Method Article

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Larvalarında Osteoblastların İki Foton Lazer Aracılı Ablasyonu

DOI:

10.3791/67279

⸱

September 6th, 2024

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, zebra balığı larvalarında gerçekleştirilen ve kemik rejenerasyonunu ve ablasyona karşı bağışıklık tepkisinin etkilerini incelemek için bir model görevi gören iki fotonlu bir lazer ablasyon yaklaşımını tanımlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı (Danio rerio), farklı organları ve uzantıları yenilemek için olağanüstü bir kapasiteye sahiptir. Zebra balıklarında kemik rejenerasyonu, yüzgeç amputasyonu, pul yolma, kafatası trepanasyonu ve mikroskobik yaklaşımlar gibi farklı yöntemler kullanılarak incelenmiştir. İki fotonlu bir lazerle donatılmış bir konfokal lazer tarama düzeneği kullanılarak, zebra balığı larvalarının gelişmekte olan operkülünde kemik oluşturan hücreleri (osteoblastlar) ablate etmek için bir lezyon paradigması olarak bir lazer ablasyon yöntemi geliştirilmiştir. Burada açıklanan yöntem, alan, şekil ve derinlik hassas bir şekilde ayarlanabildiğinden, hücrelerin kesin bir şekilde ablasyonuna izin verir. Ek olarak, bu yöntem, ablasyondan önce ve hemen sonra alanın görüntülenmesine izin verir, böylece yaralanmanın kısa vadeli etkileri analiz edilebilir. Bu deney düzeneğinde, yaralı bölgedeki osteoblastların ablasyonundan sonra bağışıklık tepkisi incelenmiştir. Ablasyondan sonra makrofajların alımında bir artış gözlendi, bu da kemik rejenerasyonu sırasında varlıklarının önemini gösteriyor.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı retina, beyin, kalp ve pankreas gibi çeşitli organları yeniler1. Ek olarak, zebra balığı iskelet elemanlarını yeniler, bu nedenle yüzgeçlerin, pulların ve calvariae'nin (kafatası kapakları) yenilenmesini incelemek için kullanılmıştır.2. Doku ve kemik rejenerasyonunu incelemek için yüzgeç rezeksiyonu (amputasyon), yüzgeç kırığı, kafatası trepanasyonu 3,4, kriyoyaralanma 5,6 veya genetik ablasyon 7,8,9 gibi farklı deneysel paradigmalar kullanılmıştır. Son zamanlarda, lazer ablasyon yaklaşımları, zebra balıklarında yaralanma sonrası iyileşme ve rejenerasyon tepkisini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır 10,11,12,13,14.

Lazer aracılı ablasyon, mekanobiyoloji, gelişim biyolojisi, rejenerasyon araştırmaları ve tümör cerrahisi gibi biyolojik araştırmaların farklı alanlarında kullanılmaktadır 10,11,12,15,16,17,18,19. YAG (itriyum alüminyum granat), UV (ultraviyole) veya 2p (iki foton) lazerler20 gibi çeşitli lazer ablasyon metodolojileri vardır. Lazer ablasyon, tek hücrelerin veya daha büyük doku bölümlerinin çok hassas bir şekilde çıkarılmasına izin vererek, bağışıklık sisteminin tümör ablasyonuna21 yanıtı veya zebra balığı operkül rejenerasyonu sırasında olduğu gibi farklı süreçlerin incelenmesini sağlar. İkinci örnekte, ablasyon, nükleer ve sitoplazmik florofor sinyalinin kaybolması ve nekroz boyaması10,22 ile doğrulandı.

Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin ve bunun düzenlenmiş kinetiğinin uygun doku rejenerasyonu için gerekli olduğu iyi bilinmektedir. Nötrofiller ve makrofajlar, sitokin ve büyüme faktörü salınımı, hücresel kalıntıların giderilmesi ve hücre dışı matrisin yeniden şekillenmesi gibi farklı roller üstlendikleri yaralanma bölgesine alınan ilk hücrelerdir23. Bu işe alım ve müteakip makrofaj fonksiyonelleşmesi, ampute zebra balığı yüzgeçlerinde24 ve osteoblast ablasyonuna10 yol açan lazer 'nanodiseksiyona' tabi tutulan gelişmekte olan operkülde de gözlenmiştir. İkinci deneyde, UV lazer ve iki foton lazer aracılı ablasyondan sonra osteoblast sayısının geri kazanılması, normal operkül gelişimi ve doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin (nötrofiller, makrofajlar ve osteoklast benzeri hücreler) yaralı bölgeye alınması gözlendi10. Zebra balığı üzerinde yapılan deneylerde, glukokortikoidler kullanılarak bağışıklık sisteminin farmakolojik olarak baskılandığı deneyler, yanlış düzenlenmiş bağışıklık üzerine rejenerasyonda bir bozulma olduğunu gösterdive bu da bağışıklık sisteminin doku onarımındaki işlevsel rolünü destekledi 3,10,25,26.

Burada, gelişmekte olan zebra balığı kemiklerinde kemik rejenerasyonunun biyolojisini incelemek için iki fotonlu lazer aracılı bir ablasyon metodolojisi açıklanmaktadır. Özellikle, osteoblast ablasyon yaklaşımının operküldeki etkisi, makrofajların ablasyon bölgesine alımının izlenmesi ile araştırılan immün yanıt açısından gösterilmiştir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma protokolü, 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87 izin numaraları olan Landesdirektion Sachsen'den onay aldı. Kullanılan zebra balığı türleri, ulusal yasalara göre ve daha önce açıklandığı gibi standart koşullar altında muhafaza edilmiştir27,28. Çalışmada kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Malzemelerin ve çözeltilerin hazırlanması

  1. Embriyoları 1x E3 ortamında muhafaza edin. 10 L deiyonize su içinde 170 mL 60x E3 stoğunu seyrelterek ve 2 mL %0.1 metilen mavisi ekleyerek 1x E3 ortamını hazırlayın.
    1. 1 L deiyonize otoklavlanmış su içinde 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.90 g CaCl2·2 H2O, 4.90 g MgSO4·7 H2O'yu karıştırarak 60x E3 medya stoğunu hazırlayın.
  2. Larvaların gömülmesi için, önceden %1 düşük erime noktalı agaroz (LMA) alikotları hazırlayın ve oda sıcaklığında tutun.
    1. Alikotları hazırlamak için, LMA'yı 1x E3 ortamında, örneğin bir Erlenmeyer şişesinde 50 mL 1x E3'te 500 mg LMA'yı çözün, çözeltiyi agaroz tamamen eriyene kadar mikrodalgada ısıtın ve 1.5 mL'lik tüplerde 1 mL alikotlara dağıtın.

2. Zebra balığı yetiştiriciliği ve embriyo toplama

NOT: Taahhüt edilen osteoblastların varlığını bildiren çift transgenik zebra balığı larvaları [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 ve makrofajlar [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23] buradakullanılmıştır 30 (Şekil 1A).

  1. Çiftleşmeden önceki akşam standart çiftleşme kafeslerinde istenen tek transgenlere sahip ebeveyn zebra balığı kurun.
    NOT: Standart çiftleşme kafesleri, yumurtaların ebeveyn zebra balığının ulaşamayacağı daha düşük bir bölmeye geçmesine izin verir.
    1. Çiftleşme kafesinde bir bölücü kullanarak çiftleşene kadar erkekleri ve dişileri ayrı tutun. Çiftleşmeyi başlatmak için ertesi günün sabahı bölücüyü çıkarın.
  2. Öğlen saatlerinde, en geç ebeveyn zebra balığını üreme tanklarından çıkarın ve embriyoları toplayın, çiftleşme kafesindeki suyu bir elek ile süzün.
    NOT: Larvaların kesin yaşının belirleyici olması durumunda, embriyoları yaklaşık 30 dakikalık düzenli aralıklarla hasat edin. Farklı deney grupları ile yapılan deneylerde debriyaj montaj ilişkileri kullanılmalıdır.
  3. Embriyoları 1 adet E3 besiyeri içeren 100 mm çapında bir kabın içine yerleştirin ve 28 °C'de bir inkübatörde saklayın31.
  4. Döllenmemiş yumurtaları ve ölü embriyoları stereomikroskop yardımıyla plastik bir pipet kullanarak tabaktan çıkarın ve günde 1 adet E3 ortamını değiştirin.
  5. Deneyden önce, bir floresan stereomikroskop kullanarak raportör transgenleri için pozitif larvaları sıralayın.

3. Düşük erime noktalı agaroz içine gömülen larvalar

  1. LMA alikotlarını 65 °C'de bir termoblok veya su banyosunda eritin. LMA eridikten sonra, gömülene kadar 42 °C'de tutun (Şekil 1B). Anestezi için% 0.02 MS-222 konsantrasyonu elde etmek için erimiş 1 mL LMA alikotuna 50 μL% 0.4 MS-222 ekleyin.
  2. % 0.02 MS-222 E3 ortamında 4 dpf (döllenmeden sonraki gün) larvaları (veya daha yaşlı larvaları) anestezi altına alın.
  3. Anestezi uygulanmış larvaları 3 mL'lik bir plastik Pasteur pipeti kullanarak cam tabanlı bir mikrokuyu kabına aktarın ve aynı pipetle fazla E3 ortamını çıkarın (Şekil 1B). Larvaların kurumasını önleyin.
    NOT: Bir tabağa aynı anda birden fazla larva gömülebilir; Yerleştirme için yeterli zaman tanımak için 3 ila 5 larva yerleştirilmesi önerilir.
  4. Erimiş LMA agarozunu su banyosundan/termobloktan alın ve larvaların yerleştirildiği cam tabanı kaplayacak şekilde tabağa bir (soğutma) damla LMA ekleyin. LMA'nın çok sıcak olmamasına rağmen yine de sıvı olmasına dikkat edin.
  5. Ardından, agaroz katılaşmadan önce larvaları istenen yanal pozisyona yerleştirin. Burada, ters mikroskop kurulumuna hazırlık olarak operkülün tabağın cam tabanına mümkün olduğunca yakın olduğu bir yanal konum sağlayın (Şekil 1B).
  6. Agarozun katılaşmasına izin verin ve ardından agarozun kurumasını önlemek için tabağa E3 ortamı (maksimum% 0.02 MS-222 içeren) ekleyin (Şekil 1B).

figure-protocol-1
Şekil 1: Gömme prosedürünün şematik gösterimi. (A) Çift transgenik Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 zebra balığı larvaları, yeşil işaretli operküler osteoblastlar ve kırmızı ile işaretlenmiş makrofajlar kullanıldı. (B) Protokolün 3. adımında açıklandığı gibi gömme prosedürünün iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Larvaların in vivo görüntülenmesi ve lazer ablasyonu

  1. Transgenik zebra balığı Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, 25x/0.95 su objektifi veya eşdeğer bir kuruluma sahip ters çevrilmiş iki fotonlu lazer tarama mikroskobu kullanın.
  2. Gömülü larvaların bulunduğu tabağı ters çevrilmiş mikroskopta mikroskobik aşamaya yerleştirin ve ablasyon için istenen bölgeyi görüş alanının ortasına yerleştirin. Operkül, GFP floresan sinyalinin yardımıyla kolayca tanımlanabilir.
  3. Operkül mikroskobun görüş alanına odaklandıktan ve ortalandıktan sonra, operkülün tüm genişliğini görüntülemek için z-yığını ayarlarını seçin (genellikle 1-2 μm z-aralıkları kullanılır). Aynı zamanda, ablasyon yapılacak belirli bir z düzlemindeki alanı seçin (genellikle operkülün arka bölgesinde). İki fotonlu lazer ablasyonu sadece bu düzlemde uygulanır.
    NOT: Z boyutunda daha yüksek çözünürlük, daha uzun görüntüleme sürelerine yol açacak ancak daha sonra elde edilen verilerin hacimsel analizlerini mümkün kılacaktır.
  4. Ablasyondan önce ilgilenilen ameliyat alanını görüntüleyin. GFP tespiti için 488 nm'de beyaz ışıklı bir lazer ve 495 nm ila 550 nm veya eşdeğeri arasında değişen bir hibrit dedektör kullanın. Makrofajları, hibrit bir dedektörde (veya eşdeğeri) 595 ila 780 nm mCherry algılama aralığı ile 555 nm (beyaz ışık lazeri) uyarımı kullanarak görüntüleyin.
    1. İyi bir kalite/zaman oranı için 512 x 512 görüntü formatını kullanın (daha yüksek çözünürlük veya alternatif olarak daha yüksek hız isteniyorsa diğer formatlar da kullanılabilir).
      NOT: Mikroskoba monte edilen sıcaklık kontrollü bir inkübatör kullanılabilir ve örneğin 28 °C'ye ayarlanabilir.
  5. ROI aracını kullanarak operkülü odaklayarak, seçilen bir 2B düzlemde 25 μm çapında dairesel bir bölge çizin (deneye bağlı olarak başka şekiller ve boyutlar seçilebilir).
  6. Ablasyonu gerçekleştirmek için, 450 mW'ta ablasyon gücü (objektif olmadan ölçülür) uygulayın ve seçilen alanı 400 Hz tarama hızında ve toplam 10 saniye süreyle iki fotonlu lazere maruz bırakın. Ablasyon sırasında alan, 401-443 nm veya eşdeğeri aralığında bir hibrit dedektör kullanılarak görüntülenebilir.
  7. Ablasyondan sonra, ablasyondan önce kullanılanla aynı ayarlarla aynı z-yığınını tekrar görüntüleyerek ablasyonu yapısal olarak onaylayın. Ablasyon yapılan alan artık floresan hücreler içermez.

5. Larvaların geri kazanılması ve bağışıklık hücresi alımını izlemek için görüntüleme

  1. İmmün hücre alımının görüntülenmesinin gecikmeli olarak yapılması gerekiyorsa, larvaları görüntüleme ve anesteziden kurtarın. Forseps veya diseksiyon iğnesi kullanarak larvaları LMA'dan dikkatlice çıkarın.
    1. İlk olarak, larvaları kaplayan bir agaroz tabakasını çıkarın. İkinci olarak, agarozu larvalarla doğrudan temas halinde çıkarın. Bağışıklık hücresi alımının anında görüntülenmesi gerçekleşiyorsa bu adımı atlayın.
  2. Larvaları saf E3 ortamı olan bir tabağa geri koyun ve iyileşmelerini kontrol edin. İyileşme, larvaların yüzmesi ile belirgindir.
  3. 4 veya 6 hpl'de (lezyondan sonraki saatler), ablasyonun makrofaj alımı üzerindeki etkilerini kontrol etmek için aynı mikroskopta aynı ayarları kullanarak ameliyat alanını tekrar görüntüleyin. Bunu yapmak için, gömmeyi (3. adım) ve görüntülemeyi daha önce gerçekleştirildiği gibi tekrarlayın (4. adım).
  4. Görüntülemeden sonra larvaları LMA'dan çıkarın. Larvaların kurban edilmesi, yasal gerekliliklere bağlı olarak buzlu suda inkübasyon yoluyla veya E3'te aşırı dozda MS-222 ile gerçekleştirilebilir. Örnekler daha sonra takip çalışmaları için kullanılabilir veya atılabilir.

6. Görüntü analizi ve istatistiksel analiz

  1. Görüntüleri Fiji32 gibi bir görüntü işleme yazılımı kullanarak işleyin. Elde edilen verilerin z-çözünürlüğüne bağlı olarak, analizler 2D veya 3D olarak gerçekleştirilebilir.
  2. Makrofajları, ana hücre gövdelerini ayırt etmek gibi açıkça ayrı olan hücreleri dahil ederek veya alternatif olarak bir nükleer etikete sahip hücreleri ölçerek veya hücrelerin örtüşmesi durumunda alanı ölçerek (bir sonraki adım) manuel olarak ölçün.
  3. Alanın ölçülmesi için makrofajları kapsayan bir maske oluşturun. Bunu yapmak için Image > Adjust > Threshold aracını kullanın ve Fiji'de bir ROI (ROI Manager > Add'> Analiz > Araçları) oluşturun. Miktar tayini için arka plandaki küçük parçacıkları hariç tutun.
    1. Ardından alanı ölçün (Analiz > Ölçün). Çakışan hücresel floresan alanlarının ölçüme dahil edilmesi gerekip gerekmediğini göz önünde bulundurun.
      NOT: Burada, bu alanda işe alınan makrofajlar ayırt edilemediği için dairesel ablasyon alanı alan ölçümlerinden çıkarılmıştır.
  4. Uygun yazılımı kullanarak ölçüm sonuçlarını çizen grafikler oluşturun. Ablasyondan önce ve sonra verileri karşılaştırmak için uygun bir istatistiksel test yapın (burada, eşleştirilmiş tek kuyruklu bir t-testi yapıldı).
    NOT: Şekiller fotoğraf düzenleme ve grafik tasarım yazılımları kullanılarak hazırlanabilir.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lazer ablasyon yukarıdaki protokolde belirtildiği gibi yapıldı. Ablasyon yapılan bölgedeki osteoblastların GFP sinyali, ablasyondan sonra anında kayboldu. Osteoblast ablasyonunun immün yanıt açısından yanıtını incelemek için, 6 dpf larvasında 6 hpl öncesi ve sonrasında makrofaj varlığı görüntülendi. Ablasyondan önce, operkül alanında10 çok az makrofaj gözlendi (Şekil 2). 6 hpl'de, ablasyonlu operkül bölgesinde güçlü bir makrofaj birikimi ve operkül ve operkülü çevreleyen alan da dahil olmak üzere görüş alanında artmış sayıda makrofaj tespit edildi10 (Şekil 2).

figure-results-1
Şekil 2: 6 dpf zebra balığı larvasında 6 hpl'de makrofaj alımı. Ablasyon yapılmayan ve 6 hpl'de ameliyat alanı. Operküler osteoblastlar yeşil renkte, makrofajlar macenta renkte etiketlenmiştir ve kesikli daire lazerle kesilmiş alanı gösterir. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Makrofaj alımı, 4 hpl'de çok daha küçük operküllerle 4 dpf larvasında da analiz edildi ve benzer sonuçlar gözlendi (Şekil 3). Makrofaj sayısının nicelleştirilmesi (acil lazer ablasyon bölgesi dışında), incelenen zaman çerçevesi içinde bir artış gösterdi (ablasyondan önce 4.00 ± 2.37 makrofaj, 4 hpl'de 7.00 ± 2.76 makrofaj) (Şekil 3B). Benzer şekilde, makrofaj alanı (ablasyondan önce μm2, 785.8 μm2 ± 723.1 μm2 olarak ölçülürken, 4 hpl'de 1553 μm2 ± 869.9 μm2 olarak ölçülmüştür) artmıştır (Şekil 3C). Makrofajların ayırt edilmesi bazen zor olduğundan, burada yapıldığı gibi makrofaj sayısı yerine makrofaj alanının ölçülmesi önerilir.

figure-results-2
Şekil 3: 4 dpf zebra balığı larvasında 4 hpl'de makrofaj alımı. (A) Ablasyon olmadan ve 4 hpl'de operkül alanı. Operküler osteoblastlar yeşil renkte, makrofajlar macenta renkte etiketlenmiştir ve kesikli daire lazerle kesilmiş alanı gösterir. Ölçek çubuğu: 50 μm. (B) Operkül alanındaki makrofaj sayısının doğrudan ablasyondan önce (0 hpl) ve ablasyondan sonra (4 hpl) ölçülmesi. (C) Makrofaj alanının ölçülmesi (lazer ablasyon bölgesi hariç). Eşleştirilmiş tek kuyruklu t-testleri. Her nokta bir larvanın verilerini temsil eder ve SD ± ortalama gösterilir, n = 6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lazer ablasyon, biyolojik araştırmaların çeşitli disiplinlerinde uygulanmıştır. Özellikle, doku rejenerasyonunu incelemek için bir yöntem olarak yararlı olmuştur 10,11,12. Örneğin, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin işe alımı ve fenotip değişiklikleri, lazer ablasyon bölgesinde10 osteoblastların geri kazanılmasının yanı sıra UV lazer veya iki fotonlu lazer ablasyon testleri kullanılarak zaman içinde analiz edildi. İmmün hücre alımının canlı görüntülemesi, lezyon sonrası 12 saate (hpl) kadar gerçekleştirildi; Bununla birlikte, anestezide uygun ayarlamalar ve ilgili makamların onayı ile daha uzun görüntüleme süreleri öngörülebilir. Geurtzen ve ark.'da, lazer ablasyondan birkaç gün sonrasına kadar analizler yapıldı ve ablasyon bölgesindeki inflamatuar ortamın tanımlanmasına ve ayrıca makrofajların kemik rejenerasyonunda destekleyici rolünün belirlenmesine yardımcı oldu10. Kemik dokusunda hücre ölümü üzerine reaktif oksijen türlerinin33 salınımının rolünü incelemek gibi birçok başka uygulama düşünülebilir.

İki fotonlu lazer aracılı hücre ablasyonu kullanmanın avantajlarından biri, onu konfokal görüntüleme ile birleştirme olasılığıdır. Burada kullanılan yazılım (Malzeme Tablosuna bakınız), görüntüleme ve ablasyonun art arda gerçekleştiği bir moda (Canlı Veri Modu) ayarlanabilir, bu da süreci hızlandırır. Teknolojinin bir diğer avantajı da ablasyonun doğruluğudur. Ablasyonun boyutu ve şekli yazılımda çok hassas bir şekilde kolayca ayarlanabilir. Burada sunulan deney ortamında, ablasyon için 25 μm çapında dairesel bir alan seçildi. Bununla birlikte, Drosophila'daki diğer ablasyon deneyleri, komşu-komşu hücresel bağlantıları 34 keserek embriyonik epiteldeki doku gerilimini azaltmak için25 μm doğrusal ablasyonlar kullandı. Bu doğruluk, belirli ve kontrollü sayıda hücrenin, tek hücrelerin ve hatta hücre zarlarının ablasyonuna izin verir.

Özellikle, iki fotonlu bir lazerle gerçekleştirilen lezyon tipi, rejenerasyon araştırmalarında ve diğer disiplinlerde de akılda tutulması gereken, doğal olarak meydana gelen yaralanmalara ve hücre ölümüne benzemez. Özellikle, lazer ablasyonlar, çevre dokularda en az hasarlailgilenilen bölgedeki hücreleri 20 tamamen yok ederek (yakarak) çok odaklanmış lezyonlar oluştururken, mekanik veya diğer yaralanma türleri daha geniş ölçekte birkaç doku tipini ve tabakasını etkileme eğilimindedir. Bu, farklı hücre ölümü türlerini (örneğin, nekroz, apoptoz, otofaji)35 ve farklı rejeneratif sonuçları içeren manifold sonuçlarına yol açabilir. Ayrıca, lazer ablasyonuna verilen reaksiyonlar hücresel ve moleküler açıdan farklılık gösterebilir. Örneğin, lazer lezyon bölgesini çevreleyen hücrelerin plazma zarı bütünlüğünü kaybedebilmesine rağmen, hasardan kurtulabilecekleri ve bütünlüğü geri kazanabilecekleri gösterilmiştir36. Lazer ablasyon ayrıca, uygulanan lazer ışınının tam merkezindeki "termal patlamalardan" ve ayrıca doğrudan komşu hücrelerde güçlü ısıya maruz kalmaktan kaynaklanabilecek hasarlı hücre dışı matris alanlarına da yol açar10,37. Bununla birlikte, lazer ablasyon bölgelerini çevreleyen hücreler, lazerle ablasyonlu kalp dokusu38 için gösterildiği gibi artan sayıda apoptotik cisim gösterir ve burada gösterildiği gibi bir bağışıklık tepkisi tetiklenir. Açıklanan farklılıklara ek olarak, lazer destekli ablasyon testlerinin bir başka sınırlaması, yaralanmanın gerçekleştirilebileceği derinlik ve sınırlı numune boyutu olabilir. Kalın örneklerde gizlenen yapılar uygun şekilde kesilemeyebilir ve görüntüleme zor olacaktır. Bununla birlikte, bu, kullanılan mikroskop ve lazerin yanı sıra objektif ve gömmeye de büyük ölçüde bağlı olacaktır.

Larvaların, operkülün tabağın cam tabanına yakın bir yere yerleştirilecek şekilde gömülmesi, sunulan protokolde olduğu gibi ters çevrilmiş bir kurulumun kullanılması durumunda çok önemlidir. Ayrıca, larvaları örtmek için uygulamadan önce LMA'nın sıcaklığını test etmek çok önemlidir (adım 3.4), çünkü sıcak agaroz larvalara zarar verecektir. Bunu önlemek için, LMA alikotunu termobloktan erkenden alın, örneğin kalan E3 ortamını cam tabanlı tabaktan çıkarırken ve bilek derisi gibi sıcaklığı test edin. LMA'nın sıcak olması gerekiyor ama sıcak değil.

Larvalar LMA ile kaplandıktan sonra, LMA katılaşmaya başlamadan önce onları hızlı bir şekilde doğru konuma getirmek önemlidir. Yanal pozisyon, elde edilmesi en kolay olanıdır; Sunulan çalışmada, istenen pozisyon ventral tarafa hafif bir eğim ile lateral idi. Larvalar doğru şekilde konumlandırılmadan önce LMA'nın katılaşması durumunda, LMA'yı çıkarmak (adım 5.1'deki gibi) ve gömme işlemini tekrarlamak mümkündür. Benzer şekilde, görüntülenecek (ve lazerle kesilecek) alanın, maksimum görüntü kalitesi ve hücre ablasyonu için kalıbın cam tabanına mümkün olduğunca yakın olması önemlidir, ancak bu aynı zamanda objektifin çalışma mesafesine de bağlı olacaktır.

Görüntüleme için aynı tabağa birden fazla larva gömmek mümkündür. Bu, zamandan tasarruf sağlayacak ve LMA'yı daha iyi kullanacaktır. Gömülebilecek larva sayısı deneycinin deneyimine bağlı olacaktır, ancak 3-5 larva önerilir.

Lazer ablasyon, daldırma lensleri kullanılarak dik mikroskobik kurulumlarla da gerçekleştirilebilir. Bu durumda, operkülün iyi görüntüleme kalitesini ve lazer ablasyon başarısını sağlamak için larvaları hafif ventral bir görünümle (yukarıdan) gömmek önemlidir. Ek olarak, floresan sinyallerin iyi bir şekilde uyarılmasına ve algılanmasına izin vermek için larvaları yalnızca ince bir LMA tabakası örtmelidir.

Bu protokolde, osteoblastlar için iki fotonlu lazer aracılı bir ablasyon kurulumu, gelişmekte olan kemiklerde, özellikle operkülde lezyonları gerçekleştirmek için bir metodoloji olarak tanımlanmaktadır. Bu yöntem, gelişmekte olan zebra balığının diğer kemiklerindeki hücreleri ablate etmek için uyarlanabilir. Ayrıca, yaralı dokuların rejenerasyonunu incelemek genellikle yararlı bir yaklaşımdır11,12. Farklı boyut ve şekillerde ablasyon ve doku kesimi yapma kolaylığı, farklı deney düzeneklerinde ve araştırma alanlarında kullanılmasına izin verir 15,17,18,19,21,34. Toplamda, iki fotonlu lazer aracılı ablasyon, farklı dokular, organizmalar ve hatta in vitro ortamlar için çok uyarlanabilir bir yöntemdir ve biyolojik araştırmalarda önemli bir araçtır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı (DFG) Transregio 67 (proje 387653785), DFG SPP 2084 μBone (proje KN 1102/2-1) tarafından FK'ya desteklenmiştir. Bu çalışma, TU Dresden'deki CMCB Teknoloji Platformu'nun bir Çekirdek Tesisi olan Işık Mikroskobu Tesisi (DFG proje 413875620) tarafından desteklenmiştir. TU Dresden'deki çalışma, Sakson Parlamentosu tarafından kabul edilen bütçeye ('Landtag') dayalı vergi gelirleriyle birlikte finanse edildi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kalsiyum klorür dihidrat, CaCl2· H2OCarl Roth5239.1
Hücre Kültürü Kabı, PS, 100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51Uç şekli düz, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm
Falcon 6 kuyulu plakaCorning353502
Cam tabanlı mikro kuyu kabıMatTekP35G-1.5-14-C35 mm Çanak, No. 1.5 Lamel, 14 mm Cam Çapı, Kaplamasız
Insight X3 multifoton lazerSpectra-Physics
Leica Application SuiteLAS X, Leica Microsystems
Düşük erime noktalı agaroz Biozyme840101Biozym Plak Agaroz
Magnezyum sülfat heptahidrat, MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM5921
Çiftleşme kafesleribirçok çeşit, örneğin Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
Potasyum Klorür, KClPanReac AppliChem131494
Sodyum klorür, NaClCarl Roth3957.1
SP8 ŞAHIN Leica MicrosystemsInsight X3 multifoton lazer ve Leica Application Suite yazılımı ile donatılmıştır
Paslanmaz Çelik Diseksiyon İğnesiBochem12010140 mm
Stereo Mikroskop Sistemi SZX16OlympusLED aydınlatma tabanı ile donatılmıştır SZX2-ILLTQ
Termostatik Dolaplar TS - WTWksilemTS 608/2-iİnkübasyon (embriyo) transferi için
pipet, 3,5 mLSARSTEDT861171155 x 15 mm, LD-PE, şeffaf
Zeiss SteREO Discovery.V12 sürüm 4.7.1.0.ZeissAxiocam MRm kamera ve AxioVision yazılımı ile donatılmıştır

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692(2019).
  2. Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).
  3. Geurtzen, K., Knopf, F. Adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue. J Vis Exp. (140), e58429(2018).
  4. Sousa, S., Valerio, F., Jacinto, A. A new zebrafish bone crush injury model. Biol Open. 1 (9), 915-921 (2012).
  5. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  6. Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biol Open. 5 (6), 819-828 (2016).
  7. Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Dev Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. Ando, K., Shibata, E., Hans, S., Brand, M., Kawakami, A. Osteoblast production by reserved progenitor cells in zebrafish bone regeneration and maintenance. Dev Cell. 43 (5), 643-650.e3 (2017).
  10. Geurtzen, K., López-Delgado, A. C., Duseja, A., Kurzyukova, A., Knopf, F. Laser-mediated osteoblast ablation triggers a pro-osteogenic inflammatory response regulated by reactive oxygen species and glucocorticoid signaling in zebrafish. Dev. 149 (8), 1998030(2022).
  11. Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. J Vis Exp. (159), e60966(2020).
  12. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845(2011).
  13. Goldstein, A. M., Fishman, M. C. Notochord regulates cardiac lineage in zebrafish embryos. Dev Biol. 201 (2), 247-252 (1998).
  14. Zhang, J., Jeradi, S., Strähle, U., Akimenko, M. A. Laser ablation of the sonic hedgehog-a-expressing cells during fin regeneration affects ray branching morphogenesis. Dev Biol. 365 (2), 424-433 (2012).
  15. Marshall, A. R., et al. Two-photon cell and tissue level laser ablation methods to study morphogenetic biomechanics. Methods Mol Biol. 2438, 217-230 (2022).
  16. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  17. Lee, J., Lee, S., Truong, V. G., et al. Laser ablation of pancreatic cancer using a cylindrical light diffuser. Lasers Med Sci. 37 (6), 2615-2621 (2022).
  18. Luther, E., Mansour, S., Echeverry, N., et al. Laser ablation for cerebral metastases. Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 537-547 (2020).
  19. Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods Mol Biol. 1189, 219-235 (2015).
  20. Vogel, A., Venugopalan, V. Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues. Chem Rev. 103 (2), 577-644 (2003).
  21. Wu, F. Heat-based tumor ablation: Role of the immune response. Adv Exp Med Biol. 880, 131-153 (2016).
  22. Renvoizé, C., Biola, A., Pallardy, M., Bréard, J. Apoptosis: Identification of dying cells. Cell Biol Toxicol. 14 (2), 111-120 (1998).
  23. Julier, Z., Park, A. J., Briquez, P. S., Martino, M. M. Promoting tissue regeneration by modulating the immune system. Acta Biomater. 53, 13-28 (2017).
  24. Petrie, T. A., Strand, N. S., Tsung-Yang, C., Rabinowitz, J. S., Moon, R. T. Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration. Dev. 141 (13), 2581-2591 (2014).
  25. Geurtzen, K., Vernet, A., Freidin, A. Immune suppressive and bone inhibitory effects of prednisolone in growing and regenerating zebrafish tissues. J Bone Miner Res. 32 (12), 2476-2488 (2017).
  26. Fleischhauer, L., López-Delgado, A. C., Geurtzen, K., Knopf, F. Glucocorticoid effects in the regenerating fin reflect tissue homeostasis disturbances in zebrafish by affecting Wnt signaling. Front Endocrinol. (Lausanne). 14, 1122351(2023).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. https://books.google.de/books?id=Iy8PngEACAAJ (2002).
  28. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  29. Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Dev. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. JoVE Science Education Database. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  32. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  34. Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions. Dev. 151 (10), dev202862(2024).
  35. Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. Diversity and complexity of cell death: A historical review. Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).
  36. O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds. PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).
  37. Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues. APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).
  38. Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two Photon AblationOsteoblast AblationZebrafish LarvaeBone RegenerationConfocal MicroscopyMacrophage RecruitmentImmune ResponseOpercle ImagingLow Melting AgaroseTransgenic Zebrafish

Related Articles