Yöntem makalesi

Mezenterik İskemi-Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Mezenterik Venüllerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İntravital Mikroskopi ile Görüntülenmesi

DOI:

10.3791/67264

⸱

27 Eylül 2024

 ,  ,  ,  , 
1Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center Mainz, Johannes Gutenberg-University Mainz, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Rhine-Main

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, mezenterik iskemi-reperfüzyon hasarını indüklemek ve mezenterik venüllerde nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) intravital mikroskopi kullanarak görüntülemek için bir yöntem sunar. Superior mezenterik arterdeki kan akışı 1 saat boyunca kısıtlandı, ardından reperfüzyon yapıldı ve lökosit yapışması ve NETosis'in doğrudan ölçülmesine izin verildi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İntestinal iskemi-reperfüzyon (I/R) yaralanması, mezenterik damarlara kısıtlı kan akımı sonucu oluşan doku hasarı ile karakterize, kötü prognozlu hem lokal hem de sistemik patolojilere yol açan akut bir durumdur. Hem iskemi hem de reperfüzyon, inflamatuar hücrelerin patolojinin anahtar düzenleyicileri olarak görev yaptığı bir dizi hücresel ve moleküler yanıtı tetikler. İskemik endotel ile bu etkileşimlere çoklu adezyon reseptörleri aracılık eder. Bu patolojiyi taklit etmek ve ilgili moleküler yolakları araştırmak için çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bu çalışmada, lökosit yuvarlanmasını, adezyonu ve nötrofil hücre dışı tuzak (NET) oluşumunu görselleştirmek için I/R yaralanmasının mikrocerrahi modeli intravital mikroskopi ile birleştirilmiştir. Bu model, PAR1'in iskemiden 1 saat sonra ve reperfüzyondan hemen sonra lökosit yuvarlanması ve NET oluşumu üzerindeki etkisini değerlendirmek için endotelyal PAR1 (F2r) eksikliği olan transgenik farelere uygulanır. İn vivo, Akridin Turuncu lökosit boyaması kullanıldı ve NET'ler bir nükleik asit boyası kullanılarak görüntülendi. İlginç bir şekilde, endotelyal PAR1 reseptörü olmayan farelerde azalmış lökosit yapışması ve NET oluşumu gözlenmiştir. Bu model, I/R yaralanmasında yer alan ana düzenleyicilerin in vivo analizini sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akut mezenterik iskemi (AMİ), çölyak eksenindeki trombüs veya superior veya inferior mezenterik arter nedeniyle mezenterde kan akımının azalması ile karakterize, yüksek mortalite riski2 olan nadir bir patoloji1'dir. Olguların %60-70'inde akut barsak iskemisinden tromboz veya embolizasyona bağlı superior mezenterik arterin akut tıkanıklıkları sorumludur3. Buna karşılık, vakaların% 5-15'inde mezenterik venöz tromboz, superior mezenterik veni ve daha nadiren inferior mezenterik veni içeren mezenterik iskemiyi açıklar4. İskemiden kaynaklanan hipoksi ve malnütrisyon, hücresel düzeyde enerji metabolizması bozukluklarına yol açar5. Örneğin, bozulmuş mitokondriyal fonksiyon, hücresel ölüm mekanizmalarını başlatan çoklu sinyal yollarını aktive eder6. Hızlı reperfüzyon aerobik metabolizmanın restorasyonunu sağlasa da, iskemik bir bölgeye kan akışının restorasyonu genellikle reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi7, aşırı kalsiyum yükü8, endotel disfonksiyonu9 ve inflamatuar yanıtlar10 nedeniyle geniş doku hasarına neden olur.

İskemi-reperfüzyon (I/R) hasarı11 sırasındaki moleküler mekanizmaları aydınlatmak için superior mezenterik arterin geçici vasküler oklüzyonunu kullanan birçok deneysel hayvan modeli kurulmuştur. Bu tür modellerin intravital mikroskopi (IVM) ile birlikte kullanılması, altta yatan hücresel etkileşimler ve hastalığın ilerlemesi hakkında bilgi edinmek için esastır11. Bağırsak bariyeri disfonksiyonu iskemi12'den kısa bir süre sonra gözlenir, epitel bütünlüğünükaybeder 13 ve mezenterik lenf düğümleri, dalak, karaciğer ve böbrek gibi ekstraintestinal bölgelere bakteri translokasyonu ile sonuçlanır12,14. Reperfüzyon mukozal hasarı daha da şiddetlendirir15. Arteriyollerdeki enflamatuar bir yanıt, L-selektin16, P-selektin (CD62P)17, trombosit GPIIb/IIIa ve fibrinojen18 gibi moleküllere bağlı olan lökositlerin endotel hücre tabakasına yuvarlanması ve sıkı bir şekilde yapışması ile kendini gösterir. İlginç bir şekilde, lökositin mezenterik venüllere yapışması, bağırsak mikrobiyotası19 ve Toll benzeri reseptör 4 sinyali10'un varlığından etkilenir. I/R hasarı ayrıca nötrofil hücre dışı tuzak (NET) oluşumunutetikler 10. Nötrofiller gibi aktive edilmiş lökositlerden kaynaklanan hücre dışı DNA'nın terapötik hedeflemesi, bağırsak I / R hasarınınsonucunu iyileştirir 20. Karaciğerde, I/R yaralanması, yerleşik mikrofajlar21 tarafından ateşlenir ve mikroRNA inhibisyonu, apoptozu22 önemli ölçüde azaltır. Dikkat çekici bir şekilde, mezenterdeki I/R hasarı, revaskülarizasyondan sonra geri dönüşümlü ve düzelen bağırsak disbiyozu ile sonuçlanır23.

Endotel ayrıca I/R hasarının zararlı etkilerinden de etkilenir ve ROS bu süreçte çok önemli bir rol oynar24. Lökositin endotel hücre tabakasına yapışması, endotel hasarı ve nitrik oksit (NO) metabolizmasında değişiklikler gözlenir9. Bununla birlikte, ilgili moleküler yollar henüz tam olarak keşfedilmemiştir.

Proteaz ile aktive olan reseptör 1 (PAR1, F2r), endotel hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücreler tarafından eksprese edilen bir membran reseptörüdür ve enflamatuar durumlar sırasında aktive edilir25. Aktivasyonu, serin proteazlar reseptörü N-terminalinde parçaladığında, bağlı ligandı açığa çıkardığında meydana gelir ve bu da molekül26'nın ikinci hücre dışı döngüsüne bağlanarak reseptörü aktive eder. Endotelyal protein C reseptörü (EPCR)-PAR1 sinyal yolu, endotelyal NO homeostazını etkiler ve periferik iskemi27'de kan akışının restorasyonunu kolaylaştırır.

Bu çalışmada, lökosit yuvarlanmasını, adezyonunu ve NET oluşumunu görselleştirmek için endotel hücresine özgü PAR1 eksikliği ile karakterize genetik bir fare modeline I/R hasarı uygulandı. I/R mikrocerrahisi sonrası genetik fare modeli ve intravital mikroskopi kombinasyonu, hastalığın ilerlemesinde rol oynayan spesifik hücre tiplerini vurgulayarak değerli bilgiler sağlar. Genetik fare modellerine I/R hasarının uygulanması, hastalığın seyrini iyileştirmek için kullanılabilecek potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesinde etkilidir. Ayrıca, NETosis'te endotelyal PAR1'in önemi gösterilmiştir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farelerle ilgili tüm prosedürler, hayvanların mevzuatı yerel komitesi tarafından onaylandı (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Almanya; G21-1-041). 6-8 haftalık erkek ve kız B6. Çalışma için FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc fareleri kullanıldı. F2r'nin (PAR1) endotel hücresine özgü regülasyonu, VE-Cadherin Cre promotörü28 aracılığıyla gerçekleşir. Bu çalışmada, flox-F2r x VE-Cadherin Cre+ (F2RΔEC), endotel hücrelerinde azalmış F2r (PAR1) ekspresyonu sergiledi ve flox-F2r x VE-Cadherin Cre- (WT) normal endotelyal F2r (PAR1) seviyelerini eksprese etti. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Ameliyat için hazırlık

  1. Gerekli cerrahi aletleri sterilize edin (ekstra dar makas düz, forseps, vasküler kelepçe vb.).
  2. Oksijen ve izofluran bazlı anestezi sistemini bir burun konisi ve bir ısıtma plakası ile hazırlayın.

2. Hayvan hazırlama

  1. Hayvanı tartın.
  2. Anestezi uygulayın: Midazolam (5 mg / kg), medetomidin (0.5 mg / mL) ve fentanil (0.5 mg / kg) içeren bir çözeltinin intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu yoluyla fareleri uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokollere göre).
  3. Küçük hayvanlar için elektrikli tıraş makinesi ile boyun ve karın operasyon bölgesindeki tüyleri alın.
  4. Fareyi ısıtma yastığının sırtına yaslanmış olarak konumlandırın ve bir burun konisi aracılığıyla oksijen sistemine bağlayın. Farenin uzuvlarını cerrahi bantla ısıtılmış bir pede sabitleyin. Lateks burun konisi zarının farenin başının üzerine sıkıca oturduğundan emin olun. Kemirgenlere özgü bir termometre kullanarak hayvanın vücut ısısını rektal olarak izleyin.
  5. Boyun cerrahi bölgesinden kalan tüyleri almak için tüy dökücü krem sürün ve operasyon bölgesinin cildini %70 etanol ile silin.
  6. Hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için bir ayak parmağı sıkışma testi (pedal refleksi) yapın.

3. Cerrahi prosedür

  1. Şah damarında kateter implantasyonu
    1. Soluk borusu üzerinde enine bir kesi (~ 0,5 cm) yapın, boynu kaplayan cildi çıkarın ve sağ juguler veni izole edin.
    2. Yaklaşık 5 cm'lik ipek bir iplik kullanın, damarın distal ucunu kapatın ve cerrahi forseps ile sabitleyin. Damarın yaklaşık 2 cm altına üç ipek iplik yerleştirin: biri distal uca yakın ve ikisi juguler venin proksimal ucuna yakın. Cerrahi bir düğüm bağlayın, ancak damarı kapatmayın.
    3. % 0.9 NaCl ile doldurulmuş ve 1 mL şırınga ile tıkalı bir polietilen kateter (0.28 mm ID, 0.61 mm OD) hazırlayın. İkinci ve üçüncü düğümler arasında bir delik açmak için makas kullanın ve kateteri şah damarına implante edin. Kateterde kan bulunduğundan emin olmak için şırıngayı aspire edin.
    4. İpek ipliği bağlayarak kateteri damara sabitleyin ve güvenli bir şekilde bağlandığından emin olun. Şırıngayı sabitlemek için tıbbi bant kullanın.
    5. Akridin portakalı hazırlayın: 1 mL'lik bir şırıngada steril salin (0.5 mg / mL nihai konsantrasyon) ile 1: 4 a 2 mg / mL stok çözeltisini seyreltin. Şırıngayı karanlıkta tutun ve fareye 50 μL enjekte edin.
    6. Nükleik asit boyası hazırlayın: 1 mL'lik bir şırıngada steril salin (5 μM nihai konsantrasyon) ile 1:1000 a 5 mM stok çözeltisini seyreltin. Şırıngayı karanlıkta tutun ve fareye 50 μL enjekte edin.
    7. Enjekte edin vivo Acridine portakalı (50 μg / μL, fare başına 50 μL) lekeli lökositleri ve lekeli nötrofil hücre dışı tuzaklara (NET'ler) benzer şekilde hücre dışı bir DNA floresan boyasını görselleştirmek için juguler ven kateteri yoluyla (fare başına 5 μM, 50 μL). NET'ler ve lökositler aynı anda görüntülenir.
  2. Mezenterik I/R yaralanma modeli
    1. Karın cildini% 70 etanol ile dezenfekte edin.
    2. Cerrahi makas kullanarak linea alba boyunca 3-5 cm'lik bir laparotomi yapın.
    3. Tuzlu suyla nemlendirilmiş iki pamuk ucu kullanarak bağırsağı nazikçe çıkarın ve minimum yağ kapsama alanı olan bir yer belirleyin. Arka plan sinyalini azaltmak için ince bağırsak dallarını siyah bir hamurun üzerine yerleştirin.
    4. Videoları I/R'den (pre iskemi) önce edinin.
    5. NaCl ile nem sıkıştırın ve bağırsağı içine yerleştirin. Adım 5.6 sırasında bağırsağın kompres ile çevrili olduğundan ve nemin korunduğundan emin olun.
    6. Superior mezenterik arteri küçük bir vasküler klemp ile tıkayın.
    7. Tuzlu suyla nemlendirilmiş pamuklu çubuklar kullanarak bağırsağı nazikçe karın boşluğuna geri itin ve nem ve sıcaklık kaybını önlemek için karın duvarını kapatmak için 7-0 dikiş kullanın. İskemiyi 60 dakika boyunca koruyun, anesteziyi en az 20 dakikada bir kontrol edin.
    8. 1 saat sonra, kelepçeyi çıkararak reperfüzyonu başlatın.
      NOT: İskemi prosedürünün uygun şekilde yürütülmesi gözle görülür bir değişikliğe neden olur. Başlangıçta, etkilenen alan kan akışının olmaması nedeniyle soluk veya beyaz görünecektir. Kelepçenin çıkarılmasından sonra, kan akışı yavaş yavaş iskemik bölgeye geri dönecek ve bu da normal rengini geri kazanacak ve başarılı bir oklüzyon anlamına gelecektir. İskemi aşaması boyunca fareyi sürekli olarak yakından gözlemlemek zorunludur.
    9. İskemik dönemi takiben, kırpılan bölgeye birkaç damla salin uygulayın, ardından bir klips uygulayıcı kullanarak mikrovasküler klipsleri nazikçe çıkarın.
    10. Tuzlu suyla nemlendirilmiş pamuk uçları kullanarak, bağırsağı tekrar nazikçe çıkarın, damarın küçük dallarını siyah bir hamur üzerine yerleştirin, tekrar 50 μL Akridin portakalı enjekte edin ve aynı damarın aynı yerde (iskemi sonrası) videolarını çekin.

4. İntravital yüksek hızlı video epifloresan mikroskobu

  1. Uzun mesafeli bir kondansatör, bir monokromatoratör, 10x suya daldırma objektifi ve şarj bağlantılı bir cihaz kamerası ile donatılmış yüksek hızlı geniş alanlı bir floresan mikroskobu ile lökositleri ve NET'leri görselleştirin. Görüntü alımı, 30 ms pozlama süresi ve Alexa Fluor 488 (495/519) ve Rhodamine Red (570/590) filtreleri ile gerçekleştirildi.
  2. Görüntü elde etmek ve analiz etmek için görüntüleme yazılımı kullanın.
  3. 0,06 mm²'lik bir ilgi alanı içinde hücre alımını ölçün.
  4. Yapışık lökositleri, 20 saniyelik bir gözlem süresi boyunca sabit kalan veya endotel astarına bağlı hücreler olarak ölçün.
  5. NET'leri hem lökosit hem de hücre dışı nükleik asit floresan boyaları ile etiketlenmiş hücre dışı yapılar olarak tanımlayın.
  6. Deneyin sonunda rahim ağzı çıkığı ile hayvanlara ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).

5. Karaciğer endotel hücresi (LEC) izolasyonu ve kantitatif RT-PCR

  1. LEC'leri manyetik hücre sıralama (MACS) yoluyla izole edin29.
  2. Toplam RNA'yı izole edin.
  3. 2 μg toplam RNA'yı 2 μL RT Tamponu, 0.8 μL dNTP Karışımı, 2 μL RT Rastgele Primer, 1 μL Ters Transkriptaz ve 4.2 μL steril damıtılmış H2O ilekarıştırarak tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi 27 gerçekleştirin.
  4. cDNA transkripsiyonu aşağıdaki koşullar uygulanarak gerçekleştirildi: 25 °C'de 10 dakika, 37 °C'de 120 dakika, 85 °C'de 5 dakika.
  5. qPCR için 20 ng cDNA kullanın.
  6. Aşağıdaki astarları kullanın: F2r (ileri): TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r (geri): CCAGCAGGACGCTTTCATTTTT, L32 (ileri): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (geri): TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. Aşağıdaki koşulları kullanın: 95 °C 30 sn, 45 döngü (10 sn için 95 °C, 25 sn için 60 °C), ΔΤ 1 °C ile 6 sn boyunca 60 °C ila 95 °C.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lökosit yuvarlanması ve adezyonu ile NET oluşumu üzerindeki endotel hücresine bağlı etkileri incelemek için, başlangıçta, endotel hücrelerinde VE-Cadherin Cre ile indüklenebilir F2r eksikliğinin etkinliği incelenmiştir. Hepatik endotel hücrelerini izole etmek için manyetik hücre sınıflandırması yapıldı. Daha sonra, RNA izole edildi, ardından kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) izledi. VE-Cadherin promotörü kontrolü altında eksprese edilen Cre rekombinazının bulunmadığı F2rΔEC fareleri, WT kontrollerine kıyasla önemli ölçüde azalmış F2r (PAR1) mRNA seviyeleri (yaklaşık üçte bir) göstermiştir (Şekil 1).

Fare hattındaki eksiklik doğrulandıktan sonra, vasküler endotel hücreleri tarafından eksprese edilen PAR1'in intravital mikroskopi ile görüntülenen lökosit yuvarlanması ve adezyonu üzerindeki etkisini incelemek için mezenterik I/R hasarı gerçekleştirildi (Şekil 2A,B). 1 saatlik iskemi sonrasında, klemp çıkarıldı ve damarın tekrar perfüze olmasına izin verildi. Lökosit yuvarlanması ve yapışması gözlendi ve kaydedildi (beyaz oklarla gösterilen yeşil lekeli). Her iki grup da I/R hasarından sonra yapışık lökosit sayısında artış gösterse de, endotelyal F2r (PAR1) eksikliği, I/R ile aktive olan mezenterik endotelyuma belirgin ancak önemli ölçüde azalmamış lökosit yapışması ile sonuçlandı, bu da iskemik mezenterik venüllere lökosit alımında endotelyal PAR1 aktivasyonunun aktif bir rol oynadığını düşündürmektedir (Şekil 2C).

Bir sonraki amaç, endotelyal PAR1 ekspresyonunun I/R hasarına bağlı NET oluşumunu düzenleyip düzenlemediğini incelemekti. Bu nedenle, hücre dışı nükleik asitler hücre geçirimsiz bir boya30 ile boyandı ve üretilen NET'ler intravital mikroskopi (siyah oklarla gösterilen) kullanılarak görüntülendi (Şekil 2A,B). I/R hasarından sonra, NET'ler sadece endotel hücrelerinde normal PAR1 seviyelerini eksprese eden WT grubunda gözlendi, bu da NET1'in NETosis'te düzenleyici bir rolü olduğunu gösteriyor (Şekil 2C, D). Özellikle, endotelyal F2r ekspresyonu baskılandığında, I/R ile yaralanan mezenterik venüllerde NET yoktu.

figure-results-1
Şekil 1: F2r (PAR1) mRNA ekspresyonu. L32 temizlik genine göre WT (n = 6) ve F2rΔEC (n = 9) farelerinin F2r

figure-results-2

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İntravital mikroskopi ile kombine edilen mezenterik I/R hasarı, 1 saatlik iskemi sonrası lökositlerin ve NET'lerin in vivo analizi için endotel hücrelerinde F2r (PAR1) eksikliğinin genetik fare modeline uygulandı. Mezenterik I/R yaralanma modeli, hem iskemi hem de reperfüzyon süreleri dakikalar ile birkaç saatarasında değişen kemirgenlerde sıklıkla kullanılır 23,31 ve inflamatuar sonucu32 ve mortaliteyi33 etkiler. Model ayrıca mikrobiyota 19,34, bağışıklık reseptörleri 10,35,36,37, cinsiyet 38,39 ve35 yaş gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Değişen I / R sürelerinin yanı sıra, bu modeldeki bir başka değişken, bağırsağın farklı bölümlerinin yaralanmaya farklı tepkisidir ve ince bağırsak, kolon40'tan daha fazla mukozal hasar gösterir. İskemik bölgeyi etkileyen mikrovasküler klipsin konumlandırılması, yöntemin tekrarlanabilirliği için çok önemlidir32,33. Daha da önemlisi, süperior mezenterik arter tıkanıklığı kollateral akış kesintisi ile birleştiğinde, iskemi süresi ile tutarlı bir şekilde ilişkili mortalite oranları verir41.

Bu çalışmada, fareler 1 saat iskemiye maruz bırakıldı ve endotelyal F2r ekspresyonunun yokluğunda iskemik durum tarafından tetiklenen erken inflamatuar yanıtı incelemek için reperfüzyondan hemen sonra in vivo lökosit yapışması ve NET oluşumu görüntülendi. Bu yöntemlerin genetik fare modellerine uygulanması, belirli hedef moleküllerin hem iskemi sonrası hem de reperfüzyon sırasında hücresel davranışı ve inflamatuar yanıtı nasıl etkilediğinin araştırılmasına olanak tanır.

Protokolde bağırsak bütünlüğünün korunması da dahil olmak üzere birkaç kritik adım vardır. Doku hasarını önlemek için bağırsakların kullanımı nazikçe yapılmalıdır. Bu amaçla, nemli pamuklu çubuklar, bağırsağı karın boşluğundan geçici olarak ayırmak için uygun bir araçtır. Bağırsağın karın içinde yeniden konumlandırılana kadar nemli kalması çok önemlidir. Küçük kullanım yaralanmaları, trombositler ve endotel hücreleri gibi çeşitli hücre tiplerinin aktivasyonunu tetikleyebilir ve bu da sonuçları etkileyebilir.

Tutarlılık için, iskemi öncesi ve sonrası aynı bağırsak segmentleri bölgesini görselleştirmek çok önemlidir. Bu zor olabilir, çünkü bağırsak iskemi sonrası karın boşluğunda yeniden konumlandırılır. Bu sorunu çözmek için bir yaklaşım, iskemiden önce görüntülenen bağırsak kısmına küçük bir parça nemli kompres yerleştirmektir.

Lökosit yuvarlanması ve yapışmasının yanı sıra in vivo NET oluşumunu görselleştirmek için, farelere juguler ven yoluyla hem lökosit hem de nükleik asit floresan boyası enjekte edildi. Lökosit boyası (Malzeme Tablosuna bakınız), beyaz kan hücrelerine bağlanan ancak kırmızı kan hücrelerine bağlanmayan hücre geçirgen bir metakromatik floresan boyadır ve lökositleri in vivo 17,42 boyamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Boya intravenöz olarak uygulanır ve saniyeler içinde güçlü lökosit boyaması sağlar. Bununla birlikte, özgüllük, endotel hücreleri gibi diğer çekirdekli hücreleri de lekelediği için bir sınırlama olabilir. Bununla birlikte, dolaşım hücreleri, yıkama etkisi nedeniyle lekelenmeyi daha uzun süre korur43. Nükleik asit floresan boyası (Malzeme Tablosuna bakınız), NET oluşumunu görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan hücre geçirimsiz bir nükleik asit boyasıdır30,44,45. Ayrıca intravenöz olarak uygulanabilir, yüksek afinite ile bağlanır ve kullanımı hızlı ve kolaydır. Yine, boya sağlam olmayan bir zara sahip herhangi bir hücreye bağlanacağı için özgüllük bir dezavantajdır. İdeal olarak, özgüllüğü arttırmak için bir nötrofil markörü (ör., CD15, CD11b) veya bir NETosis markörü (ör., anti-citH3 antikorları) ile birleştirilmelidir. Bu boyalar, laboratuvar hayvanlarının mezenterik venüllerindeki lökositlerin in vivo olarak görüntülenmesini sağlar.

Tekniğin en büyük sınırlaması, bağırsak kılcal damarlarının görselleştirilmesini kısıtlayan ve görüntü elde edilmesini büyük ölçüde engelleyen viseral yağın varlığıdır. Bu komplikasyonu önlemek için, viseral yağ oluşumunu azaltmış genç deney hayvanlarının (6-8 haftalık) kullanılması gerekir. Ek olarak, ex vivo histolojik analiz, in vivo boyama kullanımı ile engellenir. Diğer bir sınırlama, bağırsak mikrobiyotasının ve diyetinin bu model üzerindeki etkisidir ve bu, farklı fare yetiştiricilikleri arasında büyük farklılıklar gösterebilir46. Bu sınırlamayı ele almak için, gnotobiyotik fare modellerinin incelenmesi10 olarak kabul edilebilir.

Bu çalışmada, iskemi sonrası ani hücresel yanıt araştırıldı ve aktive mezenterik endotelyuma lökosit birikiminde azalma ve in vivo NET oluşumu gözlendi. İskemiden 1 saat sonra intravenöz DNaz uygulamasıyla NET bozulması, erken proinflamatuar yanıtı azaltır ve bağırsak bariyeri bozulmasını iyileştirir47. Not olarak, trombin aktivitesini48 inhibe eden bir transmembran glikoprotein olan trombomodulin ile tedavi, ciddi bağırsak I / R hasarı olan farelerin sağkalımını iyileştirdi, endotel disfonksiyonunun enflamatuar tepkisini azalttı ve uzak organlarda yoğun histon birikimini azalttı49. Burada, endotelyal trombin reseptörünün I/R sonucunu etkilediği gösterildi ve hastalık patolojisinin önemli mediatörlerini araştırmak için genetik olarak tasarlanmış farelerde bağırsak I/R yaralanma modelini intravital mikroskopi ile birleştirmenin önemini vurguladı.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması açıklamaz.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.R., Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz ve ReALity (proje MORE), BMBF Cluster4Future CurATime (proje MicrobAIome; 03ZU1202CA), Wilhelm Sander-Stiftung (Nr. 2022.131.1) ve Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung (DZG) İnovasyon Fonu "Microbiome" (81X2210129) tarafından sağlanan finansmanı kabul eder. C.R., Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi'nde (DZHK) bir bilim insanıdır. C.R., Translasyonel Vasküler Biyoloji Merkezi (CTVB), İmmünoterapi Araştırma Merkezi (FZI) ve Mainz Johannes Gutenberg Üniversitesi'ndeki Potentialbereich EXPOHEALTH üyesidir. C.R., DFG Araştırma Birimi 5644 INFINITE'in (RE 3450/15-1) bir üyesidir. C.R., Mainz Johannes Gutenberg Üniversitesi'ndeki Gutenberg Araştırma Koleji'nden bir Burs kazandı. K.K., DZHK "Kadın Bilim İnsanlarının Teşviki" Mükemmeliyet Programı tarafından desteklenmektedir ve Young DZHK'nın bir üyesidir. Z.G ve O.D., Mainz Translasyonel Biyotıp Araştırma Okulu'nda (TransMed) doktora öğrencileridir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Akridin portakalSigma-Aldrich   A-6014
96 oyuklu plaka Multiply PCR-Platten Sarstedt721977202.00
Kemirgenler için Anestezi SistemleriGROPPLER medizintechnikUni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVMB Braun Melsungen53402101
siyah hamurStaedtlermodelleme kili
CD146 Mikro boncuklar, fareMiltenyi Biotec130-092-007
cellSensOlympusOlympus cellSense Dimension Desktop 2.3yazılımı
şarj bağlantılı cihaz kamerasıHamamatsu PhotonicsORCA-R2kamera
pamuklu çubuklarBö ttger09-119-9100
Kavisli Hemostat 125mm / 5 "Indigo Instruments 22466
Tüy dökücü kremBalyauygulanamaz
Dorbene Vetzoetis
Dumont ForsepsGüzel Bilim Araçları11251-35
Etanol pa 99,5 %Roth5504.20
Ekstra Dar Makas – Düz/Keskin-Keskin/10.5FST14088-10
FentanilJanssen-Cilag GmBH
Forseps "Dumont #5" (Inox, uç 0,1 mm, uzunluk 11 cm)FST11251-20
GentleMACS C TüpleriMiltenyi Biotec130-093-236
GraphpadprismGraphpadPrism 10yazılım
izofluranı Piramal4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5mlBioRad1725125.00
Leukofix tıbbi bantBSNMedical0213600
Karaciğer Ayrışma Kiti, fareMiltenyi Biotec130-105-807
LS-Ayırma sütunları MACSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Akıllı Süzgeç 100 ve mikro; mMiltenyi Biotec130-098-463
Microseal B Conta ContalarıBioradMSB1001
Midazolamhameln5918501.00
NaClBraun2350748
İğne tutucuFST12001-13
Emilmeyen Örgülü İpek Sütür, Boyut: 7/0, 91 Metre Güzel Bilim Araçları18020-70
Olympus BX51WI floresan mikroskobuOlympusmikroskobu
Tüp Şeritleri için PCRSarstedt72985002.00
PCR Tüp KapaklarıSarstedt65989002.00
Vinil KateterSmith Medical Deutschland GmbH800/100/100
Prolene (8648G), Polipropilen 6-0, Nahtmalzeme Johnson & Johnson Medical GmbH 8695H
Relia Prep RNA Miniprep SistemleriPromegaZ6112
Ters Tanscription Kiti (Yüksek Kapasiteli cDNA)Applied Biosystems4368813.00
Okul ölçeği KERN & SOHN GmbHEMB 500-1
Yaylı Makas - Yana AçılıFST15006-09
Stereo mikroskopLeicaM50
Düz Kanama Durdurucular 135mm/5.5"Indigo Instruments 22468
Şırınga 1 mLBraun9166017V
SYTOX TuruncuThermo Fisher ScientificS11368
Sıcaklık Kontrol Cihazı TC-1000FMI Fö hr Medical Instruments GmbHuygulanamaz
Doku Forseps - 1x2 DişFST18057-14
vasküler kelepçeGüzel Bilim Araçları18055-02
Vetiva miniWAHL1584-0480

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cudnik, M. T., et al. The diagnosis of acute mesenteric ischemia: A systematic review and meta-analysis. Acad Emerg Med. 20 (11), 1087-1100 (2013).
  2. Kassahun, W. T., Schulz, T., Richter, O., Hauss, J. Unchanged high mortality rates from acute occlusive intestinal ischemia: Six-year review. Langenbecks Arch Surg. 393 (2), 163-171 (2008).
  3. Florim, S., Almeida, A., Rocha, D., Portugal, P. Acute mesenteric ischemia: A pictorial review. Insights Imaging. 9 (5), 673-682 (2018).
  4. Kumar, S., Sarr, M. G., Kamath, P. S. Mesenteric venous thrombosis. N Engl J Med. 345 (23), 1683-1688 (2001).
  5. Dugbartey, G. J. Cellular and molecular mechanisms of cell damage and cell death in ischemia-reperfusion injury in organ transplantation. Mol Biol Rep. 51 (1), 473(2024).
  6. Ikeda, H., et al. Apoptosis is a major mode of cell death caused by ischemia and ischemia/reperfusion injury to the rat intestinal epithelium. Gut. 42 (4), 530-537 (1998).
  7. Gutierrez-Sanchez, G., Garcia-Alonso, I., Gutierrez Saenz De Santa Maria, J., Alonso-Varona, A., Herrero De La Parte, B. Antioxidant-based therapy reduces early-stage intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Antioxidants (Basel). 10 (6), 853(2021).
  8. Jia, Z., Chen, Q., Qin, H. Ischemia-induced apoptosis of intestinal epithelial cells correlates with altered integrin distribution and disassembly of f-actin triggered by calcium overload. J Biomed Biotechnol. 2012, 617539(2012).
  9. Gordeeva, A. E., et al. Vascular pathology of ischemia/reperfusion injury of rat small intestine. Cells Tissue Organs. 203 (6), 353-364 (2017).
  10. Ascher, S., et al. Gut microbiota restricts netosis in acute mesenteric ischemia-reperfusion injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 40 (9), 2279-2292 (2020).
  11. Kiouptsi, K., Casari, M., Mandel, J., Gao, Z., Deppermann, C. Intravital imaging of thrombosis models in mice. Hamostaseologie. 43 (5), 348-359 (2023).
  12. Wang, B., Huang, Q., Zhang, W., Li, N., Li, J. Lactobacillus plantarum prevents bacterial translocation in rats following ischemia and reperfusion injury. Dig Dis Sci. 56 (11), 3187-3194 (2011).
  13. Guan, Y., Worrell, R. T., Pritts, T. A., Montrose, M. H. Intestinal ischemia-reperfusion injury: Reversible and irreversible damage imaged in vivo. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297 (1), G187-G196 (2009).
  14. Joao, S. A., Medeiros, A. C., Diniz, S. O. F., Cardoso, V. N., Brandt, C. T. Translocation of 99mTc labelled bacteria after intestinal ischemia and reperfusion. Acta Cir. Bras. 19 (4), (2004).
  15. Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6 Pt 1), G749-G753 (1986).
  16. Kurose, I., et al. Molecular determinants of reperfusion-induced leukocyte adhesion and vascular protein leakage. Circ Res. 74 (2), 336-343 (1994).
  17. Massberg, S., et al. Platelet-endothelial cell interactions during ischemia/reperfusion: The role of p-selectin. Blood. 92 (2), 507-515 (1998).
  18. Salter, J. W., Krieglstein, C. F., Issekutz, A. C., Granger, D. N. Platelets modulate ischemia/reperfusion-induced leukocyte recruitment in the mesenteric circulation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281 (6), G1432-G1439 (2001).
  19. Bayer, F., et al. Colonization with altered schaedler flora impacts leukocyte adhesion in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Microorganisms. 9 (8), 1601(2021).
  20. Boettcher, M., et al. Therapeutic targeting of extracellular DNA improves the outcome of intestinal ischemic reperfusion injury in neonatal rats. Sci Rep. 7 (1), 15377(2017).
  21. Li, T. T., et al. Fbxw5 aggravates hepatic ischemia/reperfusion injury via promoting phosphorylation of ask1 in a traf6-dependent manner. Int Immunopharmacol. 99, 107928(2021).
  22. Huang, Z., et al. Inhibition of mir-450b-5p ameliorates hepatic ischemia/reperfusion injury via targeting cryab. Cell Death Dis. 11 (6), 455(2020).
  23. Munley, J. A., et al. Chronic mesenteric ischemia-induced intestinal dysbiosis resolved after revascularization. J Vasc Surg Cases Innov Tech. 9 (2), 101084(2023).
  24. Rubio-Gayosso, I., Platts, S. H., Duling, B. R. Reactive oxygen species mediate modification of glycocalyx during ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (6), H2247-H2256 (2006).
  25. Grimsey, N. J., et al. Ubiquitin plays an atypical role in gPCR-induced p38 map kinase activation on endosomes. J Cell Biol. 210 (7), 1117-1131 (2015).
  26. Weithauser, A., Rauch, U. Role of protease-activated receptors for the innate immune response of the heart. Trends Cardiovasc Med. 24 (6), 249-255 (2014).
  27. Bochenek, M. L., et al. EPCR-PAr1 biased signaling regulates perfusion recovery and neovascularization in peripheral ischemia. JCI Insight. 7 (14), e157701(2022).
  28. Alva, J. A., et al. Ve-cadherin-cre-recombinase transgenic mouse: A tool for lineage analysis and gene deletion in endothelial cells. Dev Dyn. 235 (3), 759-767 (2006).
  29. Formes, H., et al. The gut microbiota instructs the hepatic endothelial cell transcriptome. iScience. 24 (10), 103092(2021).
  30. Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888(2014).
  31. How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells alleviate lung injury from mesenteric ischemia-reperfusion. J Trauma Acute Care Surg. 79 (4), 592-601 (2015).
  32. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. 111, e53881(2016).
  33. Henein, L., Clevenger, R., Keeran, K., Brinster, L. Rodent model of intestinal ischemia-reperfusion injury via occlusion of the superior mesenteric artery. J Vis Exp. (200), e64314(2023).
  34. Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301 (6), G1020-G1030 (2011).
  35. Watanabe, T., et al. Activation of the myd88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303 (3), G324-G334 (2012).
  36. Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PLoS One. 9 (10), e110441(2014).
  37. Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45 (6), 1246-1255 (2010).
  38. Wu, M., Rowe, J. M., Fleming, S. D. Eicosanoid production varies by sex in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Clin Immunol. 220, 108596(2020).
  39. Mester, A., et al. gender-related hemorheological alterations in intestinal ischemia-reperfusion in the rat. J Surg Res. 225, 68-75 (2018).
  40. Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E., Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263 (3 Pt 1), G301-G305 (1992).
  41. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49 (2), 168-173 (1990).
  42. Von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  43. Cahoon, J. M., et al. Acridine orange leukocyte fluorography in mice. Exp Eye Res. 120, 15-19 (2014).
  44. Jiang, D., Saffarzadeh, M., Scharffetter-Kochanek, K. In vitro demonstration and quantification of neutrophil extracellular trap formation. Bio Protoc. 7 (13), e2386(2017).
  45. Westhorpe, C. L., et al. In vivo imaging of inflamed glomeruli reveals dynamics of neutrophil extracellular trap formation in glomerular capillaries. Am J Pathol. 187 (2), 318-331 (2017).
  46. Rausch, P., et al. Analysis of factors contributing to variation in the c57bl/6j fecal microbiota across German animal facilities. Int J Med Microbiol. 306 (5), 343-355 (2016).
  47. Wang, S., et al. DNase-1 treatment exerts protective effects in a rat model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Sci Rep. 8 (1), 17788(2018).
  48. Li, Y. H., Kuo, C. H., Shi, G. Y., Wu, H. L. The role of thrombomodulin lectin-like domain in inflammation. J Biomed Sci. 19 (1), 34(2012).
  49. Hayase, N., et al. Recombinant thrombomodulin on neutrophil extracellular traps in murine intestinal ischemia-reperfusion. Anesthesiology. 131 (4), 866-882 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

L kosit AdhezyonuEndotelyal PAR1Germ Free FarelerFloresan MikroskopiL kosit Yuvarlanmas

İlgili makaleler