bir . TIF yığın biçimi. Bunları doğrudan görüntüleme yazılımından kaydedin veya açık kaynaklı bir program kullanarak dönüştürün.
2. CellGeo komut dosyası paketini ek veri sıkıştırılmış dosyalarından^{indirin 26}.
   NOT: CellGeo paketi birkaç farklı komut dosyası içerir. Protokol bölümleri 7-9'da ele alınan analiz türüne göre listeden istediğiniz paketi seçin.
3. Hücrenin maskesini oluşturmak için MovThresh adlı betiği açın ve çalıştırın.
   1. Dosya > İçe Aktar'ı (.tif) seçin ve hücrelerin Stargazin-iRFP görüntülerini seçin.
   2. Sol alt köşedeki kaydırma çubuğunu kullanarak çerçeveleri tarayın. Önerilen eşik uygunsa, adım 7.4'e gidin.
   3. Önerilen eşik hücrenin davranışıyla uyumlu değilse, Eğri Seçimi'nin altında düzleştirilmiş veya özel eğrileri seçin. Çerçeveler arasında kaydırarak ve ardından pencerenin sağ tarafındaki eşiği ayarlayarak özel eğriyi oluşturun.
   4. Yeniden Eşik'i tıklayın.
   5. Dosya > Maske olarak kaydet'i tıklatın, Dosyanın adını değiştirin ve Farklı kaydet seçeneğini kullanarak kaydedin.
4. Yeni oluşturulan yığın dosyasını açık kaynaklı bir görüntü analiz programında açın.
5. Görüntüyü seçin > > eşiğini ayarlayın > uygulayın.
6. Analiz et > Parçacıkları analiz et > Görüntü sonuçlarını kontrol et -> Tamam'ı seçin.
7. Mavi ışık ışınlamasından önce herhangi bir zamanda alanı aynı hücrenin ortalama alanına bölerek her hücre için alandaki değişikliği hesaplayın.
8. Alan değişikliğini bir çizgi veya çubuk grafik olarak çizin.

6. 
   

4. 
   
   

Sonuçlar

LightR-Src, Şekil 1A,B'de açıklanan stratejiye göre tasarlanmış ve üretilmiştir. LightR-Src'nin biyokimyasal analizi, 60 dakikalık sürekli aydınlatmada mavi ışığa yanıt olarak bilinen endojen Src substratlarının, p130Cas (Y249)²² ve paxillin (Y118)^23'ün fosforilasyonuna erişir (Şekil 2B). Özellikle, LightR-Src, transfeksiyondan sonra 16-18 saat boyunca sadece karanlıkta eksprese edildiğinde, Src kinazın arka plan aktivasyonu gözlenmez. Ayrıca, D388R mutasyonuna sahip LightR-Src'nin katalitik olarak aktif olmayan mutantı, Src substratının fosforilasyonunu indüklemez, bu da fosforilasyonun aktif LightR-Src tarafından gerçekleştirildiğini ve mavi ışık aydınlatmasının spesifik olmayan etkisinden kaynaklanmadığını gösterir (Şekil 2B). Canlı hücrelerde Src²⁷ kinazın salınım aktivitesinin raporlarını kabul ederek, LightR-Src'nin döngüsel aktivasyon sergileyecek şekilde ayarlanıp ayarlanamayacağını araştırdık. Orijinal LightR-Src, yavaş devre dışı bırakma kinetiği gösterdi (Şekil 2C), bu da her iki VVD'de de I85V mutasyonunu barındıran yeni bir varyant olan Fast-LightR-Src'nin üretilmesine yol açtı. Şekil 2D, Fast-LightR-Src'nin belirgin şekilde daha hızlı devre dışı bırakma kinetiği gösterdiğini ve LightR-Src için bir saatten fazla olan ışığı kapattıktan sonraki 10 dakika içinde tamamen devre dışı bıraktığını göstermektedir. FastLightR-Src kullanarak, tekrarlanan aktivasyon / inaktivasyon döngüleri de elde edebildik (Şekil 2E). Bu sonuçlar toplu olarak, LightR aracının canlı hücrelerde Src aktivitesinin spesifik ve sıkı bir şekilde kontrol edilen düzenlemesini sağlama yeteneğini göstermektedir.

FastLightR-Src uygulaması, geçici Src aktivasyonunun hücre morfodinamiği üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine de izin verir. HeLa hücrelerinde FastLightR-Src'nin aktivasyonu, hücre yayılmasını indükler ve bu işlem, FastLightR-Src inaktive edildiği anda durur. Aktivasyon üzerine, FastLightR-Src'nin perinükleer bölmeden fokal adezyonlara ve plazma membranına translokasyonunu gözlemledik, bu vahşi tip Src kinaz^11,12 tarafından sergilenen bir davranış. Katalitik olarak inaktif mutant D388RLightR-Src'yi eksprese eden aydınlatıcı hücreler bu tür yayılma etkilerini gösteremez (Şekil 3B,C). Bu ayrıca, FastLightR-Src'nin vahşi tip muadili ile benzer şekilde çalıştığını doğrular. Bir hücre bölgesinin lokal olarak aydınlatılması, fokal yapışmada lokal birikim LightR Src ile gösterilen ve lokal membran çıkıntılarının oluşumu (Şekil 4B (i), (ii)) ve hücre merkezi kayması (Şekil 4C (i), (ii)) ile birlikte FastLightR-Src'nin lokalize aktivasyonu ile sonuçlanır ve bu da hücrenin ışığa doğru hareketine neden olur. Src kinazın düzenlenmesi için LightR aracının uygulamasını kurduktan sonra, LightR'nin bRaf kinaz ve DNA rekombinaz Cre'nin düzenlenmesine kadar uzanan geniş kapsamlı yardımcı programını sergiliyoruz. LightR-bRaf analizi, bRaf, MEK1'in endojen substratının ışık kaynaklı fosforilasyonunu ve yapısal olarak aktif bRaf mutantının (V1E) ile karşılaştırılabilir seviyelerde^ERK24,25 24,25'in aşağı akış fosforilasyonunu gösterir (Şekil 5A). Tersine, katalitik olarak aktif olmayan D575RLightR-bRaf, aydınlatılmamış LightR-bRaf örnekleriyle karşılaştırılabilir hiçbir MEK1 ve ERK1/2 fosforilasyonu göstermez, böylece LightR-bRaf düzenlemesinin özgüllüğünü doğrular. Canlı hücre görüntüleme, tekrarlanan FastLightR-bRaf aktivasyon / inaktivasyon döngülerinin, bRaf aktivasyonunun²⁸ bilinen sonuçlarıyla doğrulayarak, ERK2'nin çekirdeğin içine ve dışına tekrarlanan translokasyonunu indüklediğini gösterdi (Şekil 5B). LightR-Cre'nin aktivasyonu, LightR'nin farklı enzim sınıflarına uygulanabilirliğini gösteren bir raportör mCherry geninin başarılı bir şekilde rekombinasyonu ile sonuçlanır (Şekil 5C).

Şekil 1: LightR yaklaşımının geliştirme stratejisi. (A) Karanlık durumdaki (PDB: 2PD7) iki Canlı monomerin ve aydınlık durumdaki dimer (PDB: 3RH8) kristal yapıları. (B) LightR tasarımının karikatür temsili. Katalitik alana yerleştirilen iki tandem bağlı VVD fotoreseptörü, karanlıkta proteinin katalitik aktivitesini bozar. Mavi ışığa tepki olarak VVD'nin dimerizasyonu protein aktivitesini geri kazandırır. (C) (i) Src (PDB 1Y57) ve (ii) bRaf (PDB 4MNF) katalitik alanlarının kristal yapıları. (ii) Cre rekombinazın yapısı (PDB 1MA7). Sarı oklar LightR yerleştirme bölgesini gösterir ve ikame edilmiş amino asidi gösterir. (D) LightR alanının bir hedef enzim dizisine eklenmesi için klonlama stratejisinin şematik diyagramı¹⁹. Adım 1'de, yerleştirme bölgesinden önce ve sonra hedef gende tavlama bölgeleri ile çevrili bir LightR fragmanının PCR sentezi için özel olarak tasarlanmış primerler kullanılır. Adım 2'de, bu şekilde üretilen LightR fragmanının, LightR'nin Hızlı değişim bölgesine yönelik mutajenez ile hedef enzim genine eklenmesi için bir "megaprimer" olarak kullanıldığı gösterilmiştir. Paneller A-C, Shaaya ve ^ark.10'un izniyle uyarlanmış ve değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Tasarlanmış LightR-Proteinlerinin biyokimyasal karakterizasyonu. (A) LightR Src'nin Biyokimyasal karakterizasyonu için deneysel protokolün şematik gösterimi. (B) C-terminalinde bir mCherry ve bir myc etiketi taşıyan LightR Src yapısını geçici olarak ifade eden LinXE hücreleri, 465 nm'lik bir LED kurulumu kullanılarak 60 dakika boyunca sürekli olarak mavi ışıkla aydınlatıldı. Hücre lizatları, Src substratları, paxillin ve p130Cas'ın fosforilasyonu için problandı. Western Blot sonuçları, canlı hücrelerde LightR-Src'nin aktivasyonuna yanıt olarak endojen paxillin ve p130Cas'ın fosforilasyonunu göstermektedir. (C,D) C-terminalinde tandem mCherry-myc etiketini taşıyan belirtilen LightR-Src yapılarını geçici olarak ifade eden LinXE hücreleri, belirtilen süreler boyunca (0 dakika ve 30 dakika) sürekli olarak mavi ışığa maruz bırakıldı ve daha sonra belirtilen süreler boyunca karanlıkta bırakıldı. Hücre lizatları, (C) LightR-Src ve (D) FastLightR-Src arasındaki aktivasyon ve deaktivasyon kinetiğinin karşılaştırmasını gösteren Src substratlarının fosforilasyonu için incelendi. (E) C-terminalinde tandem mCherry-myc etiketi taşıyan belirtilen LightR-Src yapılarını geçici olarak ifade eden LinXE hücreleri, 20 dakika boyunca sürekli olarak mavi ışığa maruz bırakıldı, ardından karanlıkta 10 dakika ve ışıkta 20 dakika boyunca tekrarlanan inkübasyon yapıldı. Hücre lizatları toplandı ve Src substratlarının fosforilasyonu için araştırıldı, bu da aktivasyon ve inaktivasyon durumları arasındaki Src kinaz döngüsünün etkinliğini gösterdi. Tüm deneyler benzer sonuçlarla en az üç kez tekrarlandı. Her bir batı leke paneli B-E'nin yanında görüntülenen sayılar, kilodalton (kDa) cinsinden ölçülen proteinlerin moleküler ağırlıklarını temsil eder. Paneller B-E, Shaaya ve ^ark.10'un izniyle uyarlanmış ve değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Küresel ve zamansal aydınlatma kontrolü ve FastLightR-Src aktivitesi üzerindeki etkisi. (A) Küresel ve zamansal döngüsel aydınlatmanın deneysel şemasının karikatür temsili ve müteakip veri analizleri. (B,C) Hücre morfolojisinin düzenlenmesi ve FastLightR-Src lokalizasyonunun mavi ışıkla yapılması, geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak hızlandırılmış bir seriden elde edilen HeLa hücrelerinin temsili görüntülerinde gösterilmiştir. Bu hücreler, Stargazin-iRFP670 (plazma zarı işaretleyicisi) ile birlikte FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 hücre) veya katalitik olarak inaktif D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 hücre) ile birlikte geçici olarak birlikte eksprese edildi. Canlı hücre görüntülemesi her dakika gerçekleştirilirken, hücreler küresel olarak mavi ışıkla (mavi ana hatlar) aydınlatıldı. (B) Sarı oklar, fokal yapışıklıklara benzeyen yapılarda FastLightR-Src lokalizasyonunu vurgular. Görüntüler, geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak hızlandırılmış bir dizi HeLa hücresinden elde edildi. (C

Tartışma

Çalışmamız, çeşitli sinyal yollarının araştırılması için optogenetik bir yaklaşım sunmakta ve farklı biyolojik soruların ele alınmasında geniş uygulanabilirliğini göstermektedir. LightR araç sistemi birkaç önemli avantaj sağlar: (1) Protein aktivitesinin allosterik regülasyonu, (2) Farklı aktivasyon ve inaktivasyon kinetiği elde etmek için ayarlanabilen aktivitenin sıkı zamansal kontrolü, (3) Subselüler düzeyde aktivitenin uzamsal çözünürlüğü, (4) Sinyal modülasyonunun ve biyolojik aktivitenin özgüllüğü ve (5) Çeşitli hedef proteinlere geniş uygulanabilirlik yelpazesi. Özellikle, LightR tüm bu avantajları tek bir araca benzersiz bir şekilde entegre eder ve böylece ileriye doğru önemli bir adım sağlar.

LightR'nin allosterik bir anahtar olarak tasarımı çeşitli avantajlar sunar. LightR'nin küçük, esnek bir döngüye yerleştirildiğinde protein aktivitesini kontrol etme yeteneği, çeşitli yapı ve işlevlere sahip çeşitli proteinler arasında uygulama için önemli ölçüde çok yönlülük sağlar. Allosterik bir anahtar olan LightR, ilgilenilen proteinin yalnızca hedef alanını düzenler ve proteinin diğer alanlarını etkilemez. Bu nedenle, bu yöntem, proteinin bağlayıcı ortaklarıyla etkileşimler veya hücreler içinde doğal lokalizasyon gibi temel işlevlerinden ödün vermeden aktivitenin spesifik olarak düzenlenmesine izin verir. İki bileşenli optogenetik sistemler, homo- veya heterodimerizasyonun ışık aracılı kontrolünü kullanarak protein lokalizasyonunun, etkileşimlerinin veya diğer temel fonksiyonların düzenlenmesi için başarıyla uygulanmıştır 29,30,31,32,33,34,35. Bununla birlikte, bu sistemler genellikle iki proteinin optimize edilmiş eşmolar ekspresyonunu gerektirir ve bu da uygulamalarını daha zor hale getirir. LightR sistemi kullanılarak allosterik regülasyon, tek bir protein içinde elde edilir ve böylece hücre sinyalizasyonunun sorgulanması için çok daha çok yönlü bir yaklaşım sağlar.

LightR anahtarının farklı protein sınıflarına geniş uygulanabilirliği, kısmen, LightR alanı içindeki farklı modüllerin optimizasyonu yoluyla elde edilir. LightR'yi ilgilenilen proteine bağlayan bağlayıcılar ve LightR içindeki iki VVD alanını birbirine bağlayan bağlayıcı (VVD arası bağlayıcı) düzenlemenin verimliliğini etkileyebilir. Inter-VVD esnek bağlayıcı (GGS)4G(GGS)3 seçimi, LightR alanı içindeki VVD monomerlerinin ilişkilendirilmesini ve ayrışmasını sağlamak için yeterli esneklik ve uzunluk sağlar. Bu bağlayıcı, şimdiye kadar hedeflenen tüm proteinlerin başarılı bir şekilde düzenlenmesini sağlamıştır. Bununla birlikte, LightR alanının karanlıkta proteini yeterince etkisiz hale getirmediği durumlarda, LightR kelepçesinin açılmasını arttırmak için VVD alanlarını daha da ayrı tutacak ve böylece enzimi inaktif tutacak daha sert bir bağlayıcı eklenebilir. Bağlayıcı, VVD'lerin dimerizasyonunu ve hedeflenen proteinin aktivasyonunu sağlamak için hala yeterli esnekliği korumalıdır. LightR'yi ilgilenilen proteine bağlamak için, LightR alanının N ve C terminallerine eklenen kısa esnek bağlayıcılar, GPGGSGG ve GSGGPG kullanıyoruz. Bağlantıda yeterli esneklik sağlarlar, böylece hedef proteinin geri dönüşü olmayan bir şekilde bozulmasını önlerler. Yine de, karanlıkta hedeflenen proteinin bozulmasını sağlarken, ışıkta protein fonksiyonunun restorasyonunu kolaylaştıracak kadar kısadırlar. Bu bağlayıcılar, birçok protein uygulaması için LightR tarafından düzenlemeyi destekler. Bununla birlikte, bu bağlayıcıların karanlıkta proteinin yeterli inaktivasyonunu sağlayamadığı bazı durumlarda, bağlayıcıların kısaltılması faydalı olabilir. Bu tür bir Bağlayıcı kısalması, esnekliği azaltabilir ve karanlıkta açık LightR kelepçesinin neden olduğu bozulmayı artırabilir, böylece herhangi bir sızıntıyı en aza indirebilir. Bununla birlikte, bu ayarlama, yanan durumdaki potansiyel yapısal bozulmalar nedeniyle enzimin maksimum aktivitesini tehlikeye atabilir. Alternatif olarak, yerleştirme döngüsündeki birden fazla amino asidin değiştirilmesi, konformasyonel kararsızlığın önemli bir endişe olmadığı durumlarda dengeli esnekliğin benzer faydalarını sağlayabilir.

Birçok kritik sinyalizasyon süreci geçici olarak etkinleştirilir veya salınımlı bir şekilde düzenlenir 36,37,38,39,40,41,42,43. LightR aracının ayarlanabilirliği, karmaşık sinyalizasyon modellerini taklit etmemize olanak tanır ve böylece zamansal olarak kontrol edilen biyolojik süreçlerin sorgulanması için güçlü bir yaklaşım sağlar. Bunu, I85V mutasyonunun her iki VVD alanına dahil edilmesi yoluyla LightR'nin kapalı kinetiğini modüle ederek başarıyoruz. Bu mutasyon, karanlık durumda VVD dimerinin yarı ömrünü 18.000 s'den 780 s'ye¹⁹ düşürür, böylece FastLightR-Enziminde daha hızlı inaktivasyonu kolaylaştırır.

Hızlı inaktivasyon kinetiği ayrıca hücre altı çözünürlükte protein aktivitesinin düzenlenmesini sağlar. Yavaş kapanma kinetiğine sahip LightR enzimleri, aktive edilmiş yapının hücre içi difüzyonu nedeniyle hücre altı aktivasyonun etkilerini gözlemlemeyi zorlaştırabilir. Hızlı kapanma kinetiği ile, yerel aydınlatma bölgesinin ötesine yayılan herhangi bir FastLightR enzimi hızlı bir şekilde etkisiz hale getirilecektir. Araştırmacılar, belirli hücre altı bölgeleri seçici olarak aktive ederek, karmaşık hücresel yollara ve sinyal ağlarına katkılarını daha iyi anlamak için proteinlerin yerel işlevleri hakkında bilgi edinebilirler.

FastLightR'ler, hücreler içindeki protein aktivitelerinin mekansal ve zamansal olarak sınırlı optik kontrolü için paha biçilmez olsa da, yavaşlama kinetiğinin arzu edilebileceği uygulamalar hala vardır. Yavaşlama kinetiğine sahip LightR, sürekli ve gelişmiş mavi ışıkla indüklenebilir aktivitenin gerekli olduğu çalışmalarda uygulanabilir. Bu uygulamalar, sürekli optogenetik aktiviteyi sürdürmek için yalnızca seyrek aydınlatma darbeleri gerektirecek ve böylece fototoksisite gibi sorunları da en aza indirecektir. Farklı senaryolar için, belirli bir deney için uygulamasını optimize etmek üzere LightR performansını ayarlamak için umut verici bir çözüm sunmak üzere çok çeşitli kinetik modifikasyonlar^10,18 tek başına veya birbiriyle birlikte uygulanabilir.

LightR enzimlerinin uygulanabilirliği, endojen muadillerinin biyolojik fonksiyonunu taklit etme yetenekleri ile belirlenir. Bu nedenle, substrat özgüllüklerini, aşağı akış sinyalizasyonunu ve hücre altı lokalizasyonunu değerlendirmek çok önemlidir. LightR-Src aktivitesinin özgüllüğü, paxillin ve p130Cas^22,23 dahil olmak üzere Src substratlarının fosforilasyonu ile doğrulanır. FastLightR-Src, döngüsel aydınlatma altında perinükleer bölge ile fokal adezyonlar arasında mekik dokuyarak hücrenin yayılmasına neden olur. Böyle bir fenomen, doğal Src kinaz ile yapılan daha önceki gözlemlere başarılı bir şekilde benzemektedir ve ayrıca mevcut aracın Src biyolojisini keşfetmedeki etkinliğini doğrulamaktadır 11,12,44,45,46,47. LightR-bRaf ayrıca MEK ve ERK kinazlar^24,25 gibi sinyal komplekslerini hedeflemede özgüllük gösterir. Ek olarak, FastLightR-bRaf, bRaf aktivasyonu^28'in bilinen bir sonucu olan mavi ışığa yanıt olarak ERK nükleer mekiğinin döngüsel salınımlarını sergiler. LightR-enzimlerinin endojen proteinlerin fonksiyonlarını yakından taklit etme yeteneği, fonksiyonlarının sorgulanması için paha biçilmez bir araç sağlar.

Yukarıdaki tartışma, LightR kinazların tanımlanmış hücresel bölmeler içinde kesin hücresel sinyal yollarını çoğaltma kapasitesini göstermektedir. Kinazlarla elde edilen bu başarı ile uyumlu olarak, LightR-Cre, P1 bakteriyofajından türetilen orijinal Cre rekombinazının işlevselliğini gösteren açıklayıcı bir model olarak hizmet eder. Cre rekombinaz, bölgeye özgü rekombinazların integraz ailesine aittir ve hedef DNA üzerinde loxP adı verilen iki tanıma bölgesi arasındaki rekombinasyonu kolaylaştırarak çalışır. Bu tür bir rekombinasyon, bir çaprazlama olayı yoluyla DNA'nın yeniden düzenlenmesine neden olur. Hedef DNA üzerindeki loxP bölgesinin yönlü oryantasyonuna bağlı olarak, çaprazlama olayı, kromozomal elementlerin⁴⁸ silinmesine, kopyalanmasına veya translokasyonuna yol açabilir. Cre rekombinaz, indüklenebilir gen regülasyonunun in vivo modellerinin üretilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır^49,50. Bununla birlikte, diğer spontan, kimyasal olarak indüklenebilir veya optogenetik olarak indüklenebilir cre rekombinaz sistemleri, hayvan modelinde DNA rekombinasyonunun ne zaman ve nerede indüklendiği konusunda sınırlı kontrol sağlar. LightR-Cre, DNA rekombinasyonunun sıkı zamansal ve mekansal kontrolünü sağlayarak bu sınırlamaların üstesinden gelir. Ayrıca, LightR'nin ayarlanabilirliği, istenmeyen sızıntı aktivitesini ortadan kaldırmamıza ve Cre'nin yüksek hassasiyetle düzenlenmesini sağlamamıza olanak tanır. Bu yetenekler, hastalık patolojisinin modellenmesi ve yeni terapötiklerin geliştirilmesi için yeni fırsatlar sunmaktadır.

LightR'nin kinazlarda ve DNA rekombinazında kesin olarak düzenlenmesi, bu aracın aynı stratejiye sahip birkaç proteine uygulanabileceğine dair kanıt sağlar. LightR, çeşitli enzim sınıflarını aktive etmenin yanı sıra, proteinleri belirli hücre altı bölgelere lokalize etmek, protein-protein etkileşimlerini indüklemek, mavi ışıkla indüklenebilir biyosensörler tasarlamak ve daha fazlası için allosterik modülasyonun kullanılabileceği diğer protein tiplerine potansiyel olarak bağlanabilir. Spesifik alan hedeflemenin allosterik avantajları nedeniyle, LightR'ler, biyolojik süreçleri incelemek için daha yüksek derecede ayarlanabilirlik elde etmek için aynı proteindeki diğer kemogenetik ve optogenetik yaklaşımlarla da birleştirilebilir.

LightR'yi diğer birçok proteine başarıyla uyguladık (hazırlanmakta olan el yazmaları). Bu başarıya rağmen, işlevsel bir LightR proteininin geliştirilmesi, özellikle uygun bir yerleştirme yeri seçiminde ve hedef proteinin biyolojik işlevini doğru bir şekilde taklit etmede potansiyel zorluklarla karşı karşıya kalabilir. Kristal yapı mevcut olmadığında, araştırmacılar tahmin edilen yapılara veya amino asit dizisi bilgilerine güvenmek zorundadır, bu da çoklu yerleştirme bölgeleri veya amino asit ikameleri olan proteinleri tasarlamak için daha fazla sorun giderme gerektirir. Ek olarak, tasarlanmış protein aktivitesi, hücre içindeki biyolojik işlevi doğru bir şekilde çoğaltmak için ince bir şekilde ayarlanmalıdır. Bu deneylerdeki başarı, genellikle titiz sorun giderme gerektiren ve hücre tipine, hedef protein sınıfına ve tipine ve ayrıca mavi ışık aktivasyonunun gücüne ve süresine bağlı olarak değişebilen endojen homologu ile tasarlanmış proteinin hassas fonksiyonel taklidine bağlıdır.

Sonuç olarak, LightR sistemi, protein fonksiyonu üzerinde hassas uzay-zamansal kontrol elde etmek için güçlü bir araçtır. Sağlamlığı, ayarlanabilirliği ve çok yönlülüğü, onu karmaşık hücresel süreçleri incelemek, sinyal yollarını çözmek ve gen düzenleyici mekanizmaları aydınlatmak için paha biçilmez kılar. LightR sistemi, araştırmacılara protein aktivitesi üzerinde benzeri görülmemiş bir kontrol sağlayarak, temel biyolojik süreçler hakkındaki anlayışımızı geliştirmeyi ve yenilikçi terapötik müdahalelerin önünü açmayı vaat ediyor.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
# 1.5 Cam Lamel 25 mm Yuvarlak	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tüpler	ABD Bilimsel	cc7682-3394
2x Laemmli Tampon			: 5.18 g  Tris-HCL, 131.5 mL gliserol, 52.5 mL %20 SDS, 0.5 g bromofenol mavisi, son pH 6.8
%4-20 Mini-PROTEAN TGX Prekast Jel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Tampon	Termo Bilimsel	F538L
60 LED Mikroskop Halka Işık	Boli Optik	ML46241324	Mavi LED, 60 mm çap, 5 W
Agaroz	GoldBiotech	A-201
Anti-ERK 1/2 Antikor	Hücre Sinyali	9102
Anti-GAPDH Antikor	invitrojen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antikoru	invitrojen	M11217
Anti-MEK	Hücre Sinyali	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Hücre Sinyali	2542
Anti-fosfo-Erk 1/2 T202 / Y204 Antikor	Hücre Sinyali	9101
Anti-fosfo-pY249 p130Cas	Hücre Sinyali	4014
Anti-fosfo-Y118 Paxillin	Hücre Sinyali	2541
Anto-fosfo-S217 / 221 MEK	Hücresi Sinyalizasyon	9121
Arduino Uyumlu Güç Kaynağı	Kurumsal Bilgisayar	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	& lrm;
Attofluor Hücre Odası	invitrojen	A7816
Benchmark Fetal Sığır Serumu (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Isı ile İnaktive Edilmiş Üçlü 0.1 ve mikro; m steril filtreli
bRaf-V600E-Dr	. John O'Bryan'dan
BSA	Altın Biyoteknoloji	A-420
Karbenisilin (Disodyum)	Altın Biyoteknoloji	C-103-25
CellMask Koyu Kırmızı plazma membran boyası	invitrojen	c10046
Koloni Ekranı MasterMix	Genesee	42-138
DH5a yetkin hücreler	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Merdiveni	AltınBiyo	D010-500
dNTP'ler	NEB	N04475
Dpn1 Enzimi	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland Reaktifleri
EGTA	Acros
FastLightR-bRaf-mVenüs	Addgene	# 162155
Sığır plazmasından fibronektin	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfeksiyon Reaktifi	Promega	E2692	Transfeksiyon reaktifi
Jel Yeşil Nükleik Asit Boyası	GoldBio	G-740-500
Jel Yükleme Boyası Mor 6x	NEB	B7024A
GeneJET Jel ekstraksiyon Kiti	Termo Bilimsel	K0692	Jel Ekstraksiyon Kiti
GeneJET Plazmid Miniprep Kiti	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Hücreleri	ATCC	CRL-11268
HeLa Hücreleri	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Röle	Dijital Kaydediciler	DLI 705020645490	Aydınlatma için AC / DC kontrol rölesi
Kanamisin Monosülfat	Altın Biyoteknoloji	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Ağar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Işık Sistemi	HQRP	884667106091218	LED panel lamba sistemi
LightR-bRaf-mVenüs	Ekle	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Ekle	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	CellGEO Komut Dosyalarını çalıştırmak için yazılım
Metamorf	Moleküler Cihazlar		Görüntüleme Analiz
Yazılımı MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Madeni Yağ	Sigma	M5310
Mini Hazırlık Seti	Gen Seçimi	96-308
Mini-PROTEAN TGX Prekast Jeller 12 kuyulu	Bio-Rad	4561085
Moleküler Biyoloji Sınıfı Su	Corning	46-000-CV
Çok Bantlı Polikroik Ayna	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Kimyasal	S271-3
PBS, Ca ve Mg 'siz;	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Dr. Channing Der'in Laboratuvarından Hediye, UNC
PCR Tüpleri	labForce	1149Z65	0,2 mL 8 şeritli tüpler ve kapaklar, sert şerit ayrı ayrı takılan kubbe kapakları
Phusion Plus DNA	Polimeraz Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	# 79987
Polygon 400 Desenli Aydınlatıcı	Mightex	DSI-G-00C
Astarlar	IDT
PVDF Membranlar	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF / Filtre Kağıdı Sandviçleri
T0.25% Tripsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodyum	Corning	25-053-CI
Tris-Asetat-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	Elektroforez için
UPlanSApo 40x Mikroskop Objektif	Olympus	1-U2B828
USB TTL Kutusu	Ulusal Aletler	6501	TTL arayüzü için
β-Merkaptoetanol	Fisher Chemical	O3446I-100