Fare derisi yara iyileşmesinin tek hücreli transkriptomik veri kümesini analiz etmek için R, Seurat ve CellChat'i kullanma

Shalyn Keiser; Nichole Botello; Ethan Cruz; Mateusz S. Wietecha

doi:10.3791/67266

Method Article

Fare derisi yara iyileşmesinin tek hücreli transkriptomik veri kümesini analiz etmek için R, Seurat ve CellChat'i kullanma

DOI:

10.3791/67266

⸱

August 1st, 2025

Shalyn Keiser¹ , Nichole Botello¹ , Ethan Cruz¹ , Mateusz S. Wietecha¹

¹Department of Oral Biology, College of Dentistry, University of Illinois Chicago

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, R kullanarak fare derisi yara iyileşmesinin tek hücreli zaman seyri transkriptomik veri kümesini analiz etmek için adım adım, görsel bir iş akışı sunuyoruz. Protokol, veri kümesi indirme, kalite kontrol, görselleştirmeler ve Seurat kullanarak hücre türü ek açıklamaları ve CellChat kullanarak hücre-hücre etkileşim analizi için standart bir boru hattı içerir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yara iyileşme süreci, uzay ve zaman boyunca farklı hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimlerle düzenlenir. Tek hücreli transkriptomik yöntemler, karmaşık ortamlarında tek tek hücrelerin profillenmesi yoluyla, yara iyileşme sürecinde yer alan hücresel heterojenliğin, hücre iletişim ağlarının ve hücre-hücre etkileşimlerinin araştırılmasını sağlar. Bununla birlikte, birçok tek hücreli analiz aracı bir bilgisayar kodlama ortamında çalıştırılır ve yara iyileşmesi bilim adamları tarafından daha yaygın kullanımı, biyoinformatik uzmanlığının belirgin eksikliği nedeniyle engellenir. Bu nedenle, temporal fare eksizyonel cilt yara iyileşmesi veri kümesinin temel tek hücreli analizini gerçekleştirmek için RStudio adlı bir grafik kodlama ortamının nasıl kullanılacağını gösteren adım adım bir iş akışı sunulmaktadır. Bu görsel ve rehberli protokol, biyoinformatik geçmişi olmayan bilim insanlarının daha önce yayınlanmış bir yara iyileşme veri setini indirmesine, kritik kalite kontrol adımlarını gerçekleştirmesine, Seurat kullanarak veri seti görselleştirmeleri ve hücre tipi açıklamaları dahil olmak üzere standart bir tek hücreli analiz iş akışı çalıştırmasına, hücre alt tipi analizlerini çalıştırmasına, modül puanlama analizlerini çalıştırmasına, CellChat kullanarak hücre-hücre etkileşim analizlerini çalıştırmasına ve Seurat kullanarak birden fazla veri kümesinin bütünleştirici analizlerini gerçekleştirmesine olanak tanır. Protokoldeki her adım için anlatısal açıklamalar sağlanır ve kullanıcıyı iş akışı boyunca güvenli bir şekilde yönlendirmek için her kod satırından elde edilen grafiksel sonuçlar sunulur. Tek hücreli bir analiz hattına bu görsel girişin amacı, daha fazla yara iyileştirici bilim insanının, kendi tek hücreli veri kümelerinin daha derin analizlerini ve daha önce yayınlanmış tek hücreli veri kümelerinin daha yaygın yeniden analizlerini kolaylaştırmak için biyoinformatik araçlarını doğrudan kendi laboratuvarlarında kullanmalarını sağlamaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yara iyileşmesi, memeli biyolojisindeki en karmaşık süreçlerden biridir ve iyileşmenin üç aşamasından oluşan bir spektrumu içerir: İnflamatuar, Proliferatif ve Çözünürlük ^1,2. Bu iyileşme aşamaları, düzinelerce hücre tipinin ve yüzlerce moleküler ürününün yara onarımının uzay ve zamanı boyunca koordineli eylemlerini geniş bir şekilde sınıflandırır³. İyileşme süresi boyunca yara dokusu örneklemesine dayanan onlarca yıllık histolojik ve moleküler çalışmalar, özellikle eksizyonel cilt yara iyileşmesinin tekrarlanabilir fare modellerinde^doku onarımının 3 kapsayıcı hücresel modellerini aydınlatmıştır ^4,5,6. Sadece son yirmi yılda, toplu dokular ^7,8,9 ve hücre^{10,11,12,13,14} ölçeklerinde yaraların yüksek verimli transkriptomik analizlerinin ortaya çıkmasıyla başlayarak, yara iyileşmesinin karmaşıklığını daha tam olarak anlamak mümkün hale geldi . Son zamanlarda, birkaç çalışma, tek hücre düzeyinde cilt yaralarının transkripsiyonel profilini çıkarmış, yeni yara hücresi alt tiplerini tanımlamış ve iyileşme sırasında birbirleriyle nasıl etkileşime girebileceklerini göstermiştir 15,16,17,18,19,20. Hu ve ark. yara merkezinden birkaç radyal mesafede iyileşme süresi boyunca cilt yaralarının profilini çıkarmak için yenilikçi bir uzamsal tek hücreli RNA dizileme yaklaşımı kullandı ve bu da uzay ve zaman boyunca yeni hücreler arası ve moleküler 'hareketleri' ortaya çıkardı²⁰. Bu tür çalışmalar, yara iyileşmesinin karmaşıklığını benzeri görülmemiş ayrıntılarla çözüyor ve muazzam hücresel ve moleküler heterojenliğin bir resmini çizmeye başlıyorlar.

Biyoinformatik analiz yöntemlerindeki son zamanlardaki önemli gelişmeler, yara iyileşmesi araştırmaları alanında üretilen karmaşık multi-omik veri kümelerinin biyolojik olarak anlamlandırılmasını mümkün kılmaktadır. Seurat gibi tek hücreli analiz paketleri, yaralar gibi karmaşık dokulardaki hücre tiplerinin sınıflandırılması da dahil olmak üzere veri kümelerinin sağlam analizi ve entegrasyonu için araçlar sağlar²¹. Tek hücreli verilerin aşağı yönlü yorumlanması için, hücrelerin yaraları onarmak için nasıl koordine olduğunu açıklayabilen varsayılan hücre-hücre etkileşim programlarını tanımlamak için CellChat gibi araçlar kullanılır²². Bu araçlar iyi belgelenmiş ve iyi alıntılanmış olsa da, genomik ve transkriptomik biyoinformatik alanlarında en yaygın olarak kullanılan istatistiksel ve grafiksel bir programlama dili olan R gibi bir bilgisayar kodlama ortamında çalıştırılmalıdır. Yara iyileşmesi alanındaki biyologlar ve klinisyenler, doku onarımını incelemek için tek hücreli yaklaşımları giderek daha fazla kullanırken, çok azı Seurat ve CellChat gibi araçları doğrudan kendi laboratuvarlarında kullanmak için gereken biyoinformatik eğitimine sahiptir. Bu biyoinformatik araçların kullanımındaki bu tür bir engel, bilim adamlarının biyoinformatikçilerin yardımı olmadan kendi veri kümelerini daha derinlemesine analiz etmelerini engellemekle kalmaz, aynı zamanda bilim adamlarının diğer gruplar tarafından halihazırda yayınlanmış olan tek hücreli verilerin zenginliğini güvenilir bir şekilde yeniden analiz etmelerini de engeller.

Bu nedenle, biyoinformatik geçmişi olmayan bilim adamlarının daha önce yayınlanmış ve halka açık tek hücreli yara iyileşmesi veri setini analiz etmelerini sağlamak için burada adım adım bir iş akışı sunulmaktadır²⁰. Protokol, RStudio adı verilen yaygın ve ücretsiz grafiksel R kodlama ortamını kullanır ve Seurat ve CellChat kullanarak karmaşık bir tek hücreli veri kümesinin temel bir analizini sağlayan önceden belirlenmiş kod satırlarını çalıştırmak için bu ortamda nasıl gezinileceğini gösterir. Bu protokol kapsamında, yara iyileşmesi araştırmaları ile ilgili yedi ana yöntem sunulmaktadır: 1) kodlama ortamı kurulumu, 2) veri setinin ve kritik kalite kontrol adımlarının indirilmesi, 3) görselleştirmeler ve hücre tipi ek açıklamaları dahil olmak üzere tek hücreli analiz iş akışları, 4) hücre alt tipi analizleri, 5) modül puanlama analizleri, 6) hücre-hücre etkileşim analizleri ve 7) çoklu veri setlerinin bütünleştirici analizleri. Her yöntemde, kullanıcının protokolle yan yana çalışması için gerçek kod sağlanır ve kullanıcıya iş akışı boyunca rehberlik etmek için her kod satırından elde edilen gerçek grafik sonuçları gösterilir. RStudio'ya bu rehberli ve görsel girişin ve temel bir tek hücreli analiz iş akışının birincil amacı, araştırma alanında daha hızlı ilerleme sağlamak için daha fazla yara iyileşmesi bilim insanının bu güçlü araçları doğrudan kullanmasını sağlamaktır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Yedi biyoinformatik yöntemi detaylandıran aşağıdaki iş akışlarında, protokollerin tüm adımlarına, listelendikleri sırayla doğrudan kullanıcının kendi RStudio arayüzünde çalıştırılması gereken ilgili kod blokları eşlik eder. Bu protokolü olabildiğince kullanıcı dostu hale getirmek için, her kod satırının kolayca çalıştırılabilmesi için doğrudan kullanıcının RStudio oturumuna yüklenebilen bir R betik dosyası (Ek Dosya 1: JoVE_Rscript.R) dahil edilmiştir. Bu, kullanıcının protokol belgesinden kodu yazmasını veya kopyalayıp yapıştırmasını önler, bu da hatalara neden olabilir. Tüm protokol talimatları, her yorum satırının başında bir hashtag '#' sembolü ile gösterilen yorumlar biçiminde R betik dosyasına da dahil edilir.

1. Tek hücreli analiz iş akışı için R, RStudio ve gerekli R paketlerini yükleme

R'yi (sürüm 4.4.1) bilgisayara indirin ve yükleyin. Bilgisayarın işletim sistemine karşılık gelen bağlantıyı kullanın.
1. Microsoft Windows çalıştıran bir bilgisayar kullanıyorsanız, şu bağlantıyı kullanın: https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/
2. MacOS çalıştıran bir bilgisayar kullanıyorsanız şu bağlantıyı kullanın: https://cran.rstudio.com/bin/macosx/
Bilgisayara RStudio'nun en son sürümünü yükleyin. Aşağıdaki bağlantıya tıklayın ve talimatları izleyin:
https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/#download
R'nin belirli paketleri derlemesine izin verecek olan Rtools'u (sürüm 4.4) yükleyin. Aşağıdaki bağlantıya tıklayın ve talimatları izleyin:
1. Windows kullanıyorsanız, şu bağlantıyı kullanın: https://cran.rstudio.com/bin/windows/Rtools/
2. MacOS kullanıyorsanız şu bağlantıyı kullanın:
  https://mac.r-project.org/tools/
Yerel çalışma dizinini ayarlayın; Bu, bilgisayardaki tüm dosyaların yükleneceği ve kaydedileceği klasördür. RStudio menü çubuğunda Oturum'u seçip Çalışma Dizinini Ayarla'yı > Dizin Seç'i tıklatarak ve istediğiniz klasörü seçerek çalışma dizinini ayarlayın.
1. Bir Windows bilgisayar kullanıyorsanız, çalışma dizinini ayarlamak için aşağıdaki komutu kullanın. Aşağıdaki kod satırındaki [Directory] öğesini gerçek dizin yapısıyla değiştirin. R'deki dizin sınırlayıcısının "/" karakteri olduğunu unutmayın
  setwd("C:/[Directory]")
2. Bir MacOS bilgisayar kullanıyorsanız, aşağıdaki komut çalışma dizinini de ayarlayacaktır. Aşağıdaki kod satırındaki [Directory] öğesini gerçek dizin yapısıyla değiştirin. R'deki dizin sınırlayıcısının "/" karakteri olduğunu unutmayın
  setwd("~/[Directory]")
3. R oturumu sırasında herhangi bir noktada, aşağıdaki kod satırını kullanarak çalışma dizinini denetleyin:
  getwd()
4. RStudio'da, Dosyalar sekmesindeki sağ pencerede, içerdiği tüm dosya ve klasörler de dahil olmak üzere çalışma dizini yapısını görsel olarak keşfedin. RStudio'nun Dosya gezgininde çalışma dizinine gitmek için dişli simgesine tıklayın -> Çalışma Dizinine Git.
Protokol için gerekli bağımlılıklar olan R paket deposu CRAN'dan aşağıdaki paketleri yükleyin. Bu paketleri yüklemek için aşağıdaki komutları çalıştırın.
install.packages("devtools") install.packages("readxl") install.packages("openxlsx") install.packages("tidyverse") install.packages("scCustomize")
NOT: R paketlerinin kurulumu sırasında çeşitli pencerelerin görünüp kaybolması normaldir. Bir paketi derlemenizi isteyen bir pencere açılırsa, EVET'i tıklatın. Paketi yüklemeden önce R'yi yeniden başlatmanızı isteyen bir pencere açılırsa, HAYIR'a tıklayın.
Seçilmiş R paket deposu Bioconductor'dan aşağıdaki paketleri yükleyin
(https://bioconductor.org/), protokol için gerekli bağımlılıklardır. Bu paketleri yüklemek için aşağıdaki komutları çalıştırın.
if (! requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE) ) install.packages("BiocManager") BiocManager::install("NMF", update=F) BiocManager::install("ComplexHeatmap", update=F) BiocManager::install("BiocNeighbors", update=F) BiocManager::install("SingleCellExperiment", update=F) BiocManager::install("circlize", update=F) BiocManager::install("edgeR", update=F) BiocManager::install("scDblFinder", update=F)
Bu el yazmasında açıklanan iş akışı için gerekli olan aşağıdaki paketleri yükleyin.
install.packages("Seurat") devtools::install_github("jinworks/CellChat")
Yüklemelerin başarılı olduğunu onaylamak için her paketi yükleyin. Paketlerden herhangi birinin "paket bulunamadı" hatasıyla sonuçlanması durumunda, yukarıdaki uygun kodu kullanarak yeniden yükleyin.
library(readxl) library(openxlsx) library(tidyverse) library(scCustomize) library(edgeR) library(scDblFinder) library(Seurat) library(CellChat)

2. Tek hücreli yara iyileşmesi veri setine yükleme ve kalite kontrol adımlarının gerçekleştirilmesi

NOT: Bu biyoinformatik iş akışı için, daha önce yayınlanmış bir uzay-zamansal tek hücreli cilt yara iyileşme deneyinin yeniden analizi yapılır²⁰. Veri kümesi dosyaları, küratörlüğünde NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) deposunda (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) saklanır.

Erişim numarasını GSE204777 kullanarak GEO'dan veri kümesi dosyalarına gidin. Aşağıdaki bağlantıyı kullanın ve çalışmanın deneysel tasarımını gözden geçirin: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE204777
GEO depo sayfasında, beş sıralama şeridinden elde edilen beş ayrı veri grubu vardır. GSM6190913 başlıklı ilk veri kümesine tıklayın. Aşağıda, örneğe doğrudan bir bağlantı verilmiştir: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM6190913
Sayfanın en altına kaydırın ve ftp veya html bağlantılarını kullanarak aşağıdaki üç dosyayı indirin. Bilgisayarın dosya gezgininde, bu üç dosyayı b1 adlı dizine taşıyın. b1 klasörünün Adım 1.4'te ayarlanan çalışma dizini içinde bulunduğundan emin olun.
Dosya adı: GSM6190913_b1_barcodes.tsv.gz / dosya boyutu: 18.5 Mb
dosya adı: GSM6190913_b1_features.tsv.gz / dosya boyutu: 254.1 Kb
Dosya adı: GSM6190913_b1_matrix.mtx.gz / dosya boyutu: 151.2 Mb
Adım 2.3'te indirilen tek hücreli sıralama dosyaları için dizin bilgilerini alın.
b1_data_dir <- file.path(getwd(), "b1")
Tek hücreli sıralama dosyalarını yükleyin. gene.column parametresi, kullanılan gen/özellik adlandırmasını belirtir. Bu durumda, gen sembolleri için gene.column = 2 kullanın (gene.column = 1 Ensembl gen adları içindir).
b1 <- Read10X_GEO(data_dir = b1_data_dir, gene.column = 2)
NOT: Tek hücreli veri kümelerinin çoğunda ek çoğullanmış veri yoktur, bu nedenle bu adım kullanılarak oluşturulan 10x dosyalarının birden çok katmanı olmaz. Geçerli çoğullanmış veri kümesi için adım 2.6 ile ilerleyin. Verileri çoğullamayan veri kümeleri için adım 2.7'ye atlayın.
Uzay-zamansal barkodları kullanarak tek hücreli veri kümesini çoğullamadan çıkarın.
1. Çalışan veri kümesi için gen ifadesini ve HTO (çoğullama) verilerini ayırın.
  dataset_rna_counts <- b1$GSM6190913_b1_$`Gene Expression` dataset_barcodes <- b1$GSM6190913_b1_$`Antibody Capture`
2. 5'ten az hücrede ifade edilen genleri ve tespit edilen 200'den az gene sahip hücreleri hemen filtrelerken, gen ifadesi verilerini kullanarak bir Seurat nesnesi oluşturun.
  dataset <- CreateSeuratObject(counts = dataset_rna_counts, min.cells = 5, min.features = 200)
3. Katman olarak bir gen ifadesi veri kümesi oluşturun ve her iki tahlil için ortak olan hücrelerin ve barkodların bir listesini oluşturun.
  dataset_rna_counts2 <- LayerData(dataset, data = "RNA") dataset_joint.barcodes <- intersect(colnames(dataset_rna_counts2), colnames(dataset_barcodes))
4. Ortak hücre barkodları ile alt küme gen ekspresyonu ve HTO sayımları.
  dataset_rna_counts2 <- dataset_rna_counts2[, dataset_joint.barcodes] dataset_barcodes2 <- as.matrix(dataset_barcodes[, dataset_joint.barcodes])
5. HTO'nun beklenen barkod adlarına sahip olduğunu onaylayın.
  rownames(dataset_barcodes2)
6. Barkod bilgilerini saklamak için yeni bir tahlil oluşturun ve bu tahlili daha önce oluşturulan Seurat nesnesine ekleyin.
  dataset_barcode_assay <- CreateAssayObject(counts = dataset_barcodes2) dataset[["barcodes"]] <- dataset_barcode_assay
7. Nesnenin artık birden çok tahlil içerdiğini doğrulayın.
  DefaultAssay(dataset)
8. Barkod verilerini normalleştirin ve HTODemux işlevi aracılığıyla çoğullama çözme işlemi gerçekleştirin. Bu yöntem, aşağıdaki Seurat vinyetinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır: https://satijalab.org/seurat/articles/hashing_vignette
  dataset <- HTODemux(dataset, assay = "barcodes", positive.quantile = 0.99)
9. Hücreleri genel sınıflandırma sonuçlarına göre gruplandırın ve barkod sınıflandırması olmayan hücreleri kaldırın.
  Idents(dataset) <- "barcodes_classification.global" dataset <- subset(dataset, idents = "Negative", invert = TRUE)
10. Hücreleri maksimum HTO sinyaline göre gruplandırın.
  Idents(dataset) <- "barcodes_maxID"
11. Hücrelerde tespit edilen genlerin dağılımını çoğullanmış barkodlarına göre görselleştirin (Ek Şekil 1).
  VlnPlot(dataset, features = "nFeature_RNA", pt.size = 0.1, log = TRUE)
12. Barkodları gerçek yara zamanlarına (yara sonrası günler) ve boşluk (2-8 mm) atamalarına (orijinal el yazmasından alınmış) yeniden adlandırın ve bunları time_space adlı yeni bir meta veri değişkenine atayın.
  Idents(dataset) <- "barcodes_maxID" levels(dataset) dataset <- RenameIdents(dataset, "Barcode-1" ="D01_2mm", "Barcode-2" ="D01_4mm", "Barcode-3" ="D01_6mm", "Barcode-4" ="D01_8mm", "Barcode-5" ="D03_2mm", "Barcode-6" ="D03_4mm", "Barcode-7" ="D03_6mm", "Barcode-8" ="D03_8mm", "Barcode-9" ="D07_2mm", "Barcode-10" ="D07_4mm", "Barcode-11" ="D07_6mm", "Barcode-12" ="D07_8mm", "Barcode-13" ="D14_2mm", "Barcode-14" ="D14_4mm", "Barcode-15" ="D14_6mm", "Barcode-16" ="D14_8mm", "Barcode-17" ="UW") levels(dataset) dataset[["time_space"]] <- Idents(dataset)
Verileri çoğullamayan veri kümeleri için: 5'ten az hücrede ifade edilen genleri ve 200'den az gen tespit edilen hücreleri hemen filtrelerken bir Seurat nesnesi oluşturun.
dataset <- CreateSeuratObject(counts = b1, min.cells = 5, min.features = 200)
Veri kümesinin gen ekspresyonu testini analiz etmeye geçin.
DefaultAssay(dataset) <- "RNA" Idents(dataset) <- "data"
Önemli bir kalite kontrol adımı olarak, her hücredeki mitokondriyal genlerin yüzdesini hesaplayın ve bunu bir meta veri değişkeni olarak atayın. Bu yöntem, aşağıdaki Seurat vinyetinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır: https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial#qc-and-selecting-cells-for-further-analysis
dataset[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(dataset, pattern = "^mt-")
Tüm hücrelerde tespit edilen genlerin dağılımını, RNA sayısını ve mitokondriyal yüzdeyi görselleştirin (Ek Şekil 2).
plot1 <- FeatureScatter(dataset, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt") plot2 <- FeatureScatter(dataset, feature1 = "nFeature_RNA", feature2 = " percent.mt ") plot1 + plot2
Düşük RNA sayıları ile ilişkili olan büyük mitokondriyal içeriğe sahip bir dizi hücre vardır; Bunlar ölü veya ölmekte olan hücrelerdir. Adil bir kesme kullanarak bu düşük kaliteli hücreleri veri kümesinden kaldırın. Bu durumda,%^25'ten fazla mitokondriyal gen içeren hücrelerin çıkarıldığı, daha önce yayınlanmış çalışmada 20 açıklanan orijinal veri kümesinin değerlerini kullanın.
dataset <- subset(dataset, subset = nFeature_RNA > 200 & percent.mt < 25)
Düşük kaliteli hücreleri çıkardıktan sonra tüm hücrelerde tespit edilen genlerin dağılımını, RNA sayılarını ve mitokondriyal yüzdeyi görselleştirin (Ek Şekil 3).
plot1 <- FeatureScatter(dataset, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt") plot2 <- FeatureScatter(dataset, feature1 = "nFeature_RNA", feature2 = " percent.mt ") plot1 + plot2
Ek bir önemli kalite kontrol adımı olarak, veri kümesindeki olası çiftleri tespit edin. Bunlar, damlacık dizilimi sırasında birleştirilen hücrelerdir ve bu nedenle tek hücre düzeyinde olmayan gen ifadeleri ile sonuçlanacaktır. Bu soruna karşı koymak için çeşitli araçlar geliştirilmiştir. Her aracın tek hücreli veriler hakkında belirli varsayımlarda bulunduğuna dikkat etmek önemlidir, bu nedenle kullanıcının herhangi bir aracı kullanmadan önce ilgili tüm belgeleri okuması önemlidir. Bu iş akışında, scDblFinder²³ adlı bir yöntem uygulayın. Lütfen bu yöntemin, sabit bir beklenen çift oranı uygulayan bir algoritma kullandığını unutmayın. scDblFinder işlem hattını çalıştırmak için aşağıdaki komutları kullanın.
DefaultAssay(dataset) <- "RNA" sce <- scDblFinder(GetAssayData(dataset, assay="RNA", slot="counts"), samples=Idents(dataset))
NOT: Bunun gibi çoğullanmış tek hücreli veri kümeleri, birden çok barkodu ifade eden hücrelerin çıkarılmasıyla çiftler için de taranabilir. Tek hücreli veri kümelerinin çoğu bu benzersiz özelliğe sahip olmadığı için bu iş akışı bu yöntemi göstermedi. Bunun yerine, scDblFinder yöntemi kullanılarak çiftlerin taranması için daha genelleştirilebilir bir işlem hattı gösterilir.
Çift puanı yeni bir meta veri değişkenine atayın.
dataset$scDblFinder.score <- sce$scDblFinder.score
Tüm hücrelerdeki ikili skor dağılımını görselleştirin (Ek Şekil 4).
VlnPlot(dataset, features = "scDblFinder.score", raster=FALSE, pt.size=0.5)
0,25 çift puan eşiğinin üzerindeki hücreleri kaldırın. Bu eşik, yukarıda oluşturulan keman grafiğine dayalı olarak seçildi, bu da veri kümesindeki çoğu hücrenin çok yüksek veya çok düşük çift puanlara atanabileceğini gösterdi ve 0,25, bu veri kümesi için pek çok olası çifti kaldırmadan olası çiftlerin büyük çoğunluğunu kaldıracak makul bir sınırdır.
dataset <- subset(dataset, scDblFinder.score < 0.25)
Veri kümesi Seurat nesnesini bir RDS dosyası olarak çalışma dizinine kaydedin.
saveRDS(dataset, "dataset_post_Method2.rds")

3. Seurat kullanarak tek hücreli bir yara iyileşmesi veri setinin analizi

NOT: (İsteğe bağlı adım) İş akışını burada başlatıyorsanız, kaydedilen RDS dosyasını bir Seurat nesnesi olarak yükleyin.

dataset <- readRDS("dataset_post_Method2.rds")

Tek hücreli veri kümesi normalleştirmesi, ölçeklendirme ve Temel Bileşen Analizi (PCA) için standart Seurat iş akışını gerçekleştirin. Bu standart iş akışı aşağıdaki Seurat vinyetlerinde açıklanmıştır:
Seurat - Rehberli Kümeleme Eğitimi: https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial
Seurat Komut Listesi: https://satijalab.org/seurat/articles/essential_commands
DefaultAssay(veri seti) <- "RNA"
dataset <- NormalizeData(object = dataset) dataset <- FindVariableFeatures(object = dataset) dataset <- ScaleData(object = dataset) dataset <- RunPCA(object = dataset)
İlk 50 PCA boyutuna göre veri kümesi varyasyon miktarını görselleştirin (Ek Şekil 5).
ElbowPlot(dataset, reduction = "pca", ndims = 50)
Büyük varyasyonların çoğu ilk 13 boyutta meydana gelir.
1-13 arasında ayarlanmış bir PCA boyut aralığı ve 0,1 arasında ayarlanmış bir çözünürlük kullanarak veri kümesinin hücre kümelemesini gerçekleştirin.
dataset <- FindNeighbors(dataset, verbose = TRUE, dims = 1:13) dataset <- FindClusters(dataset, verbose = TRUE, resolution = 0.1)
NOT: Bu iş akışı, hücre türlerindeki büyük ölçekli farklılıklara odaklanır. Bu nedenle, PCA boyut aralığı için oldukça muhafazakar bir parametre kullanır, burada ilk 13 boyutun veri kümesindeki varyasyonun büyük çoğunluğunu temsil ettiği gösterilir. Hücrelerin daha küçük ve daha nadir alt türlere ayrılması için, bu nadir hücre alt türleri büyük olasılıkla daha düşük veri kümesi varyasyonu düzeylerini hesaba kattığından, kullanıcı aşağı akış analizi için daha fazla sayıda boyut kullanabilir. Çözünürlük parametresi 0 ile 1 arasında değişir ve veri kümesine uygulanan kategorik ayrımın büyüklüğünü belirler. Bu parametrenin ayarlanması kullanıcının araştırma sorusuna bağlıdır. Hücrelerin çok sayıda küçük ve nadir alt tipe kümelenmesi için, aşağı akış analizi için daha yüksek çözünürlükler kullanın. Bu iş akışı, ana hücre türleri arasındaki daha geniş farkları keşfetmeyi amaçladığından, hücreleri daha az sayıda, daha büyük gruplara kümelemesi beklenen 0,1 gibi oldukça küçük bir çözünürlük değeri kullanır. Adım 3.3'te belirtilen ayarların kullanılması, 8 benzersiz hücre kümesini ayırt edecektir. Bu kümeler otomatik olarak "seurat_clusters" adlı bir meta veri değişkenine atanır.
İlk 13 PCA boyutunu kullanarak UMAP boyutsal azaltma ve komşu bulma analizi gerçekleştirin. Elde edilen veri projeksiyonunun tekrarlanabilirliğini sağlamak için 123 numaralı tohumu ekleyin.
dataset <- RunUMAP(dataset, verbose = TRUE, dims = 1:13, seed.use = 123)
NOT: UMAP algoritması stokastiktir ve boyutsal indirgemeye rastgelelik getirir (https://cran.r-project.org/web/packages/umap/vignettes/umap.html'daki "Kararlılık ve Tekrarlanabilirlik"e bakınız). Tutarlı bir tohum kullanmak, algoritmaya "minimum düzeyde tekrarlanabilirlik" sağlarken, ortaya çıkan grafik, temsili şekillerde ve aşağı akış sonuçlarında gösterilenden biraz farklı olabilir. Testler, sonuçların özellikle Windows çalıştıran bilgisayarlar ile MacOS çalıştıran bilgisayarlar arasında, muhtemelen bu işletim sistemlerindeki farklı rastgelelik uygulamaları nedeniyle farklılık göstereceğini bulmuştur.
Hücrelerin kümelenmesini bir UMAP grafiğinde görselleştirin (Şekil 1).
DimPlot(dataset, group.by = "seurat_clusters", raster = FALSE, label = TRUE)
NOT: UMAP algoritmasının rastgeleliği, Windows ve MacOS çalıştıran bilgisayarlarda yukarıdakiyle aynı kod kullanılarak oluşturulan alternatif UMAP grafiklerini gösteren şekilde gösterildiği gibi biraz farklı grafikler oluşturabilir; Kümelerin şekillerindeki küçük farklılıklara dikkat edin. Bu nedenle, kullanıcının tüm verileri ve grafikleri oluşturuldukları gibi kaydetmesi ve zaman damgası eklemesi ve kümeler üzerindeki tüm aşağı akış analizlerinin, hücre tipi açıklaması için aşağıda açıklandığı gibi, dikkatli bir şekilde ve biyolojik anlayış göz önünde bulundurularak yapılması zorunludur.
Yara iyileşmesi sırasında hücrelerin nereden ve ne zaman geldiğine atıfta bulunan orijinal deney etiketleri dahil edildiğinden, hücrelerin yara zaman/mekan açıklamasını bir UMAP grafiği üzerinde görselleştirin (Şekil 2).
DimPlot(dataset, group.by = "time_space", raster = FALSE, label = FALSE)
Yara zaman/uzay ek açıklaması ile bir hücre kümesi ilişkilendirme tablosu oluşturun.
table(dataset$time_space, dataset$seurat_clusters)
Veri kümesindeki ana hücre türlerinin kimliklerini belirleyin. Bunu yapmak için, tüm kümeler arasında diferansiyel olarak ifade edilen genleri (DEG) hesaplayın. Kümeler için DEG listelerini alın, bunları bir değişkene atayın ve çıktıyı çalışma dizini içinde sınırlandırılmış bir metin dosyası olarak kaydedin.
NOT: Bu adım CPU yoğundur ve kullanıcının donanımına bağlı olarak uzun sürebilir.
Idents(dataset) <- "seurat_clusters" Cell_markers <- FindAllMarkers(dataset, max.cells.per.ident = 500, only.pos = TRUE, min.pct = 0.10, logfc.threshold = 0.25) write.csv(Cell_markers, file = file.path(getwd(), "dataset_cluster_markers.txt"))
Dahil edilen dataset_cluster_markers.txt dosyasını bir elektronik tabloda (örneğin, Excel) indirin ve açın, metin dosyasının içeriğini kopyalayın ve virgül sınırlayıcısını ve gen adı sütunlarının kimliğini Metin olarak belirtmek için Metin İçe Aktarma Sihirbazı'nı kullanın. Gen adlarının 'Metin' olduğunu belirtmek önemlidir, aksi takdirde Excel belirli gen adlarını otomatik olarak tarihlere dönüştürür, örneğin 7 Eylül, 7 Eylül olarak değişir.
Bir e-tabloda, sonuçları aşağıdaki önerilen parametrelere göre filtreleyin:
1. Tüm satırları azalan günlük₂ kat değişikliklerine (log2FC) göre düzenlemek için avg_log2FC sütunu en büyükten en küçüğe doğru sıralayın.
2. Tüm satırları artan Seurat küme sayılarına göre düzenlemek için küme sütununu küçükten büyüğe doğru sıralayın.
3. Belirtilen kümede diğer kümelere kıyasla yalnızca en diferansiyel olarak ifade edilen genleri (DEG'ler) göstermek için avg_log2FC sütunu 2,5'e eşit veya daha büyük sayılar için filtreleyin.
4. pct.1 sütununu 0,4'ten büyük veya 0,4'e eşit sayılar için filtreleyin. Bu sütun, belirtilen geni ifade eden belirtilen kümedeki hücrelerin yüzdesini ifade eder (Küme %) ve eşiğin 0,4 olarak ayarlanması, yalnızca belirtilen kümedeki hücrelerin en az %40'ında ifade edilen genlerin gösterildiği anlamına gelir.
5. pct.2 sütununu 0,2'den küçük veya 0,2'ye eşit sayılar için filtreleyin. Bu sütun, belirtilen geni ifade eden belirtilen kümede OLMAYAN hücrelerin yüzdesini ifade eder (Küme dışı %) ve eşiğin 0,2 olarak ayarlanması, yalnızca belirtilen kümede OLMAYAN hücrelerin en fazla %20'sinde ifade edilen genlerin gösterildiği anlamına gelir.
6. 0,01'e eşit veya daha küçük sayılar için p_val_adj sütununa filtre uygulayın. Bu sütun, belirtilen DEG'nin istatistiksel gücünü gösteren düzeltilmiş P değerine veya yanlış keşif oranına (FDR) atıfta bulunur ve eşiğin 0.01 olarak ayarlanması, yalnızca FDR < 0.01 olan genlerin gösterildiği anlamına gelir.
  NOT: Ek Tablo 1 (JoVE_DEGs_cellMarkers.xlsx), protokolün 3.10 adımında kullanılan sıralı diferansiyel olarak ifade edilen genlerin tam çıktısını içerir. Ek Tablo 2 , bu analizdeki her küme için en iyi 5 geni ve sonraki görselleştirmeler için kullanılan kalın genleri göstermektedir.
Kümelerin tarafsız hücre tipi açıklamaları için EnrichR web tabanlı zenginleştirme analiz aracını kullanın.
Bağlantıyı kullanın: https://maayanlab.cloud/Enrichr/
Her küme için DEG listelerini ayrı bir EnrichR penceresine kopyalayın ve ardından Çözümle'ye tıklayın. EnrichR aracı, gen listesini yüzlerce küratörlü veritabanında çalıştırır ve her kategorideki zenginleştirilmiş her terimi sıralar.
Hücre türü ek açıklaması amacıyla, yukarıdaki Hücre Türleri sekmesine tıklayın ve sol taraftaki üç hücre işaretçisi küratörlüğünde veritabanlarındaki ilk 5 zenginleştirmeye odaklanın (Şekil 3):
Hücre İşaretleyici 2024 (http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/)
Tabula sapiens (https://tabula-sapiens-portal.ds.czbiohub.org/)
PanglaoDB Artırılmış (https://panglaodb.se/)
Bu veritabanlarındaki DEG'lerin zenginleştirmelerine bağlı olarak, 8 kümenin olası kimliğini doğrulayın. Fibroblastlar olarak zenginleşen iki küme (2, 6) olduğuna dikkat edin; Bu nedenle, bu kümeleri tek hücre türü ek açıklamalarda birleştirin. Hücre türü kimliklerini, cell_types adlı yeni bir meta veri değişkenine etiket olarak atayın.
Idents(dataset) <- "seurat_clusters" dataset[["cell_types"]] <- Idents(dataset) Idents(dataset) <- "cell_types" dataset <- RenameIdents(dataset, "0" = "Macrophage", "1" = "Neutrophil", "2" = "Fibroblast", "3" = "Epithelial cell", "4" = "Endothelial cell", "5" = "T cell", "6" = "Fibroblast", "7" = "Smooth muscle cell" ) levels(dataset) dataset[["cell_types"]] <- Idents(dataset)
Yeniden adlandırılan hücre kümelerini bir UMAP grafiğinde ek açıklamalar olarak görselleştirin (Şekil 4).
DimPlot(dataset, group.by = "cell_types", raster = FALSE, label = FALSE)
Tablo 1'deki en üstteki (kalın) küme işaretleyici genlerinin lokalizasyonunu bir dizi UMAP grafiği üzerinde görselleştirin (Şekil 5).
DefaultAssay(dataset) <- "RNA" FeaturePlot(dataset, features = c("Arg1", "Retnlg", "Fgf7", "Dsp", "Tie1", "Cd3g", "Cdh4", "Rgs5"), raster=FALSE, ncol = 4)
En iyi küme işaretçisi DEG'lerini, orijinal küme numaralarına göre gruplandırılmış bir nokta çizimi üzerinde görselleştirin (Ek Şekil 6).
DotPlot(dataset, group.by = "seurat_clusters", features = c("Arg1","Retnlg","Fgf7","Dsp","Tie1", "Cd3g","Cdh4","Rgs5")) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(low = "blue", mid = "grey", high = "red")
En üst küme işaretçisi DEG'lerini, açıklamalı hücre türlerine göre gruplandırılmış bir nokta grafiği üzerinde görselleştirin (Şekil 6).
DotPlot(dataset, group.by = "cell_types", features = c("Arg1","Retnlg","Fgf7","Dsp","Tie1", "Cd3g","Cdh4","Rgs5")) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(low = "blue", mid = "grey", high = "red")
Zaman serisi analizleri gerçekleştirmek için önce uzamsal bileşeni kaldırmak için veri kümesini basitleştirin. Zaman seyri analizleri için, yara zaman/mekan açıklamalarını "DPW" adlı yeni bir meta veri değişkeni ile yara sonrası toplam gün (DPW) olarak gruplandırın.
Idents(dataset) <- "time_space" dataset[["DPW"]] <- Idents(dataset) Idents(dataset) <- "DPW" new.cluster.ids <- c("D1", "D1", "D1", "D1", "D3", "D3", "D3", "D3", "D7", "D7", "D7", "D7", "D14", "D14", "D14", "D14", "UW") names(new.cluster.ids) <- levels(dataset) dataset <- RenameIdents(dataset, new.cluster.ids) dataset[["DPW"]] <- Idents(dataset) Idents(dataset) <- "DPW"
Yeni yara zaman rotası gruplamalarını bir UMAP grafiği üzerinde görselleştirin (Ek Şekil 7).
DimPlot(dataset, group.by = "DPW", raster = FALSE, label = FALSE)
Her DPW'de her türden kaç hücre oluştuğunu gösteren tablolar oluşturun.
table(dataset$DPW, dataset$cell_types)
1. İsteğe Bağlı Adım: Yara zaman-kurs grupları için DEG listelerini de almak için, bunları bir değişkene atayın ve çıktıyı sınırlandırılmış bir metin dosyası olarak kaydedin.
  Idents(dataset) <- "DPW" Cell_DPW_markers <- FindAllMarkers(dataset, max.cells.per.ident = 500, only.pos = TRUE, min.pct = 0.10, logfc.threshold = 0.25) write.csv(Cell_DPW_markers, file = file.path(getwd(), "dataset_DPW_markers.txt"))
İyileşme süresi boyunca hücre tipi bileşimindeki nispi değişiklikleri daha iyi anlamak için hücre sayılarını kategori başına oranlara dönüştürün. Her hücre tipindeki DPW oranını görselleştirin (Ek Şekil 8):
pt1 <- table(dataset$DPW, dataset$cell_types) pt1 <- as.data.frame(pt1) pt1$Var1 <- as.character(pt1$Var1) ggplot(pt1, aes(x = Var2, y = Freq, fill = Var1)) + theme_bw(base_size = 15) + geom_col(position = "fill", width = 0.5) + xlab("Sample") + RotatedAxis() + ylab("Proportion") + theme(legend.title = element_blank())
Her DPW'deki hücre tiplerinin oranını görselleştirin ( Şekil 7).
pt2 <- table(dataset$cell_types, dataset$DPW) pt2 <- as.data.frame(pt2) pt2$Var1 <- as.character(pt2$Var1) ggplot(pt2, aes(x = Var2, y = Freq, fill = Var1)) + theme_bw(base_size = 15) + geom_col(position = "fill", width = 0.5) + xlab("Sample") + ylab("Proportion") + theme(legend.title = element_blank())
Veri kümesi Seurat nesnesini bir RDS dosyası olarak çalışma dizinine kaydedin.
saveRDS(dataset, "dataset_post_Method3.rds")

4. Seurat kullanarak hücre alt tiplerini analiz etme

NOT: Tek hücreli analizin gücü, yukarıda analiz edilen ana hücre tipleri içindeki nadir alt tiplerin keşfedilmesini ve analiz edilmesini sağlar. Bu örnek, tek bir kategoride birleştirilmeden önce başlangıçta iki Seurat kümesinde kümelenen fibroblastlara odaklanmaktadır. Protokolün bu kısmı, diğer tüm hücre tiplerini hariç tutarak, özellikle fibroblastlara odaklanır ve yara iyileşmesi sırasında kimliklerini ve zamansal özelliklerini araştırır. İsteğe bağlı bir adım olarak, gerekirse kaydedilen RDS dosyasını bir Seurat nesnesi olarak yükleyin.

dataset <- readRDS("dataset_post_Method3.rds")

Orijinal veri kümesini fibroblast hücre kimliğine göre alt kümeleyin.
Kimlikler(veri kümesi) <- "cell_types"
dataset_fibroblast <- subset(dataset, idents = "Fibroblast")
Bu daha küçük veri kümesinde PCA gerçekleştirin ve PCA boyutlarına göre veri kümesi varyasyonunun miktarını görselleştirin (Ek Şekil 9).
dataset_fibroblast <- RunPCA(dataset_fibroblast, verbose = TRUE) ElbowPlot(dataset_fibroblast, reduction = "pca", ndims = 50)
NOT: Büyük varyasyonların çoğu ilk 9 boyutta meydana gelir.
1-9 arasında ayarlanmış bir PCA boyut aralığı ve 0,1 arasında ayarlanmış bir çözünürlük kullanarak veri kümesinin hücre kümelemesini gerçekleştirin.
dataset_fibroblast <- FindNeighbors(dataset_fibroblast, verbose = TRUE, dims = 1:9) dataset_fibroblast <- FindClusters(dataset_fibroblast, verbose = TRUE, resolution = 0.1)
NOT: Bu ayarları kullanarak, algoritma 3 benzersiz fibroblast kümesini ayırt eder. Bu kümeler otomatik olarak seurat_clusters adlı bir meta veri değişkenine atanır.
İlk 9 PCA boyutunu kullanarak UMAP boyutsal küçültme ve komşu bulma analizi gerçekleştirin. Elde edilen veri projeksiyonunun tekrarlanabilirliğini sağlamak için 123 numaralı tohumu ekleyin.
dataset_fibroblast <- RunUMAP(dataset_fibroblast, verbose = TRUE, dims = 1:9, seed.use = 123)
Hücrelerin kümelenmesini bir UMAP grafiğinde görselleştirin (Şekil 8).
DimPlot(dataset_fibroblast, group.by = "seurat_clusters", raster = FALSE, label = TRUE)
Hücrelerin yara zaman seyri açıklamasını bir UMAP grafiği üzerinde görselleştirin (Ek Şekil 10).
DimPlot(dataset_fibroblast, group.by = "DPW", raster = FALSE, label = FALSE)
Üç fibroblast alt tipi için DEG listelerini alın ve bunları çalışma dizinindeki bir metin dosyasına kaydedin.
Idents(dataset_fibroblast) <- "seurat_clusters" fibroblast_markers <- FindAllMarkers(dataset_fibroblast, max.cells.per.ident = 500, only.pos = TRUE, min.pct = 0.10, logfc.threshold = 0.25) write.csv(fibroblast_markers, file = file.path(getwd(), "fibroblast_cluster_markers.txt"))
DEG'leri en iyi fibroblast alt tip belirteçlerine filtrelemek için bir elektronik tabloda yukarıdakine benzer adımları (adım 3.9-3.10) izleyin.
DEG metin dosyasından üç kümenin her biri için ilk 5 fibroblast alt tip işaretleyicisini kopyalayarak değişken olarak özel bir gen listesi tanımlayın.
FB_type_marker <- c("Plac8", "Cthrc1", "Adam12", "Ifi211", "Plat", "Cdh4", "Aldh3a1", "Ppp1r14a", "Oxtr", "Serpina3c", "Sostdc1", "Scube3", "Ptprz1", "Corin", "Alx4")
Dotplot'un özellikler parametresindeki değişkeni çağırarak yalnızca fibroblast veri kümesindeki listedeki genleri görselleştirin (Şekil 9).
DotPlot(dataset_fibroblast, group.by="seurat_clusters", features = FB_type_marker) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(midpoint = 0, low = "blue", mid = "grey", high = "red") DotPlot(dataset_fibroblast, group.by="DPW", features = FB_type_marker) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(midpoint = 0, low = "blue", mid = "grey", high = "red")
Nokta grafiğinin özellikler parametresinde değişkeni çağırarak orijinal tek hücreli veri kümesindeki listedeki genleri görselleştirin (Ek Şekil 11).
DotPlot(dataset, group.by="cell_types", features = FB_type_marker) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(midpoint = 0, low = "blue", mid = "grey", high = "red")
Her DPW kategorisindeki fibroblast alt tiplerinin oranını görselleştirin (Ek Şekil 12).
pt3 <- table(dataset_fibroblast$seurat_clusters, dataset_fibroblast$DPW) pt3 <- as.data.frame(pt3) pt3$Var1 <- as.character(pt3$Var1) ggplot(pt3, aes(x = Var2, y = Freq, fill = Var1)) + theme_bw(base_size = 15) + geom_col(position = "fill", width = 0.5) + xlab("Sample") + ylab("Proportion") + theme(legend.title = element_blank())
Her bir fibroblast alt tipi kategorisindeki DPW fibroblast hücrelerinin oranını görselleştirin (Ek Şekil 13).
pt4 <- table(dataset_fibroblast$DPW, dataset_fibroblast$seurat_clusters) pt4 <- as.data.frame(pt4) pt4$Var1 <- as.character(pt4$Var1) ggplot(pt4, aes(x = Var2, y = Freq, fill = Var1)) + theme_bw(base_size = 15) + geom_col(position = "fill", width = 0.5) + xlab("Sample") + ylab("Proportion") + theme(legend.title = element_blank())
Veri kümesi Seurat nesnesini bir RDS dosyası olarak çalışma dizinine kaydedin.
saveRDS(dataset_fibroblast, "dataset_fibroblast_post_Method4.rds")

5. Modül puanlaması yoluyla bir takip analizi örneği

NOT: Tek hücreli veri kümelerini analiz etmek için kullanışlı bir yöntem, modül puanlaması olarak adlandırılır. Bu iş akışında, önceki bilgilere göre bir gen listesi tanımlanabilir ve ardından her hücre içindeki gen listesinin potansiyel zenginleşmelerini tanımlayabilen modül puanları hesaplanabilir. Bu puanlar, potansiyel zenginleştirme modellerini ortaya çıkarmak için hücre ek açıklamaları arasında ortalaması alınabilir.

Burada, daha önce yayınlanmış bir çalışma^2'den gen listelerini kullanın, burada yara iyileşme fazına özgü genler, iyileşme sürekliliği boyunca toplu RNA dizili örnekler kullanılarak tanımlanmıştır. Gen listeleri, artık çalışma dizinine indirilebilen ve üç ana iyileşme aşamasını tanımlayan gen listeleri oluşturmak için kullanılabilen sekmeyle ayrılmış bir metin dosyasına (Ek Dosya 2: JoVE_PhaseSpecificGenes.txt) kaydedildi.

TEXT dosyasını okuyarak gen listelerini bir değişkene yükleyin.
PhaseSpecificGenes <- read_delim("JoVE_PhaseSpecificGenes.txt", delim="\t", col_names = T)
Sütunları tek tek gen listesi değişkenlerine ayırın ve genleri, ilk harfleri büyük olan fare adlarıyla değiştirin.
PS_Inflammatory <- PhaseSpecificGenes[1] PS_Inflammatory_ms <- lapply(PS_Inflammatory, str_to_sentence) PS_Proliferative <- PhaseSpecificGenes[2] PS_Proliferative_ms <- lapply(PS_Proliferative, str_to_sentence) PS_Resolution <- PhaseSpecificGenes[3] PS_Resolution_ms <- lapply(PS_Resolution, str_to_sentence)
NOT: (İsteğe bağlı) Gerekirse, kaydedilen RDS dosyasını bir Seurat nesnesi olarak yükleyin.
dataset <- readRDS("dataset_post_Method3.rds")
Veri kümesindeki her hücreyi iyileşmenin üç aşamasına göre puanlamak için gen listelerini modüller olarak kullanın.
dataset <- AddModuleScore( object = dataset, features = PS_Inflammatory_ms, ctrl = 100, name = 'Inflammatory' ) dataset <- AddModuleScore( object = dataset, features = PS_Proliferative_ms, ctrl = 100, name = 'Proliferative' dataset <- AddModuleScore( object = dataset, features = PS_Resolution_ms, ctrl = 100, name = 'Resolution' )
DPW ve ana hücre türleri dahil olmak üzere hücre kategorisi başına toplam modül puanlarını görselleştirin (Şekil 10).
DotPlot(dataset, group.by="DPW", features = c("Inflammatory1","Proliferative1", "Resolution1")) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(midpoint = 0, low = "blue", mid = "grey", high = "red") DotPlot(dataset, group.by="cell_types", features = c("Inflammatory1","Proliferative1", "Resolution1")) + RotatedAxis() + scale_colour_gradient2(midpoint = 0, low = "blue", mid = "grey", high = "red")

6. CellChat aracılığıyla bir takip analizi örneği

NOT: Tek hücreli veri kümelerinin analizi için bir başka yararlı ve iyi alıntı yapılan yöntem, hücre-hücre etkileşimlerinin çıkarılmasıdır. Bu iş akışında, hücre grupları²² arasındaki diferansiyel ligand-reseptör etkileşimlerini analiz ederek hücre-hücre iletişimini çıkaran CellChat paketini kullanın. Son zamanlarda, CellChat'in geliştiricileri, genelleştirilmiş kullanımı²⁴ için ayrıntılı bir adım adım protokol yayınladı ve bu, aşağıdaki iş akışı üzerinde çalışan ve bunu veri kümelerine uygulayan kullanıcılar için mükemmel bir kaynaktır. Örnek olarak, aşağıdaki iş akışı, yaralamadan 1 ve 14 gün sonraki (DPW) yaralardaki tüm ana hücrelerin etkileşimlerini karşılaştırır. Her adım çok ayrıntılı olarak açıklanmamıştır, çünkü tüm adımlar resmi CellChat yayını^24'te ve burada bağlantısı verilen öğreticilerde zaten açıklanmıştır:

Hücre-hücre iletişiminin çıkarımı ve analizi
Hücre Sohbeti: https://github.com/jinworks/CellChat/blob/master/tutorial/CellChat-vignette.html

CellChat kullanarak birden çok veri kümesinin karşılaştırma analizi:
https://github.com/jinworks/CellChat/blob/master/tutorial/Comparison_analysis_of_multiple_datasets.html

İsteğe bağlı adım: Gerekirse, kaydedilen RDS dosyasını bir Seurat nesnesi olarak yükleyin:

dataset <- readRDS("dataset_post_Method3.rds")

Orijinal veri kümesini DPW ek açıklamasına göre iki veri kümesine alt kümeleyin.
Idents(dataset) <- "DPW" dataset_D1 <- subset(dataset, ident = "D1") dataset_D14 <- subset(dataset, ident = "D14")
CellChat'in gerçekleştirileceği ek açıklamayı tanımlayın --- bu durumda ana hücre türlerini kullanın.
Idents(dataset_D1) <- "cell_types" Idents(dataset_D14) <- "cell_types"
CellChat nesnelerini oluşturun ve tipik CellChat iş akışını takip edin. Her adım için ayrıntılı referanslar olarak yukarıda bağlantısı verilen öğreticilere bakın.
cellchat_D1 <- createCellChat(dataset_D1, group.by = "ident", assay = "RNA") cellchat_D14 <- createCellChat(dataset_D14, group.by = "ident", assay = "RNA") CellChatDB <- CellChatDB.mouse CellChatDB.use <- CellChatDB cellchat_D1@DB <- CellChatDB.use cellchat_D14@DB <- CellChatDB.use cellchat_D1 <- subsetData(cellchat_D1) cellchat_D14 <- subsetData(cellchat_D14) future::plan("multisession", workers = 4) cellchat_D1 <- identifyOverExpressedGenes(cellchat_D1, do.fast = F) cellchat_D14 <- identifyOverExpressedGenes(cellchat_D14, do.fast = F) cellchat_D1 <- identifyOverExpressedInteractions(cellchat_D1) cellchat_D14 <- identifyOverExpressedInteractions(cellchat_D14) cellchat_D1 <- computeCommunProb(cellchat_D1, type = "triMean", population.size = TRUE) cellchat_D14 <- computeCommunProb(cellchat_D14, type = "triMean", population.size = TRUE) cellchat_D1 <- filterCommunication(cellchat_D1, min.cells = 10) cellchat_D14 <- filterCommunication(cellchat_D14, min.cells = 10) cellchat_D1 <- computeCommunProbPathway(cellchat_D1) cellchat_D14 <- computeCommunProbPathway(cellchat_D14) cellchat_D1 <- aggregateNet(cellchat_D1) cellchat_D14 <- aggregateNet(cellchat_D14) cellchat_D1 <- netAnalysis_computeCentrality(cellchat_D1, slot.name = "netP") cellchat_D14 <- netAnalysis_computeCentrality(cellchat_D14, slot.name = "netP")
Her yara iyileşme zaman noktasında tüm ana hücre tiplerinde gelen ve giden etkileşim güçlerini görselleştirin (Ek Şekil 14).
netAnalysis_signalingRole_scatter(cellchat_D1) netAnalysis_signalingRole_scatter(cellchat_D14)
Fibroblastlar, D1 ve D14 DPW arasındaki etkileşimlerini önemli ölçüde arttırır.
Tüm önemli çıkarılan hücre-hücre iletişim yollarının listelerini gösterin.
cellchat_D1@netP$pathways cellchat_D14@netP$pathways
Kollajen yolu, hem D1 hem de D14 DPW'deki önemli yollardan biridir.
Kollajen sinyal yoluna ve fibroblastlarla etkileşimine odaklanın.
pathways.show <- c("COLLAGEN")
Daire diyagramlarını kullanarak hücre tipleri arasındaki kollajen sinyal yolu etkileşimlerini görselleştirin (Ek Şekil 15).
par(mfrow=c(1,2)) netVisual_aggregate(cellchat_D1, signaling = pathways.show, layout = "circle") netVisual_aggregate(cellchat_D14, signaling = pathways.show, layout = "circle") par(mfrow=c(1,1))
Akor diyagramlarını kullanarak hücre tipleri arasındaki kollajen sinyal yolu etkileşimlerini görselleştirin (Ek Şekil 16).
par(mfrow=c(1,2)) strwidth <- function(x) {0.5} netVisual_aggregate(cellchat_D1, signaling = pathways.show, layout = "chord", vertex.label.cex = 0.6) netVisual_aggregate(cellchat_D14, signaling = pathways.show, layout = "chord", vertex.label.cex = 0.6) par(mfrow=c(1,1))
Kaynak hücreler olarak fibroblastlarla COLLAGEN sinyal yolu etkileşimlerini görselleştirin (Ek Şekil 17).
NOT: Cellchat nesnelerindeki hücre tipleri, orijinal Seurat nesnesinde atandıkları sıraya göre kimlikler olarak listelenir: 1 = Makrofaj, 2 = Nötrofil, 3 = Fibroblast, 4 = Epitel hücresi, 5 = Endotel hücresi, 6 = T hücresi, 7 = Düz kas hücresi.
par(mfrow=c(1,2)) strwidth <- function(x) {0.5} netVisual_aggregate(cellchat_D1, signaling = pathways.show, layout = "chord", vertex.label.cex = 0.6, sources.use = 3) netVisual_aggregate(cellchat_D14, signaling = pathways.show, layout = "chord", vertex.label.cex = 0.6, sources.use = 3) par(mfrow=c(1,1))
Kaynak hücreler olarak fibroblastlar ile COLLAGEN sinyal yolundaki her bir ligand-reseptör çiftinin katkılarını görselleştirin.
1. Kabarcık grafiklerini kullanma (Ek Şekil 18):
  gg1 <- netVisual_bubble(cellchat_D1, sources.use = 3, targets.use = NULL, signaling = pathways.show, remove.isolate = FALSE) gg2 <- netVisual_bubble(cellchat_D14, sources.use = 3, targets.use = NULL, signaling = pathways.show, remove.isolate = FALSE) gg1 + gg2
2. Akor diyagramlarını kullanma (Ek Şekil 19):
  par(mfrow=c(1,2)) strwidth <- function(x) {0.4} netVisual_chord_gene(cellchat_D1, sources.use = 3, targets.use = NULL, signaling = pathways.show, lab.cex = 0.6, show.legend= F) netVisual_chord_gene(cellchat_D14, sources.use = 3, targets.use = NULL, signaling = pathways.show, lab.cex = 0.6, legend.pos.x = 60) par(mfrow=c(1,1))
COLLAGEN sinyal yolu içindeki Col1a1-Cd44 ligand-reseptör etkileşimine odaklanın.
LR.show <- "COL1A1_CD44"
Akor diyagramlarını kullanarak hücre tipleri arasındaki Col1a1-Cd44 ligand-reseptör etkileşimlerini görselleştirin (Ek Şekil 20).
strwidth <- function(x) {0.5} netVisual_individual(cellchat_D1, signaling = pathways.show, pairLR.use = LR.show, layout = "chord") netVisual_individual(cellchat_D14, signaling = pathways.show, pairLR.use = LR.show, layout = "chord")
Birleşik bir CellChat nesnesi oluşturarak diferansiyel CellChat analizi gerçekleştirin.
object.list_D14_v_D1 <- list(D1 = cellchat_D1, D14 = cellchat_D14) cellchat_D14_v_D1 <- mergeCellChat(object.list_D14_v_D1, add.names = names(object.list_D14_v_D1))
Yara iyileşme zaman noktalarında hücre-hücre etkileşimlerinin toplam sayılarını ve göreceli güçlerini görselleştirin (Ek Şekil 21).
gg1 <- compareInteractions(cellchat_D14_v_D1, show.legend = F) gg2 <- compareInteractions(cellchat_D14_v_D1, show.legend = F, measure = "weight") gg1 + gg2
Yara 1. günden 14. güne geçerken her hücre tipi arasındaki diferansiyel hücre-hücre etkileşim güçlerini bir daire çizerek görselleştirin (Ek Şekil 22).
netVisual_diffInteraction(cellchat_D14_v_D1, weight.scale = T, measure = "weight")
Yara 1. günden 14. güne geçerken her hücre tipi arasındaki diferansiyel hücre-hücre etkileşim güçlerini bir ısı haritası kullanarak görselleştirin (Ek Şekil 23).
netVisual_heatmap(cellchat_D14_v_D1, measure = "weight")
14. güne karşı 1. günde kaynak hücreler olarak fibroblastlarla hücre hücre etkileşimlerine bireysel yolların göreceli katkılarını bir sıralama grafiği kullanarak görselleştirin (Ek Şekil 24).
rankNet(cellchat_D14_v_D1, mode = "comparison", measure = "weight", sources.use = 3, targets.use = NULL, stacked = T, do.stat = TRUE)
Kabarcık grafiklerini kullanarak, 14. günde kaynak hücreler olarak fibroblastlar ile kollajen sinyal yolundaki bireysel ligand-reseptör çiftlerinin nispi katkılarını 1. güne kıyasla görselleştirin (Ek Şekil 25).
gg1 <- netVisual_bubble(cellchat_D14_v_D1, sources.use = 3, targets.use = NULL, signaling = pathways.show, comparison = c(1, 2), max.dataset = 2, title.name = "Increased signaling in D14", angle.x = 45, remove.isolate = F) gg2 <- netVisual_bubble(cellchat_D14_v_D1, sources.use = 3, targets.use = NULL, signaling = pathways.show, comparison = c(1, 2), max.dataset = 1, title.name = "Decreased signaling in D14", angle.x = 45, remove.isolate = F) gg1 + gg2
Tıpkı Seurat nesneleri gibi, CellChat nesneleri de RDS dosyaları olarak kaydedilebilir ve açılabilir.
saveRDS(cellchat_D1, "cellchat_D1.rds") saveRDS(cellchat_D14, "cellchat_D14.rds") saveRDS(cellchat_D14_v_D1, "cellchat_D14_v_D1.rds")
İsteğe bağlı adım: CellChat nesneleri RDS dosyalarından da açılabilir.
cellchat_D1 <- readRDS("cellchat_D1.rds") cellchat_D14 <- readRDS("cellchat_D14.rds") cellchat_D14_v_D1 <- readRDS("cellchat_D14_v_D1.rds")

7. Birden çok tek hücreli veri kümesini birleştirerek bütünleştirici bir analiz örneği

NOT: Tek hücreli veri kümeleri, toplu veya gruplar halinde sıralandıkları için genellikle birden çok dosyaya ayrılır. Bu iş akışı, yara iyileşmesi veri kümesinin ²⁰ beş partisinden ikisinin nasıl entegre edileceğini gösterir. Veri kümesi entegrasyonu için mevcut yöntemler aşağıdaki Seurat vinyetleri ile açıklanmıştır:

scRNA-seq entegrasyonuna giriş:
https://satijalab.org/seurat/articles/integration_introduction

Seurat v5'te bütünleştirici analiz:

https://satijalab.org/seurat/articles/seurat5_integration

Not: Her biri kendi güçlü ve zayıf yönlerine sahip çok sayıda tek hücreli veri kümesi entegrasyon yöntemi vardır. Ayrıntılar için, entegrasyon yöntemlerinin kapsamlı karşılaştırmasına^{bakın 25}. Kullanıcının herhangi bir entegrasyon yöntemine güvenmeden önce ilgili tüm belgeleri okuması önemlidir.

Hu ve ark. veri kümesi 20'nin başka bir partisi için Yöntem^2'deki tüm adımları tekrarlayın. Aşağıdaki protokolde toplu iş #3 kullanılır. Ek R betik dosyası dahildir ve toplu iş #3'ü işlemek için kullanılabilir (Ek Dosya 3: JoVE_Rscript_b3. R). Veri kümesi için yeni bir değişken oluşturmayı ve kullanmayı unutmayın --- aşağıdaki kodda, veri kümesi toplu #3 için "dataset_b3" kullanın.
1. İsteğe Bağlı Adım: Gerekirse, iki veri kümesini çalışma dizinine kaydedilen RDS dosyalarından Seurat nesneleri olarak açın:
  dataset <- readRDS("dataset_post_Method2.rds") dataset_b3 <- readRDS("dataset_b3_post_Method2.rds")
Sonraki analizlerde kaynak veri kümesini etiketlemek için "batch" adlı her veri kümesine yeni bir değişken atayın.
dataset@meta.data$batch <- "b1" dataset_b3@meta.data$batch <- "b3"
İki veri kümesinin Seurat birleştirmesini gerçekleştirin, toplu iş tabanlı hücre kimliği ek açıklamaları ekleyin ve ardından Yöntem 3'te açıklandığı gibi birleştirilmiş veri kümesi için standart Seurat iş akışını gerçekleştirin.
dataset_merged <- merge(x = dataset, y = c(dataset_b3), add.cell.ids = c("b1", "b3"), merge.data = TRUE) DefaultAssay(dataset_merged) <- "RNA" dataset_merged <- NormalizeData(dataset_merged) dataset_merged <- FindVariableFeatures(dataset_merged) dataset_merged <- ScaleData(dataset_merged) dataset_merged <- RunPCA(dataset_merged) ElbowPlot(dataset_merged, reduction = "pca", ndims = 50)
Veri tümleştirmesinden önce birleştirilmiş veri kümesi üzerinde kümeleme ve UMAP analizi gerçekleştirin.
dataset_merged <- FindNeighbors(dataset_merged, dims = 1:10, reduction = "pca") dataset_merged <- FindClusters(dataset_merged, resolution = .1, cluster.name = "unintegrated_clusters") dataset_merged <- RunUMAP(dataset_merged, dims = 1:10, seed.use = 123, reduction = "pca", reduction.name = "umap.unintegrated")
UMAP grafiğini küme ve parti numaralarına göre görselleştirin (Ek Şekil 26).
DimPlot(dataset_merged, reduction = "umap.unintegrated", group.by = c("seurat_clusters", "batch"))
Her kümedeki hücre numaralarının parti numarasına göre dağılımını gösterin.
table(dataset_merged$batch, dataset_merged$seurat_clusters)
NOT: UMAP grafiğinden ve tablodan, bu iki veri kümesi için önemli bir toplu iş etkisi yok gibi görünüyor. Toplu etkilerin kanıtı, iki veri kümesi arasındaki küme dağılımında beklenmedik tutarsızlıklar olarak ortaya çıkacaktır, bu da veri kümeleri arasında gerçek biyolojik benzerlikleri geçersiz kılan potansiyel teknik farklılıklar olduğu anlamına gelebilir.
RPCA yöntemini kullanarak Seurat veri entegrasyonunu gerçekleştirin. Bu ve diğer veri entegrasyon yöntemleri hakkında daha fazla bilgi için lütfen yukarıda bağlantısı verilen Seurat vinyetini okuyun.
dataset_merged <- IntegrateLayers( object = dataset_merged, method = RPCAIntegration, orig.reduction = "pca", new.reduction = "integrated.rpca", verbose = TRUE )
Veri entegrasyonundan sonra birleştirilmiş veri kümesi üzerinde kümeleme ve UMAP analizi gerçekleştirin.
FindNeighbors(dataset_merged, dims = 1:10, reduction = "integrated.rpca") dataset_merged <- FindClusters(dataset_merged, resolution = .1, cluster.name = "rpca_clusters") dataset_merged <- RunUMAP(dataset_merged, dims = 1:10, seed.use = 123, reduction = "integrated.rpca", reduction.name = "umap.rpca")
Entegrasyondan sonra UMAP grafiğini küme ve parti numaralarına göre görselleştirin (Ek Şekil 27).
DimPlot(dataset_merged, reduction = "umap.rpca", group.by = c("seurat_clusters","batch"))
Entegrasyondan sonra her kümedeki hücre numaralarının parti numarasına göre dağılımını gösterin.
table(dataset_merged$batch, dataset_merged$seurat_clusters)
UMAP grafiğinden ve entegre veri tablosundan, artık farklı kümeler arasında iki parti arasında mükemmel bir örtüşme var. İlginç bir şekilde, verilerin entegrasyonu, aynı kümeleme parametrelerini kullanarak ek bir kümenin tanımlanmasıyla sonuçlandı.
Veri kümesi entegrasyonundan sonra ve aşağı akış analizlerinden önce, birleştirilmiş veri kümesinin katmanları birleştirilmelidir.
dataset_merged <- JoinLayers(dataset_merged)
Veri kümesi Seurat nesnesini bir RDS dosyası olarak çalışma dizinine kaydedin.
saveRDS(dataset_merged, "merged_dataset_post_Method7.rds")

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yöntem #2'den başlayarak, protokol, tek hücreli bir yara iyileşmesi veri setine yükleme ve kalite kontrol adımlarını gerçekleştirme adımlarında yol gösterir. Seurat nesnesini oluşturduktan sonra (adım 2.6.2), bir dizi adım, veri seti içindeki iki testi (RNA ve protein; adım 2.6.3-2.6.7) birleştirir ve protein testinin uzaysal-zamansal barkodlara göre kompleks hale getirilmesini gerçekleştirir (adım 2.6.8-2.6.9). Karmaşıklaştırma işlevi, veri kümesindeki her hücreye, her hücrenin en olası uzay-zamansal barkodunu tanımlayan "barcodes_maxID" dahil olmak üzere birkaç meta veri etiketi atar (adım 2.6.10). Adım 2.6.11'de, keman grafiği işlevi, hücrelerde tespit edilen genlerin çoğullanmış barkodlarına dayalı olarak dağılımını görselleştirmek için gerçekleştirilir. Bu adımın temsili sonucu (Ek Şekil 1), her bir barkod için tespit edilen genlerin oldukça eşit bir dağılımı olduğunu göstermektedir, bu da veri seti bütünlüğü ve yara iyileşme zaman noktalarının aşağı akış analizi için önemlidir. Protein barkodlarına uygun etiketi atadıktan sonra (adım 2.6.12), protokol daha sonra her hücredeki mitokondriyal genlerin yüzdesini hesaplamaktan başlayarak veri setinin RNA tahlili üzerinde kalite kontrol adımlarının nasıl gerçekleştirileceğini gösterir (adım 2.9). Adım 2.10'da, tüm hücrelerde tespit edilen genlerin dağılımını, RNA sayısını ve mitokondriyal yüzdeyi görselleştirmek için özellik dağılım grafiği işlevi gerçekleştirilir. Bu adımın temsili sonuçları (Ek Şekil 2), düşük RNA sayıları ile ilişkili olan ve ölü veya ölmekte olan hücreleri tanımlayan büyük mitokondriyal içeriğe sahip bir dizi hücre olduğunu göstermektedir. Düşük RNA sayımlarına ve büyük mitokondriyal içeriğe sahip hücreleri çıkardıktan sonra (adım 2.11), adım 2.12'de alt küme veri kümesinde başka bir özellik saçılma grafiği işlevi gerçekleştirilir ve bu adımın temsili sonucu (Ek Şekil 3), tespit edilen genlerin dağılımının ve hücre başına mitokondriyal RNA yüzdesinin artık daha normal olduğunu ve sağlam aşağı akış analizlerinin önünü açtığını gösterir. Daha sonra protokol, veri kümesindeki olası çiftleri tanımlamak için scDblFinder işlevinin kullanımını açıklar ve her hücreye "scDblFinder.score" adlı yeni bir meta veri atar (adım 2.13-2.14). Adım 2.15'te, veri setindeki ikili puanların dağılımını görselleştirmek için keman grafiği işlevi gerçekleştirilir ve bu adımın temsili sonucu (Ek Şekil 4), nispeten yüksek ikili puanlara sahip bir dizi hücre olduğunu ve 0.25'in üzerinde olası bir çift popülasyonun olduğu doğal bir kesme gibi göründüğünü gösterir. Bu nedenle, aşağıdaki adımlar, veri kümesini sınırın altındaki hücrelere (adım 2.16) alt kümelemek için bu parametreyi kullanır ve böylece bu tek hücreli veri kümesi için kalite kontrol adımlarını tamamlar.

Yöntem #3'ten başlayarak, protokol, Seurat paketini ve iş akışını kullanarak kalite kontrollü tek hücreli yara iyileşmesi veri setini analiz etme adımlarında yol gösterir. RNA verilerinin normalleştirilmesi ve ölçeklendirilmesinden sonra, PCA analizi yapılır (adım 3.1). Adım 3.2'de, dirsek grafiği işlevi, ilk 50 PCA boyutuna göre veri kümesi varyasyonunun miktarını ve bu adımın temsili sonucunu görselleştirmek için kullanılır (Ek Şekil 5), büyük varyasyonların çoğunun, grafikteki bükülme ile tanımlanan ilk 13 boyutta meydana geldiğini gösterir. Protokol daha sonra komşuların nasıl bulunacağını ve ilk 13 PCA boyutunu ve 0.1'lik nispeten düşük bir kümeleme çözünürlük parametresini kullanarak veri kümesinin hücre kümelemesinin (adım 3.3) ve UMAP boyutsal azaltmasının (adım 3.4) nasıl gerçekleştirileceğini gösterir, her ikisi de yaralardaki en genelleştirilebilir ana hücre tiplerini tanımlamak için seçilmiştir. Adım 3.5'te, boyutsal çizim işlevi, bir UMAP grafiği üzerindeki hücrelerin kümelenmesini görselleştirmek için gerçekleştirilir ve bu adımın temsili sonucu (Şekil 1), veri kümesindeki tüm hücrelerin, Windows (solda) ve MacOS (sağda) çalıştıran bir bilgisayardan elde edilen biraz farklı UMAP grafiklerine sahip, renk kodlu 8 ana Seurat küme grubu etrafında kümelendiğini gösterir. Adım 3.6'da, hücrelerin yara zaman/uzay açıklamasını ve bu adımın temsili sonucunu görselleştirmek için başka bir boyutsal çizim işlevi gerçekleştirilir (Şekil 2), veri kümesindeki tüm hücrelerin zaman/mekan kökenlerine göre yayıldığını ve zaman/mekan ek açıklamasına göre belirgin bir kümelenme olmadığını gösterir. Protokol daha sonra, diferansiyel olarak ifade edilen genlerin listelerinin nasıl elde edileceğini ve bunların bir metin dosyasına nasıl kaydedileceğini (adım 3.8), veri tablosunu bir elektronik tabloda nasıl açacağınızı ve her hücre kümesi için en üst sıradaki küme işaretleyicilerini elde etmek için çeşitli filtreleme adımlarının nasıl gerçekleştirileceğini açıklar (adım 3.9-3.10.6). Bu adımların temsili sonucu (Ek Tablo 1), sıralanmış diferansiyel olarak ifade edilen genlerin tam çıktısını içeren son elektronik tablo dosyasıdır, başka bir temsili sonuç ise (Ek Tablo 2), her bir Seurat kümesi için en iyi 5 yukarı regüle edilmiş ve ifade edilmiş geni gösteren basitleştirilmiş bir tablodur. Protokol daha sonra, en üst küme işaretleyici genlerine (adım 3.11-3.12) göre varsayılan hücre tiplerini tanımlamak için EnrichR adlı web tabanlı bir fonksiyonel zenginleştirme analiz aracının nasıl kullanılacağını ve bu adımların temsili sonuçlarını (Şekil 3), sekiz hücre kümesinin her biri için en çok zenginleştirilmiş hücre türlerini gösteren EnrichR çıkışlarının kırpılmış ekran görüntüleridir. Protokol daha sonra ilgili Seurat kümelerindeki tüm hücrelere en zenginleştirilmiş hücre tipi açıklamalarına göre "cell_types" adlı yeni bir meta veri etiketi atar (adım 3.14). Adım 3.15'te, boyutsal çizim işlevi, yeniden adlandırılmış hücre kümelerini bir UMAP grafiğinde hücre tipi ek açıklamaları olarak görselleştirmek için gerçekleştirilir ve bu adımın temsili sonuçları (Şekil 4), veri kümesindeki tüm hücrelerin ana renk kodlu hücre türleri etrafında kümelendiğini gösterdi. Adım 3.16'da, öznitelik grafiği işlevi, bir dizi UMAP grafiği üzerinde üst küme işaretleyici genlerinin (Ek Tablo 2'den) lokalizasyonunu görselleştirmek için kullanıldı ve temsili sonuçlar (Şekil 5), ilgili ana hücre tipi küme konumları içinde en üst hücre işaretleyici genlerin yüksek ekspresyonunu gösteren bir UMAP grafikleri ızgarasıdır. Adım 3.17 ve 3.18'de, hücrelerdeki üst küme işaretleyici genlerinin göreceli ifade seviyelerini görselleştirmek için nokta grafiği işlevi gerçekleştirildi, ilk olarak orijinal Seurat küme numaralarına göre gruplandırıldı (adım 3.17) ve ikinci olarak açıklamalı hücre tipi etiketlerine göre gruplandırıldı (adım 3.18). Bu adımların temsili sonuçları, en üst hücre işaretleyici genlerinin yalnızca kendi Seurat kümelerinde (Ek Şekil 6) ve yalnızca ilgili ana hücre tiplerinde (Şekil 6). Protokoldeki bir sonraki adım, orijinal uzamsal-zamansal protein bazlı etiketleri, hücreleri kaynaklandıkları yaralama sonrası günlere (DPW) göre tanımlayan kesinlikle zamansal ek açıklamalara basitleştirir. Adım 3.20'de, hücreleri bir UMAP grafiğinde DPW ek açıklamaları olarak görselleştirmek için boyutsal çizim işlevi gerçekleştirilir ve bu adımın temsili sonuçları (Ek Şekil 7), tek hücreli yara iyileşmesi veri seti boyunca yara zaman seyri açıklamalarının lokalizasyonunu gösterdi. Beklendiği gibi, 1. gün (D1) açıklamaları nötrofil ve makrofaj kümelerine hakim olurken, daha sonraki yara iyileşme zaman noktaları diğer hücre tiplerinde daha fazla temsil edildi. Protokoldeki aşağıdaki adımlarda, önce farklı hücre tiplerindeki DPW oranlarını görselleştirmek (adım 3.22) ve ardından farklı zaman noktalarındaki hücre tiplerinin oranlarını görselleştirmek (3.23) için yığılmış çubuk grafikleri kullanılmıştır. Bu adımların temsili sonuçları, her bir ana hücre türü kategorisindeki DPW hücrelerinin göreli sayılarını gösteren orantı grafikleridir (Ek Şekil 8) ve her DPW kategorisindeki ana hücre türlerinin göreli sayıları (Şekil 7). Bu sonuçlar, bağışıklık hücrelerinin (nötrofiller ve makrofajlar) enflamatuar faz sırasında erken zaman noktalarına hakim olduğu ve diğer hücre tiplerinin (epitel hücreleri ve endotel hücreleri) proliferatif faz sırasında ortaya çıkmaya başladığı, fibroblastların yara çözünürlüğü sırasında daha sonraki zaman noktalarında özellikle baskın olduğu bilinen hücresel cilt yara iyileşmesi kaskadını doğruladı.

Yöntem #4'ten başlayarak, protokol, yara iyileşmesi sırasında potansiyel hücresel alt tipleri tanımlamak için tek hücreli veri setindeki tek bir ana hücre tipine odaklanmak için Seurat'ı kullanma adımlarını ana hatlarıyla belirtir. Protokol, tek bir kategoride birleştirilmeden önce başlangıçta iki Seurat kümesinde kümelenen fibroblastlara odaklanır ve yalnızca orijinal veri setindeki fibroblastları içeren yeni bir Seurat nesnesinin nasıl oluşturulacağını açıklar (adım 4.1). Seurat iş akışı, bu fibroblasta özgü veri seti (adım 4.2-4.4) üzerinde gerçekleştirilir ve adım 4.2, fibroblast veri setindeki ana varyasyonun çoğunun ilk 9 PCA boyutunda meydana geldiğini gösteren bir dirsek grafiği (Ek Şekil 9) ile sonuçlanır. Adım 4.5'te, bir UMAP grafiği üzerindeki hücrelerin kümelenmesini görselleştirmek için boyutsal çizim işlevi gerçekleştirilir ve bu adımın temsili sonuçları (Şekil 8), 3 renk kodlu hücre alt tipi etrafında kümelenmiş veri setindeki fibroblastları göstermiştir. Fibroblast veri setini DPW açıklamalarına göre görselleştirmek (adım 4.6), DPW açıklamalarına göre dağıtılan veri setindeki fibroblastları gösteren bir UMAP grafiği (Ek Şekil 10) ile sonuçlandı. Protokol daha sonra, diferansiyel olarak ifade edilen genlerin listelerinin nasıl elde edileceğini ve bunların bir metin dosyasına nasıl kaydedileceğini (adım 4.7), veri tablosunu Excel'de nasıl açacağınızı ve her hücre kümesi için en üst sıradaki küme belirteçlerini elde etmek için çeşitli filtreleme adımlarının nasıl gerçekleştirileceğini (adım 4.8) ve "FB_type_marker" (adım 4.9) olarak adlandırılan en iyi fibroblast işaretleyici genlerini listeleyen yeni bir değişken atamayı açıklar. Adım 4.10'da, nokta grafiği işlevi, özellikler parametresinde "FB_type_marker" değişkenini çağırarak yalnızca fibroblast veri kümesindeki listedeki genleri görselleştirmek için kullanılır ve bu adımın temsili sonuçları (Şekil 9), fibroblast alt tip belirteçlerinin yüksek ekspresyonunu yalnızca kendi küme kategorilerinde (üstte) doğrulayan, ancak DPW kategorileri arasında oldukça dağıtılmış (altta) nokta grafikleridir. Adım 4.11'de, genel yara iyileşmesi veri setindeki fibroblast işaretleyici genlerini görselleştirmek için aynı özellikler değişkeni çağrılır ve temsili sonuç (Ek Şekil 11), çoğunlukla orijinal fibroblastta fibroblast alt tip belirteçlerinin yüksek ekspresyonunu doğrulayan bir nokta grafiğidir. Son olarak, protokoldeki aşağıdaki adımlarda, önce üç fibroblast alt tipi boyunca DPW oranlarını görselleştirmek (adım 4.12) ve daha sonra farklı zaman noktalarında fibroblast alt tiplerinin oranlarını görselleştirmek (adım 4.13) için yığılmış çubuk grafikleri kullanılmıştır. Bu adımların temsili sonuçları, her bir fibroblast alt tipi kategorisindeki DPW hücrelerinin nispi sayılarını (Ek Şekil 12) ve her bir DPW kategorisindeki fibroblast alt tiplerinin nispi sayılarını (Ek Şekil 13) gösteren oran grafikleridir. Bu sonuçlar, iyileşme süresi boyunca fibroblast alt tip oranlarında önemli bir değişikliğe işaret etmektedir, birinci fibroblast alt tipi (küme 0) erken evre yaralarda (D1 ve D3), ikinci alt tip (küme 1) yara rezolüsyonu sırasında baskın (D14) ve üçüncü alt tip (küme 2) yara iyileşmesinin proliferatif fazı (D7) sırasında en yüksektir.

Yöntem #5'ten başlayarak, protokol, Seurat'taki modül puanlama işlevini kullanarak tek hücreli bir yara iyileşme veri kümesini analiz etme adımlarında yol gösterir. Protokol ilk olarak, gen setlerini R'deki değişkenlere yüklemek için sekme ile oluşturulmuş bir metin dosyası kullanma adımlarını açıklar (adım 5.1-5.2), ardından modül puanlama fonksiyonunun yara iyileşmesinin üç ana aşamasıyla ilgili üç gen setine uygulanması (adım 5.3). Adım 5.4'te, nokta grafiği işlevi, iki farklı meta veri kategorisindeki toplam modül puanlarını görselleştirmek için kullanılır ve bu adımın temsili sonuçları (Şekil 10), yaralamadan sonraki günlerde hücreler arasında ana iyileşme fazı modüllerinin ortalama ifadesini gösteren nokta grafikleridir (DPW, sağda) ve ana hücre türleri kategorisinde (solda). Bu sonuçlar, toplu dizileme tabanlı gen ekspresyon profillerinin tek hücreli ekspresyon veri setlerine yalancı toplu bir şekilde uygulanmasının, yara iyileşmesi alanında daha önce yayınlanmış veri setlerini kullanarak karşılaştırmalı biyoinformatik yaklaşımlar için güçlü bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Yöntem #6'dan başlayarak, protokol, erken ve geç faz yaralardan türetilen hücrelerin karşılaştırılmasına ilişkin belirli bir bilimsel soruya göre CellChat paketini ve iş akışını kullanarak Seurat'tan türetilmiş tek hücreli bir yara iyileşme veri setini analiz etme adımlarından geçer. Protokol ilk olarak genel Seurat veri setini yaralanma sonrası, biri enflamatuar faz sırasında (1. gün (D1)) ve diğeri yara çözünürlüğü sırasında (14. gün (D14)) (adım 6.1) olmak üzere iki zaman noktasına ayırır. İki CellChat nesnesi oluşturulur ve protokol, protokolün #3 yönteminde (adım 6.2-6.3) tanımlanan hücre tipleri arasındaki tüm varsayılan etkileşimleri hesaplamak için CellChat protokolünün tüm tipik işlevlerinden geçer. Adım 6.4'te, sinyal saçılma grafiği fonksiyonu, her bir yara iyileşme zaman noktasında tüm ana hücre tiplerinde gelen ve giden etkileşim güçlerini görselleştirmek için gerçekleştirilir. Bu adımın temsili sonuçları (Ek Şekil 14), D1 (sol) ve D14 (sağ) zaman noktalarındaki ana hücre tipleri için gelen (y ekseni) ve giden (x ekseni) etkileşimlerin güçlerini gösteren dağılım grafikleridir. Bu sonuçlar, nötrofiller ve makrofajlar gibi bağışıklık hücrelerinin, enflamatuar faz sırasında en yüksek hücre-hücre etkileşim gücüne sahip olduğunu, ancak fibroblastların yara çözünürlüğü sırasında hücre-hücre etkileşimlerine hakim olduğunu gösterdi ve bu da onlarca yıllık yara iyileşmesi araştırmalarını doğruladı. Aşağıdaki adımlar, analizi önemli ölçüde zenginleştirilmiş yollardan biri olan kollajen yoluna odaklar (adım 6.5-6.6). Adım 6.7'de, iki zaman noktasında hücre tipleri arasındaki kollajen sinyal yolu etkileşimlerini görselleştirmek için daire diyagramı işlevi gerçekleştirilir. Bu adımın temsili sonuçları (Ek Şekil 15), D1 (solda) ve D14'te (sağda) tüm hücre tipleri arasındaki çıkarsanmış kollajen yolu sinyal etkileşimlerini gösteren daire grafikleridir. Adım 6.8'de, aynı etkileşimler akor diyagramı işlevi kullanılarak görselleştirilir ve temsili sonuçlar (Ek Şekil 16) her bir zaman noktasında tüm hücre tipleri arasındaki etkileşimleri işaret eden çıkarımsal kollajen yolunu gösteren akor diyagramlarıdır. Beklendiği gibi, bu sonuçlar fibroblastların kollajen sinyal yolu için birincil kaynak hücreler olduğunu gösterdi, ancak bilgi akışı D14'e kıyasla D1'deki bağışıklık hücreleriyle daha sınırlıydı. Hücre-hücre etkileşimlerinde bir kaynak hücre olarak fibroblasta odaklanmak için, adım 6.9, bir kaynak hücre parametresi ekleyerek akor diyagramı işlevini tekrarlar ve temsili sonuçlar (Ek Şekil 17), her bir zaman noktasında kaynak hücreler olarak fibroblastlarla etkileşimleri işaret eden çıkarsanmış kollajen yolunu gösteren akor diyagramlarıdır. Adım 6.10'da, her bir ligand-reseptör çiftinin kollajen sinyal yolundaki katkılarını kaynak hücreler olarak fibroblastlarla görselleştirmek için, biri kabarcık grafikleri (adım 6.10.1) ve diğeri akor diyagramları (adım 6.10.2) kullanılarak iki işlev gerçekleştirilir. Temsili sonuçlar, her bir ligand-reseptör çiftinin, her iki kabarcık grafiğini kullanarak D1 (solda) ve D14 (sağda) zaman noktalarında kaynak hücreler olarak fibroblastlarla sinyal veren kollajen yolu sinyalindeki çıkarımsal katkılarını göstermektedir (Ek Şekil 18) ve akor diyagramları (Ek Şekil 19). Bu sonuçlar, D1'de fibroblastlardan gelen kollajen yolunun, Cd44 ve Sdc4 reseptörlerinin baskınlığı ile nötrofiller ve makrofajlarla sınırlı olduğunu, ancak D14'te diğer hücrelerin integrinler de dahil olmak üzere çeşitli reseptörler aracılığıyla alıcı olarak hareket ettiğini gösterdi. Fibroblast etkileşimlerinde güçlü güçler gösteren Col1a1-Cd44 ligand-reseptör etkileşimine odaklanmak için bir parametre ayarlanır (adım 6.11) ve daha sonra adım 6.12'de tüm hücre tipleri arasındaki bu özel ligand-reseptör etkileşimini görselleştirmek için bir akor diyagramı fonksiyonunda kullanılır, temsili sonuçlarla (Ek Şekil 20), D1 (solda) ve D14 (sağda) zaman noktalarındaki tüm hücre tipleri arasında çıkarılan Col1a1-Cd44 ligand-reseptör etkileşimlerini gösteren akor diyagramlarıdır. Bu sonuçlar, D1'de bu etkileşimin kaynak hücreler olarak fibroblastlarla sınırlı olduğunu, D14'te ise makrofajlar ve düz kas hücrelerinin de kaynak hücreler olarak hareket ettiğini göstermiştir. Daha sonra protokol, önce D1 ve D14 CellChat nesnelerini birleştirerek diferansiyel CellChat analizinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar (adım 6.13). Adım 6.14'te, iki yara iyileşme zaman noktası arasındaki hücre-hücre etkileşimlerinin toplam sayılarını ve göreceli güçlerini ve temsili sonuçları (Ek Şekil 21), D1 ve D14 yaralarını içeren hücrelerde çıkarılan etkileşimlerin toplam sayılarını (solda) ve güçlerini (sağda) gösteren, D1'deki etkileşimlerin daha yüksek nispi güçlerinin aksine D14'te daha yüksek sayıda etkileşim ile ortaya çıkan çubuk grafiklerdir. Adım 6.15 ve 6.16'da, yara 1. günden 14. güne geçerken her hücre tipi arasındaki diferansiyel hücre-hücre etkileşim güçlerini görselleştirmek için iki fonksiyon kullanılır ve ilki bir daire çizimidir (adım 6.15, Ek Şekil 22) ve ikincisi bir ısı haritasıdır (adım 6.16, Ek Şekil 23), burada D14'te artan etkileşimler D1'e kıyasla kırmızı ile gösterilir ve azalanlar mavi ile gösterilir. Beklendiği gibi, nötrofil ve makrofaj aracılı etkileşimler D1'de artar ve fibroblast aracılı etkileşimler D14'te artar. Adım 6.17'de, sıralama fonksiyonu, D1'e kıyasla D14'te kaynak hücreler olarak fibroblastlarla hücre-hücre etkileşimlerine bireysel yolların göreceli katkılarını sıralayan bir grafik oluşturmak için kullanılır ve temsili sonuçlar (Ek Şekil 24), D1'in üstte kırmızı ve D14'ün altta mavi renkle temsil edildiği, birkaç yolun yalnızca D1 veya D14'te temsil edildiği ve diğer birçok yolun bir aktivasyon gradyanı gösterdiği ortaya çıkan sıra grafiğini gösterin. Son olarak, adım 6.18'de, D1'e kıyasla D14'te kaynak hücreler olarak fibroblastlar ile kollajen sinyal yolundaki bireysel ligand-reseptör çiftlerinin nispi katkılarını göstermek için iki kabarcık grafiği fonksiyonu kullanılır ve karşılık gelen temsili sonuçlar (Ek Şekil 25), x eksenindeki birçok hücre-hücre etkileşimi boyunca D14'e kıyasla D1'te artan (sol) ve azalan (sağ) sinyal çiftlerini gösterir. Beklendiği gibi, fibroblastlar, enflamatuar faz sırasında iletişimin nötrofillere ve makrofajlara karşı daha sınırlı olduğu D1 yaralarına kıyasla, D14 yaralarındaki birkaç alıcı hücre boyunca çok daha fazla giden ligand-reseptör çifti etkileşimine sahipti.

Yöntem #7'den başlayarak, protokol Seurat kullanarak iki tek hücreli yara iyileşme veri kümesini entegre etme adımlarında yol gösterir. Protokol ilk olarak, yayınlanan tek hücreli veri kümelerinin iki grubunu birleştirme ve birleştirilmiş veri kümesine standart Seurat iş akışını uygulama adımlarını açıklar (7.1-7.4 adımları). Adım 7.5'te, boyutsal çizim fonksiyonu, birleştirilmiş ancak henüz entegre edilmemiş yara iyileşmesi veri kümesinin küme ve parti numaralarına göre UMAP grafiğini görselleştirmek için kullanılır. Bu adımdan elde edilen temsili sonuçlar (Ek Şekil 26), Seurat kümelerinin (solda) ve parti numaralarının (sağda) dağılımını görselleştiren UMAP grafikleridir ve veri entegrasyonundan önce bu iki veri kümesi için herhangi bir önemli toplu etki görünmediğini gösterir. Protokol daha sonra RPCA yöntemini ve entegre veri kümesinin takip eden Seurat iş akışını (adım 7.7-7.8) kullanarak veri entegrasyonunu gerçekleştirir. Adım 7.9'da, boyutsal çizim fonksiyonu, entegre yara iyileşmesi veri kümesinin küme ve parti numaralarına göre UMAP grafiğini görselleştirmek için kullanılır. Bu adımdan elde edilen temsili sonuçlar (Ek Şekil 27), Seurat kümelerinin (solda) ve parti numaralarının (sağda) dağılımını görselleştiren UMAP grafikleridir ve bu da farklı kümeler arasında iki parti arasında artık daha da büyük bir örtüşme olduğunu göstermektedir. Sonuçlar ayrıca, verilerin entegrasyonunu takiben ek bir kümenin ortaya çıktığını göstermektedir, bu da veri gruplarının teknik etkileri kontrol edildikten sonra potansiyel olarak önemli hücre alt tiplerini belirleme yeteneğinin arttığına işaret edebilir.

figure-results-1
Şekil 1: Veri kümesindeki tüm hücreleri 8 ana renk kodlu küme grubu etrafında kümelenmiş olarak gösteren UMAP grafiği. Windows (solda) ve MacOS (sağda) çalıştıran bir bilgisayardan elde edilen sonuçlar. Bu rakam adım 3.5'e karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Veri kümesindeki tüm hücreleri, zaman/mekan ek açıklamasına göre belirgin bir kümeleme olmaksızın, zaman/mekan kökenlerine göre yayılmış olarak gösteren UMAP grafiği. Bu rakam adım 3.6'ya karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Her hücre kümesi için en çok zenginleştirilmiş hücre türlerini gösteren EnrichR çıkışlarının kırpılmış ekran görüntüleri. Bu rakam adım 3.13'e karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Ana renk kodlu hücre türleri etrafında kümelenmiş veri kümesindeki tüm hücreleri gösteren UMAP grafiği. Bu rakam adım 3.15'e karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Ana hücre tipi kümeleri içindeki en üst hücre işaretleyici genlerinin yüksek ekspresyonunu gösteren UMAP grafikleri ızgarası. Bu rakam adım 3.16'ya karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: En üst hücre işaretleyici genlerin yalnızca ilgili ana hücre tiplerinde yüksek düzeyde ekspresyonunu doğrulayan nokta grafikleri. Bu rakam adım 3.18'e karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Her bir DPW kategorisindeki ana hücre tiplerinin göreli sayılarını gösteren orantı grafiği. Bu rakam adım 3.23'e karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: 3 renk kodlu hücre alt tipi etrafında kümelenmiş veri setindeki fibroblastları gösteren UMAP grafiği. Bu rakam adım 4.5'e karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: Fibroblast alt tip belirteçlerinin yüksek ekspresyonunu yalnızca kendi küme kategorilerinde doğrulayan, ancak DPW kategorileri arasında adil bir şekilde dağılmış nokta grafikleri. Bu rakam adım 4.10'a karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10
Şekil 10: DPW ve ana hücre tipleri başına hücreler arasında ana iyileşme fazı modüllerinin ortalama ifadesini gösteren nokta grafikleri. Bu rakam adım 5.4'e karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Her barkod için tespit edilen genlerin oldukça eşit bir dağılımı olduğunu gösteren sonuçlar, veri seti bütünlüğü ve yara iyileşme zaman noktalarının aşağı akış analizi için önemlidir. Bu rakam adım 2.6.11'e karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Düşük RNA sayıları ile ilişkili olan büyük mitokondriyal içeriğe sahip bir dizi hücre olduğunu gösteren saçılma grafikleri --- bunlar ölü veya ölmekte olan hücrelerdir. Bu rakam adım 2.10'a karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Tespit edilen genlerin dağılımının ve hücre başına mitokondriyal RNA yüzdesinin artık daha normal olduğunu gösteren dağılım grafikleri, sağlam aşağı akış analizlerinin önünü açıyor. Bu rakam adım 2.12'ye karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Nispeten yüksek çift puana sahip bir dizi hücre olduğunu ve 0.25'in doğal bir kesme gibi göründüğünü gösteren keman grafiği, bunun üzerinde olası bir çift popülasyonu vardır. Bu rakam adım 2.15'e karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: Ana varyasyonun çoğunun ilk 13 boyutta meydana geldiğini gösteren dirsek grafiği. Bu rakam adım 3.2'ye karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 6: En üst hücre işaretleyici genlerinin yalnızca kendi Seurat kümelerinde yüksek düzeyde ekspresyonunu doğrulayan nokta grafiği. Bu rakam adım 3.17'ye karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 7: Yara iyileşmesi veri seti boyunca yara zaman seyri açıklamalarının lokalizasyonunu gösteren UMAP grafiği. Bu rakam adım 3.20'ye karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 8: Her bir ana hücre tipi kategorisindeki DPW hücrelerinin göreli sayılarını gösteren orantı grafiği. Bu rakam adım 3.22'ye karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 9: Fibroblast veri setindeki ana varyasyonun çoğunun ilk 9 boyutta meydana geldiğini gösteren dirsek grafiği. Bu rakam adım 4.2'ye karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 10: DPW açıklamalarına göre dağıtılan veri setindeki fibroblastları gösteren UMAP grafiği. Bu rakam adım 4.6'ya karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 11: Çoğunlukla orijinal fibroblast kümesinde fibroblast alt tip belirteçlerinin yüksek ekspresyonunu doğrulayan nokta grafiği. Bu rakam adım 4.11'e karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 12: Her DPW kategorisindeki fibroblast alt tiplerinin nispi sayılarını gösteren orantı grafiği. Bu rakam adım 4.12'ye karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 13: Her bir fibroblast alt tipi kategorisinde DPW boyunca fibroblastların nispi sayılarını gösteren oran grafiği. Bu rakam adım 4.13'e karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 14: 1. gün (D1, sol) ve 14. gün (D14, sağ) zaman noktalarında ana hücre tipleri için gelen (y ekseni) ve giden (x ekseni) etkileşimlerin güçlerini gösteren dağılım grafikleri. Bu rakam adım 6.4'e karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 15: Her bir DPW kategorisindeki tüm hücre tipleri arasındaki çıkarsanmış kollajen yolu sinyal etkileşimlerini gösteren daire çizimleri. Bu rakam adım 6.7'ye karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 16: Her DPW kategorisindeki tüm hücre tipleri arasındaki çıkarımsal kollajen yolu sinyal etkileşimlerini gösteren akor diyagramları. Bu rakam adım 6.8'e karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 17: Her DPW kategorisinde kaynak hücreler olarak fibroblastlarla etkileşimleri işaret eden çıkarımsal kollajen yolunu gösteren akor diyagramları. Bu rakam adım 6.9'a karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 18: Her bir DPW kategorisinde kaynak hücreler olarak fibroblastlar ile kollajen yolu sinyalindeki her bir ligand-reseptör çiftinin çıkarımsal katkılarını gösteren kabarcık grafikleri. Bu rakam adım 6.10.1'e karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 19: Her bir DPW kategorisinde kaynak hücreler olarak fibroblastlar ile kollajen yolu sinyalindeki her bir ligand-reseptör çiftinin çıkarılan katkılarını gösteren akor diyagramları. Bu rakam adım 6.10.2'ye karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 20: Her DPW kategorisindeki tüm hücre tipleri arasında çıkarılan Col1a1-Cd44 ligand-reseptör etkileşimlerini gösteren akor diyagramları. Bu rakam adım 6.12'ye karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 21: 1. ve 14. gün yaralarında çıkarılan etkileşimlerin sayısını (solda) ve gücünü (sağda) gösteren çubuk grafikler. Bu rakam adım 6.14'e karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 22: Yara 1. günden (mavi) 14. güne (kırmızı) DPW'ye geçerken her hücre tipi arasındaki diferansiyel hücre-hücre etkileşim güçlerini gösteren daire çizimi. Bu rakam adım 6.15'e karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 23: Yara 1. günden (mavi) 14. güne (kırmızı) geçerken her hücre tipi arasındaki diferansiyel hücre-hücre etkileşim güçlerini gösteren ısı haritası DPW. Bu rakam adım 6.16'ya karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 24: Bireysel yolların fibroblastlar ve diğer hücre tipleri arasındaki hücre-hücre etkileşimlerine göreceli katkılarını 1. gün ile 14. gün DPW'de gösteren sıralama grafiği. Bu rakam adım 6.17'ye karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 25: 1. gün ve 14. gün DPW'de kaynak hücreler olarak fibroblastlar ile kollajen sinyal yolundaki bireysel ligand-reseptör çiftlerinin nispi katkılarını gösteren kabarcık grafikleri. Bu rakam adım 6.18'e karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 26: Veri entegrasyonundan önce Seurat kümelerinin (solda) ve parti numaralarının (sağda) dağılımını gösteren UMAP grafikleri. Bu rakam adım 7.5'e karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 27: Veri entegrasyonundan sonra Seurat kümelerinin (solda) ve parti numaralarının (sağda) dağılımını gösteren UMAP grafikleri. Bu rakam adım 7.9'a karşılık gelir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: JoVE_Rscript.R: Protokolün tüm bölümleri için açıklanan tüm adımları ve açıklamaları içeren ana R kod betik dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: JoVE_PhaseSpecificGenes.txt. Protokolün 5.1 adımında yüklenen genlerin listesini içeren sekmeyle ayrılmış metin dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: JoVE_Rscript_b3.R. Protokolün 7.1. adımında kullanılmak üzere veri kümesinin #3 numaralı toplu işini analiz etmek için gereken tüm adımları ve açıklamaları içeren ek R kod betik dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: JoVE_DEGs_cellMarkers.xlsx. Protokolün 3.10 adımında kullanılan sıralı diferansiyel olarak ifade edilen genlerin tam çıktısını içeren Excel dosyası. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: Her seurat kümesi için ilk 5 yukarı regüle edilmiş ve ifade edilmiş gen. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde RStudio, Seurat kullanarak karmaşık bir tek hücreli veri kümesinin temel bir analizini sağlayan önceden belirlenmiş kod satırlarını çalıştırmak için kullanılır. R kodlama ortamının kurulumu, daha önce yayınlanmış tek hücreli yara iyileşmesi veri setinin indirilmesi, kritik kalite kontrol adımlarının ve görselleştirmeler, ana hücre tipi açıklamaları, hücre alt tipi analizleri ve Seurat kullanılarak bütünleştirici analizler dahil olmak üzere standart tek hücreli analiz iş akışlarının gerçekleştirilmesi ve CellChat kullanılarak hücre-hücre etkileşim analizlerinin gerçekleştirilmesi dahil olmak üzere yara iyileşmesi araştırmalarıyla ilgili çeşitli yöntemler sunulmaktadır.

Burada tanıtılan yöntemler, R ve popüler açık kaynaklı bilimsel paketleri Seurat²¹ ve CellChat²² kullanılarak tek hücreli analiz için tipik iş akışlarının basitleştirilmiş vinyetleridir. Gerçekten de, iş akışı, karmaşık bir tek hücreli yara iyileşme veri seti ile gerçekleştirilebilecek analiz türünün yalnızca bir örneğidir. Bu yöntemde yapılacak olası değişiklikler neredeyse sonsuzdur ve tek kısıtlama kullanıcının özel bilimsel araştırmasıdır. Örneğin, kullanıcı, bu veri kümesine sormak isteyebilecekleri araştırma sorularına göre hücre türleri ve zaman noktaları gibi bazı temel parametreleri değiştirebilir. Yazarlar ayrıca, kullanıcının bu iş akışını kendi tek hücreli ilgilenilen veri kümesine uyarlamak için yeterince rahat hissetmesini umuyor; Bununla birlikte, diğer veri kümelerini analiz etmek için bu iş akışını kullanırken dikkatli olunmalıdır, çünkü her deney teknik ve numune hazırlama sorunlarını verilerin kendisine yayabilir. Bu nedenle, kullanıcının daha önce yayınlanmış ve yeniden analiz edilmiş tek hücreli veri kümelerinin sonuçlarını yorumlamadan önce tüm deneysel ayrıntıları okuması ve anlaması zorunludur. Biyoinformatik araçların, biyolojik sürecin araştırılması ve hipotez üretimi için güçlü bir yöntem olduğunu ve sonuçların herhangi bir kritik biyolojik yorumunun takip deneylerinde doğrulanması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Protokol boyunca, diğer görevleri yerine getirmek için iş akışının belirli alanlarında büyük değişiklikler yapılabileceğini unutmayın. Ancak, iş akışında yapılan tüm olası değişiklik kombinasyonlarının ayrıntıları bu makalenin kapsamı dışındadır. Örneğin, hücre kümelemesi için kullanılan çözünürlük ve UMAP analizi için kullanılan boyutlar zorunlu olarak özneldir ve burada sunulan araçlar hem büyük ölçekli analizlere (burada geniş tanımlı ana hücre tipleri için gösterildiği gibi) hem de hücrelerin daha büyük veri kümesi içinde daha nadir alt popülasyonlara alt kümelenmesini gerektirebilecek çok spesifik analizlere izin verir. Tek hücreli analiz yönteminin bu yönü hakkında daha fazla bilgi ve tek hücreli analiz hattında değiştirilebilecek diğer tüm parametreler hakkında ayrıntılar için yazarlar, kullanıcıyı Seurat yayınlarına^21,26 ve bu gelişen aracın yazarlarının derinlemesine açıklamalar, vinyetler ve öğreticiler sağladığı web sitesine (https://satijalab.org/seurat/) yönlendirir.

Bu el yazması, tek hücreli transkriptomik literatüründe en çok alıntı yapılan ve kullanılan araçlardan bazılarını, yani tek hücreli ve hücre-hücre etkileşim analizleri için sırasıyla Seurat²¹ ve CellChat^22'yi tanıttı. Bununla birlikte, benzer işlevleri biraz farklı şekillerde gerçekleştiren başka araçlar da mevcuttur. Tek hücreli veri kümesi analizi için, veri kümesi entegrasyonu²⁵ için çeşitli yöntemler kullanan Scran²⁷, Scater ²⁸ ve Python tabanlı ScanPy²⁹ vardır. Bu protokolde, küme hücresi işaretleyici zenginleştirmelerini yorumlamak için kullanıcının kararına dayanan hücre tiplerinin manuel olarak açıklanması gösterildi, ancak artık diğerlerinin yanı sıra SingleR³⁰ ve scGate³¹ gibi hücre tiplerinin otomatik olarak sınıflandırılmasını sağlayan çeşitli araçlar var. Hücre-hücre iletişim analizleri için, CellChat bu protokolde gösterildi, ancak hücre-hücre iletişimini tahmin etmek için CellPhoneDB³², Cytotalk³³ ve LIANA (LIgand-reseptör ANalysis çerçevesi) konsensüs çerçevesi³⁴ içinde uygulanan diğer ligand-reseptör veritabanları dahil olmak üzere başka araçlar da var. Tüm biyoinformatik araçları benzersizdir ve kendi özellikleri ve değiştirilebilir parametreleri ile birlikte gelir. Bu nedenle, kullanıcının, kullanımlarından elde edilen herhangi bir çıktıyı yorumlamadan önce nüanslarını anlamak için her bir aracın ilgili belgelerini dikkatlice okuması önemlidir. Son olarak, hangi biyoinformatik araçları kullanılırsa kullanılsın, bu tür araçların sürekli olarak geliştiğini ve paketlerin farklı sürümlerinin farklı çıktılar verebileceğini hatırlamak çok önemlidir.

R'de sözdizimi kritiktir ve yanlış yerleştirilmiş bir noktalama işareti, tırnak işareti, köşeli parantez ve hatta yanlış büyük harfle yazılmış bir harf hataya neden olur. Bu nedenle, kullanıcının kod yazarken ayrıntılara dikkat etmesi ve yeni bilimsel sorulara ve veri kümelerine uyarlamak için kod satırlarını kopyalarken özellikle dikkatli olması hayati önem taşır. Karşılaşılabilecek belirli hataları gidermek için yazarlar, hata mesajını kullanıcının favori web arama motoruna kopyalayıp yapıştırmanızı ve GitHub ve Stack Overflow gibi biyoinformatik forumlarından gelen sonuçlara göz atmanızı önerir, çünkü en sık karşılaşılan hatalar muhtemelen bilgili bir uzman kullanıcı tarafından yanıtlanmıştır. Bazı forumlarda, en başarılı yanıtlar, sorun için en iyi çözümü bulan diğer kullanıcılar tarafından 'olumlu oylanır'. Kullanıcı, internette bulduğu kod satırlarını kendi bilgisayarına kopyalayıp yapıştırmamaya dikkat etmelidir (özellikle bir çözüm, sistem ayarlarının R programlama dili dışında değiştirilmesini gerektiriyorsa), çünkü bu tür programların kötü amaçlı olma olasılığı vardır. Kodlama hatalarını gidermenin ortaya çıkan heyecan verici bir yöntemi, OpenAI'nin ChatGPT'si, Microsoft'un Copilot'u veya Google'ın Gemini'si gibi güçlü, üretken büyük dil yapay zeka modellerini kullanmaktır. Bu modellerin genel olarak yazılım mühendisliği ve özel olarak sorun giderme için özellikle yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bunun için kullanıcı, sohbet robotuna kullanıcının kodla ilgili niyeti hakkında basit bir istem sağladıktan sonra kodunun tüm satırlarını kopyalayıp yapıştırabilir. Genel uyarı, bu modellerin kusursuz olmadığı ve kullanıcının sorunu çözmek için uygun bir yanıt oluşturmak için birden fazla istemi denemesi gerekebileceği konusunda mevcuttur.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MS Wietecha'nın laboratuvarı, NIH/NIGMS hibesi R35-GM154921, Yara İyileşme Derneği Araştırma Bursu ve UIC Diş Hekimliği Fakültesi Ağız Biyolojisi Bölümü'nden fon aldı.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dizüstü veya masaüstü bilgisayar	YOK	YOK	Windows veya MacOS çalıştırıyor
R	YOK	Sürüm 4.4.1	https://cran.rstudio.com/'dan indirmek ücretsiz
Rstüdyo	Posit Yazılımı, PBC	Sürüm 2024.09.0	https://posit.co/download/rstudio-desktop/'dan indirmek ücretsiz
Ofis Excel	Microsoft	Herhangi bir sürüm	Tablo verilerinin analizi için
İnternet tarayıcısı	YOK	YOK	Web sitelerinde gezinmek için
R Paketleri	Repository	Sürüm
Geliştirici araçları	CRAN	2.4.5
xl'yi oku	CRAN	1.4.3
OpenXLSX	CRAN	4.2.7.1
Düzenli Evren	CRAN	2.0.0
scÖzelleştirmek	CRAN	2.1.2
Biyok Yöneticisi	Biyoiletken	1.30.25
NMF	Biyoiletken	0.28
Karmaşık Isı Haritası	Biyoiletken	2.20.0
Biyoc Komşuları	Biyoiletken	1.22.0
Tek Hücre Deneyi	Biyoiletken	1.26.0
daire içine almak	Biyoiletken	0.4.16
kenar R	Biyoiletken	4.2.1
scDbl Bulucu	Biyoiletken	1.18.0
Seurat	CRAN	5.1.0
Hücre Sohbeti	Github	2.1.2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Sci Transl Med. 6 (265), 265sr6(2014).
Wietecha, M. S., et al. Phase-specific signatures of wound fibroblasts and matrix patterns define cancer-associated fibroblast subtypes. Matrix Biol. 119, 19-56 (2023).
Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: a cellular perspective. Physiol Rev. 99 (1), 665-706 (2019).
Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
Rhea, L., Dunnwald, M. Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis. J Vis Exp. (162), e61616(2020).
Fischer, K. S., et al. Protocol for the splinted, human-like excisional wound model in mice. Bio-Protocol. 13 (3), e4606(2023).
Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Sci Transl Med. 10 (451), aap8798(2018).
Chen, L., Arbieva, Z. H., Guo, S., Marucha, P. T., Mustoe, T. A., DiPietro, L. A. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471(2010).
Leonardo, T. R., et al. Transcriptional changes in human palate and skin healing. Wound Repair. 31 (2), 156-170 (2023).
Rognoni, E., et al. Fibroblast state switching orchestrates dermal maturation and wound healing. Mol Syst Biol. 14 (8), e8174(2018).
Bergmeier, V., et al. Identification of a myofibroblast-specific expression signature in skin wounds. Matrix Biol. 65, 59-74 (2018).
Plikus, M. V., et al. Regeneration of fat cells from myofibroblasts during wound healing. Science. 355 (6326), 748-752 (2017).
Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), aar2971(2018).
Rinkevich, Y., et al. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), aaa2151(2015).
Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nat Commun. 10 (1), 650(2019).
Gay, D., et al. Phagocytosis of Wnt inhibitor SFRP4 by late wound macrophages drives chronic Wnt activity for fibrotic skin healing. Sci Adv. 6 (12), eaay3704(2020).
Haensel, D., et al. Defining epidermal basal cell states during skin homeostasis and wound healing using single-cell transcriptomics. Cell Rep. 30 (11), 3932-3947.e6 (2020).
Phan, Q. M., Sinha, S., Biernaskie, J., Driskell, R. R. Single-cell transcriptomic analysis of small and large wounds reveals the distinct spatial organization of regenerative fibroblasts. Exp Dermatol. 30 (1), 92-101 (2021).
Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).
Hu, K. H., et al. Transcriptional space-time mapping identifies concerted immune and stromal cell patterns and gene programs in wound healing and cancer. Cell Stem Cell. 30 (6), 885-903.e10 (2023).
Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).
Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nat Commun. 12 (1), 1088(2021).
Germain, P. -L., Lun, A., Garcia Meixide, C., Macnair, W., Robinson, M. D. Doublet identification in single-cell sequencing data using scDblFinder. F1000Research. 10, 979(2021).
Jin, S., Plikus, M. V., Nie, Q. CellChat for systematic analysis of cell-cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 20 (1), 180-219 (2024).
Luecken, M. D., et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 19 (1), 41-50 (2022).
Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
Lun, A. T. L., McCarthy, D. J., Marioni, J. C. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with Bioconductor. F1000Research. 5, 2122(2016).
McCarthy, D. J., Campbell, K. R., Lun, A. T. L., Wills, Q. F. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics (Oxford, England). 33 (8), 1179-1186 (2017).
Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19 (1), 15(2018).
Aran, D., et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).
Andreatta, M., Berenstein, A. J., Carmona, S. J. scGate: marker-based purification of cell types from heterogeneous single-cell RNA-seq datasets. Bioinformatics. 38 (9), 2642-2644 (2022).
Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nat Protoc. 15 (4), 1484-1506 (2020).
Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell transcriptomic data. Sci Adv. 7 (16), eabf1356(2021).
Dimitrov, D., et al. Comparison of methods and resources for cell-cell communication inference from single-cell RNA-Seq data. Nat Commun. 13 (1), 3224(2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Fare derisi yara iyileşmesinin tek hücreli transkriptomik veri kümesini analiz etmek için R, Seurat ve CellChat'i kullanma

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles

Related Articles

https://satijalab.org/seurat/articles/hashing_vignette

https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial#qc-and-selecting-cells-for-further-analysis

https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial

https://satijalab.org/seurat/articles/essential_commands

https://satijalab.org/seurat/articles/integration_introduction

https://satijalab.org/seurat/articles/seurat5_integration